Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En enzym- og Serum-fri neural stamcelle Culture Model for EMT Investigation Egnet til Drug Discovery

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

Epiteliale til mesenkymale overgang (EMT) beskriver processen med epitel transdifferentiating ind mesenchyme. EMT er en grundlæggende proces under fosterudviklingen, der også ofte forekommer i glioblastom, den hyppigste maligne hjernetumor. EMT er også blevet observeret i flere carcinomer uden for hjernen, herunder brystcancer, lungecancer, coloncancer, gastrisk cancer. EMT er centralt forbundet med malignitet ved at fremme migration, invasion og metastase-dannelse. Mekanismerne i EMT-induktion er ikke fuldt forstået. Her beskriver vi et in vitro system til standardiseret isolering af corticale neurale stamceller (NSC) og efterfølgende EMT-induktion. Dette system giver fleksibilitet til at bruge enten enkelte celler eller eksplantation kultur. I dette system rotte eller mus embryonale forhjerne NSC'er dyrkes i et defineret medium, blottet for serum og enzymer. De NSC'er udtrykte Olig2 og Sox10, to transkriptionsfaktorer observeret i oligodendrocYTE precursorceller (OPCs). Med dette system interaktioner mellem FGF-, BMP- og TGF-signalering involverer Zeb1, Zeb2, og Twist2 blev observeret hvor TGFp-aktivering signifikant forøget cellemigration, hvilket antyder en synergistisk BMP- / TGFp-interaktion. Resultaterne peger på et netværk af FGF-, BMP- og TGF-signalering at være involveret i EMT induktion og vedligeholdelse. Dette modelsystem er relevant at undersøge EMT in vitro. Det er omkostningseffektiv og viser høj reproducerbarhed. Det giver også mulighed for sammenligning af forskellige forbindelser med hensyn til deres migration reaktioner (kvantitativ måling af afstand), og high-throughput screening af forbindelser til at inhibere eller forøge EMT (kvalitativ måling). Modellen er derfor velegnet til at teste drug biblioteker for stoffer, der påvirker EMT.

Introduction

Under flere stadier af fosterudviklingen, epitelceller mister deres stærke tilslutning til hinanden (f.eks tætte forbindelser) og erhverve en vandrende fænotype i en proces kaldet epitelial til mesenkymale overgang (EMT) 1. EMT er nødvendig for dannelsen af yderligere celletyper, såsom mesenkymale crista neuralis-celler, en population, der segregerer fra neuroepithelium 2. EMT er ikke kun vigtigt i fosterstadiet, men også nødvendig på senere stadier af voksne liv til at opretholde fysiologiske processer i den voksne organisme, såsom sårheling 3 og centralnervesystemet (CNS) regenerering i demyeliniserende læsioner 4.

Epiteliale tumorer er kendt for at genaktivere EMT som en indvielse skridt for migration, invasion og metastase, i sidste ende fører til kræft progression 1,3. EMT er faktisk centralt forbundet med stærk migration 1,3. De cellulære trinnene conditioning, initiering, gennemgår og vedligeholdelse EMT er ikke fuldt forstået, og har brug for yderligere undersøgelser.

Her er en standardiseret in vitro EMT model baseret på NSC, med definerede vækstfaktorer og medier (ingen serum og ingen brug enzym) præsenteres. Denne model system er af relevans for forskere, der arbejder på EMT. Sneglen, Zeb og Twist protein familier har vist sig at være kritisk for EMT både i udvikling og sygdom 1. Sneglen, Zeb og Twist familier er også involveret i den præsenterede system. Systemet er baseret på en specifik region af forhjernen, der normalt ikke undergår EMT giver en særlig fordel for studiet af indledende begivenheder under EMT induktion.

Modelsystemet kan potentielt anvendes til at studere EMT i epitel uden for CNS, idet centrale EMT induktorer som sneglen, Zeb og Twist proteiner, bliver også fundet under EMT i vævs- systemer uden for CNS. Denne model system tillader standardiseret isolering af NSC'er fra udviklingslandene cortex at studere stamcellelinjer funktioner i almindelighed og EMT i særdeleshed. Anvendelse af dette system, vi isoleret NSC'er, induceret EMT og studerede efterfølgende migrering under indvirkning af FGF2 og BMP4. Vi observerede, FGF- og BMP-signalering interagerer med TGFp-signalering at fremme cellemigration, derved valideret modelsystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer dyr fulgte vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr '(NIH publikation, 8. udgave, 2011), og blev godkendt af Animal Welfare Udvalg for Basel (schweiziske retningslinjer for pasning og anvendelse af dyr). Med disse retningslinjer dyret protokollen anses for "laveste dyr sværhedsgrad".

1. Fremstilling af Expansion Medium

Bemærk: Arbejde i aseptiske betingelser som standard for vævskultur.

  1. Tag to 15 ml rør, og der tilsættes 5 ml L-glutamin-fri DMEM / F12 (1: 1) fra en 500 ml medium flaske til hver af de to 15 ml rør. Til den første 15 ml rør, tilsættes 50 mg humant apo-transferrin, 50 pi putrescin 1 M stamopløsning (0,1 mM slutkoncentration) og 30 pi natrium selen 500 uM stamopløsning (slutkoncentration 30 nM).
    1. Der filtreres gennem et 0,2 um sprøjte filter over i den oprindelige DMEM / F12 flaske.
  2. Til den anden 15 ml rør, tilsættes 12,5 mg insulin. Tilføje6 - 9 dråber 1 M NaOH. Vortex for at opløse insulin helt. Der filtreres gennem et 0,2 um sprøjte filter over i den oprindelige DMEM / F12 flaske.
    Bemærk: NaOH er giftigt og ætsende. Brug beskyttelseshandsker, pels og beskyttelsesbriller.
  3. Tilsæt 5 ml penicillin (10.000 enheder / ml) / streptomycin (10.000 ug / ml) / amphotericin B (25 ug / ml) til DMEM / F12-medium flaske.
  4. Der tilsættes 5 ml 200 mM L-glutamin lager frisk optøede eller oligopeptider indeholdende glutamin (200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptid) til DMEM / F12-medium flaske.
  5. Ryst godt. Forbered 50 ml alikvoter.
    Bemærk: Expansion medium kan opbevares i mindst 2 uger ved 4 ° C. Alikvoteret rør vis færre pH-ændringer sammenlignet med medium holdes i 500 ml flasker.

2. Udarbejdelse af Passage Medium

  1. Til 1 liter Ca 2 + - og Mg 2 + -fri HBSS medier, tilsættes 990,85 mg Glukose (5 mM slutkoncentration) og 840,10 mg NaHCO3 Bemærk: at passere medium kan opbevares i mindst 4 uger ved 4 ° C.

3. Forberedelse af vækstfaktorer

  1. Forbered sterilt 1x PBS med 1% BSA (PBS-BSA) alene eller med saltsyre (HCI) ved 4 mM (PBS-BSA-HCI).
    Advarsel: HCl er ætsende og giftigt og kræver særlige sikkerhedsforanstaltninger (frakker, beskyttelsesbriller, handsker, hætte).
  2. Opløs 10 ug / ml rekombinant human fibroblastvækstfaktor 2 (rhFGF2) i PBS-BSA (10 ng / ml endelig koncentration), 10 ug / ml rekombinant humant knoglemorfogenetisk protein 4 (rhBMP4) i PBS-BSA (10 ng / ml endelig koncentration), og 20 ug / ml rekombinant human transformerende vækstfaktor p 1 (rhTGFβ1) i PBS-BSA-HCI (40 ng / ml slutkoncentration).
    1. Filtrer ikke sterilisere. Forbered portioner.
      Bemærk: vækstfaktor aliquoter kan opbevares ved-20 ° C i mindst 2 år.

4. Coating af Cell Culture Dishes

  1. Opløs 1,875 mg Poly-L-ornithin (PLO) i 500 ml destilleret H2O til fremstilling af en 250X PLO lager. Filtersteriliser ved anvendelse af en 0,2 um sprøjtefilter og lave 2 ml alikvoter.
    Bemærk: Disse aliquoter kan opbevares ved -20 ° C i mindst 2 år.
  2. Opløs 1 mg bovint fibronectin i 1 ml sterilt destilleret H2O til fremstilling 1.000 x fibronectin lager. Undlad at slynge, da dette kan størkne den klæbrige protein. Ryst forsigtigt med hånden i 10 min.
    1. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur med lejlighedsvis omrystning. Kontroller for fuldstændig opløsning. Varm opløsningen til under 37 ° C for fuldstændig opløsning af fibronectin. Filtrer ikke-sterilisere.
      Bemærk: Opløsningen kan opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder.
  3. Brug plasma-forbehandlet plast celle dyrkningsskåle (100 mm eller andre størrelser efter behov foreksperimentet). For at vurdere migration, bruge 35 mm retter med 500 um gitter. Inkuber retter natten over med 2 ml 1x PLO i 12 timer ved 37 ° C i en 5% CO 2 vævskultur inkubator. Vask to gange med 2 ml 1x PBS.
  4. Tilsæt 2 ml 1x fibronectin (1 ug / ml endelig koncentration) og inkuber retter i minimum 12 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. Fjern fibronectin lige før udpladning af cellerne.
    Bemærk: fibronectincoatede retter kan opbevares i mindst 2 uger ved 37 ° C.

5. Standardiseret Dissektion og Forberedelse af Kortikal subventrikulære Zone (SVZ)

  1. Opnå rotte embryonal dag 14,5 (E14.5, Sprague-Dawley) og mus E13.5 (C57BL / 6) embryoner ved tidsbestemt-parring. Mate dyr fra 18:00 til 08:00 næste morgen. Noon efter dagen for parring anses E0.5.
  2. Bedøve drægtigt dyr med 5% isofluran og 0,8 L / min oxygen flow. Tjek svar fra pote kompression med skarp dissfdeling pincet. Halshugge dyret. Undgå CO 2 kvælning som CO 2 påvirker stamceller opsving.
  3. Hent embryoner ved kejsersnit.
    1. Placer dyr i liggende stilling og desinficere pels med 70% ethanol. Brug kirurgiske pincet og saks til at gøre V-formet incision i huden på ca. 8 cm i underlivet ovenfor livmoderen. Incise kun huden med pels og samtidig holde muskulære vægge intakt.
    2. Bruge friske pincet og saks til incise muskler og den abdominale muskelvæg at indtaste peritoneum.
    3. Identificer livmoderen i den nederste bageste bughinden. Fjerne livmoderen ved skarp adskillelse fra de omgivende væv.
    4. Vask livmoderen med embryoner med sterilt 1x PBS og sted i iskold 1x PBS.
    5. Brug fin spids saks til at åbne uterine væggene til at frigive foster ved embryo under en dissektion mikroskop (3X forstørrelse, figur 1B). Brug en tang til at fjerne de embryonale skrog (
    6. Kontroller den korrekte udviklingsstadiet af Atlas i Udvikling Rat Nervous System 5. Den korrekte embryo størrelse er vist i figur 1B.
    7. Kontrollere korrekt alder yderligere ved tilstedeværelsen af begyndende ciffer dannelse hos rotter forben (FL), som vist i figur 1A.
      Bemærk: Den bagben (HL) endnu ikke vise cifret separation (figur 1B).
  4. For dissektion, overføre embryoner til ikke-coatede petriskåle fyldt med iskold 1x PBS. Udfør dissektion under et stereo dissektion mikroskop (3X til 20X forstørrelse) under anvendelse autoklaveres fin pincet.
    Bemærk: petriskålene forhindre vedhæftning af væv til skålen overfladen som kan forekomme med plasma-overtrukket celle dyrkningsskåle. Skærpet wolfram tråd nåle eller lignende er også nyttige til visse trin i dissektion.
  5. Fjern hoved huden og kraniet starter ved intersection af det udviklende telencephalon (TEL) og diencephalon (DI) (figur 1B) ved at trække samtidigt anteriort og posteriort med to pincet for at få adgang til det udviklende neuralrøret (figur 1C).
  6. Identificer midthjernen-baghjerne-grænse (MHB, sort pil hoved i figur 1B-D), der adskiller mesencephalon (MES) fra rhombencephalon. Skær rhombencephalon lige ved eller under MHB (figur 1D, trekantet pil).
    Bemærk: Den ekstra subkutane rum på MHB letter fjernelse huden uden at skade det neurale rør.
  7. Afskære forbindelsen mellem telencephalon / diencephalon på kraniet base med ansigtets skelet (Figur 1E). Dette resulterer i en blok, der indeholder telencephalon, diencephalon og mesencephalon (TEL-di-MES) (figurerne 1F-H).
  8. Overfør TEL-DI-MES blokken i ekspansion medium på is. Hold det Completely dækket i ekspansion medium i en ubelagt petriskål. Hold blokken på mesencephalon med en tang for at undgå at røre telencephalon, der indeholder den kortikale SVZ'en med NSC.
  9. Gentag trin 5.5 til 5,8 med alle embryoner (figur 1F-H).
  10. Overfør en TEL-di-MES blok i frisk iskold 1x PBS. Skåret langs den stiplede linje i den forreste mesencephalon (figur 1F-H), adskillelse af mesencephalon fra diencephalon, som vist i figur 1I.
  11. Adskil DI fra TEL ved at skære langs de stiplede linjer i figur 1F. Se isoleret telencephalon i fig 1J.
  12. Split de to telencephalic halvkugler, skæring langs den stiplede linie i figur 1J. Dette resulterer i to adskilte halvkugler som illustreret i figur 1K.
    Bemærk: Den venstre hjernehalvdel er forstørret i figur 1L.
  13. Identificer den mediale bandelionic eminences (MGE, figur 2A *) og laterale ganglioniske eminences (LGE, figur 2A; +) synlige gennem den kommende Foramen interventriculare.
    1. Brug pincet eller nål, dissekere langs en ​​lige linje i skæringspunktet mellem MGE og LGE og den forreste cortex (ant-ctx, figur 2B). Skær en lige linje gennem cortex, hippocampus (hofte) og choroid plexus (CP). Dette adskiller den anteriore cortex herunder lugtekolben (ob) fra ganglioniske eminences (GE, fig 2B, C).
  14. Skær en anden lige linje i skæringspunktet mellem den kaudale ganglie eminence (CGE, figur 2C, D) og den posteriore cortex (figur 2C), igen skære igennem cortex, hippocampus og choroid plexus.
  15. Glat ud telencephalon. Helt at fjerne bageste pol og lugtekolben (figur 2D). Identificeredet kortikale hem indeholdende hippocampus og choroid plexus (figur 2C), som defineret tidligere 6,7.
    Bemærk: Hippocampus har en tyndere neuroepithelium end cortex. CP indeholder røde skibe.
    1. Adskil det kortikale hem fra cortex og efterlod størrelse af cortex identisk med størrelsen af de ganglioniske eminences (Figur 2D). Dette resulterer i en blok af cortex (målvæv), og de ​​ganglioniske eminences (GE, figur 2D).
  16. Flip cortex-GE blok med ventrikulære (indre) side til fadet overflade.
    Bemærk: Den ydre overflade af halvkuglen vil stå eksperimentatoren (Figur 2E). På den ydre overflade er blodkarret-holdige meninges (Figur 2E).
    1. Pin GE til fadet overflade med venstre hånd og skræl hjernehinden med en tang i den rigtige (dominant) hånd (figur 2F Bemærk: Dette er den teknisk mest krævende skridt, fordi hjernehinden stærkt holde sig til cortex. Adskillelsen af ​​meninges fra cortex lettes ved at skære en helt lige linie (ikke takkede) i trin 5.13.1 og 5.14.
  17. Gentag trin 5,12-5,16 for den anden halvkugle og alle embryoner. Skær cortex langs LGE i en afstand på halvdelen af vigtigste diameter af LGE (fig 2G, 2H). Det dissekerede cortex spænder et område på 1,2 mm x 2,4 mm (figur 2H) og indbefatter SVZ'en / germinale lag med NSC'er.

6. Fremstilling af eksplantatkulturer

  1. Skær cortex i eksplantater på mindre end 400 um diameter (fig 2I). Brug en 400 um gitter (Supplerende figur 1) er placeret under dissektion petriskål for reference (Figur 2H og 2I). Overfør alle eksplantaterne i en frisk petriskål med is-cold ekspansion medium.
  2. Fjern fibronectin fra en vævskulturskål (trin 4.4). Lad det tørre. Der tilsættes 1 ml kold ekspansion medium til midten af 35 mm skål med modulmål på 10 mm x 10 mm (figur 3). Lad mediet til dannelse af en sfærisk dråbe (figur 3).
  3. Indsætte op til 8 eksplantater til midten af ​​dråben. Eksplantaterne skal ideelt placeret på nettet med mindst 3 mm afstand mellem hinanden for migration analyse (se afsnit 8).
  4. Inkubér fadet i ca. 1 time i en cellekultur inkubator (37 ° C, 21% O2, 5% CO2) til fastgørelse af eksplantaterne. Lad eksplantaterne at bosætte sig og knytte til fibronektin overflade. Ryst ikke fadet, da eksplantaterne kan løsrive og flytte ud af den optimale gitter center.
  5. Efter 1 times inkubation (37 ° C, 21% O2, 5% CO2), fylde skålen til et samlet volumen på 2 ml ekspansion medium plus væksten fskuespillere eller stoffer af interesse at teste og inkuberes.
    Bemærk: Hverken enzymatisk fordøjelse eller serum eller centrifugering er nødvendig for eksplantat forberedelse. Dette er optimalt for celle integritet.

7. Fremstilling af NSC Single Cell Culture

  1. Varme op ekspansion og passage medium ved 37 ° C.
  2. Overfør dissekerede cortex stykker (fra trin 5.17) i et 15 ml rør med koldt ekspansion medium (tube A). Centrifuger cortex stykker i 5 min ved 1.200 x g. Aspirere supernatanten. Tilsæt 200 pi forvarmet ekspansion medium til resuspendere cortex stykker.
  3. Tilføj 700 pi forvarmet passage medium til det 15 ml rør med en P1,000 spids (tube A). Forsigtigt resuspender pellet. Anbring spidsen på bunden af ​​15 ml rør. Forsigtigt og langsomt dissociere vævsstykkerne ved sugning tre gange med P1,000 spids.
    Bemærk: at passere medium fremmer celleseparation og er nødvendig for at undgå brugen af ​​enzymer.
  4. Lad røret til at sidde i 30 til 60 sek til større (tungere) dissocierede stykker til at bosætte i bunden. Single dissocierede celler vil forblive i supernatanten. Overfør ca. 700 pi af supernatanten til et frisk 15 ml rør (rør B).
  5. Gentag trin 7.3 og 7.4 for at dissociere de større stykker.
  6. Gentag trin 7.3 og 7.4 en anden gang for at dissociere de større stykker. Overfør hele supernatanten til friske 15 ml rør (rør B).
  7. Tilføj ekspansion medium til et samlet volumen på 5 ml. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer. Vurdere døde celler ved trypan-blå-farvning.
    Bemærk: Små NSC'er tolerere trin 7.2 til 7.6 bedre end større celler. Fra 10 embryoner forventer omkring 4 x 10 6 celler med 10% døde celler.
  8. Til udvidelse af NSC'er, plade 1,5 x 10 6 celler pr 10 cm fibronectin-coatede vævskulturskål i et volumen på 8 ml ekspansion medium. For standard ekspansion, tilsættes 8 pi 1.000 x rhFGF2 lager. Tilføj 8 pi rhFGF2 hver dag og ændre migdia hver anden dag.
    Bemærk: cortex på dette udviklingstrin indeholder et flertal af NSC og kun et mindretal af differentierede celler. De differentierede mindretal celler ikke reagerer på rhFGF2-behandling og dør under ekspansionen kultur.
  9. Passage udvidet NSC'er ved 60% konfluens.
    1. Til passage NSC'er, fjerne ekspansion medium. Vask cellerne hurtigt tre gange med 5 ml passage medium. Vent 2 - 4 min. Uden Ca 2 + og Mg 2 + cellerne langsomt løsnes fra overfladen, oprunding. Kontrollere frigørelse af celler under fase mikroskop. Vent et andet par minutter, hvis det er nødvendigt, indtil visuel løsrivelse fra overfladen overholdes.
      Bemærk: Enkelte celler vil helt frigøre, men de fleste celler vil stadig holde sig til fadet overflade. Varigheden er nødvendig for frigørelse er afhængig af varigheden af ​​fibronectin belægning. En kort fibronektin belægning (12 t eller mindre) resulterer i hurtigere celle løsrivelse. Ved længere eksperimenter (>; 1 uge) fibronektin belægning på mere end 24 timer anbefales.
  10. Brug en 10 ml pipette til forsigtigt løsne cellerne fra overfladen. Opsaml 5 ml passage medium med celler og overføre det til en frisk 15 ml rør. Gentag med yderligere 5 ml passage medium.
  11. Dissociere celler i 15 ml rør ved pipettering op og ned tre gange, placere 10 ml pipette i bunden af ​​røret. Spin røret i 15 minutter ved 1.200 xg ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 2 ml ekspansion medium. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer. Brug trypanblåt at vurdere døde celler.
    Bemærk: Efter udvidelsen til 60% sammenløb, forventer 4 - 5 x 10 6 celler med en død celletal på omkring 10%.
  12. Plade 8 x 10 5 celler pr 10 cm skål til yderligere passager.

8. Migration Assessment

  1. Til vurdering migration, isolere eksplantater henhold til punkt 5. Frø eksplantaterne i35 mm gitter retter. En time efter plating, tilføje FGF2 (rhFGF2). Placer retter i et 37 ° C inkubator i 2 dage.
    Bemærk: For optimal eksplantat vedhæftet fil, undgå at flytte retter.
  2. Fjern medium med 1.000 pi spids. Tilsæt 2 ml ekspansion medium ved 1000 pi spids starter ved den inderste cirkel (figur 3). Dette reducerer overfladespændingen på eksplantater.
  3. Tilføj vækstfaktorer alene eller i kombination efter behov for eksperimentet. Brug FGF2 / BMP4 / TGFp1 som positiv kontrol. Bemærk: I dette eksperiment blev 2 pi FGF2 pr 35 mm skål, 2 pi BMP4 og 4 pi TGFp1 tilsættes alene og i kombination (figur 5).
    1. Tilføj yderligere faktorer og / eller testbare stoffer. Hold retter igen urørt i 2 dage ved 37 ° C.
  4. Tag fotografier af eksplantaterne på et omvendt mikroskop.
    Bemærk: Living eksplantater give bedre fase kontrast billeder end faste celler. Begge kan anvendes.
  5. For migrationvurdering, skal du bruge en grafik software, der giver pixel målinger (f.eks Fiji 8).
  6. Mål fadet gitter af 500 um afstand i pixels og bruge det som intern reference.
  7. Definerer centrum af eksplantatet som migration startpunkt. Måle afstanden mellem midten af ​​eksplantatet og den yderste gruppe af 10 celler.
    Bemærk: Alle celler migrere centrifugalt væk fra eksplantatet. De spontant danne et ark ved periferien under de testede betingelser (figur 5).

9. Vurdering Invasion

  1. Forbered fibronectincoatede vævskulturplader plader med 24 brønde ifølge protokol afsnit 4.
  2. Placer 300 pi varm ekspansion medium ind i øverste brønd af celleinvasion kamre. Inkuber kamrene i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
  3. Fjern ekspansion medium fra den øverste brønd, og anbring Boyden kammeret ind den overtrukne plade med 24 brønde.
  4. Tilføj 500 pi varm ekspansion medium med 0,5 pi rhFGF2 og 0,5 pi rhBMP4 til bunden godt.
  5. Passage NSC'er og tæller som beskrevet i afsnit 7. Passager 1 til 4 er egnede.
  6. Plade 5 x 10 5 celler i et volumen på 300 pi varm ekspansion medium med 0,3 pi rhFGF2 og 0,3 pi rhBMP4 i den øverste brønd i Boyden kammer.
  7. Kultur seedede NSC'er for 24 timer.
  8. Tilføj yderligere faktorer og / eller testbare stoffer til kammeret og dyrke cellerne i yderligere 48 timer.
    Bemærk: Hvis cellerne er invasive, vil de passere fra toppen godt gennem basalmembranen lag til bunden godt. Invasive celler vil klynge sig til bunden af ​​Boyden kammer.
  9. Følge protokollen tilvejebragt af producenten. Brug vatpinde (inkluderet i invasionen assay kit) til at fjerne de ikke-invasive celler i den øverste godt ved at rense to gange.
  10. Fjern mediet fra brøndene, og der tilsættes 500 pi ekspansion medium medet plasma membran plet for levende celler og med den nukleare farvestof DAPI til brøndene.
  11. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
    Bemærk: Farvestofferne vil integrere i membranen og kernen af de invasive celler, henholdsvis for optimal visualisering 8. Option: Udelad plasmamembranen farvestof, hvis flerfarvet immuncytokemi er planlagt.
  12. Fjern mediet med farvestofferne og vask to gange med ekspansion medium. Visualisere og tælle invasive celler med en omvendt fluorescensmikroskop som påvist tidligere 8.
    Bemærk: Nogle invasive celler kan have frigjort fra bunden af ​​kammeret og er faldet til brøndens overflade nedenfor, hvor de holder sig til den belagte overflade. For fuldstændig analyse omfatter cellerne ved brøndens overflade.
  13. Fjern mediet og løse cellerne i iskold frisk 4% PFA i 10 min. Vask 3 x med 1x PBS. Udføre immunocytokemi for invasive celler, som tidligere beskrevet 8-10.

    14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne EMT model er baseret på den standardiserede isolering af NSC'er både som enkelte celler eller som eksplantater fra en specifik region af det udviklende neurale rør, den centrale cortex (figur 1 og 2). Til kvantitativ vurdering blev eksplantater podet lige i centrum af en 500 um gitter dyrkningsskål (figur 3). Eksplantater fra den centrale cortex blev først eksponeret for FGF2 i to dage, efterfulgt af yderligere to dage i forskellige kombinationer af vækstfaktorer (tabel 1). Vi startede med cortex, som er større end andre regioner i den neuralrøret. Vi observerede, at kun eksplantater dyrket i BMP4 viste en vandrende respons (tabel 1 og supplerende figur 2).

Næste podoplanin (PDPN) udtryk blev analyseret under definerede betingelser. PDPN er en transmembran sialomucin-lignende protein, der er blevet forbundet med invasion i flere cancertyper 11,12 og også i NSC'er 8. Andelen af PDPN udtrykkende celler er forøget i høj kvalitet gliomer 13. PDPN er også forbundet med dårligere overlevelse i glioblastom patienter 14. Endvidere PDPN har vist sig at være en markør for malign progression i multiple tumorer, herunder bryst-, lunge-, coloncarcinomer 15,16. PDPN udtrykkes både i invasive samt vandrende NSC'er 8. Under anvendelse af ovennævnte protokol blev PDPN ekspression sammenlignet med kontrol, kun FGF2, i eksplantater udsat for TGFp1 og BMP4 alene eller i kombinationer. PDPN ekspression blev påvist i alle BMP4 og TGFp1 / BMP4-behandlede eksplantater. I modsætning hertil blev der ikke PDPN observeret i kontrol eksplantater i FGF2 alene eller i eksplantater med TGFp1 alene (tabel 2 og figur 4). Desuden blev celler med en vandrende fænotype induceret i BMP4 og TGFp1 / BMP4-udsatte eksplantaterne, mens kontrol eksplantater (kun FGF2) og TGFp1 alene viste ikke migrerende celler (tabel 1). Observation af migrerende celler giver en lav pris, straight-forward kvalitativ vurdering.

Endvidere testede vi vandrende respons og EMT induktion af flere regioner i udviklingslandene neuralrøret til BMP4 (tabel 2). 400 um eksplantater blev fremstillet fra den centrale cortex, posterior cortex (mærket bageste pol), MGE og mesencephalon, som angivet i figur 1. Eksplantaterne blev alle udsat for FGF2 i to dage, efterfulgt af to dage i FGF2 med BMP4 . Migration blev defineret ved fremkomsten af flade migrerende celler med en forreste og bageste kant (figur 5 og supplerende figur 2). En stærk induktion af migrerende celler fra den bageste cortex og en mellemliggende reaktion fra MGE og meshjerne blev observeret (Tabel 2). 145 af 146 eksplantater af den centrale cortex viste en vandrende respons i FGF2 / BMP4. Således er den centrale cortex demonstrerede de mest robuste induktion af migrerende celler fra alle testede eksplantater (tabel 2). Udeladelse af BMP4 afskaffet enhver vandrende respons (tabel 1 og 2, og data ikke vist).

Til kvantitativ vurdering af vækstfaktor potens, blev migration afstand målt i eksplantater dyrket i multiple vækstfaktorer. Eksplantater blev dyrket som ovenfor i to dage i FGF2, derefter i yderligere to dage i FGF2 uden faktorer (kontrol) eller enkelt eller kombineret BMP4 og TGFp1. I kontrolgrupperne eksplantater blev der observeret en stærk proliferation som respons på FGF2, som forventet. Eksplantaterne er afledt af cortical SVZ og indeholder til en stor del NSC'er som vides at proliferere som respons på FGF2 17. Styringen ceLLS nåede 689 ± 14, de TGFp1 celler 582 ± 49 um (Figur 5.). Den BMP4-gruppen viste en gennemsnitlig migrering afstand af 935 ± 91 um. I sammenligning de TGFp1 / BMP4-celler migreret betydeligt yderligere til 1.150 ± 23 um (figur 5). Resultaterne viser, at BMP4 er at inducere en migration i FGF2-eksponerede NSC'er. Denne migration kan blive yderligere styrket af TGFp1. Kombinationen af ​​FGF2, BMP4 og TGFp1 er derfor den mest effektive til at inducere migrationen. Sammenfattende cellekultur model system gør det muligt både kvalitative såvel som kvantitativ migration.

EMT er blevet forbundet med transkriptionsfaktorer (TFS), såsom Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2, Twist1, Twist2 i forskellige systemer, herunder epitel- cancere, såsom brystcancer, coloncancer, lungecancer og også i hjernetumorer 1,18. vi hannonce tidligere vist, at FGF2 og BMP-2 eller BMP4 kan fremkalde Snail1 og Snail2 8,9. Under anvendelse af ovennævnte system, undersøgte vi ekspressionsniveauerne af de andre EMT-relaterede TF'er. Kunne påvises nogen ændringer i Twist1 udtryk; med Twist1 bliver ved lave udtryk niveauer under FGF2 eksponering (data ikke vist). I cellekultur modellen blev observeret en opregulering af Zeb1 og Zeb2 under FGF2-eksponering og Twist2 under FGF2 / BMP4-eksponering (figur 6).

NSC er kendt for at bidrage til befolkningen i oligodendrocyt prækursorceller (OPCs) 8,19,20. Flere linjer af beviser tyder på, at NSC særlig OPCs kan være cellen af oprindelse for gliomer 21,22. For at karakterisere den ovenstående model yderligere, undersøgte vi ekspressionen af ​​OPC markører. Vi observerede, at FGF2-eksponerede NSC'er demonstrerede co-ekspression af Olig2 / Nestin end Sox10 / Nestin i mere end 90% (figur 7). Denne observation viser, at NSC viser OPC-funktioner i vores system. Faktisk er de OPC-funktioner korreleret med opregulering af Zeb'1 og Zeb'2 (figur 6 og 7). Disse resultater antyder, at FGF2-ekspansion udleder en OPC identitet, som vurderet ved Olig2 og Sox10, mens samtidig initierer første Zeb -baserede trinnene EMT.

figur 1
Figur 1: Standardiseret Embryo og forhjernen Dissektion for NSC Isolation og EMT induktion. (A) Venstre forlem af rotte E14.5 embryo efter kejsersnit. Hver Forlemmet ciffer er markeret med en sort pil tip. Bemærk begyndelsen ciffer formation typisk for E14.5. (B) Rotte E14.5 embryo efter skroget fjernelse. Bemærk hash (#) på dorsale diencephalon which er ideel til at starte fjernelse af hud / kraniet anlage. (C) Huden / kraniet er allerede det meste fjernes. Grænsen mellem fjernet og ikke-fjernede hud er markeret med to trekantede pilespidser. Huden kan skrælles anteriort fra det forreste pil og posteriort fra den bageste pil. (D) Huden / kranium er nu fuldstændig fjernet. Bemærk hakket af midthjernen-baghjerne grænse (pil) og snit tæt kaudalt til det, der er markeret med en pilespids. (E) telencephalon-diencephalon-mesencephalon (TEL-di-MES) blok fjernes fra resten af embryoet . (F) Superior visning af TEL-DI-MES blok. Kraniel er tilbage. (G) Skrå set fra oven. (H) Inferior visning af TEL-DI-MES blok. (I) mesencephalon og en del af diencephalon adskilles fra telencephalon med den forreste del af diencephalon. Top: anterior afbildning af begge telencephalic vesikler. Nederst: Right lateral syn på mesencephalon, top ansigter kranialt (J) Top:. både telencephalic vesikler uden diencephalon. Ringere henblik på at illustrere fuldstændig fjernelse af diencephalon. Asterisk skildrer MGE. Nederst:. Forreste del af diencephalon (K) Top: Begge halvkugler er adskilt i interhemispheric revne. Venstre hemisfære på venstre side. Asterisk skildrer MGE. Plus tegn viser LGE. (L) Forstørrelse af venstre hjernehalvdel med median udsigt. Right står kranialt, forlod kaudalt, toppen er dorsal, bund ventrale henholdsvis. Stjerne (*) er placeret på MGE. Plus-tegnet (+) er placeret på LGE. lm, kortikal hem; FL, forben; di, diencephalon; mes, mesencephalon; MHB, midthjernen-baghjerne grænse; HL, bagben; LGE, lateral ganglie eminence; MGE, mediale ganglie eminence; ob, olfaktoriske pære; pc, bageste cortex; rho, rhombencephalon; tel, telencephalon. Gitteret på hvert billede viser 2 mm tykke linjer med fire kryds med tynde linier hver400 um. Scale bar på alle billeder:. 2 mm Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Standardiseret Kortikal SVZ dissektion for NSC Isolation og EMT induktion. (A) Median visning af venstre hemisfære. Gennem foramen af Monro MGE og LGE er synlige, præget af stjerne og plustegn. (B) Den lugtekolben fjernes lige kranialt af MGE-LGE. (C) Den bageste pol af cortex fjernes lige bag CGE . (D) Top: den korticale hem adskilles fra cortex. Venstre: posterior pol. Midt: kompleks indeholdende den centrale del af cortex og CGE-LGE-MGE blok. MGE og LGE ansigt til højre. Til højre: olfaktoriske bulb. (E) Den CGE-LGE-MGE-cortex blok er vendt vandret. Nu den ydre overflade af telencephalon vender mikroskopet. MGE og LGE nu står til venstre. (F) De rødlige meninges fjernes fra den lyse gennemskinnelige cortex. CGE-MGE-LGE-ctx blok er nu vendt tilbage vandret til det næste trin. (G, H) Den samme procedure gentages med den højre hjernehalvdel. Den centrale cortex adskilles fra CGE-MGE-LGE blok. Bemærk, at der er et mellemprodukt cortex zone, der er tilbage på CGE-MGE-LGE blok, mærket med to pile. Dette mellemprodukt cortex tykkelse svarer til halvdelen af ​​diameteren af ​​LGE. Stiplede linje repræsenterer grænsen mellem LGE-CGE og cortex. (I) Den centrale cortex adskilles i eksplantater på mindre end 400 um i diameter. Målestok: 2 mm; gitter på hvert billede viser 2 mm tykke linjer med fire skæringer (tynde linjer) hver 400 um. Stjerne (*) er placeret ent MGE. Plus-tegnet (+) er placeret på LGE. Forkortelser: ant-CTX, forreste cortex; cen-ctx, central cortex; CGE, caudale ganglie eminence; lm, kortikal hem; cp, choroid plexus; ctx, cortex; LGE, lateral ganglie eminence; mænd, hjernehinderne; MGE, mediale ganglie eminence; ob, olfaktoriske pære; pc, posterior cortex. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Explant Seeding på 35 mm Grid cellekulturskåle anbringes 1 ml ekspansion medium ved midten af 500 um gitter skålen. Faldet er indeholdt af gitteret rand (små pile). Place eksplantater lige i centrum af 1 ml dråbe. Hvis eksplantaterne er spredt udenfor nettet, swIRL fadet i en langsom cirkulær bevægelse og eksplantaterne vil flytte til midten af ​​centripetal kraft. Bemærk: eksplantaterne er kun knap synlige med det blotte øje (sort pilespidser). Målestok: 35 mm.

Figur 4
Figur 4:. PDPN induceres i tilstedeværelse af BMP 4 Eksplantater blev dyrket i henhold til protokollen § 8 (2 dage i FGF2 kun, derefter fulgt af FGF2 med forhold som angivet). Kontrol (A) (FGF2 alene) og TGFp1 (C) eksplantater indeholdt ikke PDPN-positive celler (grøn). Kerner farves med DAPI (blå). BMP4 (B) og TGFp1 / BMP4 (D) eksplantater viste en høj andel af PDPN-positive celler. Eksplantatet center er til venstre, periferien til højre. Bemærk: De PDPN-positive celler var hovedsagelig found ved periferien og ikke i midten af ​​eksplantatet. De TGFp1 / BMP4 eksplantater indeholdt fladere, mere uddybet PDPN-positive celler. (E) Procentdelen af PDPN-positive celler i eksplantater på forskellige betingelser er repræsenteret. Kontrol og TGFp1 begge er væsentligt forskellige fra de betingelser med BMP4. Midler er vist ± SEM. Kontrol vs TGFp1 er ikke signifikant (NS). Kontrol og TGFp1 vs. BMP4: p <0,0001 (***). TGFp1 vs. TGFp1 / BMP4: p <0,0001 (***). BMP4 vs. TGFp1 + BMP4 er ikke signifikant: p = 0.0981 (ns). Kontrol vs. TGFp1 + BMP4: p <0,0001 (***). Scale bar for alle billeder, som illustreret i (A):. 50 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 Figur 5: Kvantitativ Migration Assessment. BMP 4 og TGF p 1 viser additiv virkning på Cell Migration. Eksplantater blev dyrket i henhold til protokol punkt 8. (A) Kontrol eksplantation. (B) Eksplantering i BMP4 alene. (C) Eksplantering i TGFp1 alene. (D) eksplantation i kombinationen af TGFp1 og BMP4. (E) Migration afstand i um. De 500 um gitter blev anvendt som reference. Kontrollen og de TGFp1 eksplantater viser en stærk proliferation med en større eksplantat diameter end i de andre betingelser. Midler er vist ± SEM. Bemærk at BMP4 og TGFp1 / BMP4 eksplantater delvis desintegrere eksplantatet kerne og cellerne udvandre væk fra det centrifugalt. Kontrol vs TGFp1 er ikke signifikant (NS). TGFp1 vs.BMP4: p = 0,0353 (*). Kontrol vs. BMP4: p = 0,0351 (*). BMP4 vs TGFp1 + BMP4: p = 0,0372 (*). Kontrol vs. TGFp1 + BMP4: p <0,0001 (***). Målestok: 500 um. Center of eksplantation er præget af et plustegn (+). Yderkant migrerende celler er markeret med trekantet pil. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6:.. Opregulering af EMT-relaterede transkriptionsfaktorer ved QRT-PCR EMT er knyttet til de vigtigste transkriptionsfaktorer i Zeb- og Twist-familien (A, B) Zeb'1 og Zeb'2 blev opreguleret i den første fase af FGF2-eksponering. (C) Twist'2 blev opreguleret under second fase af FGF2 / BMP4-eksponering. Relative ekspressionsniveauer baseret på QRT-PCR er vist (n = 2). MRNA-niveauerne blev normaliseret til GAPDH. Midler er vist ± SEM. På dag 0 af perioden FGF2 mRNA blev høstet, blev yderligere mRNA høstet efter fire dage i FGF2, så efter en dag i FGF2 / BMP4 Zeb'1:. Kontrol vs. FGF2, p = 0,0002 Zeb'2:. Kontrol vs. FGF2, p = 0,0206 Twist'2:. Kontrol vs. FGF2 + BMP4, p = 0,003.

Figur 7
Figur 7:. NSC'er viser OPC Karakteristika i modelsystemet NSC'er blev isoleret fra den centrale cortex og dyrkes som enkelte celler i nærvær af FGF2 (ifølge afsnit 5). Efter 8 d i kultur (passage efter 4 d henhold til punkt 7.9) cellerne dannede små NSC kolonier og blev farvet for Olig2 (rød, i B, C), Sox10 (rød, i E, F) og Nestin (grøn, A, C, D, F). En høj andel af celler co-udtrykte Olig2 / Nestin (AC) og Sox10 / Nestin (DF). (G) Co-ekspression af Olig2 / Nestin og Sox10 / Nestin er vist i procent af alle celler. Midler er vist ± SEM. Scale bar for alle billeder som illustreret i (A) og (D):. 20 pm Klik her for at se en større version af dette tal.

Tilstand Total eksplantater (central cortex) Eksplantater med vandrende respons % Eksplantater med Podoplanin udtryk %
Kontrol 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

Tabel 1. BMP 4 og kombinationen af TGF p 1 med BMP 4 inducere en Robust vandrende reaktion. Eksplantater fra den centrale cortex blev opretholdt i ekspansion medium og FGF2 i i alt fire dage. Efter den førsteto dage, eksplantaterne enten fortsat modtog FGF2 alene (kontrol) eller FGF2 og derudover TGFp1, BMP4 eller TGFp1 / BMP4 som kombination. Kontrol- og TGFβ1- eksplantaterne gjorde hverken vise en vandrende respons eller PDPN udtryk. BMP4 og TGFp1 / BMP4 inducerede både migrerende celler såvel som PDPN ekspression i alle eksplantater.

Område Total eksplantater Eksplantater med vandrende respons i FGF2 / BMP4 %
Central cortex 146 145 99,3
posterior cortex 52 48 92.0
MGE 56 29 51,7
mesencephalon 53 28 52,8

Tabel 2. Den centrale Cortex viser den mest Robust Migration i Reaktion på FGF 2 / BMP 4 Eksplantater blev fremstillet af forskellige regioner i udviklingslandene rotte E14.5 neuralrøret:. Den centrale cortex, den bageste cortex, den mediale ganglioniske eminence (MGE) og mesencephalon. Alle eksplantaterne blev dyrket på samme måde i FGF2 / BMP4 (afsnit 8). Eksplantater behandlet uden BMP4 viste ingen vandrende respons (data ikke vist). Alle eksplantater blev screenet for forekomsten af ​​eventuelle migrerende celler pr eksplantation. Alle regioner var i stand til at reagere på FGF2 med BMP4 med migration. Den centrale cortex, dog viste de mest robuste svar. Bemærk, at BMP4 var forpligtet til at fremkalde nogen migrerende celler. Eksplantater dyrket i FGF2 alene viste proliferation men ingenmigration; og ingen flad migrerende celler blev observeret i FGF2 alene (tabel 1 og supplerende figur 2).

Supp Figur 1
Supplerende Figur 1. 400 um Kvadratnetsfil. Kvadratnetsfilen kan trykkes og anvendes som reference under ovennævnte dissektion trin og som vist i figur 1 og 2. De store kryds repræsenterer 2 mm med 400 um underafdelinger. Klik her for at downloade en PDF-version af dette tal.

Supp Figur 2
Supplerende Figur 2. BMP 4 -exposed Eksplantater Show Flade migrerende celler. Forstørrelse af celler vist i figur 5. (A) Control- (FGF2 alene) og (C) TGFp1-eksplantater viste en stærk celledeling med små afrundede celler. (B) BMP4- og (D) TGFp1 / BMP4-eksplantater viste konsekvent flade langstrakte celler. Scale bar for alle billeder, som illustreret i (A):. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 1
Supplerende Figur 3. Oversigt over in vitro Model System for EMT undersøgelse. E14.5 rotte central cortex indeholder NSC-holdige SVZ. Den centrale cortex er enten used som eksplantatpartikler stykker eller som enkelte celler. Eksplantat stykker er mere bekvemt for kvantitativ migration analyse (afsnit 8). Enkelte celler er egnede til kvalitativ analyse, såsom gen eller protein analyse (afsnit 9.13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse et standardiseret system til EMT analyse under anvendelse NSC'er er beskrevet (opsummeret i supplerende figur 3). Standardiseringen sikrer reproducerbarhed (tabel 1 og 2). De NSC'er stammer fra det udviklende cortex, et væv, der normalt ikke undergår EMT. Dette er en fordel for analysen af ​​de tidlige stadier af EMT. Indledende skridt i EMT kan ikke tilstrækkeligt undersøgt hos tumorceller, der har akkumuleret genetiske ændringer og kan allerede vedtaget EMT funktioner. Desuden primære tumorprøver er ikke ideelle til at forstå EMT, eftersom de fleste maligne tumorer er heterogene indeholdende både invasive og ikke-invasive celler. Den præsenterede protokol giver EMT forskere med en ny model til at studere tidlige trin i EMT induktion. Her viser vi, at de vigtigste EMT inducere af den Zeb og Twist familie sekventielt aktiveres: i første fase Zeb1 og Zeb2 opreguleres under den anden fase Twist2 (Figure 6). Tidligere havde vi vist, at Snail1 allerede er opreguleret flere timer efter BMP4-eksponering 8. Vi havde også vist, at ved BMP4-eksponering de neuroepitelceller stamceller fra den centrale cortex differentierer til mesenkymale celler, positive for glatmuskelactin (SMA) og calponin 9. Resultaterne ovenfor fuldføre tidligere undersøgelse påvise, at alle de tre kendte centrale EMT regulatorer er involveret i systemet. Derudover observerede vi, at TGFp1 markant kan øge vandrende effekt af FGF2 / BMP4 alene. Disse resultater peger på et netværk mellem FGF-, BMP- og TGF-signalering under EMT induktion.

De mest kritiske trin til vellykket isolering af NSC'er for EMT og migration analyse er: korrekt at identificere den embryonale alder, identificere anatomiske landemærker i udviklingslandene embryo, forberedelse af friske dyrkningsmedier og (mindst natten over) coatede plader, brug af fine spids instrumenter og propr dissektion af den centrale del af den udviklende cortex at etablere corticale eksplantater.

De præsenterede teknikker kan forstærkes ved visse ændringer. Som foreslået ovenfor, er flere eksplantater udpladet på en enkelt skål med et gitter. Til screening af flere forbindelser, kan det imidlertid være mere praktisk at placere single eksplantater i hver brønd i en plade med 96 brønde. Endvidere kan modelsystem forfines til masseproduktion lægemiddelforskning. Som beskrevet ovenfor, PDPN er en værdifuld markør for nyerhvervede vandrende funktioner siden PDPN findes i invasive NSC'er 8. En PDPN reporter kan transficeres i normale NSC'er før EMT induktion. Som en konsekvens PDPN udtrykkende celler kan tjene som en intern kontrol for celletransformation siden PDPN ikke udtrykkes i normale NSC'er (figur 4 og tabel 1). Adskillige yderligere NSC markører er tilgængelige, såsom Nestin, som går tabt efter EMT induktion 8. Som en konsekvens,både den oprindelige tilstand, "ikke-migrerende / non-invasiv / Nestin +", og den endelige tilstand, "vandrende / invasive / PDPN +", kan overvåges, som gør det muligt automatiseret lægemiddelforskning. I store cellekulturplader med flere brønde (fx plader med 96 brønde og større) indledende celler kan podes og behandlet med etablerede lægemidler eller forbindelser uden kendt funktion. Således kan flerbrøndsplader automatisk scannet for ekspression af PDPN eller andre migration / invasion markører. Hvis en inhibitor er det vigtigste mål for skærmen, kan forsvinden PDPN udtryk hjælpe med at identificere formodentlig interessante nye hæmmende forbindelser.

Under afprøvning af en roman stof eksplantaterne kan ikke vise migration og / eller eksplantaterne kan runde op og løsnes fra fadet. I denne situation er det bedst at ændre kun halvdelen af ​​mediet hver dag (i stedet for fuld mediumændring hver anden dag). Dette reducerer stress ved overfladespænding ved udskiftning med frisk medium. Deteksplantater kan ikke vedhæfte efter den indledende plating. I denne situation, fibronectin skal være i kontakt med skålen overflade i mindst 36 timer. Fibronectin bruges til belægning skal være frisklavet uden udsættelse for et plastrør i mere end 10 min siden fibronektin kan klæbe fast til plast. Endvidere kan eksplantaterne afregne uden for gitteret. I denne situation er det tilrådeligt at hvirvle skålen i en langsom cirkulær bevægelse. Dette tillader eksplantaterne at repositionere til midten af centripetal kraft (jf figur 3).

Der er stærke beviser for, at gliomer er afledt af NSC og / eller OPCs stammer fra NSC 23,24. Som en konsekvens andre grupper har etableret gliom vækstmodeller på grundlag af NSC'er:. Sampetrean et al isolerede NSC'er fra INK4 / ARF-manglende mus og tvungen overekspression af H-Ras 25. High-grade maligne tumorer resulterede som viste spredning og invasion efter transplantation 25. McNeill et al. også isolerede NSC'er fra genmodificerede mus (floxet RB1, NF1, Kras, PTEN alene og i kombinationer) 26. Generne blev inaktiveret ved Cre-virusinfektion og NSC'er blev transplanteret 26. Begge disse modelsystemer har den fordel, at invasion kan overvåges in vivo og eventuelle nye anti-invasion lægemidler kan testes. Deres største ulempe er, at den begyndende invasion ikke er veldefineret og det er uklart, om cellerne viser gliom-typiske EMT invasion (EMT-gener) eller kun lokalt migration. Længere kun ét stof kan testes pr dyr og analysen kræver flere uger. For at identificere en ny anti-invasion narkotika, farmaceutiske virksomheder har brug for (a) at screene for flere tusinde forbindelser eller flere på en gang, (b) at kopiere de prøvninger og (c) at prøve forskellige lægemiddelkoncentrationer. For at forberede flere tusinde transplanterede dyr, behandle dem med forskellige lægemidler og endelig teste for virkninger ved histokemisk eller bioluminescensanalyse er meget ressourcekrævende. Her en hidtil ukendt NSC-baserede modelsystem til EMT-relateret invasion beskrives der tillader omkostningseffektiv screening af tusinder af forbindelser.

Selv om denne model muliggør high throughput screening af forbindelser, er det en primær screening eneste platform. Når forbindelser af interesse er identificeret i denne model, vil de kræve yderligere validering. In vivo-undersøgelse er nødvendig for sikkerheds- og effektdata parametre for enhver forbindelse identificeret og transplantationscentre modeller som beskrevet ovenfor, blevet vigtigt 25,26. Modellen er også begrænset af, at den er baseret på gnaverceller. Selvom modellen kan bruges til at undersøge rotte eller mus EMT, er det uklart, om de samme mekanismer er på plads i humane celler eller i den menneskelige patient. Der er behov for yderligere forsøg for at undersøge om NSC'er er ikke kun invasive in vitro, men også efter transplantation. Flere linjer af beviser støtter rolle NSC'eri gliom formation. Gliom progression har været forbundet med følgende gener: Tenascin C, Hey1, SPARC, Snail1 og Snail2, FGFR +, BMPR1a, EGFR, PDGFRβ, Sox2, Podoplanin, GLI3 og p75NGFR 8. Alle disse gener også til udtryk under transformationen af normale ikke-invasive NSC'er til invasive mesenkymale celler 8. På det tidspunkt væsen, det er uklart, om NSC kan omdannes til tumorer ved kun eksterne faktorer vækst.

Tumorfremkaldende stamceller (tics) fra forskellige tumorer er blevet isoleret og anvendes som modeller til at forstå tumorudvikling 27. Tics er dog ikke velegnet til EMT-analyse, da EMT allerede fandt sted i TIC 27. For at forstå tidlige og også sene trin i EMT-induktion, er behov for en primær ikke-neoplastisk cellepopulation. Ideelt denne population var ikke meningen at undergå EMT i første omgang. Det havde tidligere vist, at embryonale NSC'er var egnede kandidater til dette formål9,28. Nemlig kunne migration og invasion induceres i NSC'er af FGF2 og BMP4 9,28. FGF2 / BMP4-induceret migration var relateret til en enkelt EMT-relaterede gener, men blev fuldstændig beviser manglede, da de centrale EMT familier Zeb og Twist ikke var blevet undersøgt otte. Resultaterne ovenfor viser, at en specifik kombination af fire faktorer, FGF2, BMP4, TGFp1 og insulin forårsager en meget stærk og fuldstændig EMT induktion, ikke observeret før. Nærværende undersøgelse viser, at de vigtigste EMT gener i Zeb- og Twist-familier også opreguleres. Denne undersøgelse giver derfor det første bevis på, at der ikke er selektiv opregulering af enkelte gener, men resultaterne viser, at alle centrale EMT familier er aktive i det foreslåede cellekultursystem.

EMT er også blevet observeret i epiteliale cancere uden for hjernen, såsom lunge-, bryst-, tyktarms- og mavecancer 29. Flere modeller til at studere EMT er i brug for disse tumorer 30-32, Som kommer dog med betydelige begrænsninger: (a) anvendelse af transformerede tumorcellelinier transporterer multiple genetiske og epigenetiske ændringer 33; at identificere hæmmere af EMT for tidlige stadier af kræft, sen-fase kræftceller er utilstrækkelige; (B) serum-afhængige kulturer, der indeholder forskellige udefinerede vækstfaktorer; dette gør identifikation af kritiske faktorer meget vanskeligt. Endvidere er eksperiment reproducerbarhed forringet siden serum kvalitet varierer fra parti til parti; (C) serum indeholder hæmmere og enzymatiske aktiviteter muligvis inaktiverer potentielt nyttige eksogene forbindelser; (D) behovet for enzymer til celle passage, der nedbryder celleoverflademolekyler; (E) at bestemme EMT agonister til at fremme fysiologisk EMT, er der behov for normale celler til at teste induktion. Tumorcellelinier modeller er utilstrækkelige til at finde stoffer, der fremmer regenerering i normale stamceller.

Migration er også påkrævet for normale processer, såsom sårheling og Regeneration af den skadede hjerne 18. Efter traumatisk hjerneskade og slagtilfælde, er nødvendige for at migrere til læsionsstedet at deltage i regenerering 4,34 NSC'er. Det nuværende system kan også anvendes til at identificere stoffer, der fremmer migration og invasion. Som vist ovenfor er migration induceret ved start med BMP4-behandling. Hvis cellerne ikke udsættes for BMP'er men i stedet hidtil ukendte forbindelser, kan disse erstatte BMP handling, som vil bidrage til at identificere nye BMP agonister. Med en reporter, der indikerer PDPN ekspression, skala testning for hidtil ukendte stoffer stort bliver mulig; hvis en hidtil ukendt forbindelse kan erstatte BMP'er, kan PDPN udtrykkende celler automatisk identificeret.

Det foreslåede system er også nyttigt at undersøge celle-signalering interaktioner. Vores resultater viser, at BMP effekt på migration kunne forbedres ved TGFp1 aktivering. Resultaterne afdække en additiv vekselvirkning mellem BMP- og TGFβ-signalering. Men yderligere signalveje, såsom hak, Wnt- eller EGFR- / MAPK- og andre signalering kaskader kan være involveret. Derfor er der behov for yderligere undersøgelser på BMP / TGF-interaktioner og krydstale til andre veje. Desuden kan den lydhør centrale cortex isoleres fra genetisk modificerede mus, som kan hjælpe til at belyse underliggende mekanismer kørsel EMT. Sammenfattende kan det EMT modelsystem beskrevet her være nyttig inden for stamcellebiologi og regenerering, samt i cancerforskning. Det kan anvendes til screening af lægemiddel-biblioteker for stoffer, der hæmmer eller forbedrer migration og invasion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev støttet af universitetet i Basel Science Foundation og den schweiziske National Science Foundation med et tilskud til MHS og AG (SNF IZLIZ3_157230). Vi takker: Dr. Tania Rinaldi Burkat for generøst leverer infrastruktur alle medlemmer af Bettler gruppen for diskussioner og kommentarer. Vi takker Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Schweiz) til professionel og kompetent installation af Full HD MC170 videokamera (Leica Microsystems, Schweiz).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Tags

Developmental Biology neurale stamceller epitelceller til mesenkymale overgang migration, gliom cancer invasion Snail1 føtalt bovint serum-frit FGF2 BMP4 TGFp
En enzym- og Serum-fri neural stamcelle Culture Model for EMT Investigation Egnet til Drug Discovery
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D.,… More

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter