Gjennom Looking Glass: Time-lapse mikroskopi og Longitudinal sporing av enkeltceller for å studere Anti-kreft Therapeutics

Summary

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Abstract

Responsen av enkle celler til kreftmedisiner bidrar i vesentlig grad ved bestemmelse av populasjonen respons, og derfor er en viktig medvirkende faktor i det totale resultat. Immunoblotting, flowcytometri og faste celleforsøk blir ofte brukt for å studere hvordan celler reagerer på anti-kreft medikamenter. Disse metodene er viktig, men de har flere ulemper. Variasjon i narkotika reaksjoner mellom kreft og normale celler, og mellom celler av forskjellig kreft opprinnelse, og forbigående og sjelden svar er vanskelig å forstå ved hjelp av befolkningen gjennomsnitts analyser og uten å være i stand til å direkte spore og analysere dem på langs. Mikroskopet er spesielt godt egnet til bilde levende celler. Fremskritt i teknologi gjør oss i stand til å rutinemessig bildet celler med en oppløsning som gjør det mulig ikke bare celle sporing, men også observasjon av en rekke cellulære responser. Vi beskriver en tilnærming i detalj som gjør det mulig for den kontinuerlige time-lapse avbildning av-celler i løpet av medikamentrespons for i hovedsak så lenge som ønskelig, typisk opp til 96 timer. Ved hjelp av variasjoner av tilnærming, kan cellene bli overvåket i flere uker. Med ansettelsen av genetisk kodet fluorescerende biosensorer mange prosesser, stier og svar kan følges. Vi viser eksempler som inkluderer sporing og kvantifisering av cellevekst og cellesyklusprogresjon, kromosom dynamikk, DNA-skade og celledød. Vi diskuterer også variasjoner av teknikk og sin fleksibilitet, og fremheve noen vanlige fallgruver.

Introduction

Levende-celle mikroskopi og lengde sporing av enkeltceller er ikke en ny teknikk. Fra de tidligste mikroskoper, har entusiaster og forskere observert og studert enkeltceller og organismer, deres atferd og utvikling ^1-3. Et kjent eksempel fra sent David Rogers ved Vanderbilt University i 1950 viser et menneske nøytrofile i et blodutstryk jage en Staphylococcus aureus bakterie og til slutt prosessen med fagocytose ^4. Denne live-cell filmen er en utmerket illustrasjon av hvordan flere prosesser kan observeres og korrelert i et enkelt eksperiment: sensing av en kjemisk gradient, mekanikk og hastigheten på cellemotilitet, figurer celle dynamikk, heft og fagocytose av et patogen.

Ankomsten av fullt automatiserte mikroskoper og svært sensitive digitale kameraer har resultert i et økende antall etterforskere bruker mikroskop for å stille grunnleggende spørsmål i cellebiologi alt from hvor cellene flytte ^5,6 og dele ^7,8 til organelle dynamikk og membran trafficking ^9-11. Non-fluorescerende, lysfelt mikroskopi, inklusive fase-kontrast (PC), som fått Nobelprisen for Frits Zernike i 1953, og differensial interferens kontrast (DIC) gir mulighet for observasjon av celler og kjerner, men også sub-cellulære strukturer inkludert mikrotubulidynamikk bunter , kromosomer, nukleoli, organelle dynamikk, og tykke aktin fibre ^12. Genetisk kodet fluorescerende proteiner og utvikling av fluorescerende fargestoffer mot organeller har dramatisk påvirket time-lapse mikros ^13-15. Selv ikke fokus for denne artikkelen, bildebehandling i celleklumper og in situ (intramikroskopi) ved hjelp av konfokal og multiphoton mikros representerer en annen utvidelse av tilnærming, og det er utestående artikler som bruker og diskuterer disse tilnærmingene ^16-19.

Svarene av celler til anti-cancere legemidler eller naturprodukter er fastsatt på molekylær og cellulær skala. Forstå celle responser og skjebner etter behandling innebærer ofte befolknings gjennomsnitts-analyser (f.eks., Immunoblottingforsøk, hele brønntiltak), eller faste tidspunkter med immunfluorescens deteksjon og flowcytometri, som måler enkeltceller. Heterogenitet i encellete respons på medikamenter innenfor en befolkning, spesielt i tumorer, kan forklare noen av variasjonen i respons sett på tvers av cellelinjer og svulster som er behandlet med det samme stoffet ved metning. Long-term langsgående tilnærminger for å følge en gitt enkelt celle eller en populasjon av celler som er en mindre vanlig, men meget kraftig metode som gjør det mulig for den direkte studium av molekylrespons trasé, forskjellige fenotyper (f.eks., Celledød eller celledelingen), observasjon av celle-til-celle variasjon innenfor en populasjon, og hvordan disse faktorene bidrar til befolkningen respons dynamikk ^20-22. Optimistisk, å kunneå observere og kvantifisere encellete svar vil bidra til å forbedre vår forståelse av hvordan stoffene virker, hvorfor de noen ganger mislykkes, og hvordan du best kan bruke dem.

Teknikken av langsiktig time-lapse mikroskopi, langsgående sporing og analyse av narkotika reaksjoner er tilgjengelig for mange etterforskere og kan være enkle, med bare overført lys til å observere fenotype svar ^20,21. De viktigste komponentene i tilnærmingen inkluderer: passende forberedelse av cellene av interesse, en automatisert mikroskop med miljøkammer, et kamera integrert med en datamaskin til å erverve og lagre bilder og programvare for å gjennomgå time-lapse og måle og analysere cellene og eventuelle fluorescerende biosensorer. Vi tilbyr en detaljert protokoll med mange tips for å drive time-lapse mikroskopi av dyrkede celler så lenge som flere dager ved hjelp av lysfelt og / eller Widefield epifluorescent mikroskopi. Denne protokollen kan anvendes for en hvilken som helst cellelinje som kan dyrkes i kulturfor å studere deres svar på anti-kreft terapi. Vi gir eksempler på data innhentet og analysert ved hjelp av flere forskjellige genetisk kodet fluorescerende biosensorer og et eksempel på fasekontrastmikroskopi, kort diskutere ulike typer sonder, fordeler og ulemper ved langsiktig time-lapse og lengde sporing, hva kan være lærte for denne tilnærmingen som er vanskelig å forstå fra ikke-direkte tilnærminger, og noen varianter som vi håper vil være av interesse og verdi for uerfarne forskere som ikke har vurdert å bruke tilnærming, og til erfarne forskere.

Protocol

Den følgende protokollen bruker parametere som er definert ved forsøkene på figurene 4 og 6 om kjøp innstillinger og eksperimentelle betingelser. Mange av disse parametrene kan endres for å passe andre forsøk (dvs. eksponeringstider, binning, fluorescerende kanaler, osv.). Alle prosedyrer må forholde seg til institusjonelle retningslinjer og regler og være godkjent av institusjonelle biosikkerhet komiteen. Mikroskop produsentens nettsider inneholder god informa…

Representative Results

Langtids time-lapse mikroskopi og direkte langsgående sporing kan for studier av mange anti-kreft effekt i løpet av legemiddelrespons. Etter generell oversikt i figur 1, er flere eksempler på celler vist uttrykker validerte fluorescerende reportere som behandles med anti-kreft narkotika, spores, og analysert ved hjelp av ulike tilnærminger. Fasekontrastmikroskop alene er veldig lærerikt og robust rapporte…

Discussion

Fordeler med Time-lapse mikroskopi og Longitudinal Tracking

Mikroskopet er et ideelt instrument for longitudinelle studier av legemiddelrespons som gjør det mulig etterforskere for å spore individuelle celler og deres skjebner, samt hele befolkningen. Variasjon i narkotika svar innen en populasjon av celler er et stort problem for anti-kreft terapeutisk design. Langsgående sporing av enkeltceller gjør at etterforskerne å observere denne variasjonen og begynne å forstå…

Materials

Taxol (paclitaxel)	Sigma	T7191	microtubule stabilizing drug
etoposide	Selleckchem	S1225	topoisomerase II inhibitor
selinexor	Karyopharm Therapeutics	na	XPO1/CRM1 inhibitor, gift
Kinesin-5 inhibitor	Merck Serono	na	gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
cell growth medium	HyClone (Fisher) or Mediatech		many companies available
5% CO2/balance air, certified	Airgas	Z03NI7222004379
35mm dish, 20mm glass bottom	Cellvis	D35-20-1.5-N	many companies available
35mm 4 well dish, 20mm glass bottom	Cellvis	D35C4-20-1.5-N	many companies available
35mm dish, gridded glass bottom	MatTek	P35G-2-14-CGRD	many companies available
multi-well, glass bottom	Cellvis	P12-1.5H-N	many companies available
Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope	Olympus
Olympus IX2-UCB controller	Olympus
PRIOR LumenPro200	Prior Scientific	Lumen200PRO
PRIOR Proscan III motorized stage	Prio Scientific	H117
STEV chamber	InVivo Scientific	STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
Environmental Controller Unit	InVivo Scientific	STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller	Hamamatsu	C10600
Nikon Eclipse Ti	Nikon
Nikon laser launch	Nikon
SOLA light engine	lumencor
iXon Ultra 897 EM-CCD	ANDOR
TOKAI HIT inclubation chamber	TOKAI HIT	TIZSH