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Developmental Biology

Un modèle Enzyme et sans sérum Neural Culture de cellules souches pour EMT enquête Adaptés pour la découverte de médicaments

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

Épithéliale de transition mésenchymateuses (EMT) décrit le processus de l'épithélium transdifferentiating en mésenchyme. EMT est un processus fondamental au cours du développement embryonnaire qui se produit également souvent dans le glioblastome, la tumeur la plus fréquente du cerveau maligne. EMT a également été observé dans de nombreux cancers, y compris en dehors du cerveau cancer du sein, le cancer du poumon, le cancer du côlon, le cancer gastrique. EMT est lié au centre de malignité en favorisant la migration, l'invasion et la formation de métastases. Les mécanismes de EMT induction ne sont pas pleinement compris. Nous décrivons ici un système in vitro pour isoler des cellules corticales normalisé souches neurales (NSC) et l' induction subséquente EMT. Ce système offre la possibilité d'utiliser soit des cellules simples ou explant. Dans ce système, un rat ou la souris NNC prosencéphale embryonnaires sont mises en culture dans un milieu défini, dépourvu de sérum et les enzymes. Les NSCs exprimés Olig2 et Sox10, deux facteurs de transcription observée dans oligodendrocles cellules précurseurs yte (OPC). En utilisant ce système, les interactions entre les FGF, TGF et BMP signalisation impliquant ZEB1, ZEB2 et Twist2 ont été observées lorsque la TGFß activation améliorée de manière significative la migration des cellules, ce qui suggère une BMP / TGF-interaction synergique. Les résultats indiquent un réseau de FGF, BMP et TGF-signalisation d'être impliqués dans EMT induction et l'entretien. Ce système de modèle est utile pour étudier EMT in vitro. Il est rentable et présente une forte reproductibilité. Il permet également la comparaison des différents composés par rapport à leurs réponses de migration (de mesure de distance quantitative), et le criblage à haut débit de composés à inhiber ou amplifier EMT (mesure qualitative). Le modèle est donc bien adapté pour tester les bibliothèques de médicaments pour les substances affectant EMT.

Introduction

Pendant plusieurs stades du développement embryonnaire, les cellules épithéliales perdent leur forte adhérence à l'autre (par exemple, les jonctions serrées) et d' acquérir un phénotype migratoire dans un processus appelé transition épithélio mésenchymateuse (EMT) 1. EMT est requis pour la formation d' autres types de cellules, telles que les cellules de la crête neurale mésenchymateuses, une population qui se sépare de la neuroepithelium 2. EMT est essentielle non seulement au cours des stades embryonnaires , mais aussi nécessaire à des étapes ultérieures de la vie adulte pour maintenir les processus physiologiques dans l'organisme adulte, comme la cicatrisation 3 et le système nerveux central (SNC) dans la régénération des lésions démyélinisantes 4.

Les tumeurs épithéliales sont connus pour réactiver EMT comme une étape d'initiation pour la migration, l' invasion et les métastases, conduisant finalement à la progression du cancer 1,3. EMT est en effet lié au centre de la forte 1,3 de migration. Les étapes cellulaires de conditioning, initier, subissant et maintenir EMT ne sont pas pleinement compris et ont besoin d'une enquête plus approfondie.

Ici, un système in vitro de modèle normalisé basé sur EMT NNC, des facteurs de croissance définis et des milieux (sans sérum et sans l' utilisation de l' enzyme) est présentée. Ce système modèle est pertinent pour les scientifiques travaillant sur EMT. Les escargots, Zeb et Twist familles de protéines se sont avérés être critique pour EMT tant dans le développement et la maladie 1. Les escargots, Zeb et Twist familles sont également impliqués dans le système présenté. Le système est basé sur une région spécifique du cerveau antérieur qui, normalement, ne subit pas de EMT fournir un avantage particulier pour l'étude des premiers événements au cours EMT induction.

Le système de modèle pourrait être appliquée à l'étude EMT dans les épithéliums en dehors du système nerveux central, depuis inducteurs EMT clés, tels que l'escargot, Zeb et les protéines Twist, sont également présents au cours EMT dans les systèmes de tissus en dehors du système nerveux central. Ce modèle système permet l'isolement normalisé de NNC du cortex en développement pour étudier les caractéristiques de cellules souches en général et EMT en particulier. Grâce à ce système, nous avons isolé NSCs, EMT induite et étudié la migration ultérieure sous l'effet de FGF2 et BMP4. Nous avons observé que interagit FGF et BMP-signalisation avec TGF-signalisation pour promouvoir la migration cellulaire, validant ainsi le système modèle.

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Protocol

Toutes les procédures animales ont suivi le «Guide pour le soin et l' utilisation des animaux de laboratoire» (publication NIH, 8 e édition, 2011) et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de Bâle (Directives suisses pour le soin et l' utilisation des animaux). Par ces lignes directrices du protocole animal est considéré comme de la «qualité de la gravité de l'animal le plus bas».

1. Préparation de l'Expansion Medium

Remarque: Le travail dans des conditions aseptiques en tant que norme pour la culture de tissus.

  1. Prenez deux tubes de 15 ml et ajouter 5 ml de L-glutamine libre-DMEM / F12 (1: 1) à partir d'un 500 ml de milieu bouteille dans chacun des deux tubes de 15 ml. Pour le premier tube de 15 ml, ajouter 50 mg apo-transferrine humaine, 50 pl de putrescine 1 M stock (0,1 mM de concentration finale) et 30 pi de sélénium de sodium 500 uM stock (concentration finale 30 nM).
    1. Filtrer à travers un filtre à seringue de 0,2 um dans le flacon DMEM / F12 initiale.
  2. Le deuxième tube de 15 ml, on ajoute 12,5 mg d'insuline. Ajouter6 - 9 gouttes de 1 M de NaOH. Tourbillonnement pour dissoudre complètement l'insuline. Filtrer à travers un filtre à seringue de 0,2 um dans le flacon DMEM / F12 initiale.
    Remarque: NaOH est toxique et corrosif. Utilisez des gants de protection, manteau, et des lunettes de sécurité.
  3. Ajouter 5 ml de pénicilline (10000 unités / ml) / streptomycine (10 000 pg / ml) / amphotéricine B (25 ug / ml) à la / F12 bouteille DMEM.
  4. Ajouter 5 ml de 200 mM de L-glutamine mère fraîchement décongelés ou oligopeptides contenant glutamine (200 mM de L-alanyl-L-glutamine dipeptide) au / F12 bouteille DMEM.
  5. Bien agiter. Préparer 50 ml aliquotes.
    Remarque: moyen d'extension peut être stocké pendant au moins 2 semaines à 4 ° C. tubes aliquoté montrent des changements de pH moins par rapport à moyen maintenu en bouteilles de 500 ml.

2. Préparation de repiquage Medium

  1. Pour 1 L Ca 2 + - et Mg 2 + -free HBSS médias, ajouter 990,85 mg de glucose (5 concentration finale mM) et 840,10 mg de NaHCO 3 Note: moyenne repiquage peut être stocké pendant au moins 4 semaines à 4 ° C.

3. Préparation des facteurs de croissance

  1. PBS 1x stérile préparer avec 1% de BSA (PBS-BSA) seul ou avec de l'acide chlorhydrique (HCl) à 4 mM (PBS-BSA-HCl).
    Attention: HCl est corrosif et toxique et nécessite des mesures spéciales de sécurité (manteaux, lunettes, gants, hotte).
  2. Dissoudre 10 pg / ml humain de croissance des fibroblastes recombinants du facteur 2 (rhFGF2) dans du PBS-BSA (10 ng / ml de concentration finale), 10 pg / ml humain de la protéine morphogénétique osseuse recombinante 4 (rhBMP4) dans du PBS-BSA (10 ng / ml final concentration), et 20 pg / ml de facteur humain recombinant de croissance transformant ß 1 (rhTGFβ1) dans du PBS-BSA-HCl (40 ng / ml de concentration finale).
    1. Ne pas filtrer stériliser. Préparer des aliquotes.
      Remarque: Des aliquotes de facteur de croissance peuvent être stockés à-20 ° C pendant au moins 2 ans.

4. Revêtement de cellulaires Vaisselle Culture

  1. Dissoudre 1,875 mg Poly-L-ornithine (OLP) dans 500 ml d' eau distillée H 2 O pour préparer une OLP stocks 250x. Stériliser par filtration en utilisant un filtre à seringue de 0,2 um et faire 2 ml aliquotes.
    Note: Ces aliquotes peuvent être conservés à -20 ° C pendant au moins 2 ans.
  2. Dissoudre 1 mg de fibronectine bovine dans 1 ml de H stérile distillée 2 O pour préparer 1,000x fibronectine stock. Ne pas vortexer car cela peut coaguler la protéine collante. Agiter doucement à la main pendant 10 min.
    1. Incuber pendant 1 heure à température ambiante avec agitation occasionnelle par secousses. Vérifiez la dissolution complète. Chauffer la solution à moins de 37 ° C pour la dissolution complète de la fibronectine. Ne pas filtrer stériliser.
      Remarque: La solution peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
  3. Utiliser des boîtes de culture en plastique cellulaire plasmatique prétraitée (100 mm ou d'autres dimensions comme requis pourl'expérience). Pour évaluer la migration, utilisez 35 mm plats avec grille de 500 um. Laisser incuber pendant une nuit avec des plats 2 ml 1x OLP pendant 12 heures à 37 ° C dans un CO 2 culture tissulaire incubateur à 5%. Laver deux fois avec 2 ml 1x PBS.
  4. Ajouter 2 ml 1x fibronectine (1 pg / ml de concentration finale) et on incube la vaisselle pendant un minimum de 12 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Retirer fibronectine juste avant le plaquage des cellules.
    Remarque: Les plats fibronectine revêtus peuvent être conservés pendant au moins 2 semaines à 37 ° C.

5. normalisé Dissection et préparation de la zone corticale-ventriculaire (SVZ)

  1. Obtenir rat jour embryonnaire 14,5 (E14.5, Sprague-Dawley) et E13.5 de la souris (C57BL / 6) des embryons par minuté-accouplement. Maté animaux de 18h00 à 08h00 le lendemain matin. Noon après le jour de l'accouplement est considéré comme E0.5.
  2. Anesthésier l'animal gravide avec 5% d'isoflurane et le débit d'oxygène de 0,8 L / min. Vérifier la réponse par la compression de la patte avec diss forteforceps exion. Décapitez l'animal. Évitez CO 2 asphyxie CO 2 affecte la tige la récupération des cellules.
  3. Récupérer des embryons par césarienne.
    1. Placez l'animal en position couchée et désinfecter la fourrure avec 70% d'éthanol. Utilisez des pinces et des ciseaux chirurgicaux pour faire en forme de V-incision cutanée d'environ 8 cm dans le bas ventre au-dessus de l'utérus. Inciser seulement la peau avec de la fourrure tout en gardant intacte parois musculaires.
    2. Utilisez une pince frais et des ciseaux pour inciser les muscles et la paroi musculaire abdominale pour entrer dans le péritoine.
    3. Identifier l'utérus dans le péritoine postérieur inférieur. Retirer l'utérus par une séparation nette des tissus environnants.
    4. Laver l'utérus avec des embryons avec stérile 1x PBS et les placer dans la glace froide 1x PBS.
    5. Utilisez des ciseaux à pointe fine pour ouvrir les parois de l' utérus pour libérer l' embryon par l' embryon au microscope de dissection (3X grossissement, figure 1B). Utilisez une paire de pinces pour enlever les coques embryonnaires (
    6. Vérifiez le stade de développement correct par l'Atlas du développement du système nerveux Rat 5. La taille de l' embryon correct est illustré à la figure 1B.
    7. Vérifiez âge exact en outre par la présence de commencer la formation de chiffres dans le forelimb de rat (FL) comme illustré sur la figure 1A.
      Remarque: Le membre postérieur (HL) ne montre pas encore la séparation de chiffres (figure 1B).
  4. Pour la dissection, le transfert d'embryons à des plats non revêtus de Pétri remplis de glace-froid 1x PBS. Effectuer la dissection sous un microscope de dissection stéréo (3X à 20X grossissement) en utilisant une pince fine autoclavés.
    Remarque: Les boîtes de Petri empêchent la fixation du tissu à la surface de la boîte comme cela peut arriver avec des plats de culture de cellules plasmatiques enrobées. aiguilles de fil de tungstène aiguisés ou similaires sont également utiles pour certaines étapes de dissection.
  5. Retirez la peau de la tête et du crâne à partir de l'intersection du télencéphale développement (TEL) et diencéphale (DI) (figure 1B) en tirant simultanément avant et en arrière avec deux pinces afin d'accéder au tube de neurones en développement (Figure 1C).
  6. Identifier le-hindbrain-frontière mésencéphale (MHB, noir tête de flèche sur la figure 1B-D), séparant le mésencéphale (MES) à partir du rhombencéphale. Couper le rhombencephalon juste au ou en dessous du MHB (figure 1D, flèche triangulaire).
    Remarque: L'espace sous-cutané supplémentaire au MHB facilite l'enlèvement de la peau sans nuire au tube neural.
  7. Sever la connexion entre le télencéphale / diencéphale à la base du crâne avec le squelette du visage (figure 1E). Il en résulte un bloc contenant le télencéphale, diencéphale et le mésencéphale (TEL-di-MES) (figures 1F-H).
  8. Transférez le bloc TEL-DI-MES dans le milieu de l'expansion sur la glace. Keep it Completsely recouvert de milieu d'expansion dans une boîte de Petri non revêtue. Tenez le bloc au mésencéphale avec une paire de pinces pour éviter de toucher le télencéphale qui contient le SVZ corticale avec NNC.
  9. Répéter les étapes 05/05 à 05/08 avec tous les embryons (figure 1F-H).
  10. Transfert d'un TEL-DI-MES bloc dans la glace fraîche et froide 1x PBS. Coupez le long de la ligne en pointillé dans le mésencéphale antérieur (figure 1F-H), séparant le mésencéphale du diencéphale, comme le montre la figure 1I.
  11. Séparez le DI du TEL en coupant le long des lignes en pointillés sur la figure 1F. Voir télencéphale isolé sur la figure 1J.
  12. Diviser les deux hémisphères télencéphaliques, coupe le long de la ligne en pointillés sur la figure 1J. Il en résulte deux hémisphères séparés comme cela est illustré sur la figure 1K.
    Remarque: L'hémisphère gauche est amplifié dans la figure 1L.
  13. Identifier la bande médianeéminences Lionic (MGE, Figure 2A; *) et éminences ganglionnaires latérales (LGE, Figure 2A; +) visible à travers l'avenir interventriculare foramen.
    1. En utilisant des pinces ou aiguille, disséquer le long d' une ligne droite à l'intersection entre la MGE et LGE et le cortex antérieur (ant-ctx, figure 2B). Couper une ligne droite à travers le cortex, l'hippocampe (hanche) et le plexus choroïde (CP). Ceci sépare le cortex antérieur dont le bulbe olfactif (OB) à partir des éminences ganglionnaires (GE, les figures 2B, C).
  14. Couper une seconde ligne droite à l'intersection de l'éminence ganglionnaire caudale (EGC, figure 2C, D) et le cortex postérieur (figure 2C), la coupe à nouveau à travers le cortex, l' hippocampe et le plexus choroïde.
  15. Aplatir le télencéphale. Retirez complètement le pôle postérieur et le bulbe olfactif (figure 2D). Identifierl'ourlet contenant du cortex et de l'hippocampe du plexus choroïde (figure 2C), tel que défini précédemment 6,7.
    Remarque: L'hippocampe a une neuroepithelium plus mince que le cortex. Le CP contient des vaisseaux rouges.
    1. Séparer l'ourlet corticale du cortex, ce qui laisse la taille du cortex identique à la taille des éminences ganglionnaires (figure 2D). Il en résulte un bloc du cortex (le tissu cible) et les éminences ganglionnaires (GE, la figure 2D).
  16. Retournez le bloc cortex-GE avec le ventricule latéral (interne) à la surface de la boîte.
    Remarque: La surface extérieure de l'hémisphère fera face à l'expérimentateur (figure 2E). Sur la surface extérieure sont les meninges contenant des vaisseaux de sang (figure 2E).
    1. Pin le GE à la surface du plat de la main gauche et éplucher les méninges avec une paire de pinces à la main droite (dominante) (Figure 2F Note: Ceci est l'étape techniquement plus exigeants parce que les meninges adhèrent fortement au cortex. La séparation des méninges du cortex est facilitée par la coupe une ligne complètement droite (non dentelée) dans les étapes 5.13.1 et 5.14.
  17. Répétez les étapes à 5.16 pour 5.12 l'autre hémisphère et tous les embryons. Couper le cortex le long de la LGE dans une distance de la moitié du diamètre principal de la LGE (figure 2G, 2H). Le cortex disséqués couvre une superficie de 1,2 mm x 2,4 mm (figure 2H) et inclut la / couche germinale SVZ avec les NNC.

6. Préparation des cultures d'explants

  1. Couper le cortex dans des explants de moins de 400 um de diamètre (figure 2I). Utilisez une grille de 400 um (figure supplémentaire 1) placé au- dessous de la dissection boîte de Pétri pour référence (Figure 2H et 2I). Transférer tous les explants dans une boîte de Pétri frais avec de la glace-comilieu d'expansion ld.
  2. Retirez la fibronectine à partir d'une boîte de culture tissulaire (étape 4.4). Laisser sécher. Ajouter 1 ml de milieu d'expansion à froid au centre de la coupelle 35 mm avec grille de dimension de 10 mm x 10 mm (figure 3). Laisser le milieu pour former une goutte sphérique (Figure 3).
  3. Insérer jusqu'à 8 explants par rapport au centre de la goutte. Les explants doivent être idéalement situés sur la grille avec au moins 3 mm de distance entre l'autre pour l'analyse de la migration (voir la section 8).
  4. Laisser incuber le plat pendant environ 1 h dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 21% de O 2, 5% de CO 2) pour la fixation des explants. Autoriser les explants à établir et à attacher à la surface de fibronectine. Ne pas secouer le plat, car les explants peuvent se détacher et se déplacer en dehors du centre de la grille optimale.
  5. Après 1 heure d' incubation (37 ° C, 21% O 2, 5% de CO 2), remplir le plat à un volume total de 2 ml de milieu d'expansion plus la croissance facteurs ou de substances d'intérêt pour tester et incuber.
    Note: Ni la digestion enzymatique, ni sérum ou centrifugation sont nécessaires pour la préparation des explants. Ceci est optimal pour l'intégrité cellulaire.

7. Préparation du NSC unique Culture cellulaire

  1. Réchauffez expansion et moyenne repiquage à 37 ° C.
  2. Transférer les morceaux de cortex disséqués (étape 5.17) dans un tube de 15 ml avec un milieu d'expansion à froid (tube A). Centrifuger les morceaux de cortex pendant 5 min à 1200 x g. Aspirer le surnageant. Ajouter 200 ul de milieu d'expansion préchauffée à la remise en suspension des morceaux de cortex.
  3. Ajouter 700 pi de milieu préchauffé repiquage au tube de 15 ml avec une pointe de P1,000 (tube A). Resuspendre doucement le culot. Placer la pointe à la partie inférieure du tube de 15 ml. Doucement et lentement dissocier les morceaux de tissu par aspiration à trois reprises avec la pointe de P1,000.
    Remarque: Le repiquage milieu favorise la séparation des cellules et il est nécessaire d'éviter l'utilisation d'enzymes.
  4. Laisser le tube reposer pendant 30 à 60 secondes pour les plus grandes (plus lourds) pièces non dissociées pour régler au fond. Les cellules individuelles dissociées resteront dans le surnageant. Transférer environ 700 ul du surnageant dans un tube de 15 ml frais (tube B).
  5. Répétez les étapes 7.3 et 7.4 de dissocier les gros morceaux.
  6. Répétez les étapes 7.3 et 7.4 une deuxième fois pour dissocier les gros morceaux. Transférer la totalité surnageant dans le tube de 15 ml frais (tube B).
  7. Ajouter au milieu d'expansion à un volume total de 5 ml. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Évaluer les cellules mortes par coloration au bleu trypan.
    Remarque: Les petits NSCs tolèrent les étapes 7.2 à 7.6 mieux que des cellules plus grandes. A partir de 10 embryons attendre environ 4 x 10 6 cellules avec 10% de cellules mortes.
  8. Pour l' extension de NNC, une plaque de 1,5 x 10 6 cellules par boîte de 10 cm de culture tissulaire revêtus de fibronectine dans un volume de 8 ml de milieu d'expansion. Pour l'extension standard, ajouter 8 pi de 1,000x rhFGF2 stock. Ajouter 8 pi rhFGF2 chaque jour et me changerdia tous les autres jours.
    Note: Le cortex à ce stade de développement contient une majorité de NNC et seule une minorité de cellules différenciées. Les cellules différenciées de la minorité ne répondent pas au traitement rhFGF2 et meurent au cours de la culture d'expansion.
  9. Passage élargi NSCs à 60% de confluence.
    1. Pour NSCs de passage, éliminer le milieu d'expansion. Laver les cellules rapidement trois fois avec du milieu 5 ml de repiquage. Attendez 2-4 min. Sans Ca2 + et Mg2 + les cellules se détachent de la surface lentement, arrondi vers le haut. Vérifier le détachement des cellules au microscope de phase. Attendez encore quelques minutes, si nécessaire, jusqu'à ce que le détachement visuel de la surface est observée.
      Remarque: Les cellules individuelles vont détacher complètement, mais la plupart des cellules seront toujours adhérer à la surface de la boîte. La durée nécessaire pour le détachement dépend de la durée du revêtement de fibronectine. Un revêtement de fibronectine courte (12 h ou moins) se traduit par le détachement des cellules plus rapidement. Pour des expériences plus longues (>; 1 semaine) fibronectine revêtement de plus de 24 heures est recommandé.
  10. Utiliser une pipette de 10 ml pour détacher doucement les cellules de la surface. Recueillir le milieu de repiquage de 5 ml avec des cellules et la transférer à un nouveau tube de 15 ml. Répéter l'opération avec un supplément de 5 ml de milieu de repiquage.
  11. Dissocier les cellules dans le tube de 15 ml par pipetage de haut en bas trois fois, en plaçant les 10 ml pipette au fond du tube. Spin le tube pendant 15 min à 1200 xg à la température ambiante. Retirer le surnageant et resuspendre le culot dans 2 ml de milieu d'expansion. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Utilisez bleu trypan pour évaluer les cellules mortes.
    Remarque: Après l' expansion à 60% de confluence, attendez 4 - 5 x 10 6 cellules avec un nombre de cellules mortes à environ 10%.
  12. Plate 8 x 10 5 cellules par boîte de 10 cm pour les autres passages.

8. Évaluation des migrations

  1. Pour l'évaluation de la migration, isoler explants conformément à la section 5. Seed les explants dans35 plats mm de la grille. Une heure après le placage, ajouter FGF2 (rhFGF2). Placer les capsules dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 jours.
    Remarque: Pour la fixation d'expiant optimale, éviter de déplacer les plats.
  2. Retirer moyenne de 1000 pointe ul. Ajouter 2 ml de milieu d'expansion de 1000 pointe ul à partir du cercle intérieur (figure 3). Ceci réduit la tension superficielle sur des explants.
  3. Ajouter des facteurs de croissance seuls ou en combinaison selon les besoins de l'expérimentation. Utilisez FGF2 / BMP4 / TGFβ1 comme témoin positif. Remarque: Dans cette expérience, 2 pl FGF2 par boîte de 35 mm, 2 pl BMP4 et 4 ul TGFβ1 ont été ajoutés seul et en combinaison (Figure 5).
    1. Ajouter des facteurs supplémentaires et / ou des substances testables. Gardez les plats encore intact pendant 2 jours à 37 ° C.
  4. Prenez des photos de explants sur un microscope inversé.
    Note: explants Living donnent de meilleures images à contraste de phase que les cellules fixes. Les deux peuvent être utilisés.
  5. Pour la migrationévaluation, utiliser un logiciel graphique qui permet des mesures de pixels (par exemple, Fidji 8).
  6. Mesurer la grille de plat de 500 um distance en pixels et l'utiliser comme référence interne.
  7. Définissez le centre de l'expiant comme point de départ de la migration. Mesurer la distance entre le centre de l'explant et le groupe le plus externe de 10 cellules.
    Remarque: Toutes les cellules migrent par centrifugation loin de l'expiant. Ils se forment spontanément une feuille à la périphérie dans les conditions testées (figure 5).

9. Évaluation Invasion

  1. Préparer culture de tissu des plaques à 24 puits revêtues de fibronectine selon la section protocole n ° 4.
  2. Placez 300 pi de milieu d'expansion au chaud dans le puits haut de chambres d'invasion cellulaire. Incuber les chambres pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
  3. Retirer le moyen d'expansion du puits haut et placez la chambre de Boyden dans la plaque de 24 puits revêtue.
  4. Ajouter 500 ul de milieu d'expansion chaud avec 0,5 pi de rhFGF2 et 0,5 ul rhBMP4 au fond puits.
  5. NSCs Passage et compter comme décrit dans la section 7. Passages 1 à 4 sont adaptés.
  6. Plate 5 x 10 5 cellules dans un volume de 300 pi de milieu d'expansion chaud avec 0,3 pi de rhFGF2 et 0,3 pi de rhBMP4 dans le puits haut de la chambre de Boyden.
  7. Culture Les NSCs ensemencées pendant 24 h.
  8. Ajouter des facteurs supplémentaires et / ou des substances dans la chambre testables et la culture des cellules pendant encore 48 heures.
    Remarque: Si les cellules sont envahissantes, ils passent par le haut et à travers la couche de membrane basale au fond du puits. cellules envahissantes se cramponner au fond de la chambre de Boyden.
  9. Suivre le protocole fourni par le fabricant. Utilisez des cotons-tiges (inclus dans le kit de dosage d'invasion) pour éliminer les cellules non-invasives dans le puits supérieur par le nettoyage deux fois.
  10. Éliminer le milieu à partir des puits et ajouter du milieu de dilatation 500 ul avecune coloration de la membrane plasmique des cellules vivantes et avec le colorant nucléaire DAPI dans les puits.
  11. Incuber pendant 10 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
    Remarque: Les colorants vont s'intégrer dans la membrane et le noyau des cellules invasives, respectivement, pour une visualisation optimale 8. Option: Omettre plasma colorant membrane si multicolore immunocytochimie est prévu.
  12. Retirez le support avec les colorants et laver deux fois avec un milieu d'expansion. Visualiser et compter les cellules invasives avec un microscope inversé à fluorescence comme démontré précédemment 8.
    Remarque: Certaines cellules invasives peuvent être détachés de la partie inférieure de la chambre et ont chuté à la surface du puits au-dessous de laquelle ils adhèrent à la surface revêtue. Pour une analyse complète inclure les cellules à la surface du puits.
  13. Retirez le support et fixer les cellules dans la glace fraîche et froide 4% PFA pendant 10 min. Laver 3x avec PBS 1x. Effectuer immunocytochimie sur les cellules invasives, comme décrit précédemment 8-10.

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Representative Results

Ce système modèle EMT est basée sur l'isolement normalisé de NNC à la fois comme des cellules individuelles ou sous forme d' explants provenant d' une région spécifique du tube neural en développement, le cortex central (figures 1 et 2). Pour l' évaluation quantitative, les explants ont été ensemencées à droite au centre d'une boîte de culture de grille de 500 um (figure 3). Des explants de cortex central ont d' abord été exposées à FGF2 pendant deux jours, puis deux jours supplémentaires dans différentes combinaisons de facteurs de croissance (tableau 1). Nous avons commencé avec le cortex qui est plus grande que les autres régions du tube neural en développement. Nous avons observé que seuls les explants cultivés dans la BMP4 ont montré une réponse migratoire (tableau 1 et complémentaire figure 2).

podoplanin Next (PDPN) expression a été analysée dans des conditions définies. PDPN est un transmembranaire sprotéines ialomucin-like qui a été associée à l' invasion dans de multiples cancers 11,12 et également dans NSCs 8. La proportion de cellules exprimant PDPN est augmentée en haute qualité gliomes 13. PDPN est également associée à une moins bonne survie chez les patients atteints de glioblastome 14. En outre, PDPN a été montré comme un marqueur de la progression maligne de tumeurs multiples , y compris les cancers du sein, du poumon, du côlon 15,16. PDPN est exprimée à la fois en NSCs envahissantes ainsi que 8 migrateurs. En utilisant le protocole ci-dessus, l'expression PDPN a été comparée à un contrôle, FGF2 uniquement, dans les explants exposés à TGFβ1 et BMP4 seuls ou en combinaisons. expression PDPN a été détecté dans tous les BMP4 et TGFβ1 / explants BMP4 traité. En revanche, aucune PDPN n'a été observée dans les explants de contrôle dans le FGF2 seul ou avec des explants TGFβ1 seul (tableau 2 et figure 4). En plus des cellules avec un phénotype migratoire ont été induites chez BMP4 et TGFβ1 / BMP4-Des explants exposés, tandis que les explants témoins (uniquement FGF2) et TGFβ1 seul ne présentaient pas des cellules migratrices (tableau 1). L'observation des cellules migratrices fournit un faible coût une évaluation qualitative, straight-forward.

En outre, nous avons testé la réponse migratoire et EMT induction de plusieurs régions du tube neural développement de la BMP4 (tableau 2). 400 um explants ont été préparées à partir du cortex central, le cortex postérieur (pôle postérieur marqué), MGE et le mésencéphale, comme il est indiqué sur la figure 1. Les explants ont tous été exposés à FGF2 pendant deux jours, suivis de deux jours dans le FGF2 avec BMP4 . La migration a été défini par l'apparition de cellules migratoires à plat avec un bord d' attaque et de fuite (figure 5 et figure complémentaire 2). Une forte induction de cellules migratoires à partir du cortex postérieur et une réponse intermédiaire du MGE et les mesencéphale a été observée (tableau 2). 145 de 146 explants du cortex central a montré une réponse migratoire au FGF2 / BMP4. Ainsi, le cortex central a démontré l'induction la plus forte des cellules migratrices de l' ensemble des explants testées (Tableau 2). L' omission de la BMP4 supprimé toute réponse migratoire (Tableau 1 et 2, et données non représentées).

Pour une évaluation quantitative du facteur de croissance de l'activité, la distance de migration a été mesurée dans des explants cultivés en facteurs de croissance multiples. Les explants ont été cultivées comme ci-dessus pendant deux jours en FGF2, puis pendant deux jours supplémentaires dans FGF2 sans facteurs (contrôle) ou BMP4 simple ou combiné et TGFβ1. Dans les explants témoins d'une forte prolifération a été observée en réponse à FGF2, comme prévu. Les explants sont issus de la SVZ cortical et contiennent , dans une large NNC partiels qui sont connus pour proliférer en réponse à 17 FGF2. Le CE de contrôlells ont atteint 689 ± 14, les cellules TGFβ1 582 ± 49 pm (Figure 5.). Le BMP4-groupe a montré une distance moyenne de 935 ± 91 um de migration. En comparaison avec les cellules TGFβ1 BMP4 / migré significativement plus loin, à 1,150 ± 23 pm (figure 5). Les résultats montrent que la BMP4 est induire une migration de NNC FGF2 exposée. Cette migration peut être encore améliorée par TGFβ1. La combinaison de FGF2, BMP4 et TGFβ1 est donc le plus efficace pour induire la migration. En résumé, le système modèle de culture cellulaire permet à la fois qualitative ainsi que l'évaluation quantitative de la migration.

EMT a été liée à des facteurs de transcription (TFS), tels que Snail1, Snail2, ZEB1, ZEB2, TWIST1, Twist2 dans divers systèmes , y compris des cancers épithéliaux, tels que le cancer du sein, le cancer du côlon, le cancer du poumon , ainsi que dans les tumeurs cérébrales 1,18. Nous had montré précédemment que FGF2 et BMP2 ou BMP4 peut induire Snail1 et Snail2 8,9. En utilisant le système ci-dessus, nous avons étudié les niveaux des autres TFs liés EMT-expression. Aucun changement dans l' expression TWIST1 pourraient être détectés; avec TWIST1 étant à faibles niveaux d'expression au cours de l' exposition au FGF2 (données non présentées). Dans le modèle de culture cellulaire d' une régulation positive de ZEB1 et ZEB2 pendant l' exposition et FGF2 de Twist2 pendant FGF2 / BMP4-exposition a été observée (figure 6).

NNC sont connus pour contribuer à la population de cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC) 8,19,20. Plusieurs éléments de preuve indiquent que NNC et en OPCs particuliers peuvent être la cellule d'origine pour les gliomes 21,22. Pour caractériser davantage le modèle ci-dessus, nous avons étudié l'expression des marqueurs OPC. Nous avons observé que NSCs de FGF2 exposés ont démontré co-expression de Olig2 / Nestin uned Sox10 / nestine dans plus de 90% (figure 7). Cette observation montre que les NSCs montrent OPC-fonctionnalités de notre système. En effet, les OPC traits corrélés avec surexpression de Zeb'1 et Zeb'2 (figures 6 et 7). Ces résultats suggèrent que le FGF2 extension infère une identité d'OPC, tel que jugé par Olig2 et Sox10, alors que dans le même temps initie première à base Zeb étapes consistant EMT.

Figure 1
Figure 1: Embryo normalisé et Prosencéphale Dissection pour NSC isolement et EMT Induction. (A) forelimb gauche de E14.5 rat embryon après une césarienne. Chaque membre chiffres avant est marqué avec une pointe de flèche noire. Notez la formation de chiffres commençant typique pour E14.5. E14.5 (B) Rat embryon après le retrait de la coque. Notez le dièse (#) au diencéphale dorsale wUEL est idéal pour commencer le retrait de la anlage peau / crâne. (C) La peau / crâne est déjà presque éliminé. La frontière entre la peau enlevée et non enlevée est marquée avec deux pointes de flèches triangulaires. La peau peut être pelée en avant de la flèche antérieure et postérieure de la flèche postérieure. (D) La peau / crâne est maintenant complètement enlevé. Notez l'encoche de la frontière mésencéphale-rhombencéphale (flèche) et la coupe juste caudale à elle, marquée par une pointe de flèche. (E) Le télencéphale-diencéphale-mésencéphale (TEL-di-MES) bloc est retiré du reste de l'embryon . (F) vue supérieure du bloc TEL-DI-MES. Cranial est à gauche. (G) vue Oblique de haut. (H) vue Inferior du bloc TEL-DI-MES. (I) Le mésencéphale et une partie du diencéphale sont séparés du télencéphale avec la partie antérieure du diencéphale. Top: Vue antérieure des deux vésicules télencéphaliques. Bottom: Right vue latérale du mésencéphale, faces supérieures céphalique (J) Top:. les deux vésicules télencéphaliques sans diencéphale. vue Inferior pour illustrer l'élimination complète de diencéphale. Asterisk représente MGE. Bottom:. Partie antérieure du diencéphale (K) Top: Les deux hémisphères sont séparés dans la fissure interhémisphérique. Hémisphère gauche sur le côté gauche. Asterisk représente MGE. Signe plus illustre LGE. (L) Grossissement de l' hémisphère gauche avec vue médiane. Droit face crânialement, gauche caudale, en haut est dorsale, ventrale en bas, respectivement. L'astérisque (*) est situé à MGE. Signe plus (+) est situé à LGE. ch, ourlet corticale; FL, forelimb; di, diencéphale; mes, mésencéphale; MHB, frontière mésencéphale-rhombencéphale; HL, membre postérieur; LGE, éminence ganglionnaire latérale; MGE, éminence ganglionnaire médiale; ob, bulbe olfactif; pc, cortex postérieur; rho, rhombencephalon; tel, télencéphale. La grille sur chaque image montre 2 mm d'épaisseur des lignes avec quatre intersection avec des lignes fines chaque400 um. La barre d'échelle sur toutes les images:. 2 mm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Normalisé corticale SVZ dissection pour NSC isolement et EMT Induction. (A) Vue médian de l' hémisphère gauche. A travers les foramen de Monro MGE et LGE sont visibles, marqués par astérisque et signe plus. (B) Le bulbe olfactif est enlevé juste crânialement du MGE-LGE. (C) Le pôle postérieur du cortex est enlevé juste derrière le CEG . (D) Top: l'ourlet corticale est séparé du cortex. Gauche: pôle postérieur. Moyen: complexe contenant la partie centrale du cortex et le bloc-EGC LGE-MGE. MGE et LGE visage vers la droite. Droite: bul olfactiveb. (E) Le bloc-EGC LGE-MGE-cortex est basculée horizontalement. Maintenant, la surface extérieure du télencéphale fait face au microscope. MGE et LGE maintenant face à la gauche. (F) Les méninges rougeâtres sont retirés du cortex translucide lumineux. Le bloc CGE-MGE-LGE-ctx est maintenant retournée en arrière horizontalement pour l'étape suivante. (G, H) La même procédure est répétée avec l'hémisphère droit. Le cortex central est séparé loin du bloc CGE-MGE-LGE. Notez qu'il existe une zone de cortex intermédiaire qui est à gauche au niveau du bloc CGE-MGE-LGE, marquée par deux flèches. Cette épaisseur du cortex intermédiaire correspond à la moitié du diamètre de la LGE. La ligne pointillée représente la frontière entre LGE-EGC et le cortex. (I) Le cortex central est séparé en explants de moins de 400 um de diamètre. Barre d'échelle: 2 mm; grille sur chaque image montre 2 mm d'épaisseur des lignes avec quatre intersections (lignes fines) tous les 400 um. Astérisque (*) est situé à unet MGE. Signe plus (+) est situé à LGE. Abréviations: ant-ctx, cortex antérieur; cen-ctx, le cortex central; EGC, éminence ganglionnaire caudale; ch, ourlet corticale; cp, plexus choroïde; ctx, cortex; LGE, éminence ganglionnaire latérale; les hommes, les méninges; MGE, éminence ganglionnaire médiale; ob, bulbe olfactif; pc, cortex postérieur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Explantation Semis sur 35 mm Grille cellulaires Vaisselle Culture Placer 1 ml de milieu d'expansion au centre du plat de grille de 500 um. La baisse est contenue par la grille jante (petites flèches). La place explants droit au centre de la goutte 1 ml. Si les explants sont répartis en dehors de la grille, swIrl le plat dans un mouvement circulaire lent et les explants se déplacer vers le centre par la force centripète. Note: les explants sont à peine visible par l'oeil (flèche noire têtes). Barre d'échelle: 35 mm.

Figure 4
Figure 4:. PDPN est induite en présence de BMP 4 explants ont été cultivés conformément à la section 8 du protocole (2 jours en FGF2 seulement, puis suivi par le FGF2 avec des facteurs comme il est indiqué). Commande (A) (FGF2 seul) et TGFβ1 (C) explants ne contenaient pas de cellules positives PDPN (vert). Nuclei sont colorées avec du DAPI (bleu). BMP4 (B) et TGFβ1 / BMP4 (D) , les explants ont montré une forte proportion de cellules positives PDPN. Le centre d'expiant est à gauche, la périphérie à droite. Remarque: Les cellules PDPN-positives étaient surtout found à la périphérie et non pas au centre de l'expiant. Les explants TGFβ1 / de BMP4 contenus plus plate, plus élaborées cellules PDPN-positives. (E) Le pourcentage de cellules PDPN-positives dans des explants dans des conditions différentes est représentée. Contrôle et TGFβ1 les deux sont très différents des conditions avec BMP4. Les moyens sont représentés ± SEM. Contrôle vs. TGFβ1 est non significative (ns). Contrôle et TGFβ1 vs. BMP4: p <0,0001 (***). TGFβ1 par rapport à TGFβ1 / BMP4: p <0,0001 (***). BMP4 vs. TGFβ1 + BMP4 est pas significative: p = 0,0981 (ns). Commande par rapport à la BMP4 TGFβ1 + p <0,0001 (***). Barre d'échelle pour toutes les images, comme illustré dans (A):. 50 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 Figure 5: Évaluation quantitative des migrations. BMP 4 et TGF ß 1 montrent Additive Effet sur ​​la migration cellulaire. Explants ont été cultivés selon la section du protocole 8. (A) Contrôle explant. (B) explantation dans BMP4 seul. (C) explantation dans TGFβ1 seul. (D) explantation dans le combinaison de TGFβ1 et BMP4. (E) distance de migration en um. La grille de 500 pm a été utilisé comme référence. Le contrôle et les explants TGFβ1 montrent une forte prolifération avec un diamètre de explant plus grande que dans les autres conditions. Les moyens sont représentés ± SEM. Notez que les explants BMP4 et TGFβ1 / BMP4 se désintègrent en partie le noyau explant et les cellules émigrent loin de la force centrifuge. Contrôle vs. TGFβ1 est non significative (ns). TGFβ1 vs.BMP4: p = 0,0353 (*). Le contrôle par rapport à la BMP4: p = 0,0351 (*). BMP4 par rapport à la BMP4 TGFβ1 + p = 0,0372 (*). Commande par rapport à la BMP4 TGFβ1 + p <0,0001 (***). Barre d'échelle: 500 um. Centre d'explant est marquée par un signe plus (+). Le bord extérieur des cellules migrantes est marquée avec une flèche triangulaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6:.. La régulation positive des EMT liées Facteurs de transcription par qRT-PCR EMT est liée aux facteurs clés de transcription de la Zeb- et Twist-famille (A, B) Zeb'1 et Zeb'2 ont été surexprimés au cours de la première phase de FGF2-exposition. (C) Twist'2 a été régulée à la hausse au cours de la seconded phase du FGF2 / BMP4-exposition. les niveaux d'expression relatifs basés sur la qRT-PCR sont indiquées (n = 2). Les taux d'ARNm ont été normalisées par rapport à la GAPDH. Les moyens sont représentés ± SEM. Au jour 0 de la période de FGF2 ARNm a été récolté, outre l' ARNm a été récolté au bout de quatre jours dans le FGF2, puis au bout d' un jour dans le FGF2 / BMP4 Zeb'1. FGF2 par rapport au témoin, p = 0,0002 Zeb'2. Par rapport au témoin FGF2, p = 0,0206 Twist'2. vs contrôle. Le FGF2 + BMP4, p = 0,003.

Figure 7
Figure 7:. NSCs montrent OPC Caractéristiques du modèle de système NNC ont été isolés à partir du cortex central et cultivées comme des cellules individuelles en présence de FGF2 (selon la section 5). Après 8 j en culture (passage après le 4 d conformément à la section 7.9) , les cellules formées de petites colonies NSC et ont été colorées pour Olig2 (rouge, en B, C), Sox10 (rouge, E, F) et de la nestine (vert, A, C, D, F). Une proportion élevée de cellules Olig2 co-exprimé / Nestin (AC) et Sox10 / Nestin (DF). (G) Co-expression de Olig2 / Nestin et Sox10 / Nestin est représenté en pourcentage de toutes les cellules. Les moyens sont représentés ± SEM. Barre d'échelle pour toutes les images comme illustré dans (A) et (D):. 20 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Condition Total des explants (cortex central) Explants avec une réponse migratoire % Explants avec expression podoplanin %
Contrôle 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

Tableau 1. BMP 4 et la combinaison de TGF ß 1 à 4 BMP induisent une réponse migratoire robuste. Des explants de cortex central ont été maintenues dans un milieu d'expansion et FGF2 pour un total de quatre jours. Après la premièredeux jours, les explants soit continué à recevoir FGF2 seul (témoin) ou FGF2 et en plus TGFβ1, BMP4 ou TGFβ1 / BMP4 comme combinaison. Control- et TGFβ1- explants ne ne montrent une réponse migratoire ni expression PDPN. BMP4 et TGFβ1 / BMP4 induit les cellules migratrices ainsi que l'expression PDPN dans tous les explants.

Région total des explants Explants avec une réponse migratoire dans le FGF2 / BMP4 %
cortex central 146 145 99,3
postérieur cortex 52 48 92,0
MGE 56 29 51,7
mésencéphale 53 28 52,8

Tableau 2. Le Cortex central montre la migration la plus robuste en réponse à FGF 2 / BMP 4 explants ont été préparés à partir de différentes régions du tube neural E14.5 de rat en développement:. Le cortex central, le cortex postérieur, l'éminence ganglionnaire médiale (MGE) et la mésencéphale. Tous les explants ont été cultivés de manière identique dans FGF2 / BMP4 (Section 8). Explants traités sans BMP4 ne montraient aucune réponse migratoire (données non présentées). Tous les explants ont été criblées pour l'apparence de toutes les cellules migratrices par explant. Toutes les régions ont été en mesure de répondre à FGF2 avec BMP4 à la migration. Le cortex central, cependant, a montré la réponse la plus robuste. Notez que BMP4 a été nécessaire pour induire les cellules migratrices. Explants cultivés dans le FGF2 seul a montré une prolifération mais pasmigration; et aucune migration de cellules plates ont été observées dans le FGF2 seul (Tableau 1 et Figure complémentaire 2).

La figure 1 supp
Figure complémentaire 1. 400 um Grille fichier. Le fichier de grille peut être imprimé et utilisé comme référence lors des étapes de dissection ci - dessus et comme représenté sur les figures 1 et 2. Les grandes intersections représentent 2 mm avec 400 um subdivisions. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger une version PDF de ce chiffre.

La figure 2 supp
Figure complémentaire 2. BMP 4 -exposed explants Show cellules migratrices plates. de grossissement des cellules représentées sur la figure 5. (A) Control- (FGF2 seul) et (C) TGFβ1-explants ont démontré une division cellulaire forte avec de petites cellules arrondies. (B) BMP4- et (D) TGFβ1 / BMP4-explants ont montré des cellules allongées toujours à plat. Barre d'échelle pour toutes les images, comme illustré dans (A):. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 1
Figure complémentaire 3. Résumé du système in vitro Modèle pour EMT enquête. E14.5 rat cortex central contient le SVZ NSC contenant. Le cortex central est soit used comme des pièces d'explants ou des cellules individuelles. pièces explants sont plus commodes pour l'analyse de la migration quantitative (section 8). Les cellules individuelles sont adaptées pour une analyse qualitative, par exemple le gène ou l'analyse des protéines (section 9.13).

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Discussion

Dans cette étude , un système standardisé pour EMT analyse NSCs utilisant est décrite (résumé dans la figure complémentaire 3). La normalisation permet la reproductibilité (Tableau 1 et 2). Les NNC sont dérivées du cortex développement, un tissu qui, normalement, ne subit pas EMT. Ceci est avantageux pour l'analyse des premières étapes de l'EMT. Les premières étapes dans EMT ne peuvent pas être étudiés de manière adéquate dans les cellules tumorales qui ont accumulé des changements génétiques et peuvent ont déjà adopté des caractéristiques de l'EMT. En outre, des échantillons de tumeur primaire ne sont pas idéales pour comprendre EMT puisque la plupart des tumeurs malignes sont hétérogènes contenant les cellules invasives et non invasives. Le protocole présenté fournit aux chercheurs EMT avec un modèle de roman pour étudier les premières étapes de EMT induction. Ici , nous montrons que les inducteurs EMT clés du Zeb et de la famille Twist sont activés séquentiellement: pendant la première phase ZEB1 et ZEB2 sont régulés à la hausse, au cours de la deuxième phase Twist2 (Figure 6). Auparavant, nous avions montré que Snail1 est déjà upregulated plusieurs heures après l' exposition BMP4-8. Nous avons également montré que lors de la BMP4 exposition des cellules souches neuro - épithéliales du cortex central se différencient en cellules mésenchymateuses, positives pour l' actine du muscle lisse (SMA) et calponin 9. Les résultats ci-dessus complètent l'étude précédente en démontrant que tous les trois connus régulateurs EMT clés sont impliqués dans le système. En outre, nous avons observé que TGFβ1 peut améliorer de manière significative l'effet migratoire de FGF2 / BMP4 seul. Ces résultats indiquent un réseau entre FGF, BMP et TGF-signalisation pendant EMT induction.

Les étapes les plus critiques pour l'isolement réussi de NNC pour EMT et de l'analyse de la migration sont: identifier correctement l'âge embryonnaire, l'identification des repères anatomiques de l'embryon en développement, la préparation des milieux de culture frais et (au moins une nuit) des plaques revêtues, utilisation d'instruments à pointe fine et propar dissection de la partie centrale du cortex en développement pour établir explants corticaux.

Les techniques présentées peuvent être améliorées par quelques modifications. Comme suggéré ci-dessus, plusieurs explants sont étalées sur un plat unique avec une grille. Pour le criblage de composés multiples, cependant, il peut être plus commode de placer explants unique dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. En outre, le système de modèle peut être affiné pour la découverte de médicaments à grande échelle. Comme cela est décrit ci - dessus, PDPN est un marqueur utile pour des fonctions nouvellement acquises depuis migratrice PDPN se trouve dans invasif NNC 8. Un journaliste PDPN peut être transfecté dans des NSCs normales avant EMT induction. En conséquence PDPN exprimant les cellules peuvent servir de contrôle interne pour la transformation cellulaire depuis PDPN est pas exprimée dans NSCs normales (figure 4 et tableau 1). Plusieurs marqueurs NSC supplémentaires sont disponibles, comme Nestin, qui sont perdus après EMT induction 8. En conséquence,à la fois l'état initial, "non-migrateurs / non-invasive / Nestin +", et l'état final, «migration / invasive / PDPN +", peuvent être contrôlés, ce qui permet la découverte de médicaments automatisés. Dans les grandes plaques de culture cellulaire avec plusieurs puits (par exemple, des plaques à 96 puits et plus grandes) cellules initiales peuvent être ensemencées et traités avec des médicaments ou des composés sans fonction connue établis. Ainsi, des plaques multipuits peuvent être automatiquement analysés pour l'expression de PDPN ou d'autres marqueurs de migration / invasion. Si un inhibiteur est la cible principale de l'écran, la disparition de l'expression PDPN peut aider à identifier de nouveaux composés inhibiteurs putative intéressants.

Au cours de l'essai d'une nouvelle substance les explants peuvent ne pas montrer la migration et / ou les explants peuvent arrondir et détacher du plat. Dans cette situation, il est préférable de changer seulement la moitié des médias tous les jours (au lieu de plein changement de milieu tous les deux jours). Cela réduit le stress par la tension de surface en cas de remplacement par du milieu frais. leexplants peuvent pas fixer après l'étalement initial. Dans cette situation, la fibronectine doit être en contact avec la surface de la vaisselle pendant au moins 36 h. Fibronectine utilisé pour le revêtement doit être fraîchement préparée sans exposition à un tube en plastique pendant plus de 10 min depuis fibronectine peut coller à la matière plastique. En outre, les explants peuvent régler en dehors de la grille. Dans cette situation, il est conseillé de faire tourbillonner le plat dans un lent mouvement circulaire. Cela permet aux explants de repositionner au centre par la force centripète (cf. figure 3).

Il y a des preuves solides que les gliomes sont dérivés de NNC et / ou OPCs dérivés de NNC 23,24. En conséquence les autres groupes ont établi des modèles de croissance de gliomes sur la base de NNC. Sampetrean et al NNC isolées à partir de souris / ARF déficientes INK4 et la surexpression de H-Ras 25 forcée. Des tumeurs malignes de haute qualité qui a entraîné la prolifération et l' invasion a montré après une transplantation 25. McNeill et al. NSCs également isolées à partir de souris génétiquement modifiées (Rb1 floxée, Nf1, Kras, Pten seul et en combinaison) 26. Les gènes ont été inactivés par une infection Cre-virus , et les NNC ont été transplantées 26. Ces deux systèmes modèles ont l'avantage d'invasion peut être contrôlée in vivo et d' éventuels nouveaux médicaments anti-invasion peut être testée. Leur principal inconvénient est que le début de l'invasion est pas bien définie et il est difficile de savoir si les cellules montrent une invasion de gliome-type EMT (gènes EMT) ou seulement la migration locale. De plus un seul médicament peut être testé par animal et l'analyse nécessite plusieurs semaines. Pour identifier un médicament anti-invasion nouvelle, les sociétés pharmaceutiques ont besoin (a) à l'écran pour plusieurs milliers de composés ou plusieurs à la fois, (b) de reproduire les tests et (c) d'essayer différentes concentrations de médicament. Pour préparer plusieurs milliers d'animaux transplantés, les traiter avec des médicaments différents et enfin tester les effets de histochimique ou bioluminescenceanalyse des ressources prend beaucoup. Voici un nouveau système de modèle basé sur NSC pour l'invasion EMT liée est décrite qui permet la projection rentable de milliers de composés.

Bien que ce modèle permet criblage à haut débit de composés, il est une plate-forme de criblage primaire. Une fois que les composés d'intérêt sont identifiés dans ce modèle, ils nécessitent une validation supplémentaire. Des tests in vivo est nécessaire pour la sécurité et l' efficacité des paramètres pour tout composé identifié et modèles de transplantation comme décrit ci - dessus deviennent importants 25,26. Le modèle est également limité par le fait qu 'il est basé sur des cellules de rongeurs. Bien que le modèle peut être utilisé pour étudier rat ou EMT de la souris, on ne sait pas si les mêmes mécanismes sont en place dans les cellules humaines ou chez le patient humain. D' autres expériences sont nécessaires pour vérifier si NNC sont non seulement invasif in vitro, mais aussi après la transplantation. Plusieurs preuves soutiennent le rôle de NNCdans la formation de gliome. La progression des gliomes a été liée aux gènes suivants: ténascine C, Hey1, SPARC, et Snail1 Snail2, FGFR +, BMPR1A, EGFR, PDGFRß, Sox2, podoplanin, GH3 et 8 p75NGFR. Tous ces gènes sont également exprimés lors de la transformation de NNC non invasives normales aux cellules mésenchymateuses invasives 8. A l'heure actuelle, il est difficile de savoir si NNC peuvent être transformées en tumeurs par des facteurs de croissance externe seulement.

Les cellules souches tumorales initiatrices (TICS) à partir de différentes tumeurs ont été isolées et sont utilisés comme modèles pour comprendre 27 la progression tumorale. TICs sont, cependant, pas bien adaptée à l' analyse EMT, EMT depuis déjà ne se produisent dans TICs 27. Pour comprendre au début et aussi les étapes tardives de EMT induction, une population de cellules non-néoplasique primaire est nécessaire. Idéalement, cette population ne devait pas subir EMT en premier lieu. Il avait été précédemment montré que NSCs embryonnaires étaient des candidats appropriés à cet effet9,28. A savoir, la migration et l' invasion pourraient être induites dans NSCs par FGF2 et BMP4 9,28. Migration FGF2 / BMP4 induite était liée à des gènes liés à l'EMT-simples, cependant, une preuve complète faisait défaut puisque les familles EMT clés Zeb et Twist avaient pas été étudiés 8. Les résultats ci-dessus montrent qu'une combinaison spécifique de quatre facteurs, FGF2, BMP4, TGFβ1 et de l'insuline provoquent une induction de EMT très forte et complète, non observées auparavant. La présente étude démontre que les gènes EMT clés du Zeb- et Twist-familles sont également surexprimés. Cette étude fournit donc la première preuve qu'il n'y a pas surexpression sélective des gènes uniques, mais les résultats montrent que toutes les familles EMT clés sont actifs dans le système de culture cellulaire proposé.

EMT a également été observée dans des cancers épithéliaux en dehors du cerveau, tels que le poumon, du sein, du côlon et le cancer gastrique 29. Plusieurs modèles pour étudier EMT sont utilisés pour ces tumeurs 30-32Qui viennent, cependant, avec des limitations importantes: (a) l' utilisation de lignées de cellules tumorales transformées portant de multiples changements génétiques et épigénétiques 33; pour identifier des inhibiteurs de EMT pour les stades précoces du cancer, les cellules cancéreuses à un stade avancé sont insuffisantes; (B) des cultures de sérum-dépendante qui contiennent divers facteurs de croissance définis; ce qui rend l'identification des facteurs critiques très difficile. En outre, l'expérience reproductibilité est altérée car la qualité de sérum varie d'un lot à; (C) le sérum contient des inhibiteurs et des activités enzymatiques éventuellement inactivant composés exogènes potentiellement utiles; (D) la nécessité d'enzymes pour des passages cellulaires qui dégradent les molécules de la surface cellulaire; (E) pour identifier des agonistes de l'EMT pour promouvoir EMT physiologique, les cellules normales sont nécessaires pour tester l'induction. les modèles de cellules tumorales sont insuffisantes pour trouver des substances qui favorisent la régénération des cellules souches normales.

La migration est également nécessaire pour les processus normaux tels que la cicatrisation des plaies et regeneration du cerveau blessé 18. Après une lésion cérébrale traumatique et d' AVC, NNC sont nécessaires pour migrer vers le site de la lésion à participer à la régénération 4,34. Le système actuel peut également être utilisé pour identifier les substances qui favorisent la migration et l' invasion. Comme indiqué ci-dessus, la migration est induite lors du démarrage avec BMP4-traitement. Si les cellules ne sont pas exposés à des PGB, mais plutôt de nouveaux composés, ceux-ci peuvent se substituer à l'action BMP qui aidera à identifier de nouveaux agonistes BMP. Avec un système rapporteur qui indique l'expression PDPN, des essais à grande échelle pour de nouvelles substances devient possible; si un nouveau composé peut remplacer PGB, les cellules exprimant PDPN peuvent être automatiquement identifiés.

Le système proposé est également utile pour étudier les interactions de signalisation cellulaire. Nos résultats montrent que l'effet BMP sur la migration pourrait être renforcée par l'activation TGFβ1. Les résultats dévoilent une interaction additive entre BMP et TGFβ-signalisation. Cependant, les voies de signalisation supplémentaires, tels que Notch-, Wnt ou EGFR / MAPK- et d'autres cascades de signalisation peuvent être impliqués. Par conséquent, d'autres investigations sur BMP / TGF-interactions et diaphonie à d'autres voies sont nécessaires. En outre, le cortex central réactif peut être isolé à partir des souris génétiquement modifiées, qui peuvent aider à élucider les mécanismes sous-jacents EMT de conduite. En résumé, le système de modèle décrit ci-EMT peut être utile dans les domaines de la biologie des cellules souches et la régénération, ainsi que dans la recherche sur le cancer. Il peut être utilisé pour le criblage de banques de médicaments pour les substances inhibitrices ou améliorant la migration et l'invasion.

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Acknowledgments

L'étude a été soutenue par la Fondation Université de Bâle des sciences et de la Fondation nationale suisse par une subvention à MHS et AG (SNF IZLIZ3_157230). Nous remercions: Dr Tania Rinaldi Burkat pour fournir généreusement l'infrastructure; tous les membres du groupe Bettler pour des discussions et des commentaires. Nous remercions Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Suisse) pour une installation professionnelle et compétente de la caméra vidéo HD complet MC170 (Leica Microsystems, Suisse).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

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References

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Developmental Biology numéro 114 les cellules souches neurales épithéliales de transition mésenchymateuses la migration, le gliome l'invasion du cancer Snail1 bovin foetal sans sérum FGF2 BMP4 TGFß
Un modèle Enzyme et sans sérum Neural Culture de cellules souches pour EMT enquête Adaptés pour la découverte de médicaments
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Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D.,… More

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

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