Abstract
上皮至间质转变（EMT）描述的上皮转分化成间充质的过程。 EMT是也通常发生在胶质母细胞瘤，最常见的恶性脑肿瘤胚胎发育过程中的基本处理。 EMT也已在脑外多种癌包括乳腺癌，肺癌，结肠癌，胃癌观察。 EMT是通过促进迁移，侵袭和转移形成集中挂恶性肿瘤。 EMT诱导的机制尚未完全清楚。在这里，我们描述了皮层神经干细胞（NSCs）和随后的EMT诱导的标准化隔离的体外系统。这个系统提供了以使用单细胞或外植体培养的灵活性。在这个系统中，大鼠或小鼠胚胎前脑的神经干细胞是在限定的培养基中培养，不含血清和酶。的神经干细胞表达Olig2的和SOX10两个转录因子在oligodendroc观察YTE前体细胞（OPCs的）。使用这个系统，FGF-，BMP-和之间的相互作用的TGFβ信号传导涉及ZEB1，ZEB2，观察TWIST2哪里的TGFβ-活化显著增强细胞迁移，这表明有协同BMP-/TGFβ-相互作用。结果指向FGF-，BMP-和TGFβ-信令网络，以参与EMT诱导和维持。这个模型系统相关的体外研究EMT。它是具有成本效益的和显示出高再现性。它也允许对不同的化合物相对于它们的迁移响应（定量距离测量），和化合物抑制或增强EMT（定性测定）的高通量筛选的比较。因此，该模型是非常适合于测试药物库影响EMT物质。
Introduction
在胚胎发育的几个阶段，上皮细胞失去强粘附到彼此（ 例如，紧密连接），并获得在这个过程被称为上皮至间质转变（EMT）1迁徙表型。 EMT需要形成额外的细胞类型，如间充质神经嵴细胞，一个人口从神经上皮2偏析。 EMT是不在胚胎阶段只有必要的，但还需要在成年生命的后期阶段保持在成年生物体的生理过程，如伤口愈合3和中枢神经系统（CNS）的再生在脱髓鞘病灶4。
上皮性肿瘤是众所周知的激活EMT作为迁移，侵袭和转移引发步骤，最终导致癌症的发展1,3。 EMT确实集中连接到强大的迁移1,3。 C的细胞的步骤onditioning，发起，接受和维持EMT尚不完全清楚，需要进一步调查。
在此，提出了一种基于神经干细胞的标准化体外 EMT模型系统，以确定生长因子和媒体（无血清和无酶的使用）。这个模型系统是在EMT工作的科学家的相关性。蜗牛，瑞伯和Twist蛋白家族已被证明是既在发育和疾病1为EMT的关键。蜗牛，瑞伯和扭曲的家庭也参与所提出的系统。该系统是基于通常不经历EMT提供一个特别的优点为初始事件的EMT诱导时研究的前脑的特定区域。
该模型系统可能被用于研究在CNS外上皮EMT，由于关键的EMT诱导剂，如蜗牛，瑞伯和扭曲的蛋白质，也都EMT期间在CNS外组织系统中发现的。该型号System使神经干细胞的分离标准化来自发展中国家皮质学习一般干细胞的功能和EMT尤其如此。使用该系统，我们分离的神经干细胞，诱导的EMT和研究FGF2和BMP4的作用下随后的迁移。我们观察到，FGF-和BMP-信令相互作用与TGFβ-信令以促进细胞迁移，从而验证该模型的系统。
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Protocol
所有动物的程序遵循指南“实验动物的护理和使用”（NIH出版， 第 8版，2011）和巴塞尔的动物福利委员会（用于动物的护理和使用瑞士准则）获得批准。通过这些准则的动物协议被认为是“最严重的动物品位”的。
1.膨胀培养基的制备
注：在无菌条件下的标准组织培养工作。
- 取两个15毫升管，加入5 ml L-谷氨酰胺的DMEM / F12（1：1）从500毫升培养基瓶到每个两个15毫升管中。到的前15毫升管中，添加50毫克人脱辅基转铁蛋白，腐胺1M的股票（0.1毫终浓度）的50微升和硒酸钠500μM的股票（最终浓度为30nM）的30微升。
- 通过0.2μm注射器过滤成原来的DMEM / F12瓶过滤。
- 到第二15ml试管中，添加12.5毫克胰岛素。加6 - 9滴1M的氢氧化钠。涡旋以完全溶解的胰岛素。通过0.2μm注射器过滤成原来的DMEM / F12瓶过滤。
注意：氢氧化钠是有毒和腐蚀性。使用防护手套，外套，和护目镜。 - 5毫升青霉素（10,000单位/ ml）/链霉素（10,000微克/毫升）/两性霉素B（25微克/毫升）添加到DMEM / F12培养基瓶。
- 加入5毫升的200mM L-谷氨酰胺股票刚解冻或寡肽含有谷氨酰胺（200mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽）的DMEM / F12培养基瓶。
- 摇匀。准备50毫升等分。
注意：膨胀介质可以在4℃贮存至少2周。相比保持在500毫升的瓶子分装中显示管少pH值的变化。
2.传代培养基的制备
- 以1升的Ca 2+ -和Mg 2 2+ HBSS媒体，添加990.85毫克葡萄糖（5毫摩终浓度）和840.10毫克碳酸氢钠 注意：传代培养基可在4℃贮存至少4周。
3.生长因子的制备
- 制备无菌1×PBS中的1％BSA（PBS-BSA）的单独或与在4mM的PBS（PBS-BSA-HCl）的盐酸（HCl）。
注意：盐酸是腐蚀性和毒性，需要特殊的安全措施（大衣，护目镜，手套，头罩）。 - 解散10微克/毫升重组人成纤维细胞生长因子2（rhFGF2）在PBS-BSA（10毫微克/毫升终浓度），10微克/毫升的重组人骨形态发生蛋白4（rhBMP4）在PBS-BSA（10毫微克/毫升的最终浓度），和20μg/ ml重组人转化生长因子β1（rhTGFβ1）在PBS-BSA的盐酸（40纳克/毫升最终浓度）。
- 不要过滤消毒。准备等分。
注：生长因子等份可以储存在-20℃，至少2年。
- 不要过滤消毒。准备等分。
4.涂料细胞培养皿中
- 溶解1,875毫克的聚L-鸟氨酸在500毫升（巴解组织）蒸馏水2 O准备了250X巴解组织的股票。过滤消毒用0.2μm注射器过滤器和将2毫升分装。
注意：这些等分试样可被储存在-20℃下至少2年。 - 溶解1毫克牛纤维粘连蛋白在1毫升无菌蒸馏水2 O准备纤维连接蛋白1000倍的股票。不要涡旋因为这可能会凝结成块的黏蛋白。轻轻摇动用手10分钟。
- 孵育在室温下偶尔摇动1小时。检查完全溶解。温热该溶液至低于37℃，纤连蛋白的完全溶解。不要过滤，消毒。
注意：溶液可以被存储在4℃下长达6个月。
- 孵育在室温下偶尔摇动1小时。检查完全溶解。温热该溶液至低于37℃，纤连蛋白的完全溶解。不要过滤，消毒。
- 如需要使用的等离子预处理塑料细胞培养皿（100毫米或其它尺寸本实验）。为了评估迁移，使用35毫米菜肴500微米的网格。过夜用2ml 1X PLO在37℃下在5％CO 2的组织培养箱中孵育菜肴12小时。用2ml 1×PBS中洗两次。
- 在37℃下加入2毫升1×纤连蛋白（1微克/毫升终浓度）孵育菜肴最少12小时的，在5％CO 2的培养箱中。刚电镀细胞之前删除纤维连接蛋白。
注意：纤连蛋白包被的培养皿可以在37℃下贮存至少2周。
5.标准化的解剖和皮质下区的准备（SVZ）
- 获得大鼠胚胎14.5天（E14.5，只SD）和小鼠E13.5（C57BL / 6）通过胚胎定时交配。交配18:00动物，直到第二天早上08:00。交配后的一天中午被认为是E0.5。
- 麻醉孕动物，用5％异氟醚和0.8升/分钟的氧气流。通过检查用锋利的爪子迪斯响应压缩挠度镊子。斩首动物。避免二氧化碳窒息的CO 2会影响干细胞的恢复。
- 检索剖腹产胚胎。
- 将动物仰卧位和消毒用70％乙醇的皮毛。使用外科镊子和剪刀使约8cm V形皮肤切口在子宫上方的下腹部。切开只有皮毛，同时保持肌肉的墙壁完好无损。
- 使用新鲜镊子和剪刀切开肌肉和腹部肌肉壁进入腹膜。
- 识别在下部后腹膜子宫。从周围组织被删除锐性分离子宫。
- 洗用无菌1×PBS中的胚胎并置于冰冷的1×PBS中的子宫。
- 用细尖的剪刀剪开子宫壁由胚胎解剖显微镜下释放胚胎（放大3倍， 图1B）。用一对镊子除去胚胎船体（
- 由显影大鼠神经系统5的图谱验证正确的发育阶段。正确的胚胎尺寸示于图1B。
- 通过如在图1A中所示的鼠前肢（佛罗里达州）的开头位形成的存在下进一步检查正确的年龄。
注意：后肢（HL）尚未显示数字的分离（ 图1B）。
- 对于剥离，转移胚胎充满了冰冷的1X PBS无涂层的培养皿。使用高压细镊子立体解剖显微镜（3X到20X倍）下进行清扫。
注意：培养皿中防止组织与餐具表面的附着，与等离子涂层细胞培养皿可能发生。削尖的钨丝，针或类似也是夹层的某些步骤有帮助。 - 取出头部皮肤及颅骨开始在INTE通过以获得显影神经管（ 图1C）前方和后方的两个镊子同时拉动显影端脑（TEL）和间脑（DI）（ 图1B）的rsection。
- 确定中脑-后脑边界（MHB，黑色箭头图1B-D），分离从菱脑的中脑（MES）。切菱脑只是在或低于MHB（ 图1D，三角形箭头）。
注：在MHB额外的皮下空间有利于去除皮肤，而不伤害神经管。 - 在断绝颅底与面部骨骼（ 图1E）端脑/间脑之间的连接。这导致含端脑，间脑和中脑（TEL-DI-MES）（ 图1F-H）的块。
- 传送TEL-DI-MES块进入膨胀介质在冰上。保持完满成功伊利浑身膨胀介质在未涂布培养皿。握住块在一双镊子的脑，以免触及包含与神经干细胞皮质SVZ端脑。
- 重复步骤5.5至5.8的所有的胚胎（ 图1F-H）。
- 转移一个TEL-DI-MES块到新鲜的冰冷的1X PBS。沿于前脑（ 图1F-H）中的虚线切割，从间脑分离脑， 如图1I。
- 通过沿图1F中的虚线切割从TEL分开的DI。参见图1J隔离端脑。
- 拆分两个端脑半球，沿着图1J的虚线切割。这导致两个分离的半球， 如图1K所示。
注：左半球如图1L放大。 - 确定内侧团伙lionic隆起（MGE， 图2A; *）和横向神经节隆起（LGE， 图2A +）通过椎间孔未来可见interventriculare。
- 使用镊子或针，沿着在MGE和LGE和前皮层（蚂蚁-CTX， 图2B）之间的交叉点的直线解剖。通过皮质，海马（臀部）和脉络丛（CP）的切割直线。这个分离前皮层包括来自神经节隆起嗅球（OB）（GE， 图2B，C）。
- 在尾神经节隆起（CGE， 图2C，D）和后皮层（ 图2C）的交叉点切的第二直线，通过皮层，海马和脉络丛再次切割。
- 扁平化端脑。完全除去后极和嗅球（ 图2D）。鉴定含有海马和脉络丛（ 图2C）皮质下摆，如先前6,7限定。
注意：海马具有比皮质较薄神经上皮。该CP含红船。- 从皮层分离皮质下摆，而使皮质相同于神经节隆起（ 图2D）的大小的大小。这导致皮质（靶组织）和神经节隆起（GE， 图2D）的块。
- 翻转与心室（内）侧与餐具表面皮层-GE块。
注意：半球的外表面将面对实验者（ 图2E）。上的外表面是血液的容器中，脑膜（ 图2E）。- 针脚的GE用左手盘表面，并与在右侧（显性）手用镊子剥离脑膜关闭（ 图2F 注：这是技术上最苛刻的步骤，因为脑膜强烈坚持皮质。从皮层脑膜的分离是通过切割在步骤5.13.1和5.14完全直线（未锯齿状）促进。
- 重复步骤5.12到5.16的另一半球，所有的胚胎。切割沿LGE皮层在LGE（ 图2G，2H）一半的主直径的距离。解剖皮质跨越1.2毫米x 2.4英寸毫米（ 图2H）的面积，包括与神经干细胞在SVZ /生发层。
6.准备外植体培养的
- 切皮质成直径小于400微米（ 图2I）的外植体。使用定位在解剖培养皿下列参考（ 图2H和2I）400μm的格子（ 补充图1）。全部转让植到一个新的培养皿冰协LD膨胀介质。
- 从组织培养皿（步骤4.4）拆下纤维连接蛋白。允许它干。 1毫升冷膨胀介质的添加到35mm培养皿以10毫米×10毫米（ 图3）的网格尺寸的中心。允许介质中以形成一个球形下降（ 图3）。
- 插入多达8个外植体以液滴的中心。外植体应坐落于电网与迁移分析相互之间至少有3毫米的距离（见第8节）。
- 孵化菜用于在细胞培养孵化器外植体的附着约1小时（37℃，21％O 2，5％的CO 2）。允许外植体沉降并附着在纤连蛋白涂覆的表面。不要摇晃的菜，因为植体分离和移动优化电网中心的。
- 孵育1小时后（37℃，21％O 2，5％的CO 2），该盘填满至2ml膨胀介质的总体积加生长˚F行动者或感兴趣的物质的测试和孵化。
注意：无论是酶消化，也不是血清或离心所必需的外植体的准备。这是最佳的细胞完整性。
7.准备NSC单细胞培养
- 预热在37℃扩张和传代网上平台。
- 传送解剖皮质片（从步骤5.17）放入15毫升管与冷膨胀介质（管A）。离心机皮质片5分钟，在1200×g的。吸出上清液。加入200μl预热的膨胀介质悬浮皮质件。
- 加入700μl预热的传代中至15毫升管与P1,000头（管A）。轻轻重悬沉淀。将吸头在15ml试管的底部。通过与P1,000尖端抽吸三次轻缓地解离组织片。
注意：传代培养基促进细胞分离，并且需要避免使用酶。 - 允许管坐30到60秒，大（重）未解离片底部定居。单离解的细胞将保留在上清液中。转约700微升的上清液至新鲜15ml试管（试管B）。
- 重复步骤7.3和7.4以解离大块。
- 重复步骤7.3和7.4的第二时间以解离较大的碎片。全部转移到上清新鲜15ml试管（管B）。
- 膨胀介质添加到5毫升的总体积。算使用血球细胞。通过台盼蓝染色评估死细胞。
注：小神经干细胞容忍的步骤7.2至7.6比大细胞更好。从10胚胎期望约4×10 6个细胞，用10％的死细胞。 - 为神经干细胞的扩张，板在8ml膨胀介质的体积每10cm纤连蛋白包被的组织培养皿1.5×10 6个细胞。对于标准的扩展，加入8微升的1000倍rhFGF2股票。添加8微升rhFGF2每天改变我直径隔日1次。
注：在这个发展阶段的皮层中含有大多数的神经干细胞，只有分化细胞的少数。分化的少数细胞不给rhFGF2处理响应，并扩大培养过程中死亡。 - 通路扩大的神经干细胞在60％汇合。
- 要通过神经干细胞，取出扩张中。洗涤细胞迅速三次用5毫升传代网上平台。等待2 - 4分钟。不含Ca 2+和Mg 2+的细胞从表面慢慢脱落，向上舍入。验证阶段显微镜下的细胞脱离。再等几分钟，如果需要的话，直到表面视觉支队观察。
注意：单细胞就会完全分离，但多数仍细胞将坚持与餐具表面。需要分离的持续时间依赖于纤连蛋白涂层的持续时间。短纤维连接蛋白涂层（12小时或更少）导致更快的细胞脱落。对于较长的实验（>; 1周）超过24小时的纤连蛋白涂层建议。
- 要通过神经干细胞，取出扩张中。洗涤细胞迅速三次用5毫升传代网上平台。等待2 - 4分钟。不含Ca 2+和Mg 2+的细胞从表面慢慢脱落，向上舍入。验证阶段显微镜下的细胞脱离。再等几分钟，如果需要的话，直到表面视觉支队观察。
- 用10毫升吸管轻轻从表面分离细胞。收集与细胞中的5毫升传代培养基，并将其转移到新鲜的15ml试管。有一个额外的5毫升传代中的重复。
- 离解在15ml试管中的细胞通过上下吹打三次，将10毫升吸管在管的底部。旋管15分钟，在室温下1200 xg离心。除去上清，悬浮于2ml膨胀介质中的颗粒。算使用血球细胞。使用台盼蓝评估死细胞。
注意：扩张至60％汇合后，期望4 - 5×10 6个细胞与死细胞计数在10％左右。 - 板每10cm培养皿进一步通路8×10 5个细胞。
8.迁移评估
- 对于迁移评估，根据第5种子植于植隔离35毫米电网菜肴。电镀后一小时，添加FGF2（rhFGF2）。将在37℃培养箱菜2天。
注：为了获得最佳的外植体附着，避免移动的菜肴。 - 由1000微升提示删除网上平台。由1000微升尖端起始于内圆（ 图3），加入2mL扩张介质。这降低了外植体的表面张力。
- 添加生长因子单独或根据需要组合进行实验。使用FGF2 / BMP4 /TGFβ1作为阳性对照。注意：在这个实验中，每35mm培养皿2微升FGF2，2微升BMP4和4微升TGFβ1分别单独和组合（ 图5）中加入。
- 添加额外的因子和/或测试的物质。保留菜在37°C 2天后再次触及。
- 采取上倒置显微镜外植体的照片。
注：生活外植体产生更好的相衬图像比固定细胞。两者都可以使用。 - 对于迁移评估，使用图形软件，使像素测量（ 如 ，斐济8）。
- 测量为500μm距离像素的菜格，并用它作为内部参考。
- 定义为外植体迁移起点的中心。测量外植体的中心和10个细胞的最外组之间的距离。
注：所有细胞迁移从植离心之遥。它们自发形成于下测试的情况下（ 图5）的周围的片。
9.评估入侵
- 根据协议第4制备纤连蛋白包被的组织培养的24孔板中。
- 将300微升温暖扩展介质进入细胞侵袭室顶好。孵育室在37℃，30分钟和5％ 的 CO 2。
- 除去从顶部以及膨胀介质和Boyden小室放置到涂覆24孔板。
- 添加500微升与rhFGF2 0.5和0.5μlrhBMP4至底部以及温暖膨胀介质的。
- 神经干细胞传代和第7节经文说明1至4计数都适合。
- 板5×10 5细胞以300μl暖膨胀介质与rhFGF2 0.3微升并在boyden小室的顶部以及0.3微升rhBMP4的体积。
- 培养24小时的神经干细胞种子。
- 添加额外的因子和/或检验的物质的腔室和培养的细胞另外48小时。
注意：如果细胞是侵入性的，它们将通过从顶部以及通过基底膜层的底部很好。侵入细胞会附着到Boyden小室的底部。 - 遵循由生产商提供的方案。用棉签（包含在侵袭测定试剂盒）通过清洗两次以除去在顶部以及非侵入性的细胞。
- 从孔中除去培养基并加入500μl膨胀介质与质膜染色活细胞，用核染料DAPI到孔中。
- 孵育在37℃下10分钟和5％ 的 CO 2。
注意：染料将分别纳入膜和侵入细胞的细胞核，以获得最佳的可视化8。选项：省略质膜染料如果多色免疫计划。 - 与染料取出培养基并用扩张中洗两次澡。可视化和先前8演示了一个倒置荧光显微镜计数侵袭细胞。
注意：某些侵袭性细胞可能已经从腔室的底部分离的，并已下降到低于它们粘到涂布表面，其中所述孔的表面。有关完整的分析，包括孔表面的细胞。 - 除去培养基并固定在冰 - 冷的新鲜的4％PFA的细胞10分钟。洗3次用1×PBS。上侵袭细胞进行免疫细胞化学，如前所述8-10。
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Representative Results
此EMT模型系统是基于对NSCs都为单细胞或作为从显影神经管的特定区域的外植体的标准化的隔离，中央皮质（ 图1和2）。对于量化考核，在植500微米格培养皿中（ 图3）的中心接种的权利。从中央皮质植体首先暴露于FGF2两天，随后在生长因子（ 表1）的不同组合的其他两天。我们开始与它比显影神经管的其它区域更大的皮质。我们观察到，在BMP4培养仅植呈迁移反应（ 表1和补充图2）。
确定的条件下进行了分析下一个podoplanin（PDPN）表达。 PDPN是跨膜小号已经在多种癌症11,12以及在神经干细胞8与入侵相关联ialomucin样蛋白。 PDPN表达细胞的比例高级别胶质瘤13增加。 PDPN还与较差的生存胶质母细胞瘤患者14相关联。此外，PDPN已经显示出是恶性进展的多种肿瘤，包括乳腺癌，肺癌，结肠癌15,16的标记。 PDPN是无论是在侵入以及迁徙的神经干细胞表达8。使用上述协议，PDPN表达与对照相比，FGF2只，在暴露于TGFβ1与单独BMP4或组合外植体。在所有BMP4和TGF-β1/ BMP4处理的外植体检测PDPN表达。与此相反，在对照植中观察到单独的FGF2或与TGFβ1单独（ 表2和图4）的外植体没有PDPN。另外一个游走型细胞BMP4和TGF-β1/ BMP4-诱导露出外植体，而对照外植体（仅FGF2）和TGFβ1单独没有显示迁移细胞（ 表1）。迁移细胞的观察提供了一种成本低，直接的定性评估。
此外，我们测试显影神经管的若干区域的迁移响应和EMT诱导BMP4（ 表2）。 400微米的外植体从中央皮质，后皮质（标记后极），所述MGE和中脑制备，如在图1中表示。外植体的所有暴露于FGF2两天，随后两天FGF2与BMP4 。迁移是由平游走细胞的外观采用了前缘和后缘（ 图5和图补充2）定义。游走细胞的诱导强从后皮质和来自MGE和MES的中间响应脑观察（ 表2）。中央皮层146植145显示，FGF2 / BMP4洄游响应。因此，中央皮质证实所有测试的植体（ 表2）的迁移细胞的最强大的诱导。 BMP4省略废除任何迁移反应（ 表1和2，数据未显示）。
对于生长因子效力的定量评估，在多种生长因子培养外植体测定迁移距离。外植体培养如上两天中FGF2，然后在FGF2额外两天没有因子（对照）或单或组合BMP4和TGFβ1。在控制植响应观察到FGF2强大的扩散，符合市场预期。将外植体从皮质SVZ来源并含有其已知响应于FGF2 17增殖有很大一部分的NSCs。控制CELLS达到689±14，TGFβ1的细胞582±49微米（ 图5）。该BMP4组表现出的935±91微米，平均迁移距离。在比较时，TGFβ1/ BMP4细胞迁移显著进一步，到1150±23微米（ 图5）。结果表明，BMP4被诱导FGF2暴露的神经干细胞的移植。这种迁移可以通过TGFβ1进一步增强。因此FGF2，BMP4和TGFβ1的组合是最有效的诱导的迁移。总之，细胞培养模型系统允许定性和定量迁移评估。
EMT已与转录因子（TF），如SNAIL1，Snail2，ZEB1，ZEB2，TWIST1，TWIST2在各种系统中，包括上皮癌，如乳腺癌，结肠癌，肺癌和也在脑瘤1,18。我们ħ广告曾表明，FGF2和BMP2或BMP4可诱发SNAIL1和Snail2 8,9。利用上述系统，我们研究了其他的EMT相关转录因子的表达水平。在TWIST1表达没有变化，可检测;与TWIST1处于FGF2曝光中表达水平低（数据未显示）。在细胞培养模型中观察到ZEB1和ZEB2的期间FGF2曝光和TWIST2的FGF2 / BMP4曝光期间的上调（ 图6）。
神经干细胞是公知的有助于少突胶质细胞前体细胞（OPCs的）8,19,20的人口。若干条证据表明，神经干细胞，尤其是OPCs可能是起源于神经胶质瘤21,22的小区。为了进一步表征上述模型中，我们调查的OPC标记物的表达。我们观察到，FGF2暴露的NSCs表现出Olig2的/巢蛋白的共表达ðSOX10 /巢蛋白在90％以上（ 图7）。这一观察结果表明，神经干细胞表现出我们的系统OPC的功能。事实上，随着Zeb'1和Zeb'2上调相关的OPC-特征（ 图6和7）。这些结果表明，FGF2膨胀推断的OPC的身份，由Olig2的和SOX10来判断，而在同一时间启动第一瑞伯基础的EMT的步骤。
图1： 标准化胚胎及中枢淋巴清扫术NSC分离和EMT感应。 （A）剖腹产后大鼠E14.5胚胎的左前肢。每个前肢数字被打上了黑色的箭头提示。注意：开始数字形成典型的E14.5。船体取出后（B）大鼠胚胎E14.5。注意哈希（＃）在背间脑W¯¯HICH是理想的去除开始皮肤/头骨原基。（C）皮肤/头骨已被去除大部分。除去未除去与皮肤之间的边界上标有两个三角形箭头。皮肤能向前方箭头和向后从后箭头剥离。（D）的皮肤/颅骨现已被完全除去。注中脑-后脑边界（箭头）和切割的缺口只是尾端它，标有一个箭头。（E）端脑，间脑，中脑（TEL-DI-MES）块从胚胎的其余部分去除（F）TEL-DI-MES块的高级视图。颅在左边。（G）立体图，从上面。（H）TEL-DI-MES块的劣质看法。（I）中脑和间脑的一部分是从端脑与间脑的前部分开。上图：这两个端脑泡的前视图。下图：右击ŧ脑的侧面，顶面颅（J）上图：两个端脑泡不间脑。劣质观点来说明彻底清除间脑的。 Asterisk的描绘MGE。下图：间脑的前部（K）上衣：两半球在纵裂分开。在左侧大脑左半球。 Asterisk的描绘MGE。加号描绘了LGE（L）与中位数观点左半球的放大倍率。右颅面，左尾部，顶部是背，腹底部分别。星号（*）位于MGE。加号（+）位于LGE。 CH，皮质下摆; FL，前肢;二，间脑; MES，脑; MHB，中脑，后脑边界; HL，后肢; LGE，外侧神经节隆起;梅兰日兰，内侧神经节隆起; OB，嗅球; PC，后皮质; RHO，菱脑;电话，端脑。每张图片上的网格显示厚2毫米线有四个交叉点细线每400微米。对所有图像比例尺：2毫米请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：从 标准化皮质SVZ清扫NSC分离和EMT感应。 （A）左脑的中位数视图。通过梦露的MGE和LGE的孔是可见的，由星号加号标记。（B）的嗅球只是颅的MGE-LGE的去除。（C）皮质的后极被删除仅次于CGE （D）顶部：皮质下摆从皮质分开。左：后极。中间：包含皮质和CGE-LGE-MGE块的中央部分复合物。 MGE和LGE面到右侧。右：嗅觉BUL湾（E）的CGE-LGE-MGE皮质块水平翻转。现在端脑的外表面朝向显微镜。 MGE和LG电子目前面临的左边。（F）微红脑膜从明亮的半透明皮层去除。咨询小组-MGE-LGE-CTX块现在翻转回到水平方向为相同的步骤被重复与右半球下一步骤。（G，H）。中央皮层分离从CGE-MGE-LGE街区之遥。请注意，是留在CGE-MGE-LGE块，标有两个箭头中间皮质区。该中间皮层厚度相当于LGE的直径的一半。代表LGE-CGE和大脑皮层之间的边界（I）虚线，中央大脑皮层分为直径小于400微米的外植体。比例尺：2毫米;每个图像网格显示2mm厚线，四个交点（细线）每400微米。星号（*）所位于的ŤMGE。加号（+）位于LGE。简称：ANT-CTX，前皮质; CEN-CTX，中央皮质; CGE，尾椎神经节隆起; CH，皮质下摆;厘泊，脉络丛; CTX，皮质; LGE，外侧神经节隆起;男人，脑膜;梅兰日兰，内侧神经节隆起; OB，嗅球; PC，后皮质。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3： 植播种到 35 mm网格细胞培养皿放置1毫升扩张介质在500微米格盘的中心。该降由网格轮缘（小箭头）含有。地方植右在1ml的滴的中心。如果外植体传播网外，申银万国IRL的菜在一个缓慢的圆周运动和植将移至由向心力的中心。注：外植体仅勉强可见的眼睛（黑箭头）。比例尺：35毫米。
图 4：PDPN在BMP 4 的存在下诱导植根据协议部分8（在FGF22天只，然后接着用因子FGF2指示）下培养。控制（A）（单独FGF2）和TGF-β1（C）外植体不包含PDPN阳性细胞（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）。 BMP4（B）和TGFβ1/ BMP4（D）的外植体显示出PDPN阳性细胞的比例很高。外植体中心是在左侧，在右侧的周缘。注意：PDPN阳性细胞大多founÐ在外围，而不是在外植体的中心。含有更平坦的TGFβ1/ BMP4外植体，更详细阐述PDPN阳性细胞（E）PDPN阳性细胞中的外植体在不同条件下的百分比来表示。控制和TGFβ1两者都是从与BMP4条件显著不同。手段显示±SEM。控制对 TGFβ1是不显著（纳秒）。控制和TGF-β1 与 BMP4：P <0.0001（***）。 TGFβ1 与 TGFβ1/ BMP4：P <0.0001（***）。 BMP4 与 TGFβ1+ BMP4不显著：P = 0.0981（NS）。控制与 TGFβ1+ BMP4：P <0.0001（***）。所有图像比例尺，如（A）所示：50微米请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 定量迁移评估。 BMP 4 和转化生长因子 β 对细胞迁移 1 显示效果的添加剂。植体根据协议第8（A）控制外植体。（B）外植体仅在BMP4培养。（C）外植体仅TGFβ1（D）植在在微米TGFβ1和BMP4的组合。（E）的迁移距离。的500微米网格被用作参考。控制和TGFβ1外植体显示出具有较大的外植体直径强烈的增殖比在其它条件。手段显示±SEM。请注意，BMP4和TGF-β1/ BMP4植部分瓦解植核和细胞从中移民离开离心。控制对 TGFβ1是不显著（纳秒）。与TGFβ1BMP4：P = 0.0353（*）。控制与 BMP4：P = 0.0351（*）。 BMP4 与 TGFβ1+ BMP4：P = 0.0372（*）。控制与 TGFβ1+ BMP4：P <0.0001（***）。比例尺：500微米。外植体中心有一个加号（+）标记。迁移细胞外缘标有三角箭头。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：。通过定量RT-PCR EMT相关的转录因子 EMT被链接到Zeb-和扭家庭的关键转录因子上调 （A，B）Zeb'1和Zeb'2是在第一阶段上调FGF2曝光的。（C）Twist'2是在塞康期间上调FGF2 / BMP4曝光d的阶段。根据定量RT-PCR相对表达水平示（N = 2）。在mRNA水平标准化为GAPDH。手段显示±SEM。在FGF2 mRNA的时期收获的第0天，进一步表达了后FGF24天收获，后来有一天在FGF2后/ BMP4 Zeb'1：控制与 FGF2，P = 0.0002 Zeb'2：控制与 FGF2，p = 0.0206 Twist'2：控制VS。 FGF2 + BMP4，p值= 0.003。
图 7： 神经干细胞显示在模型系统的OPC特征的神经干细胞被从中央皮层（根据第5部分）分离并以单细胞在FGF2的存在下进行培养。在培养8天（按7.9节4天之后通过）细胞形成的小NSC殖民地和进行染色Olig2的（红，B中，C），SOX10（红，在E，F）和巢（绿色，A，C，D，F）。细胞的高比例共同表达Olig2的/巢蛋白（AC）和SOX10 /巢蛋白（DF）。（G）Olig2的/巢和SOX10 /巢蛋白的共表达显示在所有细胞的百分比。手段显示±SEM。对于在（A）中所示的所有图像比例尺和（D）：20微米请点击此处查看该图的放大版本。
| 条件 | 共植 （中央皮层） | 与迁移反应植 | ％ | 与Podoplanin表达植 ％ | |
| 控制 | 33 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| TGFB1 | 21 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| BMP4 | 34 | 34 | 100 | 34 | 100 |
| TGFB1 + BMP4 | 22 | 22 | 100 | 22 | 100 |
表 1。 BMP 4和转化生长因子与 BMP 4β1 的结合 诱导鲁棒洄游响应。外植体从中央皮质保持在膨胀介质和FGF2，共四天。第一后两天，外植体或继续单独（对照）或FGF2和另外TGFβ1，BMP4或TGFβ1/ BMP4为组合接收FGF2。控制和TGFβ1-植既没有表现出迁移反应也不PDPN表达。 BMP4和TGFβ1/ BMP4诱导既迁移细胞以及PDPN表达在所有的外植体。
| 地区 | 共植 | 在 FGF2 / BMP4 迁移反应植 | ％ |
| 中央皮层 | 146 | 145 | 99.3 |
| 后皮层 | 52 | 48 | 92.0 |
| MGE | 56 | 29 | 51.7 |
| 脑 | 五3 | 28 | 52.8 |
表 2 中 。中央皮质显示了最强大的迁移响应FGF 2 / BMP 4植体来自发展中国家大鼠E14.5神经管不同区域制定：中央皮层，皮层后，内侧神经节隆起（MGE）和脑。所有的外植体在FGF2 / BMP4（第8）相同的培养。未经BMP4处理的外植体没有表现出任何迁移反应（数据未显示）。所有的外植体进行了筛选，每个外植任何迁移细胞的外观。所有地区都能够以FGF2与移民与响应BMP4。中央皮层，但是，显示出最强有力的反应。注意，BMP4被要求以诱导任何迁移细胞。在FGF2培养的外植体单独显示的增殖，但没有移民;与在单独FGF2（ 表1和补充图2）中没有观察到平迁移细胞。
补充图1 400微米网格文件。网格文件可以被打印并用作在上述清扫步骤的参考和示于图1和2。大路口代表2个毫米，400微米的细分。 请点击此处下载此图的PDF版本。
补充图 2。 BMP 4 -exposed植嘘流平游走细胞。 如图5所示细胞的放大倍率。（A）控制- （FGF2单独）和（C）TGF-β1-植演示了小圆形细胞强大的细胞分裂。（B）BMP4-和（D）TGFβ1/ BMP4-植一贯表现出扁平细长细胞。比例尺为所有图像，如（A）所示：100微米请点击此处查看该图的放大版本。
补充图 3。 为EMT调查。E14.5大鼠皮层中部体外 模型系统 的总结包含含NSC-SVZ。中央皮质要么üsed的作为外植片或作为单细胞。植片用于定量分析的迁移（第8条）更加方便。单个细胞适合于定性分析，例如基因或蛋白质分析（第9.13节）。
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Discussion
在这项研究中描述了EMT的分析利用神经干细胞的标准化系统（总结于补充图3）。标准化保证再现性（ 表1和2）。的神经干细胞被从显影皮质衍生的，通常不经历EMT的组织。这是有利的为在EMT早期步骤的分析。在EMT初始步骤不能充分研究中已积累的遗传改变，并且可以已经通过EMT的特征的肿瘤细胞。此外，原发肿瘤的样品是不理想的理解EMT因为大多数恶性肿瘤是异质含有侵入性和非侵入性的细胞。所提出的协议提供EMT的研究人员用一种新的模型来研究EMT诱导的早期步骤。这里，我们表明，瑞伯和扭家庭的关键EMT诱导剂被依次激活：在第一阶段ZEB1和ZEB2被上调，在第二阶段期间TWIST2（FIGURË6）。此前，我们已经表明，SNAIL1是BMP4曝光后8上调已经好几个小时。我们还显示，在BMP4曝光从中央皮层神经上皮干细胞分化成间充质细胞，积极为平滑肌肌动蛋白（SMA）和调宁9。上述结果完成先前的研究中表明，所有的三个已知的键EMT调节中涉及的系统。此外，我们观察到TGF-β1可以单独显著增强FGF2 / BMP4的迁移效果。这些结果指出EMT诱导过程中FGF-，BMP-和TGFβ-信号之间的网络。
对神经干细胞的EMT和迁移分析成功地分离出最关键的步骤是：正确识别胚龄，确定胚胎发育的解剖标志，准备新鲜的培养基和（至少过夜）涂层板，用细尖的仪器和亲每显影皮质的中央部的清扫建立皮层外植体。
所呈现的技术可通过一些修改来增强。如上面所建议的，多个外植体铺板于单个菜的网格。对于多种化合物的筛选，但是，它可能会更方便放置单个植于96孔平板的每个孔。此外，该模型系统可以细化用于大规模药物发现。如上所述，PDPN是因为PDPN在侵入性的神经干细胞8找到的新获得的迁徙功能的有价值的标记。一个PDPN记者在EMT诱导前的正常神经干细胞转染。作为结果PDPN表达细胞可以作为内部控制细胞转化，因为PDPN中不正常的神经干细胞（ 图4和表1）表示。另外还有几个NSC标记可用，如巢，被诱导EMT后8丢失。作为结果，两个初始状态下，“非迁移/非侵入性/巢蛋白+”表示，最后的状态，“迁徙/侵袭性/ PDPN +”，可以被监测，从而使自动药物发现。在具有多个孔（ 例如 ，96孔板，以及较大的）初始细胞大细胞培养板可被接种和既定的药物或没有已知功能的化合物进行处理。因此，多孔板可以自动扫描PDPN或其他迁移/侵袭标志物的表达。如果抑制剂是屏幕的主要对象，PDPN表达的消失可以帮助确定推定有趣的小说抑制化合物。
期间的新物质的试验外植体可能无法显示的迁移和/或外植体可向上舍和从盘分离。在这种情况下，最好是每天（代替隔日完全介质变化）仅改变媒体的一半。这种表面张力与新鲜培养基更换时能够减轻压力。该植可能不是最初电镀后附加。在这种情况下，纤连蛋白必须在与餐具表面接触至少36小时。用于涂布纤连应该不暴露新鲜配制到塑料管中超过10分钟，因为纤连蛋白可能粘到塑料。此外，将外植可能定居在网格之外。在这种情况下，最好是漩涡以缓慢圆周运动的菜。这允许外植体，以重新定位到由向心力（参见图3）的中心。
有强有力的证据表明胶质瘤来自神经干细胞衍生23,24神经干细胞和/或衍生的OPC。从INK4 / ARF缺陷小鼠Sampetrean 等人分离的神经干细胞和强制的H-的Ras 25的过表达：作为结果其他团体已NSCs的基础上建立胶质瘤生长模型。高档的恶性肿瘤导致的结果显示增殖和侵袭移植后25。 MCN奥尼尔等人用转基因小鼠也孤立的神经干细胞（两侧装接loxP皂苷Rb1，NF1，KRAS，PTEN的单独和组合）26。所述基因通过Cre的病毒感染灭活和神经干细胞移植26。这两个模型系统具有侵入可在体内和潜在的新的抗侵袭药物被监控的优点是可以进行测试。他们的主要缺点是，入侵的发病没有明确定义，目前尚不清楚该细胞是否显示胶质瘤典型EMT入侵（EMT基因）或仅局部迁移。进一步只有一种药物可以每只动物进行测试和分析需要几个星期。以确定一个新的抗侵袭药，医药公司需要（a）至筛选几千化合物或多个一次，（b）向复制试验和（c）尝试不同的药物浓度。要准备几千移植的动物，用不同的药物对待他们，最后测试组织化学或生物发光效果分析是非常消耗资源的。此处被描述为EMT相关的入侵的新型基于NSC-模型系统，使数以千计的化合物的成本有效筛选。
虽然此模型使化合物的高通量筛选，它仅仅是一个初级筛选平台。一旦感兴趣的化合物在该模型中被确定，他们将需要额外的验证。 体内测试是必要的用于识别的任何化合物的安全性和功效参数和移植模型按上述方法变得重要25,26。该模型也被事实，即它是基于啮齿动物细胞的限制。虽然该模型可用于研究大鼠或小鼠EMT，如果相同的机制是在人细胞或人患者的地方，目前尚不清楚。还需要进一步的实验来调查，如果神经干细胞不仅在体外侵袭，而且移植后。若干条证据支持神经干细胞的作用在神经胶质瘤的形成。胶质瘤进展已链接到下列基因：韧粘素C，Hey1，SPARC SNAIL1和Snail2，FGFR + BMPR1A，EGFR，PDGFRβ，SOX2，Podoplanin，的Gli3和P75NGFR 8。所有这些基因的正常的非侵入性的神经干细胞的侵入细胞间质8的转型过程中也表达。当时之中，目前还不清楚是否神经干细胞可以转化成由唯一的外部生长因子的肿瘤。
从不同的肿瘤肿瘤起始干细胞（国际信托）已被分离并用作模型来理解肿瘤进展27。国际信托，然而，不适合于EMT分析，因为EMT并已经发生在国际信托27。理解的EMT诱导早期和晚期也步骤，就需要一个初级非肿瘤细胞群。理想的情况是这个人口并不意味着首先要经历EMT。它先前已表明，胚胎神经干细胞是合适的人选为此9,28。也就是说，迁移和侵袭可能由FGF2和BMP4 9,28神经干细胞被诱导。 FGF2 / BMP4诱导的迁移是有关单EMT相关基因，然而，缺乏完整的证据，因为关键EMT家庭瑞伯和扭尚未研究8。上述结果表明，四种因子的特定组合，FGF2，BMP4，TGFβ1与胰岛素导致非常强的和完整的EMT诱导，而不是之前观察到。目前的研究表明，Zeb-和扭家庭的关键EMT基因也上调。因此，本研究首次提供了证据表明，没有单个基因的选择性上调，但结果表明，所有关键EMT家庭都在建议的细胞培养系统中有效。
EMT也已在脑的外上皮癌，如肺癌，乳腺癌，结肠癌和胃癌29观察到。一些模型来研究EMT在使用这些肿瘤30-32，这来，但是，与显著局限性：（1）携带多个遗传和表观遗传改变33转化的肿瘤细胞系的使用;识别EMT的抑制剂早期癌症的阶段，晚期癌症细胞是不够的; （b）在含有各种不确定生长因子的血清依赖性培养;这使它的关键因素识别非常困难。此外，实验重复性受损，因为血清质量一批不同于一批; （三）的血清含有抑制剂和酶的活性可能失活潜在的有用的外源性化合物; （四）需要降解细胞表面分子酶细胞传代的; （五）以识别EMT激动剂促进生理EMT，需要正常细胞，以测试诱导。肿瘤细胞模型不足以发现，在正常干细胞促进肝细胞再生的物质。
还需要迁移正常过程，如伤口愈合和REGENE受伤的大脑18的口粮。创伤性脑损伤和中风后，神经干细胞是必要的，迁移到病灶部位参与再生4,34。当前系统也可用于鉴定促进迁移和侵袭的物质。如上图所示，迁移启动时用BMP4治疗引起的。如果细胞不暴露于骨形成蛋白，而是新的化合物，这些可以取代的BMP动作，这将有助于确定新的BMP激动剂。与报告系统，表明PDPN表达，对于新物质大规模测试变得可行;如果一种新的化合物可以替代的BMPs，PDPN表达细胞可被自动识别。
所提出的系统也进行调查细胞信号的相互作用是有用的。我们的研究结果表明，对迁移的BMP作用可被激活TGFβ1增强。结果发现BMP-和TGFβ-之间的相互作用添加剂信号。然而，更多的信号传导途径，如Notch的，Wnt-或EGFR-/ MAPK-和其它信号级联可能参与。因此，需要对BMP /TGFβ-相互作用和串扰其他途径进一步调查。此外，响应中央皮质可以从转基因小鼠中，其可以有助于阐明驱动EMT基本机制中分离出来。总之，这里所描述的EMT模型系统可以是在癌症研究中的干细胞生物学和再生的领域有帮助的，以及。它可以用于药物文库筛选抑制或增强迁移和侵袭的物质。
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Acknowledgments
这项研究是由一个赠款MHS和AG（SNF IZLIZ3_157230）巴塞尔科学基金会的大学和瑞士国家科学基金会的支持。我们感谢：塔尼亚里纳尔迪博士Burkat慷慨地提供基础设施;该Bettler小组讨论和评论的所有成员。我们感谢多恩格哈德（徕卡公司，瑞士）的专业和称职的安装全高清MC170摄像机（徕卡公司，瑞士）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1,000. |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
