Зазеркалье: Покадровый Микроскопия и Продольная Отслеживание отдельных клеток для изучения анти-терапии рака
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
Реакция отдельных клеток к противоопухолевых препаратов в значительной степени способствует в определении отклика населения, и, следовательно, является одним из основных факторов в общий результат. Иммуноблоттинг, проточной цитометрии и неподвижные клеточные эксперименты часто используются для изучения того, как клетки реагируют на противораковые препараты. Эти методы очень важны, но они имеют ряд недостатков. Изменчивость в ответах наркотиков между раком и нормальными клетками и между клетками различного происхождения рака, и переходных и редких ответов трудно понять с помощью усреднения населения анализов и не имея возможности непосредственно отслеживать и анализировать их в продольном направлении. Микроскоп особенно хорошо подходит для получения изображений живых клеток. Достижения в области технологии позволяют нам регулярно печатали изображения клетки при разрешении, что позволяет не только отслеживать клеток, но и наблюдение различных клеточных реакций. Описывается подход к деталям, что позволяет за время непрерывной покадровой визуализацииклеток во время реакции лекарственного средства для по существу до тех пор, как хотелось бы, как правило, до 96 часов. Используя вариации подхода, клетки могут быть проверены в течение нескольких недель. С занятости генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоры многочисленных процессов, путей и ответы могут быть соблюдены. Мы покажем примеры, которые включают отслеживание и количественного клеточного роста и прогрессии клеточного цикла, динамика хромосом, повреждения ДНК и гибель клеток. Мы также обсудим варианты техники и ее гибкости, а также выделить некоторые общие подводные камни.
Introduction
Live-клеточная микроскопия и продольное отслеживание отдельных клеток не является новой техникой. С самых ранних микроскопов, энтузиасты и ученые наблюдали и изучали отдельные клетки и организмы, их поведение и развитие 1-3. Известный пример с конца Дэвид Роджерс в Университете Вандербильта в 1950 – е годы показывает человека в нейтрофильный мазке крови чеканка бактерии золотистый стафилококк и в конечном итоге процесс фагоцитоза 4. Этот живой-элементная фильм является прекрасной иллюстрацией того, как множественные процессы можно наблюдать и коррелировать в одном эксперименте: зондирование химического градиента, механики и скорости подвижности клеток, клеток формирует динамику, адгезию и фагоцитоз патогена.
Появление полностью автоматизированных микроскопов и высокочувствительных цифровых камер привело к увеличению числа исследователей с помощью микроскопии задавать фундаментальные вопросы в клеточной биологии в диапазоне Fром , как клетки перемещаются 5,6 и 7,8 разделить на органелл динамику и мембранном 9-11. Нефлуоресцентной, светлого микроскопии, в том числе фазового контраста (ПК), которая получила Нобелевскую премию по Цернике в 1953 году, и дифференциального интерференционного контраста (DIC) позволяют для наблюдения клеток и ядер, но и субклеточных структур, в том числе микротрубочек пучков , хромосомы, ядрышки, органелл динамика, и толстые волокна актина 12. Генетически кодируемые флуоресцентные белки и развитие флуоресцентных красителей против органелл резко повлияли замедленную микроскопию 13-15. Хотя не в центре внимания данной статьи, изображения в клеточных сфероидов и на месте (прижизненной микроскопии) с использованием конфокальной и многофотонной микроскопии представляют собой еще один расширение подхода, и есть выдающиеся статьи , которые используют и обсудить эти подходы 16-19.
Реакции клеток на анти-Канкунеэр препараты или натуральные продукты определяются на молекулярном и клеточном уровне. Понимание клеточные ответы и судьбы после лечения часто включает в себя демографические анализы усреднения (например., Иммуноблоттинг, целые меры а) или фиксированные моменты времени с обнаружением иммунофлуоресцентного и проточной цитометрии, которые измеряют отдельные клетки. Неоднородность в единичных ответах клеток на лекарственные средства в популяции, в частности, в опухолях, может объяснить некоторые из изменчивости в ответ наблюдается вдоль клеточных линий и опухолей, которые лечат тем же лекарством при насыщении. Долгосрочные продольные подходы следовать заданной одной ячейки или популяции клеток является менее распространенным , но очень мощный подход , который позволяет непосредственного изучения путей молекулярного ответа, различные фенотипы (например., Гибель клеток или деление клеток), наблюдение от клетки к клетке изменчивость в популяции, и каким образом эти факторы способствуют динамики реагирования населения 20-22. Оптимистично, будучи в состояниинаблюдать и количественно одиночные клеточные ответы поможет улучшить наше понимание того, как препараты работают, почему они иногда терпят неудачу, и как наилучшим образом использовать их.
Методика долгосрочного покадровой микроскопии, продольного отслеживания и анализа ответов наркотиков доступно для многих исследователей и могут быть простыми, используя только проходящем свете для наблюдения фенотип ответы 20,21. Основные компоненты подхода включают в себя: соответствующий препарат клеток, представляющих интерес, автоматизированный микроскоп с климатической камерой, камера интегрирована с компьютером для получения и хранения изображений, а также программное обеспечение для обзора времени покадровой и измерения и анализа клеток и любые флуоресцентные биосенсоры. Мы предоставляем подробный протокол с большим количеством советов для проведения покадровой микроскопии культивируемых клеток, пока несколько дней с использованием светлого и / или Widefield эпифлуоресцентной микроскопии. Этот протокол может быть использован для любой линии клеток, которые можно выращивать в культуреизучить их ответы на анти-терапии рака. Мы приводим примеры данных, полученных и проанализированных с использованием нескольких различных генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры и пример фазово-контрастной микроскопии, кратко рассмотрим различные типы зондов, преимущества и недостатки долгосрочного покадровой и продольного слежения, что может быть узнал такого подхода, который трудно понять из непрямых подходов, а также некоторые варианты, которые мы надеемся, будет представлять интерес и ценность для неопытных исследователей, которые не считаются с использованием подхода, а также для опытных исследователей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Преимущества Интерв микроскопией и Продольный слежения
Микроскоп является идеальным инструментом для продольных исследований реакции лекарственного средства, поскольку это позволяет исследователям отслеживать отдельные клетки и их судьбы, а также все насе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
References
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
- Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
- van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, . Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
- Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
- Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
- Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
- Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
- Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
- Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
- Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
- Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
- Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
- Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
- Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
- Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
- Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
- Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
- Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
- Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
- Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
- Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
- Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- D’Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
- Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
- Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
- N’Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
- Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
- Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
- Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
- Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
- Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
- Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
- Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
- Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., Robinson, J. .. . P. a. u. l., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. 66, (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
- Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
- Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).
