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Developmental Biology

Un modelo enzima y Cultura Neural Stem Cell libre de suero para la EMT Investigación Adecuado para el descubrimiento de fármacos

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

Transición epitelial a mesenquimal (EMT) describe el proceso de epitelio mesénquima en transdifferentiating. EMT es un proceso fundamental durante el desarrollo embrionario que también ocurre comúnmente en glioblastoma, el tumor cerebral maligno más frecuente. EMT también se ha observado en múltiples carcinomas fuera del cerebro incluyendo cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer gástrico. EMT está vinculado centralmente a la malignidad mediante la promoción de la migración, la invasión y la formación de metástasis. Los mecanismos de inducción EMT no se entienden completamente. Aquí se describe un sistema in vitro para el aislamiento normalizado de las células corticales neuronales madre (NSC) y posterior EMT-inducción. Este sistema ofrece la flexibilidad de utilizar cualquiera de las células individuales o cultivo de explantes. En este sistema, de rata o de ratón NSCs del cerebro anterior de embriones se cultivan en un medio definido, desprovisto de suero y enzimas. Las células madre neurales expresan Olig2 y Sox10, dos factores de transcripción se observa en oligodendroccélulas precursoras yte (OPC). Utilizando este sistema, las interacciones entre FGF, BMP y TGF-señalización que implica ZEB1, Zeb2, y Twist2 fueron observada en la que TGF-activación mejora de forma significativa la migración de células, lo que sugiere un efecto sinérgico BMP / TGF-interacción. Los resultados apuntan a una red de FGF, BMP y TGF-señalización de estar involucrados en la inducción y mantenimiento de EMT. Este sistema modelo es relevante para investigar EMT in vitro. Es rentable y muestra una alta reproducibilidad. También permite la comparación de los diferentes compuestos con respecto a sus respuestas de migración (medición de la distancia cuantitativo), y cribado de alto rendimiento de los compuestos para inhibir o potenciar EMT (medición cualitativa). El modelo es, por tanto, muy adecuado para poner a prueba las bibliotecas de drogas para las sustancias que afectan a la EMT.

Introduction

Durante varias etapas del desarrollo embrionario, las células epiteliales pierden su fuerte adherencia entre sí (por ejemplo, las uniones estrechas) y adquieren un fenotipo migratorio en un proceso llamado transición epitelial a mesenquimal (EMT) 1. Se requiere EMT para la formación de tipos de células adicionales, tales como las células de la cresta neural mesenquimales, una población que segrega desde el neuroepitelio 2. EMT no sólo es esencial durante las fases embrionarias, sino también necesaria en etapas posteriores de la vida adulta para mantener los procesos fisiológicos en el organismo adulto, tales como la curación de heridas 3 y la regeneración del sistema nervioso central (SNC) en lesiones desmielinizantes 4.

Los tumores epiteliales son conocidos para reactivar EMT como una etapa de iniciación para la migración, invasión y metástasis, en última instancia conduce a la progresión del cáncer 1,3. EMT es, en efecto vinculado centralmente a la fuerte migración de 1,3. Los pasos celulares de conditioning, iniciar, mantener y someterse a EMT no se entienden completamente y necesitan más investigaciones.

Aquí, se presenta un sistema normalizado in vitro modelo EMT basado en NSCs, con factores de crecimiento definidos y medios (sin suero y sin el uso de la enzima). Este sistema modelo es de relevancia para los científicos que trabajan en la EMT. El caracol, Zeb y twist familias de proteínas han demostrado ser crucial para la EMT, tanto en el desarrollo y la enfermedad 1. El caracol, familias Zeb y la torcedura también están involucrados en el sistema presentado. El sistema se basa en una región específica del cerebro anterior que normalmente no experimenta EMT proporcionar una ventaja particular para el estudio de los acontecimientos iniciales durante la inducción de EMT.

El sistema modelo potencialmente podría ser aplicado al estudio de EMT en el epitelio fuera del SNC, ya que los inductores de la EMT clave, como el caracol, Zeb y las proteínas de la torcedura, también se encuentran durante la EMT en sistemas de tejidos fuera del SNC. Este modelo sistema permite el aislamiento normalizado de células madre neurales de la corteza en desarrollo para estudiar las características de células madre en general y, en particular, la EMT. El uso de este sistema, se aislaron células madre neurales, EMT inducida y estudiamos la posterior migración bajo el efecto de FGF2 y BMP4. Hemos observado que interactúa FGF y BMP de señalización con TGF-señalización para promover la migración de células, validando así el sistema modelo.

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Protocol

Todos los animales procedimientos siguieron la 'Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio "(publicación NIH, 8ª edición, 2011) y fueron aprobados por el Comité de Protección de los Animales de Basilea (Suiza Directrices para el Cuidado y Uso de los Animales). Por estas directrices del protocolo animal se considera de "grado de gravedad más bajo de los animales".

1. Preparación de medio de expansión

Nota: El trabajo en condiciones asépticas como estándar para el cultivo de tejidos.

  1. Tomar dos tubos de 15 ml, y añadir 5 ml de DMEM / F12-L-glutamina libre (1: 1) a partir de una botella de 500 ml de medio en cada uno de los dos tubos de 15 ml. Para el primer tubo 15 ml, añadir 50 mg humano de la apo-transferrina, 50 l de putrescina 1 stock M (0.1 mM de concentración final) y 30 l de selenio de sodio 500 mM de stock (concentración final 30 nM).
    1. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras en la botella de DMEM / F12 inicial.
  2. Para el segundo tubo de 15 ml, añadir 12,5 mg de insulina. Añadir6 - 9 gotas de NaOH 1 M. Vortex para disolver la insulina por completo. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras en la botella de DMEM / F12 inicial.
    Nota: NaOH es tóxico y corrosivo. Utilizar guantes de protección, abrigo, y gafas de seguridad.
  3. Añadir 5 ml de penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 g / ml) / anfotericina B (25 mg / ml) a la botella / medio F12 DMEM.
  4. Añadir 5 ml de 200 mM de stock de L-glutamina recién descongeladas u oligopéptidos que contienen glutamina (200 mM L-alanil-L-glutamina dipéptido) a la botella / medio F12 DMEM.
  5. Agitar bien. Preparar alícuotas de 50 ml.
    Nota: medio de expansión se puede almacenar durante al menos 2 semanas a 4 ° C. tubos aliquoted muestran menos cambios de pH en comparación con el medio guardado en botellas de 500 ml.

2. Preparación de pases Medium

  1. A 1 l de Ca 2 + - y Mg 2 + exento de medios HBSS, agregar 990,85 mg de glucosa (5 mM concentración final) y 840,10 mg de NaHCO3 Nota: medio pases se puede almacenar durante al menos 4 semanas a 4 ° C.

3. Preparación de factores de crecimiento

  1. Preparar estéril 1x PBS con 1% de BSA (PBS-BSA) solo o con ácido clorhídrico (HCl) a 4 mM (PBS-BSA-HCl).
    Precaución: HCl es corrosivo y tóxico y requiere medidas especiales de seguridad (abrigos, gafas, guantes, capucha).
  2. Disolver 10 mg / ml de factor de crecimiento de fibroblastos recombinante humano 2 (rhFGF2) en PBS-BSA (10 ng / ml de concentración final), 10 mg / ml de la proteína morfogenética ósea recombinante humana 4 (rhBMP4) en PBS-BSA (10 ng / ml final concentración), y 20 mg / ml de factor recombinante humana transformador del crecimiento beta 1 (rhTGFβ1) en PBS-BSA-HCl (40 ng / ml de concentración final).
    1. No filtrar esterilizar. Preparar alícuotas.
      Nota: alícuotas de factor de crecimiento se pueden almacenar a-20 ° C durante al menos 2 años.

4. Recubrimiento de cultivo celular platos

  1. Disolver 1,875 mg de poli-L-ornitina (OLP) en 500 ml de H2O destilada para preparar una OLP de stock 250x. Esterilizar por filtración usando un filtro de jeringa de 0,2 micras y hacer porciones de 2 ml.
    Nota: Estas alícuotas se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos 2 años.
  2. Disolver 1 mg fibronectina bovina en 1 ml de H 2 O destilada estéril para preparar 1.000 x fibronectina de valores. No vórtice ya que pueden obstruir la proteína pegajosa. Agitar suavemente con la mano durante 10 minutos.
    1. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación ocasional. Consultar la disolución completa. Calentar la solución a menos de 37 ° C para la disolución completa de la fibronectina. No filtrar a esterilizar.
      Nota: La solución se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses.
  3. Utilice platos de plasma pretratadas de plástico de cultivo de células (100 mm u otros tamaños como se requiere parael experimento). Para evaluar la migración, utilice placas de 35 mm con rejilla de 500 micras. Incubar los platos durante la noche con 2 ml 1x OLP durante 12 horas a 37 ° C en un CO 2 incubadora de cultivo de tejidos 5%. Lavar dos veces con 2 ml de PBS 1x.
  4. Añadir 2 ml de 1x fibronectina (1 mg / ml de concentración final) y se incuban los platos durante un mínimo de 12 horas a 37 ° C en un incubador de CO2 5%. Retire la fibronectina justo antes de placas las células.
    Nota: platos recubiertos de fibronectina se pueden almacenar durante al menos 2 semanas a 37 ° C.

5. La disección y estandarizado Preparación de la zona subventricular cortical (SVZ)

  1. Obtener embriones de rata día 14.5 (E14.5, Sprague-Dawley) y E13.5 ratón (C57BL / 6) embriones por cronometrada de apareamiento. Aparear los animales de 18:00 a 08:00 de la mañana siguiente. Mediodía después del día de apareamiento se considera E0.5.
  2. Anestesiar al animal preñado con un 5% de isoflurano y el flujo de oxígeno de 0,8 l / min. Comprobar la respuesta por la compresión de la pata con diss agudafórceps exión. Decapitar al animal. Evitar la asfixia de CO 2 en forma de CO 2 afecta a la recuperación de células madre.
  3. Recuperar embriones por cesárea.
    1. Lugar de los animales en decúbito supino y desinfectar la piel con un 70% de etanol. El uso de fórceps quirúrgicos y tijeras para hacer incisión en la piel en forma de V de unos 8 cm en el abdomen inferior por encima del útero. Incisión en la piel solamente con la piel, manteniendo intactas las paredes musculares.
    2. El uso de fórceps y tijeras frescos para incidir los músculos y la pared muscular abdominal para entrar en el peritoneo.
    3. Identificar el útero en el peritoneo posterior inferior. Extraer el útero por la separación nítida de los tejidos circundantes.
    4. Lavar el útero con embriones con PBS estéril y 1x lugar en helado de PBS 1x.
    5. Con unas tijeras de punta fina para abrir las paredes uterinas para liberar embrión por embrión bajo un microscopio de disección (3X ampliación, Figura 1B). Use un par de pinzas para quitar los cascos embrionarias (
    6. Verificar el estado de desarrollo correcto por el Atlas del desarrollo del sistema nervioso de la rata 5. El tamaño del embrión correcta se muestra en la Figura 1B.
    7. Compruebe edad correcta aún más por la presencia de iniciar la formación de dígitos en la extremidad anterior de rata (FL) como se ilustra en la Figura 1A.
      Nota: La extremidad posterior (HL) no muestra todavía la separación dígitos (Figura 1B).
  4. Para la disección, la transferencia de embriones a los platos de Petri llenas sin recubrimiento con helado de PBS 1x. Realizar la disección bajo un microscopio de disección estéreo (3X a 20X) usando pinzas finas tratadas en autoclave.
    Nota: Las placas de Petri impedir la adhesión de tejido de la superficie del plato, como puede ocurrir con placas de cultivo celular recubiertas con plasma. agujas de alambre de tungsteno afiladas o similares también son útiles para ciertas etapas de la disección.
  5. Retire la piel de la cabeza y el cráneo a partir de la intersection del telencéfalo en desarrollo (TEL) y el diencéfalo (DI) (Figura 1B) tirando simultáneamente anterior y posteriormente con dos pinzas con el fin de obtener acceso al tubo neural en desarrollo (Figura 1C).
  6. Identificar el cerebro posterior-límite cerebro medio (MHB, cabeza de flecha negro en la Figura 1B-D), que separa el mesencéfalo (MES) del rombencéfalo. Cortar el rombencéfalo justo en o por debajo del MHB (Figura 1D, flecha triangular).
    Nota: El espacio subcutáneo adicional en el MHB facilita la retirada de la piel sin dañar el tubo neural.
  7. Cortar la conexión entre el telencéfalo / diencéfalo en la base del cráneo con el esqueleto facial (Figura 1E). Esto da lugar a un bloque que contiene el telencéfalo, diencéfalo y el mesencéfalo (TEL-di-MES) (Figuras 1F-H).
  8. Transferir el bloque TEL-DI-MES en medio de expansión en el hielo. Manténgalo completEly cubierto en medio de expansión en un plato de Petri sin recubrimiento. Mantenga el bloque en el mesencéfalo con un par de pinzas para evitar tocar el telencéfalo que contiene la SVZ cortical con células madre neurales.
  9. Repita los pasos 5.5 y 5.8 con todos los embriones (Figura 1F-H).
  10. Transferir uno TEL-DI-MES bloque en fresco enfriado con hielo 1x PBS. Corte a lo largo de la línea punteada en el mesencéfalo anterior (Figura 1F-H), que separa el mesencéfalo del diencéfalo, como se muestra en la figura 1I.
  11. Separar el DI del TEL cortando a lo largo de las líneas de trazos en la figura 1F. Ver telencéfalo aislado en la figura 1J.
  12. Dividir los dos hemisferios telencephalic, cortando a lo largo de la línea punteada en la figura 1J. Esto resulta en dos hemisferios separados como se ilustra en la Figura 1K.
    Nota: El hemisferio izquierdo se magnifica en la Figura 1L.
  13. Identificar la banda medialeminencias Lionic (MGE, la figura 2A; *) y eminencias ganglionares laterales (LGE, la figura 2A; +) visible a través de la futura interventriculare oval.
    1. El uso de pinzas o agujas, diseccionar a lo largo de una línea recta en la intersección entre la MEG y la LGE y la corteza anterior (ant-CTX, Figura 2B). Cortar una línea recta a través de la corteza, el hipocampo (cadera) y el plexo coroideo (CP). Esto separa la corteza anterior incluyendo el bulbo olfatorio (OB) de las eminencias ganglionares (GE, las Figuras 2B, C).
  14. Cortar una segunda línea recta en la intersección de la eminencia ganglionar caudal (CGE, la figura 2C, D) y la corteza posterior (Figura 2C), de nuevo corte a través de la corteza, el hipocampo y el plexo coroideo.
  15. Aplanar el telencéfalo. Eliminar completamente el polo posterior y el bulbo olfatorio (Figura 2D). Identificarel borde cortical que contiene el hipocampo y el plexo coroideo (Figura 2C), como se definió previamente 6,7.
    Nota: El hipocampo tiene un neuroepitelio más delgada que la corteza. El CP contiene vasos rojos.
    1. Separar el borde cortical de la corteza, dejando el tamaño de la corteza idéntico al tamaño de las eminencias ganglionares (Figura 2D). Esto da lugar a un bloque de la corteza (el tejido diana) y las eminencias ganglionares (GE, Figura 2D).
  16. Da la vuelta al bloque de corteza-GE con el lado ventricular (interior) de la superficie del plato.
    Nota: La superficie exterior del hemisferio se enfrentará al experimentador (Figura 2E). En la superficie exterior son las meninges que contiene los vasos sanguíneos-(Figura 2E).
    1. Pin de la GE de la superficie del plato con la mano izquierda y la cáscara de las meninges con un par de pinzas en la mano derecha (dominante) (Figura 2F Nota: Este es el paso técnicamente más exigente porque las meninges se adhieren fuertemente a la corteza. La separación de las meninges de la corteza se ve facilitada por el corte de una línea completamente recta (rectas) en pasos 5.13.1 y 5.14.
  17. Repita los pasos 5.12 a 5.16 para el otro hemisferio y todos los embriones. Cortar la corteza a lo largo de la LGE en una distancia de la mitad del diámetro principal de la LGE (Figura 2G, 2H). La corteza diseccionado se extiende por una superficie de 1,2 mm x 2,4 mm (Figura 2H) e incluye la capa SVZ / germinal de las células madre neurales.

6. Preparación de cultivos de explantes

  1. Cortar la corteza en explantes de menos de 400 m de diámetro (Figura 2I). Utilizar una cuadrícula de 400 micras (Figura 1) colocado por debajo de la placa de Petri para la disección de referencia (Figura 2H y 2I). Transferir todos los explantes en una placa de Petri fresca con hielo-cold medio de expansión.
  2. Retire la fibronectina a partir de una placa de cultivo tisular (paso 4.4). Deje que se seque. Añadir 1 ml de medio de expansión en frío para el centro de la placa de 35 mm de dimensión de cuadrícula de 10 mm x 10 mm (Figura 3). Dejar que el medio para formar una gota esférica (Figura 3).
  3. Inserte hasta 8 explantes al centro de la gota. Los explantes deben ser idealmente situados en la parrilla con al menos 3 mm de distancia entre sí para el análisis de la migración (ver sección 8).
  4. Incubar la placa durante aproximadamente 1 hr en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 21% de O 2, 5% CO 2) para la fijación de los explantes. Permitir que los explantes a asienten y se peguen a la superficie recubiertos de fibronectina. No agitar el plato, ya que los explantes pueden separar y mover fuera del centro de la rejilla óptima.
  5. Después de 1 h de incubación (37 ° C, 21% de O 2, 5% de CO 2), llenar el plato a un volumen total de 2 ml de medio de expansión más el crecimiento factores o sustancias de interés para probar e incubar.
    Nota: Ni digestión enzimática, ni suero o centrifugación son necesarios para la preparación de explante. Esto es óptimo para la integridad celular.

7. Preparación de NSC Cultura de los organismos unicelulares

  1. Calentar la expansión y medio realizando pases a 37 ° C.
  2. La transferencia de las piezas de la corteza disecados (desde el paso 5.17) en un tubo de 15 ml con medio de expansión en frío (tubo A). Centrifugar las piezas de la corteza durante 5 minutos a 1.200 x g. Aspirar el sobrenadante. Añadir 200 l medio de expansión pre-calentado para volver a suspender las piezas de la corteza.
  3. Añadir 700 l de medio de pases pre-calentado en el tubo de 15 ml con una punta de P1,000 (tubo A). Resuspender el pellet. Coloque la punta en la parte inferior del tubo 15 ml. Suave y lentamente disociar las piezas de tejido por aspiración tres veces con la punta P1,000.
    Nota: pases medio promueve la separación de células y es necesario para evitar el uso de enzimas.
  4. Deje que el tubo repose durante 30 a 60 segundos para grandes piezas no disociadas (más pesado) para ubicarse en la parte inferior. disociar las células individuales permanecerán en el sobrenadante. Transferir unos 700 l del sobrenadante a un tubo de 15 ml fresco (tubo B).
  5. Repita los pasos 7.3 y 7.4 para disociar las piezas más grandes.
  6. Repita los pasos 7.3 y 7.4 por segunda vez para disociar las piezas más grandes. Transferir toda sobrenadante a la fresca tubo de 15 ml (tubo B).
  7. Añadir medio de expansión a un volumen total de 5 ml. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Evaluar las células muertas mediante tinción con azul de tripano.
    Nota: Las pequeñas NSC toleran los pasos 7.2 a 7.6 mejor que las células más grandes. A partir de 10 embriones esperar alrededor de 4 x 10 6 células con 10% de células muertas.
  8. Para la expansión de células madre neurales, la placa de 1,5 x 10 6 células por placa de 10 cm de cultivo de tejidos recubiertos de fibronectina en un volumen de 8 ml de medio de expansión. Para la expansión estándar, añadir 8 l de 1.000 x rhFGF2 de valores. Añadir 8 l rhFGF2 todos los días y me cambiede diámetro cada dos días.
    Nota: La corteza en esta etapa de desarrollo contiene una mayoría de NSCs y sólo una minoría de células diferenciadas. Las células diferenciadas minoritarios no responden a la rhFGF2 tratos y mueren durante el cultivo de expansión.
  9. Pasaje expandió NSC a 60% de confluencia.
    1. Para NSC paso, retire medio de expansión. Lavar las células rápidamente tres veces con medio de 5 ml pases. Espere de 2 - 4 min. Sin Ca + 2 y Mg + 2 las células desprenderse lentamente de la superficie, el redondeo. Verificar el desprendimiento de las células bajo el microscopio de fase. Esperar unos minutos, si es necesario, hasta que se observa el desprendimiento de la superficie visual.
      Nota: Las celdas individuales se separarán por completo, pero la mayoría de las células todavía se adhieren a la superficie del plato. La duración necesaria para el desprendimiento depende de la duración de recubrimiento fibronectina. Un recubrimiento de fibronectina corto (12 horas o menos) da como resultado el desprendimiento de células más rápido. Para los experimentos más largos (>; Se recomienda 1 semana) revestimiento de fibronectina de más de 24 horas.
  10. Usar una pipeta de 10 ml para separar suavemente las células de la superficie. Recoger el medio pases 5 ml con células y la transfiere a un nuevo tubo de 15 ml. Repetir con otros 5 ml de medio de pases.
  11. Disociar las células en el tubo de 15 ml pipeteando arriba y abajo tres veces, la colocación de la 10 ml pipeta en la parte inferior del tubo. Girar el tubo durante 15 minutos a 1200 xg a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 ml de medio de expansión. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Utilice azul de tripano para evaluar las células muertas.
    Nota: Después de la expansión a 60% de confluencia, esperar 4 - 5 x 10 6 células con un recuento de células muertas en torno al 10%.
  12. Placa de 8 x 10 5 células por placa de 10 cm para obtener más pasajes.

8. Valoración de la migración

  1. Para la evaluación de la migración, aislar explantes de acuerdo con la Sección 5. Las semillas en los explantesPlacas de 35 mm de rejilla. Una hora después de la siembra, añadir FGF2 (rhFGF2). Colocar las cápsulas en una incubadora a 37 ° durante 2 días.
    Nota: Para la fijación explante óptimo, evitar mover los platos.
  2. Retire medio de 1.000 l punta. Añadir 2 ml de medio de expansión por 1.000 l punta de partida en el círculo interno (Figura 3). Esto reduce la tensión superficial en los explantes.
  3. Añadir los factores de crecimiento solo o en combinación según sea necesario para el experimento. Utilice FGF2 / BMP4 / TGFß1 como control positivo. Nota: En este experimento, se añadieron 2 FGF2 l por placa de 35 mm, 2 l BMP4 y 4 l TGFß1 solo y en combinación (Figura 5).
    1. Añadir factores adicionales y / o sustancias comprobables. Mantener los platos de nuevo sin tocar durante 2 días a 37 ° C.
  4. Tome fotografías de explantes en un microscopio invertido.
    Nota: Los explantes de estar dan mejores imágenes de contraste de fase que las células fijas. Ambos pueden ser utilizados.
  5. para la migraciónevaluación, utilizar un software de gráficos que permite mediciones de píxeles (por ejemplo, Fiji 8).
  6. Medir la red plato de 500 m de distancia en píxeles y utilizarlo como referencia interna.
  7. Definir el centro del explante como punto de inicio de la migración. Medir la distancia entre el centro del explante y el grupo más exterior de 10 células.
    Nota: Todas las células migran centrífugamente lejos del explante. Se forman espontáneamente una hoja en la periferia en las circunstancias analizadas (Figura 5).

9. Evaluación Invasion

  1. Preparar cultivo de tejidos de placas de 24 pocillos recubiertas de fibronectina de acuerdo con el artículo 4 del Protocolo.
  2. Colocar 300 l de medio de expansión caliente en el bien superior de cámaras de invasión celular. Se incuban las cámaras durante 30 minutos a 37 ° C y 5% de CO 2.
  3. Retire el medio de expansión del pozo superior y coloque la cámara de Boyden en la placa de 24 pocillos recubierta.
  4. Añadir 500 l de medio de expansión caliente con 0,5 l de rhFGF2 y rhBMP4 0,5 l a la parte inferior también.
  5. NSC paso y contar como se describe en la Sección 7. Los pasos del 1 al 4 son adecuados.
  6. La placa 5 x 10 5 células en un volumen de 300 l de medio de expansión caliente con 0,3 l de rhFGF2 y 0,3 l de rhBMP4 en el pocillo superior de la cámara de Boyden.
  7. Cultivar las células madre neurales semillas durante 24 horas.
  8. Añadir factores adicionales y / o sustancias comprobables a la cámara y cultivar las células durante otras 48 hr.
    Nota: Si las células son invasivos, que se pasan desde la parte superior bien a través de la capa de membrana basal hasta la parte inferior también. células invasoras se aferran a la parte inferior de la cámara de Boyden.
  9. Siga el protocolo proporcionado por el fabricante. Use hisopos de algodón (incluidos en el kit de ensayo de invasión) para eliminar las células no invasivas en el hoyo superior mediante la limpieza dos veces.
  10. Retire el medio de los pocillos y añadir 500 l con medio de expansiónuna mancha de la membrana plasmática de las células vivas y con el DAPI colorante nuclear a los pocillos.
  11. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C y 5% de CO2.
    Nota: Los colorantes se integrarán en la membrana y el núcleo de las células invasoras, respectivamente, para la visualización óptima 8. Opción: omitir tinte membrana plasmática cuando se haya previsto inmunocitoquímica multicolor.
  12. Retire el medio con los colorantes y lavar dos veces con medio de expansión. Visualizar y contar las células invasoras con un microscopio de fluorescencia invertido como se ha demostrado con anterioridad 8.
    Nota: Algunas células invasoras pueden haber separado de la parte inferior de la cámara y se han reducido a la superficie muy por debajo de donde se adhieren a la superficie recubierta. Para el análisis completo incluir las células en la superficie del pocillo.
  13. Se elimina el medio y fijar las células en helado fresco PFA al 4% durante 10 min. Lavar 3 veces con PBS 1x. Realizar inmunocitoquímica en las células invasoras, como se describió anteriormente 8-10.

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Representative Results

Este sistema modelo de EMT se basa en el aislamiento normalizado de NSCs tanto como células individuales o como explantes de una región específica del tubo neural en desarrollo, la corteza central (Figuras 1 y 2). Para la evaluación cuantitativa, los explantes se sembraron a la derecha en el centro de una placa de cultivo de rejilla 500 micras (Figura 3). Explantes de la corteza por el medio fueron expuestos primero en FGF2 durante dos días, seguido de dos días adicionales en diferentes combinaciones de factores de crecimiento (Tabla 1). Comenzamos con la corteza que es mayor que en otras regiones del tubo neural en desarrollo. Se observó que sólo los explantes cultivados en BMP4 mostraron una respuesta migratoria (Tabla 1 y Figura suplementaria 2).

Siguiente podoplanin (PDPN) se analizó la expresión en condiciones definidas. PDPN es un transmembrana sproteína ialomucin-como que se ha asociado con la invasión en varios tipos de cáncer y también en 11,12 NSCs 8. La proporción de células que expresan PDPN se incrementa en los gliomas de alto grado 13. PDPN también se asocia con una peor supervivencia en pacientes con glioblastoma 14. Además, PDPN ha demostrado ser un marcador de la progresión maligna en tumores múltiples, incluyendo carcinomas de mama, pulmón, colon 15,16. PDPN se expresa tanto en células madre neurales invasivos, así como migratorias 8. Utilizando el protocolo anterior, la expresión PDPN se comparó con el control, FGF2 solamente, en explantes expuestos a TGFß1 y BMP4 solos o en combinaciones. Se detectó la expresión PDPN en toda BMP4 y TGFß1 explantes / BMP4 tratada. En contraste, no se observó PDPN en los explantes de control en FGF2 solo o en explantes con TGFß1 sola (Tabla 2 y Figura 4). Además se indujeron las células con un fenotipo migratorio en BMP4 y TGFß1 / BMP4-explantes expuestos, mientras que los explantes de control (sólo FGF2) y TGFß1 solo no mostraron células migratorias (Tabla 1). La observación de las células migratorias ofrece un bajo costo, evaluación cualitativa sencilla.

Además, se evaluó la respuesta y la inducción de la EMT migratoria de varias regiones del tubo neural en desarrollo para BMP4 (Tabla 2). 400 micras explantes se prepararon a partir de la corteza central, la corteza posterior (polo posterior de etiqueta), la MGE y el mesencéfalo, como se indica en la Figura 1. Los explantes fueron expuestos a FGF2 durante dos días, seguido de dos días en FGF2 con BMP4 . La migración se define por la aparición de células migratorias planas con un borde de ataque y de salida (Figura 5 y la Figura 2 complementaria). Un fuerte inducción de células migratorias de la corteza posterior y una respuesta intermedia de la MGE y el MESencéfalo se observó (Tabla 2). 145 de 146 explantes de la corteza centro mostraron una respuesta migratoria en FGF2 / BMP4. Por lo tanto, el centro de la corteza demostró la inducción más robusta de las células migratorias de todos los explantes analizadas (Tabla 2). La omisión de BMP4 abolió cualquier respuesta migratoria (Tabla 1 y 2, y los datos no se muestra).

Para la evaluación cuantitativa de factor de crecimiento de la potencia, la distancia de migración se midió en explantes cultivados en múltiples factores de crecimiento. Los explantes se cultivaron como más arriba durante dos días en FGF2, a continuación, durante dos días adicionales en FGF2 sin factores (control) o BMP4 sola o combinada y TGFß1. En los explantes de control se observó una fuerte proliferación en respuesta a FGF2, como se esperaba. Los explantes se derivan de la SVZ cortical y contienen a un gran NSCs parte que se sabe que proliferan en respuesta a FGF2 17. El control de ceLLS llegaron a 689 ± 14, las células TGFß1 582 ± 49 m (Figura 5.). El BMP4-grupo mostró una distancia de migración media de 935 ± 91 micras. En comparación, las células / BMP4 TGFß1 migran significativamente más lejos, a 1.150 ± 23 micras (Figura 5). Los resultados muestran que BMP4 está induciendo una migración en NSCs FGF2-expuesta. Esta migración se puede mejorar aún más por TGFß1. Por tanto, la combinación de FGF2, BMP4 y TGFß1 es el más eficaz para inducir la migración. En resumen, el sistema de células modelo de cultivo permite tanto cualitativa como cuantitativa evaluación de la migración.

EMT se ha relacionado con factores de transcripción (TFS), tales como Snail1, Snail2, ZEB1, Zeb2, TWIST1, Twist2 en varios sistemas, incluyendo los cánceres epiteliales, tales como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón y también en tumores cerebrales de 1,18. We hanuncio indica que previamente FGF2 y BMP2 o BMP4 puede inducir Snail 1 y 8,9 Snail2. Usando el sistema anterior se investigaron los niveles de expresión de los otros TFS relacionados EMT. No hay cambios en la expresión TWIST1 podría ser detectado; con TWIST1 estar en bajos niveles de expresión durante la exposición FGF2 (datos no mostrados). En el modelo de cultivo celular se observó una regulación positiva de ZEB1 y Zeb2 durante FGF2-exposición y de Twist2 durante FGF2 / BMP4-exposición (Figura 6).

NSC se sabe que contribuyen a la población de precursores de oligodendrocitos (OPC) 8,19,20. Varias líneas de evidencia indican que la NSC y en los OPC en particular puede ser la célula de origen para los gliomas 21,22. Para caracterizar aún más el modelo anterior, se determinó la expresión de marcadores de OPC. Hemos observado que NSCs FGF2-expuesta demostraron co-expresión de Olig2 / nestina unad Sox10 / nestina en más de 90% (Figura 7). Esta observación demuestra que las células madre neurales muestran OPC-características de nuestro sistema. De hecho, los OPC-características correlacionados con la regulación positiva de Zeb'1 y Zeb'2 (Figuras 6 y 7). Estos resultados sugieren que FGF2-expansión infiere una identidad OPC, como se juzga por Olig2 y Sox10, mientras que al mismo tiempo se inicia primero Zeb -basado pasos de EMT.

Figura 1
Figura 1: Embrión estandarizados y el cerebro anterior disección de NSC El aislamiento y la inducción de EMT. (A) de la extremidad anterior izquierda de embrión de rata E14.5 después de la cesárea. Cada dígito extremidad delantera está marcado con una punta de la flecha negro. Tenga en cuenta la formación de dígitos que comienza típica para E14.5. (B) de la rata E14.5 embrión después de la retirada del casco. Tenga en cuenta la almohadilla (#) en el diencéfalo dorsal which es ideal para comenzar la extracción del primordio de la piel / cráneo. (C) La piel / cráneo ya se ha eliminado en su mayoría. La frontera entre la piel eliminado y no eliminado se marca con dos puntas de flecha triangulares. La piel se puede pelar la parte anterior de la flecha anterior y posterior de la flecha posterior. (D) La piel / cráneo ahora se elimina por completo. Nota la muesca del límite cerebro medio-cerebro posterior (flecha) y el corte justo caudalmente a ella, marcado con una punta de flecha. (E) El telencéfalo-diencéfalo-mesencéfalo (TEL-di-MES) de bloque se elimina del resto del embrión . (F) vista superior del bloque de TEL-DI-MES. Craneal se deja. (G) Vista oblicua desde arriba. (H) Vista inferior del bloque de TEL-DI-MES. (I) El mesencéfalo y parte del diencéfalo se separan del telencéfalo con la parte anterior del diencéfalo. Arriba: Vista anterior de ambas vesículas telencephalic. En pocas palabras: Right vista lateral del mesencéfalo, la parte superior coincida craneal (J) Inicio:. telencephalic ambas vesículas sin diencéfalo. Vista inferior para ilustrar la eliminación completa del diencéfalo. El asterisco representa MGE. En pocas palabras:. Parte anterior del diencéfalo (K) Inicio: Ambos hemisferios están separados en la fisura interhemisférica. hemisferio izquierdo en el lado izquierdo. El asterisco representa MGE. Signo más representa LGE. (L) Ampliación del hemisferio izquierdo con vistas mediana. se enfrenta a la derecha en sentido craneal, dejó en sentido caudal, es superior dorsal, ventral inferior, respectivamente. El asterisco (*) se encuentra en MGE. Signo más (+) se encuentra en LGE. ch, dobladillo cortical; FL, extremidad anterior; di, diencéfalo; MES, mesencéfalo; MHB, límite cerebro medio-posterior del cerebro; NS, las extremidades posteriores; LGE, eminencia ganglionar lateral; MGE, eminencia ganglionar medial; ob, bulbo olfatorio; pc, corteza posterior; Rho, rombencéfalo; tel, telencéfalo. La rejilla en cada imagen muestra líneas gruesas de 2 mm con cuatro intersección con líneas delgadas cada400 micras. La barra de escala en todas las imágenes:. 2 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Estandarizado disección cortical SVZ de NSC El aislamiento y la inducción de EMT. (A) Vista La mediana del hemisferio izquierdo. A través del agujero de Monro el MGE y LGE son visibles, marcados por asterisco y signo. (B) El bulbo olfatorio se elimina simplemente craneal del MGE-LGE. (C) El polo posterior de la corteza se quita justo detrás del CGE . (D) superior: el borde cortical se separa de la corteza. Izquierda: polo posterior. Medio: complejo que contiene la parte central de la corteza y el bloque de CGE-LGE-MGE. MGE cara y LGE a la derecha. Derecha: bul olfativab. (E) El bloque de CGE-LGE-MGE-córtex está inclinada horizontalmente. Ahora la superficie exterior del telencéfalo se enfrenta el microscopio. MGE y LGE se enfrentan ahora a la izquierda. (F) Las meninges de color rojizo se eliminan de la corteza translúcido brillante. El bloque CGE-MGE-LGE-CTX está volteado hacia atrás horizontalmente para el siguiente paso. (G, H) El mismo procedimiento se repite con el hemisferio derecho. La corteza central se separó lejos del bloque CGE-MGE-LGE. Tenga en cuenta que hay una zona de la corteza intermedia que se deja en el bloque de CGE-MGE-LGE, marcados con dos flechas. Este grosor de la corteza intermedia corresponde a la mitad del diámetro de la LGE. La línea punteada representa la frontera entre LGE-CGE y la corteza. (I) La corteza se separa en el centro de explantes de menos de 400 micras de diámetro. Barra de escala: 2 mm; rejilla en cada imagen muestra 2 mm de espesor con cuatro líneas de intersecciones (líneas finas) cada 400 m. El asterisco (*) se encuentra unat MGE. Signo más (+) se encuentra en LGE. Abreviaturas: ant-CTX, corteza anterior; CEN-CTX, la corteza central; CGE, eminencia ganglionar caudal; ch, dobladillo cortical; cp, plexo coroideo; CTX, la corteza; LGE, eminencia ganglionar lateral; los hombres, las meninges; MGE, eminencia ganglionar medial; ob, bulbo olfatorio; pc, corteza posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. Explante Siembra de 35 mm de cuadrícula cultivo celular platos colocar 1 ml de medio de expansión en el centro de la placa de rejilla de 500 micras. La gota es contenida por el borde de rejilla (flechas pequeñas). Explantes lugar justo en el centro de la gota 1 ml. Si los explantes se extienden fuera de la cuadrícula, SWIRL el plato en un lento movimiento circular y los explantes se moverán al centro por la fuerza centrípeta. Nota: los explantes son sólo apenas visible a simple vista (cabezas de flecha negro). Barra de escala: 35 mm.

Figura 4
Figura 4:. PDPN se induce en presencia de BMP 4 Los explantes se cultivaron de acuerdo a la sección de protocolo 8 (2 días en FGF2 solamente, a continuación, seguido de FGF2 con factores como se indica). De control (A) (FGF2 solo) y explantes TGFß1 (C) no contenían células PDPN-positivos (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). BMP4 (B) y TGFß1 / BMP4 (D) explantes mostraron una alta proporción de células PDPN-positivos. El centro de explante está a la izquierda, la periferia de la derecha. Nota: Las células PDPN-positivos eran en su mayoría found en la periferia y no en el centro del explante. Los explantes TGFß1 / BMP4 contenidos más plana, más elaborados células PDPN-positivos. (E) El porcentaje de células positivas PDPN en explantes en diferentes condiciones se representa. Control y TGFß1 tanto son significativamente diferentes de las condiciones con BMP4. Medios se muestran ± SEM. Control frente a TGFß1 no es significativa (ns). Control y TGFß1 vs. BMP4: p <0,0001 (***). TGFß1 vs. TGFß1 / BMP4: p <0,0001 (***). BMP4 vs. TGFß1 + BMP4 no es significativo: p = 0,0981 (ns). Control vs. TGFß1 + BMP4: p <0,0001 (***). La barra de escala para todas las imágenes, como se ilustra en (A):. 50 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 Figura 5: Evaluación cuantitativa de migración. BMP 4 y TGF beta 1 muestran Aditivo Efecto sobre la migración celular. Los explantes se cultivaron de acuerdo a la sección de protocolo 8. (A) Control de explante. (B) explante en BMP4 solo. (C) explante en TGFß1 solo. (D) en el explante combinación de TGFß1 y BMP4. (e) La distancia de migración en micras. La rejilla 500 micras se utilizó como referencia. El control y los explantes TGFß1 están mostrando una fuerte proliferación con un diámetro explante mayor que en las otras condiciones. Medios se muestran ± SEM. Tenga en cuenta que los explantes de BMP4 y TGFß1 / BMP4 se desintegran en parte el núcleo explante y las células emigran fuera de ella de forma centrífuga. Control frente a TGFß1 no es significativa (ns). TGFß1 vs.BMP4: p = 0,0353 (*). Control vs. BMP4: p = 0,0351 (*). BMP4 vs. TGFß1 + BMP4: p = 0,0372 (*). Control vs. TGFß1 + BMP4: p <0,0001 (***). Barra de escala: 500 micras. Centro de explante está marcada por un signo más (+). Borde exterior de células que migran está marcado con la flecha triangular. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6:.. La regulación positiva de la EMT relacionadas con factores de transcripción por QRT-PCR EMT está vinculado a los principales factores de transcripción de la Zeb- y Twist-familia (A, B) y Zeb'1 Zeb'2 se upregulated durante la primera fase de FGF2-exposición. (C) Twist'2 se upregulated durante la segundad fase de FGF2 / BMP4-exposición. se muestran los niveles de expresión relativos basados ​​en QRT-PCR (n = 2). Los niveles de mRNA se normalizaron a GAPDH. Medios se muestran ± SEM. Al día 0 del período de FGF2 se cosechó mRNA, más mRNA se cosechó después de cuatro días en FGF2, a continuación, después de un día en FGF2 / BMP4 Zeb'1:. De control vs. FGF2, p = 0,0002 Zeb'2:. De control vs. FGF2, p = 0,0206 Twist'2:. control de frente. FGF2 + BMP4, p = 0,003.

Figura 7
Figura 7:. NSC muestran características OPC en el sistema modelo NSC fueron aislados de la corteza central y cultivadas como células individuales en la presencia de FGF2 (según la sección 5). Después de 8 d en cultivo (paso después de 4 días de acuerdo a la Sección 7.9), las células formaron pequeñas colonias NSC y se tiñeron para Olig2 (rojo, en B, C), Sox10 (rojo, en E, F) y nestina (verde, A, C, D, F). Una alta proporción de las células co-expresado Olig2 / nestina (AC) y Sox10 / nestina (DF). (G) Co-expresión de Olig2 / nestina y Sox10 / nestina se muestra en porcentaje de todas las células. Medios se muestran ± SEM. La barra de escala para todas las imágenes, como se ilustra en (A) y (D):. 20 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Condición Explantes totales (corteza central) Los explantes con respuesta migratoria % Los explantes con expresión Podoplanin %
Controlar 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

Tabla 1. BMP 4 y la combinación de TGF ß 1 con BMP 4 inducir una respuesta migratoria robusto. Los explantes de la corteza centro se mantuvieron en medio de expansión y FGF2 para un total de cuatro días. Después de la primerados días, los explantes o bien continuaron recibiendo FGF2 solo (control) o FGF2 y además TGFß1, BMP4 o TGFß1 / BMP4 como combinación. Control- y TGFβ1- explantes tenían ni muestran una respuesta migratoria ni la expresión PDPN. BMP4 y TGFß1 / BMP4 inducidos tanto de las células migratorias, así como la expresión PDPN en todos los explantes.

Región explantes totales Explantes con respuesta migratoria en FGF2 / BMP4 %
córtex central 146 145 99.3
cortical posterior 52 48 92.0
MGE 56 29 51.7
mesencéfalo 53 28 52.8

Tabla 2. La corteza central muestra la migración más sólidas para responder a FGF 2 / BMP 4 explantes se prepararon a partir de diferentes regiones del tubo neural E14.5 de rata en desarrollo:. La corteza central, la corteza posterior, la eminencia ganglionar medial (MGE) y la mesencéfalo. Todos los explantes se cultivaron de forma idéntica en FGF2 / BMP4 (Sección 8). Los explantes tratados sin BMP4 no mostraron ninguna respuesta migratoria (datos no mostrados). Todos los explantes fueron seleccionados para la aparición de las células migratorias por explante. Todas las regiones fueron capaces de responder a FGF2 con BMP4 con la migración. La corteza central, sin embargo, mostró la respuesta más robusta. Tenga en cuenta que BMP4 se requiere para inducir ningún células migratorias. Explantes cultivados en FGF2 solo mostraron proliferación, pero sinmigración; y no se observaron células migratorias planas en FGF2 solo (Tabla 1 y Figura 2 complementaria).

Suministros Figura 1
Complementario Figura 1. 400 micras de cuadrícula del archivo. El archivo de cuadrícula puede ser impreso y utilizado como referencia durante los pasos de disección anteriores y como se muestra en las figuras 1 y 2. Los grandes intersecciones representan 2 mm con 400 micras subdivisiones. Por favor, haga clic aquí para descargar una versión en PDF de esta figura.

Suministros Figura 2
Figura 2 suplementaria. BMP 4 -exposed explantes Show células migratorias planas. Ampliación de las células que se muestran en la Figura 5. (A) Control- (FGF2 solo) y (C) TGFß1-explantes demostraron una división celular fuerte con pequeñas células redondeadas. (B) BMP4- y (D) TGFß1 / BMP4 explantes mostraron consistentemente células alargadas planas. La barra de escala para todas las imágenes, como se ilustra en (A):. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1
Figura 3 complementario. Resumen de in vitro sistema modelo para la investigación de EMT. Rata E14.5 corteza central contiene la SVZ NSC-que contiene. La corteza central es ya sea used como piezas de explantes o como células individuales. piezas de explantes son más convenientes para el análisis de la migración cuantitativa (Sección 8). Las células individuales son adecuados para el análisis cualitativo, como el gen o el análisis de proteínas (Sección 9.13).

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Discussion

En este estudio se describe un sistema estandarizado para el análisis de la EMT que utilizan células madre neurales (que se resumen en la Figura 3 complementario). La estandarización asegura la reproducibilidad (Tabla 1 y 2). Los NSCs se derivan de la corteza en desarrollo, un tejido que normalmente no experimenta EMT. Esto es ventajoso para el análisis de los primeros pasos en EMT. Los pasos iniciales en la EMT no pueden ser estudiados adecuadamente en las células tumorales que se han acumulado cambios genéticos y pueden ya han adoptado características de la EMT. Por otra parte, muestras de tumores primarios no son ideales para entender EMT ya que la mayoría de tumores malignos son heterogéneas que contienen tanto células invasivas y no invasivas. El protocolo presentado proporciona a los investigadores de la EMT con un nuevo modelo para estudiar los primeros pasos de la inducción de la EMT. Aquí nos muestran que los inductores de la EMT clave de la familia de Zeb y de la torcedura se activan secuencialmente: durante la primera fase ZEB1 y Zeb2 se upregulated, durante la segunda fase Twist2 (Figure 6). Anteriormente, habíamos demostrado que Snail 1 ya está regulada positivamente varias horas después de la exposición BMP4-8. También habíamos demostrado que tras la exposición BMP4 las células madre neuroepiteliales de la corteza central de diferenciarse en células mesenquimales, positivas para la actina de músculo liso (SMA) y calponin 9. Los resultados anteriores completan el estudio previo en el que demuestra que todos los tres conocidos reguladores clave de la EMT están involucrados en el sistema. Además, se observó que TGFß1 puede mejorar significativamente el efecto migratorio de FGF2 / BMP4 solo. Estos resultados apuntan a una red entre FGF, BMP y TGF-señalización durante la inducción de la EMT.

Los pasos más críticos para el aislamiento con éxito de NSCs para EMT y análisis de migración son: la correcta identificación de la edad embrionaria, la identificación de puntos de referencia anatómicos del embrión en desarrollo, la preparación de medios de cultivo frescos y (al menos durante la noche) placas recubiertas, el uso de instrumentos de punta fina y propor la disección de la porción central de la corteza en desarrollo para establecer explantes corticales.

Las técnicas presentadas pueden mejorar con algunas modificaciones. Como se sugirió anteriormente, múltiples explantes se sembraron en un plato único con una rejilla. Para el cribado de varios compuestos, sin embargo, puede ser más conveniente colocar los explantes individuales en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Además, el sistema modelo se puede refinar para el descubrimiento de fármacos a gran escala. Como se describió anteriormente, PDPN es un marcador valioso para las características migratorias recién adquiridas desde PDPN se encuentra en invasivo NSCs 8. Un reportero PDPN se puede transfectar en células madre neurales normales antes de la inducción de EMT. Como consecuencia PDPN expresando células pueden servir como un control interno para la transformación celular desde PDPN no se expresa en células madre neurales normales (Figura 4 y Tabla 1). Varios marcadores adicionales NSC están disponibles, tales como nestina, que se pierde después de la inducción de la EMT 8. Como consecuencia,tanto el estado inicial, "no migratorio / no invasiva / nestina +", y el estado final, "migratoria / invasiva / PDPN +", pueden ser monitoreados, lo que permite el descubrimiento de fármacos automatizado. En placas de cultivo de células grandes con múltiples pocillos (por ejemplo, placas de 96 pocillos y las células más grandes) inicial puede ser sembrada y se trata con fármacos o compuestos sin función conocida establecidos. De este modo, las placas de múltiples pocillos se pueden escanear de forma automática para la expresión de PDPN u otros marcadores de migración / invasión. Si un inhibidor es el objetivo principal de la pantalla, la desaparición de la expresión PDPN puede ayudar a identificar nuevos compuestos inhibidores supuestamente interesantes.

Durante la prueba de una sustancia novedosa los explantes pueden no mostrar la migración y / o los explantes pueden redondear y desprenderse del plato. En esta situación, lo mejor es cambiar sólo la mitad de los medios de comunicación todos los días (en lugar de cambio de medio completo cada dos días). Esto reduce el estrés por la tensión superficial cuando se reemplaza con medio fresco. losexplantes no podrán unir después del cultivo inicial. En esta situación, la fibronectina tiene que estar en contacto con la superficie del plato durante al menos 36 h. Fibronectina utilizado para el revestimiento y se deberá preparar sin exposición a un tubo de plástico durante más de 10 minutos desde la fibronectina puede adherirse al plástico. Además, los explantes pueden establecerse fuera de la cuadrícula. En esta situación, es recomendable girar el plato en un lento movimiento circular. Esto permite que los explantes para volver a colocar al centro por la fuerza centrípeta (véase la Figura 3).

Hay una fuerte evidencia de que los gliomas se derivan de células madre neurales y / o derivados de los OPC NSC 23,24. Como consecuencia de otros grupos han establecido modelos de crecimiento glioma sobre la base de NSCs:. Sampetrean et al NSCs aisladas de ratones INK4 / ARF-deficientes y la sobreexpresión de H-Ras 25 forzado. Tumores malignos de alto grado como resultado que mostró la proliferación e invasión después del trasplante 25. McNeill et al., también NSC aislados de ratones genéticamente modificados (Rb1 floxed, la NF1, Kras, PTEN solos y en combinaciones) 26. Los genes se inactivan por la infección Cre-virus y de las células madre neurales se trasplantaron 26. Estos dos sistemas de modelos tienen la ventaja de que la invasión se puede monitorear in vivo y potenciales nuevos fármacos anti-invasión se puede probar. Su principal desventaja es que el inicio de la invasión no está bien definido y no está claro si las células muestran invasión glioma-típico EMT (genes EMT) o sólo la migración local. Además sólo un medicamento puede ser probado por animal y el análisis requiere varias semanas. Para identificar un nuevo fármaco anti-invasión, las compañías farmacéuticas necesitan (a) para la detección de varios miles de compuestos o más a la vez, (b) para reproducir las pruebas y (c) para tratar diferentes concentraciones de fármaco. Para preparar varios miles de animales trasplantados, tratarlos con diferentes fármacos y finalmente probar los efectos de histoquímica o bioluminiscenciaEl análisis de los recursos es muy lento. Aquí se describe un nuevo sistema de modelo basado en NSC para la invasión relacionados con EMT que permite la detección rentable de miles de compuestos.

Aunque este modelo permite el cribado de alto rendimiento de compuestos, es sólo una plataforma de cribado primario. Una vez los compuestos de interés se identifican en este modelo, se requieren validación adicional. Ensayo in vivo es necesaria para los parámetros de seguridad y eficacia para cualquier compuesto identificado y modelos de trasplante como se describe anteriormente convertido en importante 25,26. El modelo también está limitado por el hecho de que se basa en células de roedores. Aunque el modelo puede ser utilizado para investigar la rata o el ratón EMT, no está claro si los mismos mecanismos están en su lugar en las células humanas o en el paciente humano. Se necesitan más experimentos para investigar si NSCs no sólo son invasivo in vitro, sino también después del trasplante. Varias líneas de evidencia apoyan el papel de las células madre neuralesen la formación de glioma. La progresión del glioma se ha relacionado con los siguientes genes: La tenascina C, HEY1, SPARC, SNAIL1 y Snail2, FGFR +, Bmpr1a, EGFR, PDGFR, Sox2, podoplanin, Gli3 y p75NGFR 8. Todos estos genes también se expresan durante la transformación de NSCs no invasivos normales en células mesenquimales invasivos 8. Al ser el tiempo, no está claro si NSCs pueden transformarse en tumores por únicos factores de crecimiento externo.

Las células madre tumorales iniciadoras (TICs) de diferentes tumores se han aislado y se utilizan como modelos para entender la progresión del tumor 27. Los tics son, sin embargo, no es apropiado para el análisis de la EMT, EMT, ya que ya se produjo en TIC 27. Para comprender primeros y también los pasos finales de la inducción de EMT, se necesita una población celular no neoplásico primario. Lo ideal sería que esta población no estaba destinado a someterse a EMT en el primer lugar. Se había demostrado previamente que NSCs embrionarias eran candidatos adecuados para este propósito9,28. A saber, la migración y la invasión podrían ser inducidos en células madre neurales por FGF2 y BMP4 9,28. La migración inducida por BMP4 FGF2 / estaba relacionado con los genes individuales relacionados EMT-, sin embargo, la evidencia completa era deficiente ya que las gamas de claves EMT Zeb y torsión no habían sido investigados 8. Los resultados anteriores muestran que una combinación específica de cuatro factores, FGF2, BMP4, TGFß1 y la insulina hacen que una inducción de la EMT muy fuerte y completa, no se observaron antes. El presente estudio demuestra que los genes clave de la EMT Zeb- y twist-familias también están regulados por incremento. Por tanto, este estudio proporciona la primera evidencia de que no hay regulación por incremento selectiva de genes individuales, pero los resultados muestran que todas las familias principales de EMT son activos en el sistema de cultivo celular propuesto.

EMT también se ha observado en los cánceres epiteliales fuera del cerebro, tales como de pulmón, mama, colon y cáncer gástrico 29. Varios modelos para estudiar EMT están en uso para estos tumores 30-32, Que vienen, sin embargo, con limitaciones significativas: (a) el uso de líneas de células tumorales transformadas que llevan múltiples genética y epigenética cambios 33; para identificar inhibidores de la EMT para las etapas tempranas del cáncer, las células de cáncer en etapa tardía son insuficientes; (B) los cultivos de suero dependiente que contienen diversos factores de crecimiento no definidos; esto hace que la identificación de factores críticos muy difícil. Además, la reproducibilidad experimento se deteriora puesto que la calidad del suero varía de un lote a otro; (C) suero contiene inhibidores y actividades enzimáticas posiblemente inactivación de compuestos exógenos potencialmente útiles; (D) necesidad de enzimas para pases de células que degradan moléculas de superficie celular; (E) para identificar agonistas EMT EMT para promover fisiológica, se necesitan las células normales para probar la inducción. modelos de células tumorales son inadecuadas para encontrar sustancias que promueven la regeneración de las células madre normales.

También se requiere la migración para procesos normales, tales como curación de heridas y Regeneración del cerebro lesionado 18. Después de una lesión cerebral traumática y derrame cerebral, NSC son necesarios para migrar a la zona de la lesión para participar en la regeneración 4,34. El sistema actual también se puede utilizar para identificar sustancias que promueven la migración y la invasión. Como puede observarse, se induce la migración en el arranque con BMP4 tratos. Si las células no están expuestos a las BMP pero en cambio a nuevos compuestos, que podrán sustituir a la acción BMP lo que ayudará a identificar nuevos agonistas de BMP. Con un sistema indicador que indica la expresión PDPN, pruebas a gran escala de sustancias novedosas hace factible; si un nuevo compuesto puede sustituir a BMPs, las células que expresan PDPN pueden ser identificados automáticamente.

El sistema propuesto es también útil para investigar las interacciones de señalización celular. Nuestros resultados muestran que el efecto sobre la migración BMP podría mejorarse mediante la activación TGFß1. Los resultados revelan una interacción aditiva entre BMP y TGFβ-señalización. Sin embargo, las vías de señalización adicionales, tales como Notch, Wnt o EGFR / MAPK y otras cascadas de señalización pueden estar involucrados. Por lo tanto, se necesitan más investigaciones sobre BMP / TGF-interacciones y la diafonía de otras vías. Además, el centro de la corteza de respuesta puede ser aislado a partir de ratones modificados genéticamente, que pueden ayudar a dilucidar los mecanismos subyacentes EMT de conducción. En resumen, el sistema de modelo de EMT se describe aquí puede ser útil en los campos de la biología de células madre y la regeneración, así como en la investigación del cáncer. Puede ser utilizado para el cribado de las bibliotecas de medicamentos para las sustancias inhibir o potenciar la migración y la invasión.

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Acknowledgments

El estudio fue apoyado por la Fundación Universidad de Basilea Ciencia y la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza con una donación de MHS y AG (SNF IZLIZ3_157230). Agradecemos a: Dr. Tania Rinaldi Burkat generosamente para proporcionar la infraestructura; todos los miembros del grupo Bettler para los debates y comentarios. Agradecemos a Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Suiza) para la instalación profesional y competente de la cámara de vídeo de alta definición completa MC170 (Leica Microsystems, Suiza).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

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References

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