JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Gennem Looking Glass: Time-lapse mikroskopi og Longitudinal Tracking af enkelte celler til at studere antikræftmidler

Published: May 14, 2016
doi:
10.3791/53994
,
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology,University of Colorado, Boulder

Summary

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Abstract

Responset af enkeltceller til anticancerlægemidler bidrager væsentligt til at bestemme befolkningen reaktion, og derfor er en væsentlig medvirkende faktor i det samlede resultat. Immunoblotting, flowcytometri og faste celle eksperimenter er ofte anvendt til at undersøge, hvordan celler reagerer på anticancerlægemidler. Disse fremgangsmåder er vigtige, men de har flere ulemper. Variation i narkotika reaktioner mellem kræft og normale celler, og mellem celler af forskellig kræft oprindelse og forbigående og sjældne reaktioner er vanskelige at forstå at bruge befolkning gennemsnitsperioder analyser og uden at kunne direkte spore og analysere dem på langs. Mikroskopet er særlig velegnet til at afbilde levende celler. Fremskridt inden for teknologi gør det muligt at rutinemæssigt billeddata celler ved en beslutning, som muliggør ikke kun cellesporing, men også den observation af en række cellulære responser. Vi beskriver en fremgangsmåde i detaljer, der giver mulighed for kontinuerlig time-lapse billeddannelse afceller under lægemiddelrespons til væsentlige så længe som ønsket, typisk op til 96 timer. Brug af variationer af fremgangsmåde kan celler overvåges for uger. Med ansættelsen af ​​genetisk kodet fluorescerende biosensorer mange processer, veje og reaktioner kan følges. Vi viser eksempler, der omfatter sporing og kvantificering af cellevækst og cellecyklusprogression, kromosom dynamik, DNA-skader, og celledød. Vi diskuterer også variationer af teknikken og dens fleksibilitet, og fremhæve nogle almindelige faldgruber.

Introduction

Live-cell mikroskopi og langsgående sporing af enkeltceller er ikke en ny teknik. Fra de tidligste mikroskoper, har entusiaster og forskere observeret og studeret enkelte celler og organismer, deres adfærd og udvikling 1-3. Et berømt eksempel fra slutningen David Rogers på Vanderbilt University i 1950'erne viser en menneskelig neutrofil i en blod udstrygning jagter en Staphylococcus aureus bakterie og til sidst processen med fagocytose 4. Denne live-cell film er en glimrende illustration af, hvordan flere processer kan observeres og korreleres i et enkelt forsøg: sansning af en kemisk gradient, mekanikere og hastigheden af ​​cellemotilitet, celleformer dynamik, adhæsion og fagocytose af et patogen.

Fremkomsten af ​​fuldautomatiske mikroskoper og meget følsomme digitale kameraer har resulteret i et stigende antal efterforskere bruger mikroskopi til at stille grundlæggende spørgsmål i cellebiologi spænder from hvordan celler bevæger 5,6 og dividere 7,8 til organel dynamik og membran menneskehandel 9-11. Ikke-fluorescerende, lysfelt mikroskopi, herunder fase-kontrast (PC), der høstede Nobelprisen for Frits Zernike i 1953, og differential interferens kontrast (DIC) giver mulighed for observation af celler og kerner, men også sub-cellulære strukturer, herunder bundter mikrotubuli , kromosomer, nucleoli, organel dynamik, og tykke actin fibre 12. Genetisk indkodede fluorescerende proteiner og udvikling af fluorescerende farvestoffer mod organeller har dramatisk påvirket tidsforskudt mikroskopi 13-15. Selvom det ikke er i fokus i denne artikel, billedbehandling i celle sfæroider og in situ (intravital mikroskopi) ved hjælp af konfokal og multifoton mikroskopi repræsenterer en anden udvidelse af tilgang, og der er udestående artikler, der bruger og diskutere disse tilgange 16-19.

Svarene fra celler til anti-CancER narkotika eller naturlige produkter bestemmes på det molekylære og cellulære skala. Forståelse celle responser og skæbner efter behandling indebærer ofte befolkningens gennemsnitsperioder assays (f.eks., Immunoblotting, hele såvel foranstaltninger), eller faste tidspunkter med immunfluorescent afsløring og flowcytometri, der måler enkeltceller. Heterogenitet encellede reaktioner på lægemidler inden for en population, især i tumorer, kan forklare nogle af variabiliteten i respons set på tværs af cellelinjer og tumorer, der behandles med det samme lægemiddel ved mætning. Langsigtet langsgående tilgange til at følge en given enkelt celle eller en population af celler er et mindre almindelig men meget kraftfuld tilgang, der giver mulighed for direkte undersøgelse af molekylære respons pathways, forskellige fænotyper (f.eks., Celledød eller celledeling), observation af celle-til-celle variation i en population, og hvordan disse faktorer bidrager til befolkningens respons dynamik 20-22. Optimistisk, at kunneat observere og kvantificere encellede svar vil hjælpe med at forbedre vores forståelse af, hvordan lægemidler virker, hvorfor de undertiden mislykkes, og hvordan man bedst bruger dem.

Teknikken med langsigtet time-lapse mikroskopi, langsgående sporing og analyse af lægemiddelkandidater responser er tilgængelig for mange forskere, og kan være enkel, der kun bruger transmitteret lys at observere fænotype responser 20,21. De vigtigste komponenter i tilgangen omfatter: passende forberedelse af cellerne af interesse, et automatiseret mikroskop med klimakammer, et kamera integreret med en computer til at erhverve og gemme billederne, og software til at gennemgå time-lapse og måle og analysere cellerne og eventuelle fluorescerende biosensorer. Vi giver en detaljeret protokol med mange tips til udførelse time-lapse mikroskopi af dyrkede celler, så længe flere dage ved hjælp lysfelt og / eller vidvinklede epifluorescens mikroskopi. Denne protokol kan anvendes til enhver cellelinie, der kan dyrkes i kulturat studere deres reaktioner på anti-behandlinger mod kræft. Vi giver eksempler på data indhentet og analyseret ved hjælp af flere forskellige genetisk kodet fluorescerende biosensorer og et eksempel på fase-kontrast mikroskopi, kort diskutere forskellige typer af sonder, fordele og ulemper ved længerevarende time-lapse og langsgående sporing, hvad der kan være lært til denne tilgang, der er svært at forstå fra ikke-direkte tilgange, og nogle variationer, som vi håber vil være af interesse og værdi for uerfarne forskere, der ikke har overvejet at bruge tilgang, og til erfarne forskere.

Protocol

Følgende protokol anvender parametre defineret af eksperimenterne i figur 4 og 6 om indstillinger erhvervelse og forsøgsbetingelserne. Mange af disse parametre kan ændres til at passe andre eksperimenter (dvs. eksponeringstider, binning, fluorescerende kanaler, osv.). Alle procedurer skal overholde institutionelle retningslinier og regler, og skal godkendes af den institutionelle biosikkerhed udvalget. Mikroskop producenten hjemmesider indeholder gode oplysninger fo…

Representative Results

Langsigtet time-lapse mikroskopi og direkte langsgående sporing muliggør studiet af mange anti-cancer virkninger under lægemiddelrespons. Efter den generelle omrids i figur 1, er flere eksempler på celler vist udtrykker validerede fluorescerende journalister, at behandling med anti-cancer medicin, spores, og analyseret ved hjælp af forskellige metoder. Fase kontrast mikroskopi alene er meget informativ og…

Discussion

Fordele ved Time-lapse mikroskopi og Longitudinal Tracking

Mikroskopet er et ideelt instrument for longitudinelle studier af narkotika respons, da det giver efterforskere til at spore de enkelte celler og deres skæbner samt hele befolkningen. Variabilitet i lægemiddelrespons i en population af celler er et stort problem for anti-cancer terapeutisk design. Longitudinal sporing af enkelte celler giver efterforskerne at overholde denne variation og begynde at forstå de under…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

Materials

Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
35mm dish, 20mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
35mm 4 well dish, 20mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
35mm dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
Olympus IX2-UCB controller Olympus
PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
Nikon Eclipse Ti Nikon
Nikon laser launch Nikon
SOLA light engine lumencor
iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
  2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
  3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
  4. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, . Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
  5. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
  6. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
  7. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
  8. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
  9. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
  10. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
  11. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
  12. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
  13. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
  14. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  15. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
  16. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
  17. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
  18. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
  19. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
  20. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
  21. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
  22. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
  23. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
  24. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
  25. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
  26. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  27. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
  28. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  29. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  30. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
  31. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
  32. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
  33. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
  34. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
  35. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  36. D’Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
  37. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
  38. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
  39. N’Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
  40. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
  41. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
  42. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
  43. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
  44. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
  45. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
  46. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  47. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
  48. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
  49. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., Robinson, J. .. . P. a. u. l., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. 66, (2013).
  50. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  51. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
  52. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
  53. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

Tags

Time-lapse MicroscopyLongitudinal TrackingSingle CellsAnti-cancer TherapeuticsCell CultureHT1080 CellsEnvironmental ChamberTemperature ControlHumidity ControlMicroscopy SetupImaging ConditionsPhoto ToxicityWavelengthsTime-lapse Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image