Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Модель энзимов и бессывороточной Neural стволовых клеток культуры для ЕМТ Исследование Пригоден для обнаружения лекарственных средств

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

Эпителиальные к переходу мезенхимальных (EMT) описывает процесс эпителий transdifferentiating в мезенхимы. EMT является фундаментальным процессом во время эмбрионального развития, что также обычно происходит в глиобластомы, наиболее частой злокачественной опухоли головного мозга. ЕМТ также наблюдалась в нескольких карциномах вне мозга, включая рак молочной железы, рак легкого, рак толстой кишки, рак желудка. ЕМТ централизованно связан с злокачественности путем содействия миграции, вторжения и образование метастаз. Механизмы индукции EMT до конца не изучены. Здесь мы опишем систему в пробирке для стандартизированной изоляции корковых нервных стволовых клеток (NSC , ) и последующим EMT-индукции. Эта система обеспечивает гибкость в использовании либо отдельных клеток или эксплант. В этой системе, крысы или мыши эмбриональные переднего мозга NSC, культивируют в определенной среде, лишенной сыворотки и ферментов. В NSCs выражается OLIG2 и Sox10, два транскрипционных факторов наблюдается в oligodendrocклетки-предшественники YTE (OPCs). С помощью этой системы, взаимодействие между FGF - , BMP- и TGF - beta-сигнализации с участием Zeb1, Zeb2 и Twist2 наблюдались где TGF - beta-активация значительно улучшена миграцию клеток, что указывает на синергический BMP- / TGF - beta-взаимодействия. Результаты указывают на сеть, FGF-BMP- и TGF-beta-сигнализации, которые будут вовлечены в ЕМТ индукции и поддержания. Эта модель система актуальна для исследования EMT в пробирке. Он является экономически эффективным и показывает высокую воспроизводимость. Она также позволяет для сравнения различных соединений в отношении их миграции ответов (количественное измерение расстояния) и высокопроизводительного скрининга соединений ингибировать или усиливать EMT (качественное измерение). Модель поэтому хорошо подходит для тестирования библиотек лекарственных веществ, влияющих на EMT.

Introduction

В течение нескольких стадиях эмбрионального развития, эпителиальные клетки теряют свою твердую приверженность друг к другу (например, плотные соединения) и приобретают миграционный фенотип в процессе , называемом эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT) 1. ЕМТ требуется для формирования дополнительных типов клеток, таких как мезенхимальные клетки нервного гребня, популяции , которая отделяет от нейроэпителии 2. ЕМТ не является существенным только в течение эмбриональной стадии , но также требуется на более поздних этапах взрослой жизни для поддержания физиологических процессов во взрослом организме, таких как заживление ран 3 и центральной нервной системы (ЦНС) регенерации в демиелинизирующих поражений 4.

Эпителиальные опухоли , как известно , для повторной активации EMT в качестве стадии инициирования по миграции, инвазии и метастазирования, в конечном счете , ведет к прогрессированию рака 1,3. ЕМТ действительно централизованно связан с сильной миграции 1,3. Клеточные шаги Conditioning, инициируя, претерпевая и поддержание EMT до конца не изучены и нуждаются в дальнейшем исследовании.

Здесь стандартизированная система в пробирке EMT модель , основанная на NSCs, с определенными факторами роста и средств массовой информации (без сыворотки и без использования фермента) представлен. Эта модель система имеет значение для ученых, работающих над ЕМТ. Белок семейства Snail, Зеб и Twist было показано , что иметь решающее значение для ЕМТ как в развитии и болезни 1. Улитка, Зеб и Twist семьи также участвуют в представленной системе. Система основана на конкретной области переднего мозга, которые, как правило, не претерпевают ЕМТ обеспечивает особое преимущество для изучения исходных событий во время EMT индукции.

Система модель потенциально может быть применена для изучения EMT в эпителии за пределами центральной нервной системы, так как ключевые EMT индукторы, такие как улитка, Зебом и скрутить белки, также найдены во время EMT в системах тканевых за пределами центральной нервной системы. Эта модель system позволяет стандартизированный изоляцию NSCs от развивающейся коры, чтобы изучить особенности стволовых клеток в целом и, в частности, EMT. С помощью этой системы, мы выделили NSCs, индуцированный ЕМТ и изучали последующую миграцию под действием FGF2 и BMP4. Мы наблюдали, что FGF-и взаимодействует BMP сигнализации с TGF-beta-сигнализации для содействия миграции клеток, что подтверждает модельной системы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры на животных следовали «Руководство по уходу и использованию лабораторных животных» (NIH публикации, 8 - е издание, 2011 г.) и были утверждены Комитетом по охране животных Базель (швейцарских руководство по уходу и использованию животных) путем. С помощью этих принципов протокол животное считается из "степени тяжести низших животных".

1. Подготовка расширения среды

Примечание: Работа в асептических условиях в качестве стандарта для тканевой культуры.

  1. Возьмем две 15 мл пробирки и добавляют 5 мл L-глутамина DMEM / F12 (1: 1) с 500 мл среды бутылки в каждую из двух 15 мл пробирок. К первой 15 мл пробирку, добавляют 50 мг человеческого Apo-трансферрин, 50 мкл путресцина 1 М маточного (конечная концентрация 0,1 мМ) и 30 мкл селена натрия 500 мкМ сток (конечная концентрация 30 нМ).
    1. Смесь фильтруют через шприцевой фильтр 0,2 мкм в исходную DMEM / F12 бутылки.
  2. Ко второй 15 мл пробирку, добавляют 12,5 мг инсулина. Добавить6 - 9 капель 1 М NaOH. Vortex, чтобы полностью растворить инсулин. Смесь фильтруют через шприцевой фильтр 0,2 мкм в исходную DMEM / F12 бутылки.
    Примечание: NaOH является токсичным и едким веществом. Используйте защитные перчатки, пальто, и защитные очки.
  3. Добавьте 5 мл пенициллина (10000 ЕД / мл) / стрептомицина (10000 мкг / мл) / амфотерицин В (25 мкг / мл) в бутылке / F12 DMEM.
  4. Добавляют 5 мл 200 мМ L-глутамина на складе свеже размороженной или олигопептиды, содержащие глутамин (200 мМ L-аланил-L-глутамин-дипептид) к флакону / F12 DMEM.
  5. Встряхнуть хорошо. Приготовьте 50 мл аликвоты.
    Примечание: Расширение среда может храниться в течение не менее 2-х недель при температуре 4 ° С. Аликвоты трубки показывают меньшие изменения рН среды по сравнению с хранящейся в 500 мл бутылки.

2. Приготовление пассирования среды

  1. К 1 л Ca 2 + - и Mg 2 + -бесплатно HBSS медиа, добавьте 990.85 мг глюкозы (5 мМ конечная концентрация) и 840.10 мг NaHCO 3 Примечание: Пассирование среда может храниться в течение не менее 4 недель при температуре 4 ° С.

3. Подготовка факторов роста

  1. Приготовьте стерильную 1X PBS с 1% BSA (PBS-BSA) в одиночку или с соляной кислотой (HCl) при 4 мМ (PBS-БСА-HCl).
    Внимание: HCl вызывает коррозию и токсичен и требует специальных мер безопасности (пальто, очки, перчатки, капюшон).
  2. Растворить 10 мкг / мл рекомбинантного человеческого фактор роста фибробластов 2 (rhFGF2) в PBS-BSA (10 нг / мл конечной концентрации), 10 мкг / мл рекомбинантного человеческого костного морфогенетического белка 4 (rhBMP4) в PBS-BSA (10 нг / мл, конечная концентрации), и 20 мкг / мл рекомбинантного человеческого фактора роста трансформирующий & beta; 1 (rhTGFβ1) в PBS-БСА-HCl (40 нг / мл, конечная концентрация).
    1. Не фильтровать стерилизовать. Подготовить аликвот.
      Примечание: аликвоты фактор роста можно хранить при-20 ° C в течение по крайней мере 2-х лет.

4. Покрытие клеточных культуральных чашках

  1. Растворите 1,875 мг поли-L-орнитин (ПЛО) в 500 мл дистиллированной H 2 O , чтобы приготовить 250X ПЛО запас. Фильтр стерилизовать с помощью шприца 0,2 мкм фильтр и сделать 2 мл аликвоты.
    Примечание: Эти аликвоты можно хранить при -20 ° С в течение не менее 2-х лет.
  2. Растворите 1 мг бычьего фибронектин в 1 мл стерильной дистиллированной H 2 O , чтобы подготовить 1,000x фибронектина запас. Не вихрь, так как это может свернуться липкий белок. Осторожно встряхните вручную в течение 10 мин.
    1. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре при периодическом встряхивании. Проверка полного растворения. Подогреть раствор до менее чем 37 ° С для полного растворения фибронектина. Не фильтровать-стерилизовать.
      Примечание: Раствор можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 6 месяцев.
  3. Использование плазмы предварительно обработанных пластиковой посуды клеточной культуры (100 мм или другие размеры, требуемые дляэксперимент). Для оценки миграции, используют 35 мм блюда с сеткой 500 мкм. Инкубируйте блюда в течение ночи с 2 мл 1x ПЛО в течение 12 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе тканевых культур с. Промыть два раза с 2 мл 1X PBS.
  4. Добавить 2 мл 1x фибронектина (/ мл конечной концентрации 1 мкг) и инкубировать блюда в течение минимум 12 часов при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе. Удалить фибронектина как раз перед металлизации клетки.
    Примечание: посуда, покрытой фибронектином, могут храниться в течение не менее 2-х недель при 37 ° С.

5. Унифицированная Вскрытие и подготовка коркового субвентрикулярная зоны (СВЗ)

  1. Получить крысы эмбриональных день 14,5 (E14.5, Sprague-Dawley) и E13.5 мыши (C57BL / 6) эмбрионов от таймерной-спариванию. не Мате животных с 18:00 до 08:00 следующего утра. Полдень после дня вязки считается E0.5.
  2. Обезболить беременных животных с 5% изофлуран и 0,8 л / мин потока кислорода. Проверьте реакцию при сжатии лапой с острым диссперегиба щипцами. Обезглавьте животное. Избегайте CO 2 удушья , как CO 2 влияет на восстановление стволовых клеток.
  3. Получение эмбрионов с помощью кесарева сечения.
    1. Поместите животное в положении лежа на спине и дезинфицировать меха с 70% этанола. Используйте хирургические щипцы и ножницы, чтобы сделать V-образный разрез кожи около 8 см в нижней части живота над маткой. Надрезать только кожа с мехом, сохраняя при этом мышечные стенки нетронутыми.
    2. Используйте свежие щипцы и ножницы, чтобы надрезать мышцы и брюшной мышечной стенки, чтобы войти в брюшину.
    3. Определить матка в нижней задней брюшины. Удалить матку резкого отделения от окружающих тканей.
    4. Промыть матку с эмбрионами с стерильного 1x PBS и место в ледяной 1x PBS.
    5. Используйте остроконечный ножницы , чтобы открыть утробные стены , чтобы освободить эмбрион эмбрионом под микроскопом рассечение (3х кратным увеличением, Фигура 1В). Используйте пару щипцов для удаления эмбриональные оболочки (
    6. Проверьте правильность стадии развития Атласом Проявочной Rat нервной системы 5. Правильный размер эмбриона показан на рисунке 1В.
    7. Проверьте правильность возраста дополнительно наличием начала формирования цифр в передней лапы крысы (FL) , как показано на рисунке 1А.
      Примечание: задняя конечность (HL) еще не показывают цифры разделения (рис 1B).
  4. Для диссекции, трансфер эмбрионов с непокрытыми чашках Петри, заполненных охлажденным льдом 1x PBS. Выполните рассечение под стерео микроскопом рассечение (3X до 20X увеличением) с использованием автоклавного тонких щипцов.
    Примечание: Чашки Петри предотвратить прикрепление ткани к поверхности посуды, которая может произойти с плазменными покрытием посуды для культивирования клеток. Уточненные проволоки иглы вольфрама или аналогичные также полезны для определенных этапов рассечение.
  5. Снимите кожу головы и череп, начиная в интеrsection развивающегося телэнцефалоне (TEL) и диэнцефалона (DI) (рис 1B), потянув одновременно спереди и сзади с двумя щипцами, чтобы получить доступ к развивающейся нервной трубки (рис 1C).
  6. Определение среднего мозга-заднего мозга-граница (MHB, черная стрелка голову на рисунке 1В-D), отделение мезенцефалона (MES) от ромбовидный мозг. Вырезать ромбовидный мозг как раз на уровне или ниже MHB (рис 1D, треугольной стрелкой).
    Примечание: Дополнительное подкожное пространство в MHB облегчает удаление кожи без ущерба для нервной трубки.
  7. Разорвите связь между телэнцефалона / диэнцефалона у основания черепа с лицевого скелета (рис 1E). Это приводит блок , содержащий телэнцефалона, промежуточного и среднего мозга (TEL-DI-MES) (рис 1F-H).
  8. Перенести блок TEL-DI-MES в расширительном среде на льду. Держите его COMPLETEly покрыты в расширительном среде в непокрытую Петри. Держите блок на мезенцефалона с парой щипцов, чтобы избежать касания телэнцефалона, который содержит корковой SVZ с NSCs.
  9. Повторите шаги 5,5 до 5,8 со всеми эмбрионами (рис 1F-H).
  10. Передача одного TEL-DI-MES блок на свежий ледяной 1x PBS. Сокращение вдоль пунктирной линии на переднем мезенцефалона (рис 1F-H), отделяя мезенцефалона от промежуточного мозга, как показано на рисунке 1I.
  11. Отделить DI от TEL разрезанием вдоль пунктирными линиями на рисунке 1F. См изолированный телэнцефалоне на рис 1J.
  12. Разделение двух полушарий конечного мозга, разрезанием вдоль пунктирной линии на рисунке 1J. Это приводит к двум разделенными полушариями , как показано на рисунке 1К.
    Примечание: левое полушарие увеличивается на рисунке 1 л.
  13. Определить срединную бандуlionic Возвышение (MGE, рис 2А; *) и боковые ганглионарный бугорок (LGE, рис 2А; +) виден через interventriculare будущего отверстия.
    1. С помощью пинцета или иглы, рассекают вдоль прямой линии на пересечении между MGE и LGE и передней коры головного мозга (АНТ-CTX, рис 2В). Вырезать прямую через кору, гиппокамп (бедра) и сосудистое сплетение (CP). Это отделяет переднюю кору головного мозга , включая обонятельные луковицы (ОВ) от ганглиозных возвышений (GE, рис 2B, C).
  14. Вырезать вторую прямую линию на пересечении хвостового ганглионарный бугорок (КГЭ, рис 2C, D) и задней коры (рис 2С), опять прорезая кору, гиппокамп и сосудистом сплетении.
  15. Расплющить телэнцефалона. Полностью удалить задний полюс и обонятельной луковицы (рис 2D). идентифицироватькорковый рубчик , содержащий гиппокампе и сосудистое сплетение (рис 2С), как определено выше 6,7.
    Примечание: Гиппокамп имеет более тонкий, чем нейроэпителии коры. CP содержит красные сосуды.
    1. Отделить кортикальный рубчик от коры, в результате чего размер коры , идентичный размеру ганглиозных возвышений (рис 2D). Это приводит к блоку коры (ткани - мишени) и ганглиозных возвышений (GE, рис 2D).
  16. Переверните блок Cortex-GE с желудочковой (внутренней) стороны к поверхности посуды.
    Примечание: Внешняя поверхность полусферы столкнется экспериментатору (рис 2E). На внешней поверхности сосуда являются содержащие Оболочек крови (рис 2E).
    1. Зафиксируйте GE на поверхность тарелки с левой стороны и очистить мозговые оболочки с парой щипцов в правой (доминирующий) стороны (рис 2F Примечание: Это технически наиболее требовательных шаг, поскольку мозговые оболочки сильно прилипают к коре головного мозга. Разделение оболочках из коры облегчается за счет сокращения совершенно прямую линию (не зазубренный) на этапах 5.13.1 и 5.14.
  17. Повторите шаги 5,12 до 5,16 для другого полушария и всех эмбрионов. Обрежьте корку вдоль LGE на расстоянии половины основного диаметра LGE (рис 2G, 2H). Расчлененный коры головного мозга охватывает область 1,2 мм х 2,4 мм (рис 2Н) и включает в себя СВЗ / зародышевый слой с NSCs.

6. Подготовка эксплантата культур

  1. Отрежьте корку в эксплантатах диаметром менее 400 мкм (рис 2i). Используйте сетку с 400 мкм (Дополнительный рисунок 1) , расположенную ниже рассечение чашки Петри для справки (рис 2Н и 2I). Передача всех эксплантов в свежую чашку Петри с льдом соЛ.Д. расширение среднего.
  2. Удалить фибронектина из тканевой культуры блюдо (шаг 4.4). Дайте ему высохнуть. Добавляют 1 мл среды холодного расширения в центре 35 мм блюдо с сеткой размерностью 10 мм х 10 мм (рисунок 3). Разрешить среда для формирования сферической капли (рисунок 3).
  3. Вставьте до 8 эксплантов в центре капли. Эксплантаты должен быть идеально расположен на сетке, по меньшей мере, 3 мм расстояние между друг с другом для анализа миграции (см раздел 8).
  4. Инкубируйте блюдо в течение приблизительно 1 часа в инкубаторе для клеточных культур (37 ° C, 21% O 2, 5% СО 2) для прикрепления эксплантов. Разрешить эксплантаты отстояться и прикрепляются к поверхности, покрытой фибронектином. Не трясите блюдо, так как эксплантов может отсоединиться и выйти из оптимального центра сетки.
  5. Через 1 ч инкубации (37 ° С, 21% O 2, 5% СО 2), заполнить блюдо в общем объеме 2 мл среды расширения плюс роста Fактеры или вещества, представляющие интерес для тестирования и инкубировать.
    Примечание: Ни один ферментативное расщепление, ни в сыворотке крови или центрифугирование необходимы для подготовки эксплантов. Это является оптимальной для целостности клеток.

7. Подготовка НСК одноклеточ- культуры

  1. Разминка расширение и пассирования среду при 37 ° С.
  2. Передача расчлененные части коры (от стадии 5.17) в 15 мл пробирку со средой холодной расширения (труба A). Центрифуга коры головного мозга штук в течение 5 мин при 1200 х г. Аспирируйте супернатант. Добавить 200 мкл среды предварительно нагреты расширения для ресуспендирования коры головного мозга штук.
  3. Добавьте 700 мкл подогретого пассирования среды к 15 мл трубки с наконечником P1,000 (труба A). Аккуратно ресуспендируют осадок. Поместите наконечник в нижней части 15 мл трубки. Аккуратно и медленно диссоциируют кусочки ткани путем отсасывания три раза с наконечником P1,000.
    Примечание: Пассирование среда способствует разделению клеток и требуется, чтобы избежать использования ферментов.
  4. Дайте трубку сидеть в течение 30 до 60 секунд для больших (тяжелых) недиссоциированных части, чтобы осесть на дно. Одиночные диссоциированные клетки остаются в надосадочной жидкости. Помещают около 700 мкл супернатанта в свежую 15 мл трубки (трубки B).
  5. Повторите шаги 7.3 и 7.4, чтобы отделить большие куски.
  6. Повторите шаги 7.3 и 7.4 во второй раз, чтобы отделить крупные куски. Перенесите все супернатант в свежую 15 мл трубки (трубки B).
  7. Добавить расширительный среду до общего объема 5 мл. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Оценка омертвевших клеток трипановым-синим окрашиванием.
    Примечание: Малые NSCs переносят шаги 7.2 до 7.6 лучше, чем большие клетки. Из 10 эмбрионов ожидают около 4 × 10 6 клеток с 10% мертвых клеток.
  8. Для расширения NSCs, пластины 1,5 × 10 6 клеток на 10 см , покрытой фибронектином блюдо культуры ткани в объеме 8 мл среды расширения. Для стандартного расширения, добавьте 8 мкл 1,000x rhFGF2 запаса. Добавить 8 мкл rhFGF2 каждый день и изменить менядиам каждый день.
    Примечание: Кора на данном этапе развития содержит большинство NSCs и лишь меньшинство дифференцированных клеток. Дифференцированные клетки меньшинства не реагируют на rhFGF2 обращения и умирают во время культивирования расширения.
  9. Проход расширился NSCs на 60% слияния.
    1. Для прохождения NSCs, удалите расширения среды. Вымойте клетки быстро три раза с 5 мл пассирования среды. Подождите 2 - 4 мин. Без Са 2+ и Mg 2+ клетки медленно отделяться от поверхности, округление. Проверьте отряд клеток под микроскопом фазы. Подождите еще несколько минут, если это необходимо, пока не наблюдается визуально отрыв от поверхности.
      Примечание: Отдельные клетки полностью отделить, но большинство клеток будет по-прежнему придерживаться поверхности посуды. Продолжительность, необходимое для отрыва зависит от продолжительности фибронектина покрытия. Короткий фибронектина покрытие (12 ч или менее) приводит к более быстрому открепления клеток. Для более длительных экспериментов (>; 1 неделя) фибронектина покрытие более 24 ч рекомендуется.
  10. С помощью 10 мл пипетки, чтобы аккуратно открепления клеток с поверхности. Собирают пассирования среду 5 мл с клетками и передавать его в свежую 15 мл пробирку. Повторите с дополнительными 5 мл пассирования среды.
  11. Диссоциируют клеток в 15 мл пробирку с помощью пипетки вверх и вниз три раза, помещая 10 мл пипеткой в ​​нижней части трубы. Спин пробирку в течение 15 мин при 1200 х г при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 2 мл среды расширения. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Используйте трипановым синим для оценки мертвых клеток.
    Примечание: После расширения до 60% слияния, ожидать 4 - 5 × 10 6 клеток с мертвой подсчета клеток на уровне около 10%.
  12. Пластина 8 х 10 5 клеток на 10 см блюдо для дальнейших пассажей.

8. Оценка миграции

  1. Для оценки миграции, изолировать эксплантов в соответствии с разделом 5. Семя эксплантов в35 мм сетки блюда. Через час после посева, добавьте FGF2 (rhFGF2). Поместите блюда в инкубаторе C 37 ° в течение 2-х дней.
    Примечание: Для оптимального крепления эксплантов, избегать перемещения блюд.
  2. Удалить среду на 1000 мкл кончика. Добавляют 2 мл расширения среды на 1000 мкл кончика , начиная с внутренней окружности (рисунок 3). Это уменьшает поверхностное натяжение на эксплантов.
  3. Добавьте факторы роста сами по себе или в комбинации, как требуется для эксперимента. Используйте FGF2 / BMP4 / TGF 1 в качестве положительного контроля. Примечание: В этом эксперименте, 2 мкл FGF2 на 35 мм блюдо, 2 мкл BMP4 и 4 мкл TGF 1 добавляют отдельно и в комбинации (рисунок 5).
    1. Добавление дополнительных факторов и / или тестируемых веществ. Держите посуду снова нетронутым в течение 2 дней при температуре 37 ° С.
  4. Возьмите фотографии эксплантов на инвертированный микроскоп.
    Примечание: Живые эксплантов дают лучшие изображения фазового контраста, чем фиксированные клетки. Оба они могут быть использованы.
  5. Для миграцииоценки, использовать графическое программное обеспечение , которое позволяет производить измерения элементов изображения (например, Фиджи 8).
  6. Измерьте блюдо сетки на расстоянии 500 мкм в пикселях и использовать его в качестве внутреннего стандарта.
  7. Определить центр эксплантов в качестве начальной точки миграции. Измерьте расстояние между центром эксплантов и внешней группой из 10 клеток.
    Примечание: Все клетки мигрируют центробежно от эксплантов. Они спонтанно образуют лист на периферии при обстоятельствах тестируемых (рисунок 5).

9. Оценка вторжения

  1. Готовят покрытой фибронектином культуры ткани, 24-луночные планшеты в соответствии с разделом 4 Протокола.
  2. Поместите 300 мкл теплой среды расширения в верхнюю лунку инвазии клеток камер. Инкубируйте камеры в течение 30 мин при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  3. Удалите среды расширения из верхней скважины и поместите камеру Бойдена в покрытую пластину 24-луночного.
  4. Добавить 500 мкл теплой среды расширения с 0,5 мкл rhFGF2 и 0,5 мкл rhBMP4 до дна скважины.
  5. Прохождение NSCs и подсчитывать, как описано в разделе 7. Проходы 1 до 4 пригодны.
  6. Пластина 5 х 10 5 клеток в объеме 300 мкл теплой среды расширения с 0,3 мкл rhFGF2 и 0,3 мкл rhBMP4 в верхней лунке камеры Бойденом.
  7. Культура сеяные NSCs в течение 24 часов.
  8. Добавьте дополнительные факторы и / или тестируемых веществ в камеру и культуре клеток в течение еще 48 часов.
    Примечание: Если клетки являются инвазивными, они будут проходить от верхней скважины через базальной мембраны слоя до забоя скважины. Инвазивные клетки будут цепляться к нижней части камеры Бойден.
  9. Следуйте протоколу, предоставляемая производителем. Используйте ватные тампоны (входит в состав набора для анализа вторжения), чтобы удалить неинвазивных клетки в верхней скважины путем очистки в два раза.
  10. Удалите среду из лунок и добавляют среду расширения 500 мклплазменной мембраны пятно для живых клеток и с DAPI ядерной красителя в лунки.
  11. Инкубировать в течение 10 мин при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
    Примечание: красители будут интегрированы в мембрану и ядра инвазионных клеток, соответственно, для оптимальной визуализации 8. Вариант: Опустить мембранный краситель плазмы при многоцветной иммуноцитохимия планируется.
  12. Удалите среду с красителями и дважды моют с расширением среды. Визуализируйте и считать инвазивные клетки с перевернутой флуоресцентного микроскопа , как было показано ранее 8.
    Примечание: Некоторые инвазивные клетки могут быть отделены от нижней части камеры и упала на поверхность значительно ниже, где они прилипают к поверхности с покрытием. Для полного анализа включают клетки на поверхности скважины.
  13. Удалите среду и фиксации клеток в ледяном свежие 4% PFA в течение 10 мин. Вымойте 3x с 1x PBS. Выполните иммуноцитохимии по инвазивным клеток, как описано выше 8-10.

    14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эта система модель ЕМТ основана на стандартизированном изоляции NSC , как в виде отдельных клеток или в качестве эксплантов из определенной области развивающейся нервной трубки, центральная кора головного мозга (фигуры 1 и 2). Для количественной оценки, эксплантаты высевают право в центре 500 мкм сетки блюдо культуры (рисунок 3). Эксплантатов центральной коры вначале были облучены FGF2 в течение двух дней, а затем еще на два дня в различных комбинациях факторов роста (таблица 1). Мы начали с коры головного мозга, которая больше, чем в других регионах развивающегося нервной трубки. Мы заметили , что только эксплантаты , культивируемые в BMP4 показал миграционный ответ (Таблица 1 и Дополнительный рисунок 2).

Далее podoplanin выражение (PDPN) анализировали при определенных условиях. PDPN является трансмембранным sialomucin-подобный белок , который был связан с вторжением в нескольких видов рака 11,12 , а также в NSCs 8. Доля PDPN клеток , экспрессирующих увеличивается в высокосортного глиом 13. PDPN также связано с низкой выживаемостью пациентов глиобластомы 14. Кроме того, PDPN было показано, является маркером злокачественной прогрессии в нескольких опухолей , включая карциномы молочной железы, легких, толстой кишки 15,16. PDPN выражается как в инвазивных, а также мигрирующих NSCs 8. Используя вышеупомянутый протокол, выражение PDPN сравнивали с контрольными, FGF2, только, в эксплантатах, подверженных TGF 1 и только BMP4 или в комбинациях. Выражение PDPN был обнаружен во всех BMP4 и TGF 1 / BMP4 обработанных эксплантов. В противоположность этому , ни один PDPN не наблюдалось у эксплантов контроля в одних FGF2 или в эксплантатах с монотерапией TGF 1 (таблица 2 и рисунок 4). Кроме того клетки с миграционным фенотипом вызывали у BMP4 и TGF 1 / BMP4-подвергающиеся эксплантов, в то время как у контрольных эксплантатах (только FGF2) и TGF 1 само по себе не показывают мигрирующие клетки (таблица 1). Наблюдение мигрирующих клеток обеспечивает низкую стоимость, Прямодушная качественную оценку.

Кроме того, мы тестировали миграционный ответ и EMT индукции нескольких областей развивающейся нервной трубки к BMP4 (таблица 2). 400 мкм эксплантаты получают из центральной коры, задней коры (меченый заднего полюса), то MGE и мезенцефалона, как показано на рисунке 1. Эксплантаты все подвержены FGF2 в течение двух дней, а затем два дня в FGF2 с BMP4 , Миграция была определена появлением плоских мигрирующих клеток с передней и задней кромки (рисунок 5 и Дополнительной рисунок 2). Сильная индукция мигрирующие клетки из заднего мозга и промежуточный ответ от MGE и СМОголовной мозг наблюдалось (таблица 2). 145 из 146 эксплантов центральной коры показал миграционный ответ в FGF2 / BMP4. Таким образом, центральная кора головного мозга показал , наиболее продуманное индукцию мигрирующих клеток всех протестированных эксплантов (таблица 2). Пропуски BMP4 отменили любой миграционный ответ (таблица 1 и 2, и данные не показаны).

Для количественной оценки факторов роста потенции, миграция расстояние измерялось в эксплантатах, культивируемых в нескольких факторов роста. Эксплантаты культивируют, как описано выше в течение двух дней в FGF2, а затем в течение еще двух дней в FGF2 без факторов (контроль) или индивидуальных или комбинированных BMP4 и TGF 1. В эксплантов контрольных сильное распространение наблюдалось в ответ на FGF2, как и следовало ожидать. Эксплантаты получены из кортикальной SVZ и содержат в большой части NSC , которые , как известно пролиферируют в ответ на FGF2 17. Управление в.п.LLS достигла 689 ± 14 клеток TGF 1 582 ± 49 мкм (рис 5.). BMP4-группа показала среднее расстояние миграции 935 ± 91 мкм. Для сравнения TGF 1 / BMP4-клетки мигрировали значительно дальше, 1,150 ± 23 мкм (рисунок 5). Результаты показывают, что BMP4 является индуцируя миграцию в FGF2 подвергшихся воздействию NSCs. Эта миграция может быть дополнительно повышена путем TGF 1. Таким образом, сочетание FGF2, BMP4 и TGF 1 является наиболее эффективным, чтобы вызвать миграцию. Таким образом, модель системы культуры клеток позволяет как качественные, так и количественные оценки миграции.

EMT был связан с факторами транскрипции (TFS), такие как Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2, Twist1, Twist2 в различных системах , включая эпителиального рака, таких как рак молочной железы, рак толстой кишки, рак легких , а также в головном мозге опухолей 1,18. Мы чобъявление ранее было показано , что FGF2 и BMP2 или BMP4 могут вызывать Snail1 и Snail2 8,9. Используя описанную выше систему, мы исследовали уровни экспрессии других ТФ ЕМТ связанных. Никаких изменений в экспрессии Twist1 не обнаружено; с Twist1 будучи при низких уровнях экспрессии во время воздействия FGF2 (данные не показаны). В модели клеточной культуры регуляция Zeb1 и Zeb2 во время FGF2-облучения и Twist2 во время FGF2 / BMP4-облучения наблюдалось (рисунок 6).

NSC , как известно, способствуют популяции клеток - предшественников олигодендроцитов (OPCs) 8,19,20. Несколько линий доказательств указывают на то, что NSC , и , в частности , OPCs может быть клетка происхождения глиом 21,22. Для характеристики выше модели далее, мы исследовали экспрессию маркеров OPC. Мы наблюдали, что FGF2 подвергшихся воздействию NSC, продемонстрировали коэкспрессии OLIG2 / Nestin сd Sox10 / Nestin более чем на 90% (рисунок 7). Это наблюдение показывает, что NSCs показывают ОРС-функции в нашей системе. В самом деле, ОРС-функции коррелируют с повышающей регуляции Zeb'1 и Zeb'2 (6 и 7). Эти результаты свидетельствуют о том, что FGF2-расширение делает вывод идентичности OPC, о чем можно судить по OLIG2 и Sox10, в то же самое время инициирует первые Зебу -На шаги ЕМТ.

Рисунок 1
Рисунок 1: Стандартизированная Эмбрион и переднего мозга Препарирование для НСК изоляции и EMT индукции. (A) Левая передняя конечность крысы E14.5 эмбриона после кесарева сечения. Каждая передняя конечность цифра отмечен черной стрелкой наконечником. Обратите внимание , начиная формирование цифры , типичную для E14.5. (B) Rat E14.5 эмбрионов после удаления корпуса. Обратите внимание на хэш (#) в спинном диэнцефалона шHICH является идеальным , чтобы начать удаление кожи / черепа зачатка. (С) Кожа / череп уже в основном удалены. Граница между удаленным и неснятой кожей отмечен двумя треугольными наконечниками. Кожа может быть снята спереди из переднего стрелка и кзади от задней стрелкой. (D) Кожа / череп теперь полностью удалены. Обратите внимание на насечку среднего мозга-заднего мозга границы (стрелка) и разреза только в каудальном направлении к нему, отмеченные стрелкой. (Е) телэнцефалоне-промежуточный мозг-средний мозг (TEL-ди-MES) блок удален от остальной части зародыша . (F) Улучшенный вид TEL-DI-MES блока. Черепно остается. (G) Oblique вид сверху. (H) подчиненная вид TEL-DI-MES блока. (I) и часть среднего мозга промежуточного мозга отделены друг от телэнцефалона с передней частью промежуточного мозга. Верхняя часть: Передний вид обоих везикул конечного мозга. Внизу: Righт вид сбоку мезенцефалона, верхняя часть находится краниально (J) Верхняя часть :. оба везикулы без конечного мозга диэнцефалона. Низший вид для иллюстрации полного удаления диэнцефалона. Звездочка изображает MGE. Внизу:. Передняя часть промежуточного мозга (K) Топ: Оба полушария разделены в межполушарной щели. Левое полушарие на левой стороне. Звездочка изображает MGE. Плюс знак изображает LGE. (L) Увеличение левого полушария с срединной точки зрения. Право лица краниально, левый каудально, вершина спинного, нижняя вентральной соответственно. Звездочкой (*) расположен в MGE. Знак плюс (+) находится в LGE. ч, корковое кромка; FL, передних конечностей; ди, промежуточный мозг; тез, средний мозг; MHB, средний мозг-граница заднего мозга; HL, задних конечностей; LGE, боковая ганглионарный бугорок; MGE, медиальная ганглионарный бугорок; О.Б., обонятельная луковица; шт, задняя кора головного мозга; Rho, ромбовидный мозг; тел, конечный мозг. Сетка на каждом изображении показывает 2 мм толщиной линии с четырьмя пересечения с тонкими линиями каждый400 мкм. Шкала масштаба на всех изображениях:. 2 мм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: стандартизован Кортикальная СВЗ рассечение для НСК изоляции и EMT индукции. (A) Медиана вид левого полушария. Через отверстие Монро в MGE и LGE видны, отмечены звездочкой и знаком плюс. (В) обонятельная луковица удаляется только краниально от MGE-LGE. (C) Задний полюс коры удаляется сразу за КГЭ . (D) Верхняя часть : корковое кромка отделена от коры. Слева: задний полюс. Средний: комплекс, содержащий центральную часть коры и блока КГЭ-LGE-MGE. MGE и LGE лицом вправо. Справа: обонятельная бульб. (Е) Блок КГЭ-LGE-MGE-Кора переворачивается по горизонтали. Теперь внешняя поверхность телэнцефалоне сталкивается с микроскопом. MGE и LGE теперь лицо влево. (F) Красноватые Оболочек удаляются из светлой полупрозрачной коры. Блок КГЭ-MGE-LGE-CTX теперь переворачивается назад в горизонтальном направлении для следующего шага. (G, H) Та же процедура повторяется с правым полушарием. Центральный Кора отделяется от блока КГЭ-MGE-LGE. Обратите внимание, что имеется промежуточная зона коры головного мозга, которая остается в блоке КГЭ-MGE-LGE, отмеченные двумя стрелками. Этот промежуточный продукт толщина коры головного мозга соответствует половине диаметра LGE. Пунктирная линия , представляющая границу между LGE-КГЭ и коры головного мозга. (I) , Центральная кортекс разделяется на эксплантатах диаметром менее 400 мкм. Шкала бар: 2 мм; сетки на каждом изображении показывает 2 мм толстые линии с четырьмя пересечениями (тонкие линии) каждые 400 мкм. Звездочкой (*) находится вт MGE. Знак плюс (+) находится в LGE. Сокращения: муравей-CTX, передняя кора головного мозга; СЕН-CTX, центральная корой; КГЭ, Хвостовой ганглионарный бугорок; ч, корковое кромка; ср, сосудистое сплетение; CTX, кора головного мозга; LGE, боковая ганглионарный бугорок; мужчины, мозговые оболочки; MGE, медиальная ганглионарный бугорок; О.Б., обонятельная луковица; шт, задняя кора головного мозга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рис . 3: эксплантата Посев на 35 мм ячейки сетки Блюда культуры Поместите 1 мл расширения среды в центре сетки блюдо 500 мкм. Падение содержится в сетке ободом (маленькие стрелки). Место эксплантов прямо в центре капли 1 мл. Если эксплантаты распространяется за пределы сетки, SwIRL блюдо в медленном круговом движении и эксплантаты будет двигаться к центру по центростремительной силы. Примечание: эксплантов только едва заметны на глаз (черная стрелка голов). Шкала бар: 35 мм.

Рисунок 4
Рис . 4: PDPN индуцируется в присутствии BMP 4 Эксплантов культивировали в соответствии с разделом протокола 8 (2 дня в FGF2 только, затем следуют FGF2 с факторами , как указано). Контроль (А) (одна FGF2) и TGF 1 (C) эксплантов не содержали PDPN-позитивных клеток (зеленый). Ядра окрашивали DAPI (синий). ВМР4 (В) и TGF 1 / ВМР4 (D) эксплантов показал высокую долю PDPN-положительных клеток. Эксплантов центр находится слева, на периферии справа. Примечание: PDPN-позитивные клетки были в основном founг на периферии, а не в центре эксплантов. В TGF 1 / BMP4 эксплантов содержатся льстят, более разработанные PDPN-положительных клеток. (Е) Процент PDPN-позитивных клеток в эксплантатах при различных условиях представляется. Контроль и TGF 1 и значительно отличаются от условий, с BMP4. Средства показаны ± SEM. Контроль против TGF 1 не имеет существенного значения (нс). Контроль и TGF 1 vs. BMP4: р <0,0001 (***). TGF 1 по сравнению с TGF 1 / BMP4: р <0,0001 (***). BMP4 против TGF 1 + BMP4 не имеет существенного значения: р = 0,0981 (нс). Контроль против TGF 1 + BMP4: р <0,0001 (***). Шкала масштаба для всех изображений, как показано на (А):. 50 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5 Рисунок 5: количественная оценка миграции. BMP 4 и TGF & beta ; 1 , показывают , аддитивный эффект на миграции клеток. Эксплантов культивировали в соответствии с разделом протокола 8. (A) управления эксплантов. (B) эксплантата в одиночку BMP4. (C) эксплантата в одиночку TGF 1. (D) эксплантата в комбинация TGF 1 и BMP4. (E) расстояние миграции в мкм. Сетка 500 мкм был использован в качестве ссылки. Контроль и эксплантаты TGF 1 демонстрируют сильную пролиферацию большего диаметра эксплантов, чем в других условиях. Средства показаны ± SEM. Обратите внимание, что эксплантаты BMP4 и TGF 1 / BMP4 частично разрушаться ядро ​​эксплантов и клетки эмигрировать от него центробежно. Контроль против TGF 1 не имеет существенного значения (нс). TGF 1 vs.BMP4: р = 0,0353 (*). Контроль против BMP4: р = 0,0351 (*). BMP4 против TGF 1 + BMP4: р = 0,0372 (*). Контроль против TGF 1 + BMP4: р <0,0001 (***). Шкала бар: 500 мкм. Центр эксплантов отмечен знаком плюс (+). Наружный край мигрирующих клеток помечена треугольной стрелкой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6:.. Положительная регуляция ЕМТ , связанных с факторами транскрипции с помощью QRT-PCR EMT связан с ключевыми факторами транскрипции Zeb- и Twist-семьи (A, B) Zeb'1 и Zeb'2 были повышающей регуляции во время первой фазы из FGF2-облучения. (с) Twist'2 был повышающей регуляции во время SECONd фаза FGF2 / BMP4-воздействия. Относительные уровни экспрессии на основе QRT-PCR, показаны (п = 2). Уровни мРНК были нормированы на GAPDH. Средства показаны ± SEM. В 0 -й день периода FGF2 мРНК заготовленной, далее мРНК собирали через четыре дня в FGF2, то через один день в FGF2 / ВМР4 Zeb'1:. Контроль против FGF2, р = 0,0002 Zeb'2:. Контроль vs. FGF2, р = 0,0206 Twist'2:. Контроль против. FGF2 + BMP4, р = 0,003.

Рисунок 7
Рисунок 7:. NSC , показывают OPC характеристики в модельной системе NSC , были изолированы от центральной коры и культивировали в виде отдельных клеток в присутствии FGF2 ( в соответствии с разделом 5). После 8 дней в культуре (проход через 4 d в соответствии с разделом 7.9) клетки образуются небольшие колонии NSC и окрашивали для OLIG2 (красный, в B, С), Sox10 (красный, в E, F) и Nestin (зеленый, A, C, D, F). Значительная часть клеток экспрессируется совместно Olig2 / Nestin (AC) и Sox10 / Nestin (DF). (G) Co-выражение OLIG2 / Nestin и Sox10 / Nestin показан в процентах от всех клеток. Средства показаны ± SEM. Шкала масштаба для всех изображений , как показано на (А) и (D):. 20 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Состояние Всего эксплантов (центральная корой) Эксплантов с миграционными ответ % Эксплантов с выражением Podoplanin %
контроль 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

Таблица 1. BMP 4 и комбинация TGF & beta ; 1 с BMP 4 индуцируют Robust мигрирующих ответ. Эксплантов из центральной коры головного мозга поддерживали в среде расширения и FGF2 в общей сложности четыре дня. После того, как первыйдва дня, эксплантаты либо продолжали получать FGF2 в одиночку (контроль) или FGF2, и в дополнение TGF 1, BMP4 или TGF 1 / ВМР4 в комбинации. Control- и TGFβ1- эксплантов не сделал ни показать миграционную ответа, ни выражение PDPN. BMP4 и TGF 1 / BMP4 индуцированных как мигрирующие клетки, а также экспрессию PDPN во всех эксплантов.

Область Всего эксплантов Эксплантов с миграционными ответ в FGF2 / BMP4 %
Центральная кора головного мозга 146 145 99,3
Задней коры головного мозга 52 48 92,0
MGE 56 29 51,7
средний мозг 53 28 52,8

Таблица 2. Центральный Cortex показывает наиболее продуманных миграции в ответ на FGF 2 / BMP 4 Эксплантов были получены из различных регионов развивающегося крысы E14.5 нервной трубки:. Центральную кору, заднюю кору головного мозга, медиальной ганглионарный бугорок (MGE) и среднего мозга. Все эксплантаты культивировали тождественно в FGF2 / BMP4 (раздел 8). Эксплантов лечение без BMP4 не показали миграционную ответа (данные не показаны). Все эксплантаты скринингу на появление каких-либо мигрирующих клеток на эксплантов. Все регионы были в состоянии реагировать на FGF2 с BMP4 с миграцией. Центральная кора головного мозга, однако, показали самые надежные ответ. Обратите внимание, что BMP4 требовалось, чтобы вызвать какие-либо миграционные клетки. Эксплантов, культивируемые в FGF2 покое показал пролиферацию, но нетмиграция; и никакие плоские мигрирующие клетки не наблюдалось только в FGF2 (таблица 1 и дополнительного Рисунок 2).

Supp Рисунок 1
Дополнительный Рисунок 1. 400 мкм Сетка файла. Файл сетки может быть напечатан и использоваться в качестве ссылки в ходе вышеупомянутых шагов рассечение и , как показано на рисунках 1 и 2. Большие перекрестки представляют 2 мм с 400 мкм подразделений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать PDF - версию этой фигуры.

Supp Рисунок 2
Дополнительное Рисунок 2. BMP 4 -exposed Эксплантов Shвл Плоские Миграционные клетки. Увеличение клеток , показанных на рисунке 5. (А) Control- (FGF2 , в одиночку) и (С) TGF 1-эксплантов продемонстрировали сильное деление клеток с небольшими округлыми клетками. (В) BMP4- и (D) , TGF 1 / BMP4-эксплантов показали последовательно плоские удлиненные клетки. Шкала масштаба для всех изображений, как показано на (А):. 100 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 1
Дополнительное Рисунок 3. Резюме в пробирке модельной системы для исследования EMT. E14.5 крысы центральной коры содержит NSC-содержащий SVZ. Центральная кора головного мозга либо уСЭД в качестве эксплантов кусков или в виде отдельных клеток. Эксплантата части более удобны для количественного анализа миграции (раздел 8). Отдельные клетки пригодны для качественного анализа, такой как ген или белкового анализа (раздел 9.13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании стандартизированная система EMT анализа с использованием NSCs описана (суммированы в дополнительном рисунке 3). Стандартизация обеспечивает воспроизводимость (таблица 1 и 2). Эти NSC, происходят из развивающейся коры, ткани, которые обычно не претерпевает ЕМТ. Это является преимуществом для анализа ранних этапов в ЕМТ. Первые шаги в ЕМТ не могут быть адекватно изучены в опухолевых клетках, которые накопились генетические изменения, и, возможно, уже принятых функции ЕМТ. Кроме того, первичные образцы опухоли не являются идеальными для понимания EMT, поскольку большинство злокачественных опухолей являются гетерогенными, содержащие как инвазивные и неинвазивные клетки. Представленный протокол предоставляет исследователям ЕМТ с новой моделью для изучения ранних стадий EMT индукции. Здесь мы покажем , что ключевые EMT индукторы Зеба и Twist семьи активируются последовательно: во время первой фазы Zeb1 и Zeb2 позитивно регулируются, во время второй фазы Twist2 (Figurе 6). Ранее нами было показано , что Snail1 уже усиливает свою активность в течение нескольких часов после того, как BMP4-воздействия 8. Мы также показали , что при BMP4-воздействия нейроэпителиальные стволовые клетки из центральной коры дифференцироваться в мезенхимальных клеток, положительных для гладких мышц актина (SMA) и calponin 9. Результаты выше завершить предыдущее исследование в демонстрации того, что все три известных ключевых регуляторов ЕМТ участвуют в системе. Кроме того, мы обнаружили, что TGF 1 может значительно усилить миграционный эффект FGF2 / BMP4 в одиночку. Эти результаты указывают на сеть между FGF-, BMP- и TGF-beta-сигнализации во время EMT индукции.

Наиболее важные шаги для успешной изоляции NSCs для EMT и анализа миграции являются: правильно определять эмбрионального возраста, выявления анатомических ориентиров развивающегося эмбриона, подготовка свежей культуральной среды и (по крайней мере, на ночь) пластины, покрытые оболочкой, использование остроконечный инструментов и проза рассечения центральной части развивающейся коры, чтобы установить корковых эксплантов.

Представленные методы могут быть улучшены с помощью некоторых модификаций. Как было отмечено выше, многократные эксплантов высевают на одном блюде с сеткой. Для скрининга нескольких соединений, тем не менее, это может быть более удобно размещать одиночные эксплантов в каждую лунку 96-луночного планшета. Кроме того, система модель может быть уточнена для обнаружения крупномасштабного наркотиков. Как было описано выше, PDPN является ценным маркером для вновь приобретенных миграционных особенностей , поскольку PDPN встречается в инвазивной NSCs 8. Репортер PDPN может быть трансфицированы в нормальных NSCs перед ЕМТ индукции. Как следствие PDPN экспрессирующие клетки могут служить в качестве внутреннего контроля для трансформации клеток , так как PDPN не выражается в нормальных NSCs (рисунок 4 и таблица 1). Несколько дополнительных маркеров НСК доступны, такие как Nestin, которые теряются после индукции EMT 8. Как следствие,как начальное состояние, "немигрирующий / неинвазивным / Nestin +", а конечное состояние, "миграционный / инвазивная / PDPN +", можно контролировать, что позволяет автоматическое обнаружение наркотиков. В крупных клеточных культур пластин с несколькими скважинами (например, 96-луночные планшеты и более) исходных клеток , могут быть посеяны и обработаны с установленными препаратами или соединениями , не известной функции. Таким образом, луночные планшеты могут быть автоматически сканируются для выражения PDPN или других маркеров миграции / инвазии. Если ингибитор является главной мишенью экрана, исчезновение экспрессии PDPN может помочь выявить предполагаемо интересные новые ингибирующие соединения.

Во время тестирования нового вещества эксплантов не может показать миграцию и / или эксплантаты могут окружить и оторвать от тарелки. В этой ситуации лучше всего изменить только половину средств массовой информации каждый день (вместо полной смены носителя через день). Это уменьшает стресс за счет поверхностного натяжения при замене свежей средой.эксплантов может не придаю после первоначального посева. В этой ситуации, фибронектин должен быть в контакте с поверхностью посуды в течение по крайней мере 36 ч. Фибронектин используется для покрытия должна быть свежеприготовленной без воздействия пластиковой трубки в течение более чем 10 минут, так как фибронектин может прилипнуть к пластику. Кроме того, эксплантаты могут оседать вне сетки. В этой ситуации целесообразно циркулируют блюдо в медленном круговом движении. Это позволяет эксплантаты изменить положение к центру по центростремительной силы (см рисунок 3).

Существует убедительные доказательства того, что глиомы являются производными от NSC , и / или OPCs , полученных из NSCs 23,24. Как следствие другие группы установили модели роста глиомы на основе NSCs:. Sampetrean др изолированных NSCs из Ink4 / ARF-дефицитных мышей и заставили избыточную экспрессию H-Ras 25. Высококачественные злокачественные опухоли привело , что показало пролиферацию и инвазию после трансплантации 25. MCNeill и др. также изолированы NSCs от генетически модифицированных мышей (floxed Rb1, НФ1, Крас, PTEN по отдельности и в комбинации) 26. Гены были инактивируется Cre-вирусной инфекцией и NSC , были пересажены 26. Обе эти модели системы имеют то преимущество , что вторжение можно наблюдать в естественных условиях и потенциальных новых лекарств против вторжения могут быть проверены. Их основным недостатком является то, что начало вторжения не определена, и неясно, показывают ли клетки глиомы-типичное EMT вторжение (гены EMT) или только локальную миграцию. Далее только один препарат может быть протестирована на животное, и анализ требует нескольких недель. Для того, чтобы определить новый препарат против вторжения, фармацевтические компании должны (а) на экране в течение нескольких тысяч соединений или более сразу, (б) повторить испытания и (с), чтобы попробовать различные концентрации лекарственного средства. Для того, чтобы подготовить несколько тысяч трансплантированных животных, относиться к ним с различными препаратами и, наконец, испытать для эффектов с помощью гистологических или биолюминесценциианализ очень ресурсоемкая. Здесь новая модель системы НСК на основе вторжения EMT-связанной описано, что позволяет экономически эффективный скрининг тысяч соединений.

Хотя эта модель обеспечивает высокую пропускную способность скрининга соединений, это только основной платформой скрининга. После того, как соединения , представляющие интерес определены в этой модели, они потребуют дополнительной проверки. В естественных условиях тесты необходимы для параметров безопасности и эффективности для любого соединения , идентифицированного и модели трансплантации , как описано выше , становятся важными 25,26. Модель также ограничена тем фактом, что оно основано на грызунах клетках. Хотя эта модель может быть использована для исследования крысы или мыши ЕМТ, остается неясным, если одни и те же механизмы внедрены в клетках человека или в организме человека пациента. Дальнейшие эксперименты необходимы , чтобы исследовать , если NSC , являются не только инвазивными в пробирке, но и после трансплантации. Несколько линий доказательств подтверждают роль NSCsв формировании глиомы. Прогрессирование глиомы была связана со следующими генами: тенасцину C, Hey1, SPARC, Snail1 и Snail2, FGFR +, Bmpr1a, EGFR, PDGFRβ, Sox2, Podoplanin, Gli3 и p75NGFR 8. Все эти гены экспрессируются также в процессе превращения нормальных неинвазивных NSCs инвазивных мезенхимальных клеток 8. В то время, пока неясно, может ли NSC, трансформироваться в опухоли только внешними факторами роста.

Опухолевые инициирующие стволовые клетки (тиков) из различных опухолей, были выделены и использованы в качестве моделей для изучения опухолевой прогрессии 27. ТЭП, однако, не очень хорошо подходит для анализа ЕМТ, так как ЕМТ было произойти уже в ТЭП 27. Для того, чтобы понять, ранние и поздние стадии также ЕМТ индукции, первичная неопухолевых популяция клеток требуется. В идеале это население не должно было пройти EMT в первую очередь. Это было ранее показано, что эмбриональные NSC, были подходящими кандидатами для этой цели9,28. А именно, миграция и вторжение может быть вызван в NSCs по FGF2 и BMP4 9,28. FGF2 / BMP4-индуцированной миграции была связана с отдельных генов ЕМТ связанных, однако, полное доказательство не хватало , так как ключевые EMT семьи Зеба и Twist не были исследованы 8. Приведенные выше результаты показывают, что определенная комбинация из четырех факторов, FGF2, BMP4, TGF 1 и инсулин вызывают очень сильную и полную индукцию EMT, не наблюдалось раньше. Настоящее исследование показывает, что ключевые гены ТЭИ Zeb- и твист-семей также повышалась. Таким образом, это исследование дает первое доказательство того, что не является селективным повышающей регуляции отдельных генов, но результаты показывают, что все ключевые семьи EMT активны в предлагаемой системе клеточной культуры.

ЕМТ также наблюдалась в эпителиальных раковых образований вне мозга, таких , как рак легких, молочной железы, толстой кишки и рака желудка 29. Несколько моделей для изучения EMT используются для этих опухолей 30-32, Которые приходят, однако, имеют значительные ограничения: (а) использование трансформированных линий опухолевых клеток , несущих множественных генетических и эпигенетических изменений 33; для идентификации ингибиторов ЕМТ на ранних стадиях рака, раковые клетки поздней стадии являются недостаточными; (Б) в сыворотке крови зависящих от культуры, которые содержат различные неопределенные факторы роста; это делает выявление критических факторов очень трудно. Кроме того, эксперимент воспроизводимости ухудшается, поскольку качество сыворотки варьируется от партии к партии; (С) сыворотка содержит ингибиторы и ферментативной активности, возможно, инактивирующих потенциально полезных экзогенные соединения; (D) необходимость ферментов для клеточной пассажей, которые разрушают молекулы клеточной поверхности; (Е) для идентификации агонистов ЕМТ способствовать физиологической EMT, нормальные клетки необходимы для тестирования индукции. Модели опухолевой клетки являются недостаточными, чтобы найти вещества, которые способствуют регенерации в нормальных стволовых клеток.

Миграция также необходим для нормальных процессов, таких как заживление ран и regeneрацион потерпевшего мозга 18. После черепно - мозговой травмы и инсульта, NSC , необходимо перейти на месте повреждения участвовать в регенерации 4,34. В настоящее время система также может быть использован для идентификации веществ , которые способствуют миграции и инвазии. Как было показано выше, миграция вызывается при запуске с BMP4 обращения. Если клетки не подвергаются КМБ, но вместо этого к новым соединениям, они могут заменять действия BMP, которая поможет идентифицировать новые BMP агонистов. С помощью системы репортера, который указывает выражение PDPN, крупномасштабное тестирование для новых веществ становится возможным; если новое соединение может заменить ВМР, PDPN экспрессирующие клетки могут быть автоматически идентифицированы.

Предлагаемая система также полезна для изучения клеточных сигнальных взаимодействий. Наши результаты показывают, что эффект ВМР на миграцию может быть повышена за счет активации TGF 1. Результаты раскрыть аддитивный взаимодействие между BMP- и TGFβ-сигнализации. Тем не менее, дополнительные сигнальные пути, такие как Notch-, Wnt- или EGFR- / MAPK- и другие сигнальные каскады могут быть вовлечены. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования по BMP / TGF-beta-взаимодействий и перекрестных помех с другими путями. Кроме того, ответная центральный кора головного мозга, могут быть выделены из генетически модифицированных мышей, которые могут помочь выяснить основные механизмы, движущие ЕМТ. Таким образом, система EMT модель, описанная здесь, может быть полезным в области биологии стволовых клеток и регенерации, а также в исследовании рака. Он может быть использован для скрининга библиотек лекарственных средств для веществ, ингибирующих или усиливающих миграцию и инвазию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Исследование проводилось при поддержке Университета научного фонда Basel и Швейцарского Национального научного фонда за счет гранта в MHS и АГ (SNF IZLIZ3_157230). Мы благодарим: д-р Tania Ринальди Буркат за щедрое предоставление инфраструктуры; все члены группы Bettler для обсуждения и замечания. Мы благодарим Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Швейцария) для профессионального и грамотного монтажа Full HD видеокамеры MC170 (Leica Microsystems, Швейцария).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Tags

Биология развития выпуск 114 нейронные стволовые клетки эпителиальные к мезенхимальных перехода миграция, глиома инвазии Snail1 фетальной бычьей сыворотки свободной FGF2 ВМР4 TGF-beta
Модель энзимов и бессывороточной Neural стволовых клеток культуры для ЕМТ Исследование Пригоден для обнаружения лекарственных средств
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D.,… More

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter