Summary

Gjennom Looking Glass: Time-lapse mikroskopi og Longitudinal sporing av enkeltceller for å studere Anti-kreft Therapeutics

Published: May 14, 2016
doi:

Summary

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Abstract

Responsen av enkle celler til kreftmedisiner bidrar i vesentlig grad ved bestemmelse av populasjonen respons, og derfor er en viktig medvirkende faktor i det totale resultat. Immunoblotting, flowcytometri og faste celleforsøk blir ofte brukt for å studere hvordan celler reagerer på anti-kreft medikamenter. Disse metodene er viktig, men de har flere ulemper. Variasjon i narkotika reaksjoner mellom kreft og normale celler, og mellom celler av forskjellig kreft opprinnelse, og forbigående og sjelden svar er vanskelig å forstå ved hjelp av befolkningen gjennomsnitts analyser og uten å være i stand til å direkte spore og analysere dem på langs. Mikroskopet er spesielt godt egnet til bilde levende celler. Fremskritt i teknologi gjør oss i stand til å rutinemessig bildet celler med en oppløsning som gjør det mulig ikke bare celle sporing, men også observasjon av en rekke cellulære responser. Vi beskriver en tilnærming i detalj som gjør det mulig for den kontinuerlige time-lapse avbildning av-celler i løpet av medikamentrespons for i hovedsak så lenge som ønskelig, typisk opp til 96 timer. Ved hjelp av variasjoner av tilnærming, kan cellene bli overvåket i flere uker. Med ansettelsen av genetisk kodet fluorescerende biosensorer mange prosesser, stier og svar kan følges. Vi viser eksempler som inkluderer sporing og kvantifisering av cellevekst og cellesyklusprogresjon, kromosom dynamikk, DNA-skade og celledød. Vi diskuterer også variasjoner av teknikk og sin fleksibilitet, og fremheve noen vanlige fallgruver.

Introduction

Levende-celle mikroskopi og lengde sporing av enkeltceller er ikke en ny teknikk. Fra de tidligste mikroskoper, har entusiaster og forskere observert og studert enkeltceller og organismer, deres atferd og utvikling 1-3. Et kjent eksempel fra sent David Rogers ved Vanderbilt University i 1950 viser et menneske nøytrofile i et blodutstryk jage en Staphylococcus aureus bakterie og til slutt prosessen med fagocytose 4. Denne live-cell filmen er en utmerket illustrasjon av hvordan flere prosesser kan observeres og korrelert i et enkelt eksperiment: sensing av en kjemisk gradient, mekanikk og hastigheten på cellemotilitet, figurer celle dynamikk, heft og fagocytose av et patogen.

Ankomsten av fullt automatiserte mikroskoper og svært sensitive digitale kameraer har resultert i et økende antall etterforskere bruker mikroskop for å stille grunnleggende spørsmål i cellebiologi alt from hvor cellene flytte 5,6 og dele 7,8 til organelle dynamikk og membran trafficking 9-11. Non-fluorescerende, lysfelt mikroskopi, inklusive fase-kontrast (PC), som fått Nobelprisen for Frits Zernike i 1953, og differensial interferens kontrast (DIC) gir mulighet for observasjon av celler og kjerner, men også sub-cellulære strukturer inkludert mikrotubulidynamikk bunter , kromosomer, nukleoli, organelle dynamikk, og tykke aktin fibre 12. Genetisk kodet fluorescerende proteiner og utvikling av fluorescerende fargestoffer mot organeller har dramatisk påvirket time-lapse mikros 13-15. Selv ikke fokus for denne artikkelen, bildebehandling i celleklumper og in situ (intramikroskopi) ved hjelp av konfokal og multiphoton mikros representerer en annen utvidelse av tilnærming, og det er utestående artikler som bruker og diskuterer disse tilnærmingene 16-19.

Svarene av celler til anti-cancere legemidler eller naturprodukter er fastsatt på molekylær og cellulær skala. Forstå celle responser og skjebner etter behandling innebærer ofte befolknings gjennomsnitts-analyser (f.eks., Immunoblottingforsøk, hele brønntiltak), eller faste tidspunkter med immunfluorescens deteksjon og flowcytometri, som måler enkeltceller. Heterogenitet i encellete respons på medikamenter innenfor en befolkning, spesielt i tumorer, kan forklare noen av variasjonen i respons sett på tvers av cellelinjer og svulster som er behandlet med det samme stoffet ved metning. Long-term langsgående tilnærminger for å følge en gitt enkelt celle eller en populasjon av celler som er en mindre vanlig, men meget kraftig metode som gjør det mulig for den direkte studium av molekylrespons trasé, forskjellige fenotyper (f.eks., Celledød eller celledelingen), observasjon av celle-til-celle variasjon innenfor en populasjon, og hvordan disse faktorene bidrar til befolkningen respons dynamikk 20-22. Optimistisk, å kunneå observere og kvantifisere encellete svar vil bidra til å forbedre vår forståelse av hvordan stoffene virker, hvorfor de noen ganger mislykkes, og hvordan du best kan bruke dem.

Teknikken av langsiktig time-lapse mikroskopi, langsgående sporing og analyse av narkotika reaksjoner er tilgjengelig for mange etterforskere og kan være enkle, med bare overført lys til å observere fenotype svar 20,21. De viktigste komponentene i tilnærmingen inkluderer: passende forberedelse av cellene av interesse, en automatisert mikroskop med miljøkammer, et kamera integrert med en datamaskin til å erverve og lagre bilder og programvare for å gjennomgå time-lapse og måle og analysere cellene og eventuelle fluorescerende biosensorer. Vi tilbyr en detaljert protokoll med mange tips for å drive time-lapse mikroskopi av dyrkede celler så lenge som flere dager ved hjelp av lysfelt og / eller Widefield epifluorescent mikroskopi. Denne protokollen kan anvendes for en hvilken som helst cellelinje som kan dyrkes i kulturfor å studere deres svar på anti-kreft terapi. Vi gir eksempler på data innhentet og analysert ved hjelp av flere forskjellige genetisk kodet fluorescerende biosensorer og et eksempel på fasekontrastmikroskopi, kort diskutere ulike typer sonder, fordeler og ulemper ved langsiktig time-lapse og lengde sporing, hva kan være lærte for denne tilnærmingen som er vanskelig å forstå fra ikke-direkte tilnærminger, og noen varianter som vi håper vil være av interesse og verdi for uerfarne forskere som ikke har vurdert å bruke tilnærming, og til erfarne forskere.

Protocol

Den følgende protokollen bruker parametere som er definert ved forsøkene på figurene 4 og 6 om kjøp innstillinger og eksperimentelle betingelser. Mange av disse parametrene kan endres for å passe andre forsøk (dvs. eksponeringstider, binning, fluorescerende kanaler, osv.). Alle prosedyrer må forholde seg til institusjonelle retningslinjer og regler og være godkjent av institusjonelle biosikkerhet komiteen. Mikroskop produsentens nettsider inneholder god informa…

Representative Results

Langtids time-lapse mikroskopi og direkte langsgående sporing kan for studier av mange anti-kreft effekt i løpet av legemiddelrespons. Etter generell oversikt i figur 1, er flere eksempler på celler vist uttrykker validerte fluorescerende reportere som behandles med anti-kreft narkotika, spores, og analysert ved hjelp av ulike tilnærminger. Fasekontrastmikroskop alene er veldig lærerikt og robust rapporte…

Discussion

Fordeler med Time-lapse mikroskopi og Longitudinal Tracking

Mikroskopet er et ideelt instrument for longitudinelle studier av legemiddelrespons som gjør det mulig etterforskere for å spore individuelle celler og deres skjebner, samt hele befolkningen. Variasjon i narkotika svar innen en populasjon av celler er et stort problem for anti-kreft terapeutisk design. Langsgående sporing av enkeltceller gjør at etterforskerne å observere denne variasjonen og begynne å forstå…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

Materials

Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
35mm dish, 20mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
35mm 4 well dish, 20mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
35mm dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
Olympus IX2-UCB controller Olympus
PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
Nikon Eclipse Ti Nikon
Nikon laser launch Nikon
SOLA light engine lumencor
iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

References

  1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
  2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
  3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
  4. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, . Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
  5. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
  6. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
  7. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
  8. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
  9. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
  10. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
  11. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
  12. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
  13. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
  14. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  15. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
  16. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
  17. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
  18. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
  19. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
  20. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
  21. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
  22. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
  23. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
  24. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
  25. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
  26. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  27. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
  28. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  29. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  30. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
  31. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
  32. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
  33. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
  34. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
  35. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  36. D’Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
  37. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
  38. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
  39. N’Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
  40. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
  41. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
  42. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
  43. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
  44. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
  45. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
  46. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  47. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
  48. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
  49. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., Robinson, J. .. . P. a. u. l., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. 66, (2013).
  50. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  51. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
  52. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
  53. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

Play Video

Cite This Article
Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

View Video