Abstract
Epitelial para mesenquimal (EMT) descreve o processo de epitélio transdifferentiating em mesênquima. EMT é um processo fundamental durante o desenvolvimento embrionário que também ocorre frequentemente em glioblastoma, o tumor cerebral maligno mais frequente. EMT também tem sido observado em vários carcinomas fora do cérebro, incluindo o cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro gástrico. EMT está centralmente ligada a malignidade por promoção da migração, invasão e formação de metástases. Os mecanismos de indução de EMT não são completamente compreendidos. Aqui, descrevemos um sistema in vitro para o isolamento padronizada de células estaminais neurais corticais (NCCC) e subsequente EMT-indução. Este sistema oferece a flexibilidade para usar tanto as células individuais ou cultura explante. Neste sistema, rato ou ratinho embrionárias NSC prosencéfalo são cultivadas num meio definido, isento de soro e enzimas. As NSC expressa Olig2 e SOX10, dois factores de transcrição observada em oligodendroccélulas precursoras yte (OPCs). Usando este sistema, as interacções entre FGF, BMP- e TGFp-sinalização envolvendo Zeb1, Zeb2, e Twist2 foram observados onde o TGFp-activação melhorado significativamente a migração de células, sugerindo um sinérgico / TGFp-interacção BMP-. Os resultados apontam para uma rede de FGF, BMP- e TGF-sinalização de estar envolvido na indução e manutenção EMT. Este sistema de modelo é relevante para investigar in vitro EMT. É rentável e mostra alta reprodutibilidade. Além disso, permite a comparação de diferentes compostos no que diz respeito às suas respostas de migração (medição quantitativa distância), e rastreio de alto rendimento de compostos que inibem ou aumentam EMT (medição qualitativa). O modelo é, portanto, bem adequado para testar bibliotecas de drogas para as substâncias que afectam a EMT.
Introduction
Durante vários estágios do desenvolvimento embrionário, células epiteliais perdem a sua forte aderência entre si (por exemplo, junções apertadas) e adquirir um fenótipo migratória em um processo chamado epitelial para mesenquimal (EMT) 1. EMT é necessário para a formação de tipos de células adicionais, tais como as células da crista neural mesenquimais, uma população que segrega do neuroepitélio 2. EMT não é apenas essencial durante a fase embrionária, mas também necessária em fases posteriores da vida adulta para manter os processos fisiológicos no organismo adulto, como a cicatrização de feridas 3 e sistema nervoso central de regeneração (CNS) em lesões desmielinizantes 4.
Tumores epiteliais são conhecidos para reativar EMT como uma etapa de iniciação para a migração, invasão e metástase, levando a progressão do câncer de 1,3. EMT está de facto ligado centralmente a uma forte 1,3 migração. Os passos de c celularesonditioning, iniciando, sofrendo e manutenção de EMT não são totalmente compreendidos e necessitam de uma investigação mais aprofundada.
Aqui, um padronizado sistema modelo in vitro baseado em EMT NSC, com factores de crescimento definidos e meios (sem soro e sem o uso de enzima) é apresentada. Este sistema modelo é de relevância para os cientistas que trabalham em EMT. O caracol, Zeb e torção famílias de proteínas têm sido mostrados para ser crítico para EMT tanto em desenvolvimento e uma doença. O caracol, Zeb e torção famílias também estão envolvidos no sistema apresentado. O sistema baseia-se numa região específica do cérebro anterior que, normalmente, não sofre EMT proporcionando uma vantagem particular para o estudo dos acontecimentos iniciais de indução durante EMT.
O sistema modelo poderia potencialmente ser aplicada ao estudo de EMT em epitélios fora do SNC, uma vez que os indutores EMT-chave, tais como o caracol, Zeb e proteínas torção, também são encontradas durante EMT em sistemas de tecido fora do SNC. Este modelo sistema permite o isolamento padronizado de NSCs a partir do córtex em desenvolvimento a estudar características de células-tronco em geral e EMT em particular. Usando este sistema, foram isoladas as NSC, EMT induzida e estudada a migração subsequente sob o efeito de FGF2 e BMP4. Observamos que FGF e interage BMP-sinalizando com TGF-sinalização para promover a migração celular, validando o sistema modelo.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais seguiram o 'Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório' (publicação NIH, 8ª edição, 2011) e foram aprovados pela Comissão Bem-Estar Animal da Basileia (Diretrizes suíços para o Cuidado e Uso de Animais). Por estas orientações do protocolo animal é considerado de "menor animais gravidade grade".
1. Preparação de meio de expansão
Nota: O trabalho em condições assépticas como padrão para cultura de tecidos.
- Tomar dois tubos de 15 ml, e adicionam-se 5 mL de L-glutamina livre de DMEM / F12 (1: 1) a partir de um frasco de meio de 500 ml em cada um dos dois tubos de 15 ml. Para o primeiro tubo de 15 ml, adicionar 50 mg de apo-transf errina, putrescina 50 ul de estoque 1 M (concentração final 0,1 mM) e 30 ul de selénio de sódio a 500 uM de stock (concentração final 30 nM).
- Filtrar através de um filtro de seringa de 0,2 um para dentro da garrafa de DMEM / F12 originais.
- Para o segundo tubo de 15 ml, adicionar 12,5 mg de insulina. Adicionar6 - 9 gotas de NaOH 1M. Vortex para dissolver completamente insulina. Filtrar através de um filtro de seringa de 0,2 um para dentro da garrafa de DMEM / F12 originais.
Nota: O NaOH é tóxico e corrosivo. Use luvas, casaco e óculos de segurança. - Adicionar 5 ml de penicilina (10000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 ug / mL) / anfotericina B (25 ug / mL) para o frasco de meio DMEM / F12.
- Adicionar 5 ml de estoque de 200 mM de L-glutamina descongelado de fresco ou oligopéptidos contendo glutamina (200 mM de L-alanil-L-glutamina dipeptídeo) para o frasco de meio DMEM / F12.
- Agite bem. Preparar 50 ml de alíquotas.
Nota: meio de expansão pode ser armazenado durante pelo menos 2 semanas a 4 ° C. tubos de alíquota mostrar menos mudanças de pH em relação ao meio mantidos em garrafas de 500 ml.
2. Preparação de Passaging Médio
- Para 1 l de Ca 2 + - + 2 e Mg HBSS livre de meios de comunicação, adicionar 990,85 mg de glucose (concentração final 5 mM) e 840,10 mg de NaHCO3 Nota: O meio de passagem podem ser armazenadas durante pelo menos 4 semanas a 4 ° C.
3. Preparação de Fatores de Crescimento
- Prepare estéril 1x PBS com 1% de BSA (PBS-BSA), isoladamente ou com ácido clorídrico (HCl) a 4 mM (PBS-BSA-HCl).
Cuidado: HCl é corrosivo e tóxico e requer medidas especiais de segurança (casacos, óculos, luvas, Hood). - Dissolve-se 10 ug / ml do crescimento humana de fibroblastos recombinante Factor de 2 (rhFGF2) em PBS-BSA (10 ng / ml concentração final), 10 ug / ml de recombinante humano de proteína do osso morfogenética 4 (rhBMP4) em PBS-BSA (10 ng / mL de concentração final concentração), e 20 ug / ml de factor de crescimento transformante humano recombinante p 1 (rhTGFβ1) em PBS-BSA-HCl (40 ng / ml concentração final).
- Não filtrar esterilizar. Preparar alíquotas.
Nota: aliquotas de factor de crescimento pode ser armazenado a-20 ° C durante pelo menos 2 anos.
- Não filtrar esterilizar. Preparar alíquotas.
4. Revestimento de Cultura Celular Pratos
- Dissolve-se 1875 mg de poli-L-ornitina (PLO) em 500 ml de H2O destilada para preparar um estoque PLO 250x. Filtrar esterilizar utilizando um filtro de seringa de 0,2 um e fazer alíquotas de 2 ml.
Nota: Estas aliquotas podem ser guardadas a -20 ° C durante pelo menos 2 anos. - Dissolve-se 1 mg de fibronectina bovina em 1 ml estéril-H2O destilada para preparar a 1.000x da fibronectina. Não vortex, pois isso pode coagular a proteína pegajosa. Agitar suavemente com a mão por 10 min.
- Incubar durante 1 h à temperatura ambiente com agitação ocasional. Verifique se há dissolução completa. Aquece-se a solução para menos do que 37 ° C para a dissolução completa de fibronectina. Não filtrar-esterilizar.
Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até 6 meses.
- Incubar durante 1 h à temperatura ambiente com agitação ocasional. Verifique se há dissolução completa. Aquece-se a solução para menos do que 37 ° C para a dissolução completa de fibronectina. Não filtrar-esterilizar.
- Use pratos pré-tratados com plasma de plástico de cultura de células (de 100 mm ou outros tamanhos conforme necessário parao experimento). Para avaliar a migração, utilizar 35 mm pratos com 500 mm de grade. Incubar durante a noite pratos com 2 ml de 1x PLO durante 12 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% de cultura de tecidos. Lavar duas vezes com 2 ml de PBS 1x.
- Adicionar 2 ml de 1x fibronectina (/ ml de concentração final 1 ug) e incubar os pratos durante um mínimo de 12 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. Remover fibronectina apenas antes do plaqueamento das células.
Nota: A fibronectina pratos revestidas podem ser armazenadas durante pelo menos 2 semanas a 37 ° C.
5. Padronizado Dissecção e Preparação do subventricular Zona cortical (SVZ)
- Obter rato embrionário dia 14.5 (E14.5, Sprague-Dawley) e E13.5 rato (C57BL / 6) embriões por cronometrado-acasalamento. Acasalar animais a partir das 18:00 até às 08:00 da manhã seguinte. Meio-dia após o dia de acasalamento é considerado E0.5.
- Anestesiar o animal prenhe com 5% de isoflurano eo fluxo de oxigênio de 0,8 L / min. Verifique resposta por compressão pata com Diss afiadaforceps exão. Decapitar o animal. Evite CO 2 asfixia como CO 2 afeta tronco recuperação celular.
- Recuperar embriões por cesariana.
- Coloque o animal em decúbito dorsal e desinfectar a pele com etanol 70%. Use uma pinça cirúrgica e tesoura para fazer incisão na pele em forma de V de cerca de 8 cm no abdômen inferior acima do útero. Inciso só a pele com pele, mantendo paredes musculares intactas.
- Use uma pinça frescas e uma tesoura para inciso os músculos e parede muscular abdominal para entrar no peritônio.
- Identificar o útero no peritônio posterior inferior. Remover o útero por uma separação nítida dos tecidos circundantes.
- Lave o útero com embriões com estéril 1x PBS e coloque em gelada 1x PBS.
- Use uma tesoura de ponta fina para abrir as paredes uterinas para liberar embrião embrião sob um microscópio de dissecção (3X ampliação, Figura 1B). Utilizar um par de fórceps para remover as cascas embrionárias (
- Verificar o estágio de desenvolvimento correcta por parte do Atlas do Desenvolvimento Rat Nervous System 5. O tamanho correcto do embrião é mostrado na Figura 1B.
- Verificar idade corrigir ainda mais pela presença da formação de dígitos começando no membro anterior de rato (FL) tal como ilustrado na Figura 1A.
Nota: O membro posterior (HL) que ainda não mostram separação dígitos (Figura 1B).
- Para dissecção, transferir embriões para pratos de Petri não revestidos preenchidos com gelo-frio 1x PBS. Realizar dissecção sob um microscópio de dissecção estéreo (3X a ampliação de 20x) usando uma pinça fina autoclavados.
Nota: As placas de Petri impedir a fixação de tecido à superfície do prato, como pode acontecer com pratos de cultura de células com revestimento de plasma. agulhas fio de tungstênio afiadas ou similares também são úteis para determinadas etapas de dissecção. - Retire a pele da cabeça e do crânio começando no intersection do telencéfalo desenvolvimento (TEL) e diencéfalo (DI) (Figura 1B) puxando simultaneamente anteriormente e posteriormente com duas pinças, a fim de ter acesso ao tubo neural em desenvolvimento (Figura 1C).
- Identificar o rombencéfalo-limite mesencéfalo (MHB, cabeça da seta preta na figura 1B-D), que separa o mesencéfalo (MES) do rhombencephalon. Cortar o rombencéfalo apenas igual ou inferior ao de MHB (Figura 1D, seta triangular).
Nota: O espaço subcutâneo adicional no MHB facilita a remoção da pele sem prejudicar o tubo neural. - Cortar a ligação entre o telencéfalo / diencéfalo na base do crânio com o esqueleto facial (Figura 1E). Isso resulta em um bloco contendo o telencéfalo, diencéfalo e mesencéfalo (TEL-di-MES) (Figuras 1F-H).
- Transferir o bloco TEL-DI-MES em meio de expansão em gelo. Mantenha-o completEly coberto de meio de expansão em um prato de Petri não revestido. Manter o bloco no mesencéfalo com um par de pinças para evitar tocar no telencéfalo que contém o SVZ cortical com NSC.
- Repita os passos 5,5-5,8 com todos os embriões (Figura 1F-H).
- Transferir um TEL-di-MES bloquear em fresco gelada 1x PBS. O corte ao longo da linha ponteada no mesencéfalo anterior (Figura 1F-H), separando o mesencéfalo diencéfalo de a, como mostrado na Figura 1I.
- Separa-se a DI da TEL por corte ao longo das linhas tracejadas na Figura 1F. Ver telencéfalo isolado na Figura 1J.
- Dividir os dois hemisférios telencefálicas, cortando ao longo da linha ponteada na Figura 1J. Isto resulta em dois hemisférios separados tal como ilustrado na Figura 1K.
Nota: O hemisfério esquerdo é ampliada na Figura 1D. - Identificar o grupo medialeminências lionic (MGE, Figura 2A; *) e eminências ganglionares laterais (LGE, Figura 2A; +) visível através do futuro interventriculare Forame.
- Utilizando uma pinça ou agulha, dissecar ao longo de uma linha reta na intersecção entre a MGE e LGE eo córtex anterior (ant-CTX, Figura 2B). Cortar uma linha reta através do córtex, hipocampo (quadril) e do plexo coróide (CP). Esta separa o córtex anterior incluindo o bolbo olfactivo (OB) das sumidades ganglionares (GE, figuras 2B, C).
- Corte uma segunda linha reta no cruzamento da eminência ganglionar caudal (CGE, Figura 2C, D) e do córtex posterior (Figura 2C), novamente cortando córtex, hipocampo e plexo coróide.
- Alisar o telencéfalo. Remover completamente o pólo posterior e do bulbo olfatório (Figura 2D). Identificara bainha cortical contendo o hipocampo e o plexo coróide (Figura 2C), tal como definido anteriormente 6,7.
Nota: O hipocampo tem um neuroepitélio mais fino do que o córtex. A CP contém vasos vermelhos.- Separa-se a bainha cortical do córtex, deixando o tamanho do córtex idêntico ao tamanho das sumidades ganglionares (Figura 2D). Isto resulta num bloqueio do córtex (o tecido alvo) e as proeminências ganglionares (GE, Figura 2D).
- Virar o bloco córtex-GE com (interior) lateral do ventrículo para a superfície do prato.
Nota: A superfície exterior do hemisfério terá de enfrentar o experimentador (Figura 2E). Na superfície exterior são as meninges contendo vasos sanguíneos (Figura 2E).- Pin a GE para a superfície do prato com a mão esquerda e descascar as meninges fora com um par de fórceps na mão direita (dominante) (Figura 2F Nota: Este é o passo tecnicamente mais exigente porque as meninges aderir fortemente ao córtex. A separação das meninges do córtex é facilitada por uma linha de corte completamente linear (não recortada) em passos 5.13.1 e 5,14.
- Repita os passos de 5,12-5,16 para o outro hemisfério e todos os embriões. Cortar o córtex ao longo da LGE em uma distância de metade do diâmetro principal do LGE (Figura 2G, 2H). O córtex dissecados se estende por uma área de 1,2 mm x 2,4 milímetros (Figura 2H) e inclui a camada de SVZ / germinal com as NSC.
6. Preparação de culturas de explantes
- Cortar o córtex em explantes de menos do que 400 um de diâmetro (Figura 2I). Use uma grade de 400 mm (Recurso Figura 1) posicionado abaixo da dissecção de Petri para a referência (Figura 2H e 2I). Transferir todos os explantes em um prato fresco Petri com gelo-comeio de expansão ld.
- Remover a fibronectina a partir de uma placa de cultura de tecido (passo 4.4). Deixe-o secar. Adicionar 1 ml de meio de expansão fria para o centro do prato de 35 mm, com dimensão de grelha de 10 mm x 10 mm (Figura 3). Permitir que o meio, para formar uma gota esférica (Figura 3).
- Inserir até 8 explantes para o centro da gota. Os explantes deve ser idealmente localizado no grid, com distância de pelo menos 3 mm entre si para a análise de migração (ver secção 8).
- Incubar a placa durante cerca de 1 h numa incubadora de cultura de células (37 ° C, 21% de O 2, CO 5% 2) para fixação dos explantes. Permitir que os explantes para se estabelecer e aderir à superfície revestida com fibronectina. Não agite o prato, uma vez que os explantes podem soltar e sair do centro da grade ideal.
- Após 1 h de incubação (37 ° C, 21% de O2, 5% de CO 2), encher-se o prato para um volume total de 2 ml de meio de expansão mais o crescimento fatores ou substâncias de interesse para testar e incubar.
Nota: Nenhum digestão enzimática, nem soro ou centrifugação são necessários para a preparação dos explantes. Isto é óptimo para a integridade da célula.
7. Preparação de NSC Cultura única célula
- Aqueça expansão e médio passaging a 37 ° C.
- Transferir os pedaços de córtex dissecados (a partir do passo 5.17) para um tubo de 15 ml com meio de expansão fria (tubo A). Centrifugar os pedaços de córtex durante 5 min a 1200 x g. Aspirar o sobrenadante. Adicionar meio de expansão pré-aquecido de 200 ul para ressuspender as peças do córtex.
- Adicionar 700 ul de meio de passagem em pré-aquecido para o tubo de 15 mL com uma ponta de P1,000 (tubo A). Delicadamente ressuspender o sedimento. Colocar a ponta na parte inferior do tubo de 15 ml. Devagar e com cuidado dissociar os pedaços de tecido pela sucção três vezes com a ponta P1,000.
Nota: Passaging forma promove a separação de células e é necessário para evitar a utilização de enzimas. - Permitir que o tubo para se sentar por 30 a 60 segundos para maiores (mais pesado) peças sem dissociar a acertar na parte inferior. células dissociadas individuais permanecerão no sobrenadante. Transferir cerca de 700 ul do sobrenadante para um tubo de 15 ml fresco (tubo B).
- Repita os passos 7.3 e 7.4 para dissociar os pedaços maiores.
- Repita os passos 7.3 e 7.4 uma segunda vez para dissociar os pedaços maiores. Transferir todo o sobrenadante para o tubo de 15 ml fresco (tubo B).
- Adicionar meio de expansão de um volume total de 5 ml. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Avaliar as células mortas por coloração azul-tripan.
Nota: Pequenas NSC tolerar os passos 7.2 a 7.6 melhores do que as células maiores. A partir de 10 embriões esperar cerca de 4 x 10 6 células com as células mortas 10%. - Para a expansão da NSC, placa 1,5 x 10 6 culas por placa de 10 cm de cultura de tecidos revestidas com f ibronectina em um volume de 8 ml de meio de expansão. Para a expansão standard, adicionar 8 mL de estoque 1.000x rhFGF2. Adicionar 8 mL rhFGF2 todos os dias e me mudardia a cada dois dias.
Nota: O córtex nesta fase de desenvolvimento contem uma maioria de NSC e apenas uma minoria de células diferenciadas. As células minoritários diferenciadas não respondem ao rhFGF2-tratamento e morrem durante a expansão da cultura. - Passagem expandida NSC a 60% de confluência.
- Para NSCs passagem, remova o meio de expansão. Lavar as células rapidamente três vezes com meio 5 ml Passaging. Espera 2-4 min. Sem Ca 2 + e Mg 2 + as células lentamente separar da superfície, o arredondamento para cima. Verifique descolamento das células ao microscópio de fase. Esperar mais alguns minutos, se necessário, até o descolamento visuais de superfície é observado.
Nota: as células individuais vai separar completamente, mas a maioria das células continuarão a aderir à superfície do prato. A duração necessária para descolamento é dependente da duração do revestimento de fibronectina. Um revestimento de fibronectina de curta duração (12 horas ou menos) resulta em separação celular mais rápido. Para as experiências mais longos (>; 1 semana) de revestimento de f ibronectina mais do que 24 horas é recomendado.
- Para NSCs passagem, remova o meio de expansão. Lavar as células rapidamente três vezes com meio 5 ml Passaging. Espera 2-4 min. Sem Ca 2 + e Mg 2 + as células lentamente separar da superfície, o arredondamento para cima. Verifique descolamento das células ao microscópio de fase. Esperar mais alguns minutos, se necessário, até o descolamento visuais de superfície é observado.
- Usar uma pipeta de 10 ml para separar suavemente as células a partir da superfície. Recolhe-se o meio de passagens em 5 ml de células e transferi-lo para um tubo fresco de 15 mL. Repita com um adicional de 5 ml de meio passaging.
- Dissociar as células no tubo de 15 ml por pipetagem para cima e para baixo três vezes, colocando a pipeta de 10 ml, no fundo do tubo. Girar o tubo durante 15 minutos a 1200 xg à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 2 ml de meio de expansão. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Use azul trypan para avaliar as células mortas.
Nota: Após a expansão a 60% de confluência, esperar 4 - 5 x 10 6 células com uma contagem de células mortas em torno de 10%. - Placa 8 x 10 5 células por placa de 10 cm para passagens adicionais.
8. Avaliação de Migração
- Para avaliação da migração, isolar explantes de acordo com a Seção 5. Semente os explantes em35 pratos de grade mm. Uma hora após o plaqueamento, adicione FGF2 (rhFGF2). Coloque os pratos em uma incubadora a 37 ° C durante 2 dias.
Nota: Para a fixação explante ideal, evitar mover os pratos. - Remova o meio de 1.000 ponta ul. Adicionar 2 ml de meio de expansão por 1000 ponta ul começando no círculo interior (Figura 3). Isto reduz a tensão superficial em explantes.
- Adicionar factores de crescimento isoladamente ou em combinação, conforme necessário para a experiência. Use BMP4 / TGF-p1 controle FGF2 / como positivo. Nota: Nesta experiência, 2 ul de FGF2 por mm prato de 35, 2 ul BMP4 e 4 ul de TGF-p1 foram adicionados sozinhos e em combinação (Figura 5).
- Adicionar elementos adicionais e / ou substâncias testáveis. Manter pratos novamente intocado durante 2 dias a 37 ° C.
- Tirar fotografias de explantes em um microscópio invertido.
Nota: explantes vivos produzir melhores imagens de contraste de fase do que as células fixas. Ambos podem ser usados. - para a migraçãoavaliação, usar um software gráfico que permite medições de pixel (por exemplo, Fiji 8).
- Medir a grade prato de 500 uM distância em pixels e usá-lo como referência interna.
- Definir o centro do explante como ponto de partida a migração. Medir a distância entre o centro do explante e o grupo mais exterior de 10 células.
Nota: Todas as células migram para longe centrifugamente a partir do explante. Eles formam espontaneamente uma folha na periferia, nas circunstâncias testadas (Figura 5).
9. Avaliação Invasion
- Prepare cultura de tecidos placas de 24 poços revestidas com fibronectina de acordo com a Seção Protocol 4.
- Coloque 300 mL de meio de expansão quente para o topo poço de câmaras de invasão celular. Incubar as câmaras durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Remover o meio de expansão do poço superior e colocar a câmara de Boyden na placa de 24 poços revestidas.
- Adicionar 500 ul de meio de expansão quente, com 0,5 l de rhFGF2 e rhBMP4 0,5 ul para o fundo também.
- NSCs passagem e contam como descrito na Seção 7. Passages 1 a 4 são adequados.
- Placa de 5 x 10 5 células em um volume de 300 ul de meio de expansão quente com 0,3 ul de rhFGF2 e 0,3 ul de rhBMP4 no topo do poço de câmara de Boyden.
- Cultura as NSCs semeados durante 24 horas.
- Adicionar factores adicionais e / ou substâncias testáveis para a câmara de cultura e as células durante mais 48 h.
Nota: Se as células são invasivas, que vai passar a partir do topo bem através da camada de membrana basal para o fundo do poço. células invasivas vai agarrar a parte inferior da câmara de Boyden. - Seguir o protocolo fornecido pelo fabricante. Use cotonetes (incluído no estojo de ensaio de invasão) para remover as células não invasivas no poço superior por limpeza duas vezes.
- Remover o meio dos poços e adicionar meio de expansão 500 ul comuma mancha da membrana do plasma para as células vivas e com o corante nuclear DAPI para os poços.
- Incubar durante 10 min a 37 ° C e 5% de CO 2.
Nota: Os corantes vai integrar-se na membrana e o núcleo das células invasivas, respectivamente, para óptima visualização 8. Opção: Omitir corante membrana plasmática se imunocitoquímica multicolor é planejado. - Remover o meio com os corantes e lavar duas vezes com meio de expansão. Visualizar e contar as células invasoras com um microscópio de fluorescência invertido, como demonstrado anteriormente 8.
Nota: Alguns células invasoras podem ter separado da parte inferior da câmara e caíram à superfície do poço abaixo, onde eles aderem à superfície revestida. Para análise completa incluem as células na superfície do poço. - Remover o meio e fixar as células em gelo frio fresco PFA a 4% durante 10 min. Lavar 3x com PBS 1x. Realizar imunocitoquímica das células invasivas, como anteriormente descrito 8-10.
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Representative Results
Este sistema modelo de EMT baseia-se no isolamento normalizado de NSC tanto como células individuais ou como explantes a partir de uma região específica do tubo neural em desenvolvimento, o córtex central (Figuras 1 e 2). Para a avaliação quantitativa, os explantes foram semeadas à direita no centro de uma placa de cultura de 500 mm de grelha (Figura 3). Os explantes do córtex central, foram primeiro expostas a FGF2 durante dois dias, seguido por dois dias adicionais em diferentes combinações de factores de crescimento (Tabela 1). Nós com o córtex que é maior do que outras regiões do tubo neural em desenvolvimento. Observou-se que apenas os explantes em cultura em BMP4 mostrou uma resposta migratória (Tabela 1 e Figura 2 Complementar).
Próximo podoplanina expressão (PDPN) foi analisada sob condições definidas. PDPN é um transmembranar sialomucin proteína semelhante a que tem sido associada com a invasão em múltiplos cancros 11,12 e também em NSC 8. A proporção de células que expressam PDPN é aumentada em gliomas de alto grau 13. PDPN também está associada com pior sobrevida em pacientes com glioblastoma 14. Além disso, PDPN foi demonstrado ser um marcador de progressão maligna em vários tumores, incluindo carcinomas da mama, pulmão, cólon 15,16. PDPN é expresso tanto em invasivos, bem como migratórias NSCs 8. Usando o protocolo acima, PDPN expressão foi comparado com o controlo, FGF2 única, em explantes expostos a TGF-p1 e BMP4 isoladamente ou em combinações. expressão PDPN foi detectado em todas BMP4 e TGF-p1 / explantes tratados com BMP4. Em contraste, não foi observada PDPN nos explantes de controlo sozinho FGF2 ou em explantes com TGF-p1 sozinha (Tabela 2 e Figura 4). Além disso, foram estimuladas células com um fenótipo migratória BMP4 e TGF-p1 / BMP4-explantes expostos, enquanto que os explantes de controlo (apenas FGF2) e TGF-p1 sozinho não mostraram células migratórias (Tabela 1). A observação de células migratórias fornece um baixo custo, avaliação qualitativa simples.
Além disso, testou-se a indução de resposta e EMT migratório das várias regiões do tubo neural em desenvolvimento para BMP4 (Tabela 2). 400 uM explantes foram preparadas a partir do córtex central, o córtex posterior (marcado pólo posterior), a MGE e o mesencéfalo, como indicado na Figura 1. Os explantes foram todos expostos a FGF2 durante dois dias, seguido por dois dias de FGF2 com BMP4 . A migração foi definida pelo aparecimento de células migratórias plana com um bordo de ataque e de fuga (Figura 5 e Figura 2 Complementar). Um forte indução de células migratórias a partir do córtex posterior e uma resposta intermediária da MGE e as mesencéfalo foi observada (Tabela 2). 145 de 146 explantes do córtex central apresentou uma resposta migratória em FGF2 / BMP4. Assim, o córtex central demonstrada a indução mais robusta das células migratórias de todos os explantes testadas (Tabela 2). A omissão de BMP4 abolida qualquer resposta migratória (Tabela 1 e 2, e dados não mostrados).
Para a avaliação quantitativa da potência do factor de crescimento, distância de migração foi medida em Explantes cultivados em vários factores de crescimento. Os explantes foram cultivados como acima durante dois dias em FGF2, em seguida, durante mais dois dias sem FGF2 em factores (controlo) ou BMP4 único ou combinado e TGF-p1. Nos explantes de controlo foi observada uma forte proliferação em resposta ao FGF2, como esperado. Os explantes são derivadas da SVZ cortical e conter, em grande parte NSC que são conhecidas por proliferarem em resposta ao FGF2 17. O ce controlells atingiu 689 ± 14, as células TGF-p1 582 ± 49 pM (Figura 5.). O grupo BMP4 mostrou uma distância de migração média de 935 ± 91 pM. Em comparação, as células / BMP4-TGF-p1 migrou mais significativamente, para 1150 ± 23 pM (Figura 5). Os resultados mostram que BMP4 é induzir uma migração em NSC-exposta FGF2. Essa migração pode ser ainda reforçada por TGF-p1. A combinação de FGF2, BMP4 e TGF-p1 é, por conseguinte, a mais eficaz para induzir a migração. Em resumo, o sistema modelo de cultura celular permite tanto qualitativa, bem como avaliação da migração quantitativa.
EMT tem sido associada a fatores de transcrição (TFS), como Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2, TWIST1, Twist2 em vários sistemas, incluindo cancros epiteliais, tais como câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pulmão e também em tumores cerebrais 1,18. Nós hanúncio mostrado anteriormente que a FGF2 e BMP-2 ou BMP4 pode induzir Snail1 e Snail2 8,9. Usando o sistema acima foram investigados os níveis dos outros TFs relacionada EMT-expressão. Não há alterações na expressão TWIST1 poderia ser detectada; com TWIST1 estar em baixos níveis de expressão durante a exposição FGF2 (dados não mostrados). No modelo de cultura celular foi observada uma regulação positiva do Zeb1 e Zeb2 durante FGF2-exposição e de Twist2 durante FGF2 / BMP4-exposição (Figura 6).
NSC são conhecidos por contribuir para a população de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) 8,19,20. Várias linhas de evidência indicam que as NSC e em OPCs particular pode ser a célula de origem para gliomas 21,22. Para caracterizar ainda mais o modelo acima, foi investigada a expressão de marcadores de OPC. Observou-se que as NSC-exposta FGF2 demonstrou a co-expressão de Olig2 / nestina umd SOX10 / nestina em mais de 90% (Figura 7). Esta observação demonstra que as NSCs mostrar OPC-características do nosso sistema. Com efeito, os OPC-características correlacionados com a regulação positiva de Zeb'1 e Zeb'2 (Figuras 6 e 7). Estes resultados sugerem que a expansão de FGF2-infere uma identidade de OPC, tal como avaliado por Olig2 e SOX10, enquanto, ao mesmo tempo inicia primeiro Zeb baseados em passos de EMT.
Figura 1: Embrião Padronizado e Encéfalo anterior Dissection para NSC Isolamento e EMT indução. (A) membro anterior esquerdo do embrião E14.5 rato após cesariana. Cada dígito do membro tona é marcada com uma ponta de seta preta. Observe a formação dígitos começando típico para E14.5. (B) Rat embrião E14.5 após a remoção do casco. Observe o hash (#) no diencéfalo dorsal which é ideal para iniciar a remoção da pele Anlage / crânio. (C) A pele / crânio já é maioritariamente removido. A fronteira entre a pele removida e unremoved é marcada com duas setas triangulares. A pele pode ser desenrolada a partir do anteriormente seta anterior e posterior da seta posterior. (D) A pele / crânio é agora completamente removido. Note-se a nível da fronteira mesencéfalo-rombencéfalo (seta) e o corte apenas caudalmente para isso, marcados com uma seta. (E) O telencéfalo-diencéfalo-mesencéfalo (TEL-di-MES) do bloco é removido do resto do embrião . (F) vista Superior do bloco TEL-DI-MES. Craniana é deixado. (G) Vista oblíqua de cima. (H) Vista Inferior do bloco TEL-DI-MES. (I) O mesencéfalo e parte do diencéfalo são separados do telencéfalo com a parte anterior do diencéfalo. Top: anterior, vista, ambas as vesículas telencefálicas. Resumindo: Right vista lateral do mesencéfalo, parte superior fique cranial (J) Top:. ambas as vesículas telencefálicas sem diencéfalo. vista inferior para ilustrar a remoção completa do diencéfalo. Asterisk retrata MGE. Resumindo:. Parte anterior do diencéfalo (K) Top: Os dois hemisférios são separados na fissura inter-hemisférica. hemisfério esquerdo no lado esquerdo. Asterisk retrata MGE. Sinal de mais retrata LGE. (L) Ampliação do hemisfério esquerdo com vista para o mediano. Direito enfrenta cranial, deixou caudal, superior é dorsal, fundo ventral, respectivamente. Asterisco (*) está localizado na MGE. Sinal de mais (+) está localizado na LGE. ch, hem cortical; FL, membro anterior; di, diencéfalo; mes, mesencéfalo; MHB, limite mesencéfalo-rombencéfalo; HL, membro posterior; LGE, eminência ganglionar lateral; MGE, eminência ganglionar medial; ob, bulbo olfativo; pc, córtex posterior; ró, rhombencephalon; tel, telencéfalo. A grade em cada imagem mostra 2 mm linhas grossas, com quatro intersecção com linhas finas cada400? M. Barra de escala em todas as imagens:. 2 milímetros Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Padronizado dissecção Cortical SVZ para NSC Isolamento e EMT indução. (A) vista lateral de hemisfério esquerdo. Através do forame de Monro da MGE e LGE são visíveis, marcada por asterisco e sinal de mais. (B) O bulbo olfatório é removido apenas cranial da MGE-LGE. (C) O pólo posterior do córtex é removido logo atrás da CGE . (D) superior: a bainha cortical é separado a partir do córtex. Esquerda: pólo posterior. Meio: complexo contendo a porção central do córtex e do bloco CGE-LGE-MGE. MGE e LGE rosto para a direita. Direita: bul olfativab. (E) O bloco CGE-LGE-MGE-cortex é invertida horizontalmente. Agora, a superfície exterior do telencéfalo está de frente para o microscópio. MGE e LGE agora enfrentam à esquerda. (F) As meninges avermelhados são removidos a partir do córtex translúcido brilhante. O bloco CGE-MGE-LGE-CTX está agora virado para trás horizontalmente para a próxima etapa. (G, H) O mesmo procedimento é repetido com o hemisfério direito. O córtex é separado centro para longe do bloco de EGC-MGE-LGE. Note-se que há uma zona de córtex intermédio que é deixada no bloco de EGC-MGE-LGE, marcado com duas setas. Esta espessura córtex intermédio corresponde a metade do diâmetro da LGE. A linha ponteada que representa a fronteira entre LGE-CGE e o córtex. (I) O córtex central está separado em explantes de menos do que 400 um de diâmetro. Barra de escala: 2 mm; grade em cada imagem mostra 2 mm linhas grossas com quatro interseções (linhas finas) a cada 400 mm. Asterisco (*) encontra-se umt MGE. Sinal de mais (+) está localizado na LGE. Abreviaturas: ant-CTX, córtex anterior; CEN-CTX, o córtex central; CGE, eminência ganglionar caudal; ch, hem cortical; cp, plexo coróide; CTX, córtex; LGE, eminência ganglionar lateral; homens, meninges; MGE, eminência ganglionar medial; ob, bulbo olfativo; pc, córtex posterior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Explante Sementeira em 35 mm pratos de grade celulares de cultura de colocar 1 ml de meio de expansão no centro do prato de grade 500 um. A queda é contida pela borda grade (pequenas setas). explantes lugar certo, no centro da gota 1 ml. Se os explantes estão distribuídos no exterior da grade, swIRL o prato em um movimento circular lento e os explantes irá se mover para o centro pela força centrípeta. Nota: os explantes são apenas pouco visível a olho nu (cabeças de seta preta). Barra de escala: 35 mm.
Figura 4:. PDPN é induzida na presença de BMP 4 explantes foram cultivadas de acordo com o protocolo secção 8 (2 dias em FGF2 somente, em seguida, seguidos por FGF2 com factores como indicado). Controlo (A) (FGF2 sozinho) e explantes de TGF-p1 (C) não continham células PDPN-positivas (verde). Os núcleos são corados com DAPI (azul). BMP4 (B) e TGF-p1 / BMP4 (D) explantes mostrou uma alta proporção de células PDPN-positivos. O centro de explante é, à esquerda, à periferia, à direita. Nota: As células PDPN-positivos foram principalmente found na periferia e não no centro do explante. Os explantes de TGF-p1 / BMP4 contidos alisador, mais elaborada células PDPN-positivos. (E) A percentagem de células positivas em PDPN-explantes em diferentes condições é representado. Controlo TGF-p1 e ambas são significativamente diferentes das condições com BMP4. Meios são mostrados ± SEM. Controle vs. TGF-p1 não é significativa (ns). Controle e TGF-p1 vs. BMP4: p <0,0001 (***). TGF-p1 contra TGF-p1 / BMP4: p <0,0001 (***). BMP4 contra TGF-p1 + BMP4 não é significativa: p = 0,0981 (ns). Controlo vs. TGF-p1 + BMP4: p <0,0001 (***). Barra de escala para todas as imagens, como ilustrado na (A):. 50 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Migração avaliação quantitativa. BMP 4 e TGF p 1 mostram efeito aditivo sobre a migração celular. Explantes foram cultivados de acordo com a seção de protocolo 8. (A) Controle de explante. (B) Remoção só em BMP4. (C) Remoção só em TGF-p1. (D) explante no combinação de TGF-p1 e BMP4. (e) a distância de migração em um. A grelha de 500 um foi utilizado como referência. O TGF-p1 os explantes de controlo e estão mostrando uma forte proliferação com um diâmetro maior do que no explante as outras condições. Meios são mostrados ± SEM. Note-se que os explantes BMP4 e TGF-p1 / BMP4 parcialmente desintegrar-se o núcleo de explante e as células emigrar longe de centrifugação. Controle vs. TGF-p1 não é significativa (ns). TGF-p1 vs.BMP4: p = 0,0353 (*). Controlo vs. BMP4: p = 0,0351 (*). BMP4 contra TGF-p1 + BMP4: p = 0,0372 (*). Controlo vs. TGF-p1 + BMP4: p <0,0001 (***). Barra de escala: 500? m. Centro de explante é marcada por um sinal de mais (+). Borda externa de células que migram é marcada com a seta triangular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6:.. A sobre-regulação da EMT relacionados com Fatores de Transcrição por qRT-PCR EMT está ligada aos fatores de transcrição chave da Zeb- e Twist-família (A, B) Zeb'1 e Zeb'2 foram upregulated durante a primeira fase de FGF2-exposição. (C) Twist'2 foi regulado positivamente durante a seconfase d de FGF2 / BMP4-exposição. Os níveis de expressão relativa, com base na qRT-PCR são mostradas (N = 2). Os níveis de ARNm foram normalizados para GAPDH. Meios são mostrados ± SEM. No dia 0 do período de FGF2 ARNm foi colhido, ainda mais ARNm foi colhido depois de quatro dias de FGF2, em seguida, depois de um dia de FGF2 / BMP4 Zeb'1:. Controlo vs. FGF2, p = 0,0002 Zeb'2:. Controlo vs. FGF2, p = 0,0206 Twist'2:. Controle vs. FGF2 + BMP4, p = 0,003.
Figura 7:. NSC mostram características OPC no sistema modelo NSC foram isoladas a partir do córtex central e cultivados como células individuais na presença de FGF2 (de acordo com a Secção 5). Após 8 d em cultura (passagem após 4 d de acordo com a Seção 7.9) as células formaram pequenas colónias NSC e foram coradas para Olig2 (vermelho, em B, C), SOX10 (vermelho, em E, F) e nestina (verde, A, C, D, F). Uma elevada proporção de células co-expressas Olig2 / nestina (AC) e SOX10 / nestina (DF). (L) Co-expressão de Olig2 / nestina e SOX10 / nestina é mostrado na percentagem de todas as células. Meios são mostrados ± SEM. Barra de escala para todas as imagens, como ilustrado em (A) e (D):. 20 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Condição | Total de explantes (córtex central) | Explantes com resposta migratória | % | Explantes com podoplanina % | |
| Ao controle | 33 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| TGFb1 | 21 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| BMP4 | 34 | 34 | 100 | 34 | 100 |
| TGFb1 + BMP4 | 22 | 22 | 100 | 22 | 100 |
Tabela 1. BMP 4 e a combinação de TGF p 1 com BMP 4 induzir uma resposta robusta migratórias. Os explantes a partir do córtex central, foram mantidas em meio de expansão e FGF2 para um total de quatro dias. Após o primeirodois dias, os explantes, quer continuaram a receber FGF2 sozinho (controlo) ou de FGF2 e além TGF-p1, TGF-p1 ou BMP4 / BMP4 como combinação. De controlo e TGFβ1- explantes que não mostram uma resposta migratória nem expressão PDPN. BMP4 e TGF-p1 / BMP4 induzida ambas as células migratórias, bem como a expressão PDPN em todos os explantes.
| Região | total de explantes | Explantes com resposta migratória em FGF2 / BMP4 | % |
| córtex Central | 146 | 145 | 99,3 |
| cortical posterior | 52 | 48 | 92,0 |
| MGE | 56 | 29 | 51,7 |
| mesencéfalo | 53 | 28 | 52,8 |
Tabela 2. O Cortex centro mostra a migração mais robusta em resposta a FGF 2 / BMP 4 explantes foram preparados a partir de diferentes regiões do tubo neural E14.5 rato em desenvolvimento:. Córtex central, o córtex posterior, a eminência ganglionar medial (MGE) eo mesencéfalo. Todos os explantes foram cultivados de forma idêntica em FGF2 / BMP4 (Seção 8). Os explantes tratados sem BMP4 não mostraram qualquer resposta migratória (dados não mostrados). Todos os explantes foram rastreados para o aparecimento de quaisquer células migratórias por explante. Todas as regiões foram capazes de responder a FGF2 com BMP4 com a migração. O córtex central, no entanto, mostrou que a resposta mais robusta. Note-se que BMP4 foi necessário para induzir as células migratórias. Explantes cultivados em FGF2 sozinha mostrou proliferação, mas nãomigração; e não há células migratórias planas foram observadas em FGF2 sozinha (Tabela 1 e Figura 2 Complementar).
Figura 1. Complementar 400 um arquivo de grade. O ficheiro de grelha pode ser impresso e usado como referência durante os passos de dissecação acima e como mostrado nas Figuras 1 e 2. As grandes cruzamentos representam 2 mm com 400 mm subdivisões. Por favor clique aqui para baixar uma versão em PDF desta figura.
Suplementar Figura 2. BMP 4 -exposed explantes ShOW células migratórias plana. Ampliação de células mostrados na Figura 5. (A) Control (FGF2 sozinho) e (C) TGF-p1-explantes demonstrou uma divisão celular forte com células redondas pequenas. (B) BMP4- e (D), TGF-p1 / BMP4-explantes mostrou células alongadas planas de forma consistente. Barra de escala para todas as imagens, como ilustrado na (A):. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 3. Resumo do sistema modelo in vitro para EMT investigação. E14.5 rato córtex central contém o SVZ NSC contendo. O córtex central é qualquer Lsed como peças de explantes ou como células individuais. peças de explantes são mais convenientes para análise de migração quantitativa (Seção 8). células individuais são adequados para a análise qualitativa, como gene ou análise de proteínas (Seção 9.13).
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Discussion
Neste estudo um sistema padronizado para análise EMT NSCs utilizando é descrito (resumido na Suplementar Figura 3). A padronização garante a reprodutibilidade (Tabela 1 e 2). As NSC são derivadas do córtex em desenvolvimento, um tecido que normalmente não sofre EMT. Isto é de vantagem para a análise dos primeiros passos no EMT. passos iniciais na EMT não pode ser adequadamente estudado em células tumorais que se acumularam mudanças genéticas e pode já adoptadas características de EMT. Além disso, amostras de tumores primários não são ideais para entender EMT pois a maioria dos tumores malignos são heterogênea contendo ambas as células invasivas e não invasivas. O protocolo apresentado fornece aos pesquisadores EMT com um novo modelo para estudar os passos iniciais de indução de EMT. Aqui nós mostramos que os indutores EMT-chave da Zeb e da família da torção são sequencialmente activados: durante a primeira fase Zeb1 e Zeb2 está regulada, durante a segunda fase Twist2 (Figure 6). Anteriormente, havia mostrado que Snail1 já é regulada várias horas após BMP4-exposição 8. Nós também mostraram que após a BMP4-exposição das células estaminais neuroepiteliais do córtex central de se diferenciar em células mesenquimais, positivos para a actina do músculo liso (SMA) e calponina 9. Os resultados acima completar o estudo anterior em que demonstra que todos os três reguladores de EMT chave conhecida estão envolvidos no sistema. Além disso, observou-se que TGF-p1 pode melhorar significativamente o efeito migratório de FGF2 / BMP4 sozinho. Estes resultados apontam para uma rede entre FGF, BMP- e TGF-sinalização durante a indução da EMT.
Os passos mais críticos para isolamento de NSCs para EMT e análise de migração são: identificar corretamente a idade embrionária, identificando pontos anatômicos do embrião em desenvolvimento, preparação de meios de cultura frescos e (pelo menos durante a noite) placas revestidas, utilização de instrumentos de ponta fina e própor dissecção da porção central do córtex em desenvolvimento para estabelecer explantes corticais.
As técnicas apresentadas pode ser aumentada por algumas modificações. Como sugerido acima, vários explantes são plaqueadas sobre um único prato com uma grade. Para o rastreio de várias compostos, no entanto, pode ser mais conveniente colocar explantes individuais em cada poço de uma placa de 96 poços. Além disso, o sistema modelo pode ser refinado para descoberta de fármacos em grande escala. Como descrito acima, PDPN é um marcador valioso para características migratórias recentemente adquiridas desde PDPN é encontrado em invasivo NSC 8. Um repórter PDPN pode ser transfectado em NSCs normais antes da indução EMT. Como consequência PDPN expressando células podem servir como um controlo interno para a transformação das células uma vez que não é expresso PDPN em NSC normais (Figura 4 e Tabela 1). Vários marcadores adicionais NSC estão disponíveis, tais como nestina, que são perdidas após a indução de EMT 8. Como consequência,tanto o estado inicial, "não migratória / não-invasivo / nestina +", e o estado final, "migratória / invasivo / PDPN +", pode ser monitorizada, a qual permite a descoberta de drogas automatizado. Em grandes placas de cultura celular com múltiplos poços (por exemplo, placas de 96 poços e as células iniciais maiores) podem ser semeadas e tratadas com fármacos ou compostos sem função conhecida estabelecidos. Assim, placas de múltiplos poços podem ser digitalizados automaticamente para a expressão de PDPN ou outros marcadores de migração / invasão. Se um inibidor é o alvo principal da tela, o desaparecimento de expressão PDPN pode ajudar a identificar compostos inibidores novos supostamente interessantes.
Durante o teste de uma substância nova os explantes podem não mostram a migração e / ou os explantes podem arredondar-se e separar do prato. Nesta situação, é melhor mudar apenas metade dos meios de comunicação todos os dias (em vez de mudança de mídia completo em dias alternados). Isso reduz o estresse, tensão superficial ao substituir com meio fresco. oexplantes não pode anexar após o plaqueamento inicial. Nesta situação, a fibronectina tem de estar em contacto com a superfície do prato durante pelo menos 36 h. Fibronectina utilizado para o revestimento deve ser preparada sem exposição a um tubo de plástico por mais de 10 min desde fibronectina poderá aderir ao plástico. Além disso, os explantes podem estabelecer-se fora da grelha. Nesta situação, é aconselhável para rodar o prato em um movimento circular lento. Isto permite que os explantes para reposicionar para o centro pela força centrípeta (cf. Figura 3).
Existe forte evidência de que os gliomas são derivados de NSC e / ou derivados de OPCs NSC 23,24. Como consequência outros grupos estabeleceram modelos de crescimento de glioma com base no NSC:. Sampetrean et ai NSC isoladas a partir de ratinhos INK4 / IRA-deficientes e a sobre-expressão de H-Ras 25 forçado. Tumores malignos de alto grau resultou que mostrou proliferação e invasão após o transplante 25. McNeill et al., também NSCs isolados de camundongos geneticamente modificados (Rb1 floxed, Nf1, Kras, Pten sozinho e em combinações) 26. Os genes foram inactivados por infecção Cre-vírus e as NSC foram transplantados 26. Ambos estes sistemas de modelo tem a vantagem de que a invasão pode ser monitorizada in vivo e potencial de novos fármacos anti-invasão pode ser testado. A principal desvantagem é que o início da invasão não está bem definida e não é claro se as células de glioma de mostrar invasão típica EMT (EMT genes) ou apenas migração local. Além disso apenas uma droga pode ser testada por animal e a análise requer várias semanas. Para identificar uma droga anti-invasão romance, companhias farmacêuticas precisa (a) para o rastreio de milhares de compostos, ou mais de uma vez, (b) para replicar os testes e (c) tentar diferentes concentrações de droga. Para preparar vários milhares de animais transplantados, tratá-los com diferentes drogas e, finalmente, testar os efeitos por histoquímica ou bioluminescênciaA análise é muito recurso-consuming. Aqui um novo sistema modelo baseado no NSC para a invasão relacionadas com a EMT é descrito que permite a triagem rentável de milhares de compostos.
Embora este modelo permite a triagem de alto rendimento de compostos, que é apenas uma plataforma de rastreio primário. Uma vez que os compostos de interesse são identificados neste modelo, que irá requerer uma validação adicional. Ensaios in vivo é necessário para os parâmetros de segurança e eficácia para qualquer composto identificado e modelos de transplante, como descrito acima tornam-se importantes 25,26. O modelo também é limitada pelo facto de que ele baseia-se em células de roedores. Embora o modelo pode ser usado para investigar rato ou EMT rato, não é claro se os mesmos mecanismos são no lugar em células humanas ou em que o paciente humano. São necessários mais estudos para investigar se NSC são não só invasivo in vitro, mas também após o transplante. Diversas linhas de evidência apoiar o papel do NSCna formação de glioma. Progressão glioma foi ligado aos seguintes genes: A tenascina C, Hey1, SPARC, Snail1 e Snail2, FGFR +, BMPR1a, EGFR, PDGFRβ, Sox2, podoplanina, e Gli3 p75NGFR 8. Todos estes genes também são expressas durante a transformação de NSC não invasivos normais para células mesenquimais invasivos 8. Ao ser tempo, não está claro se NSCs podem ser transformados em tumores por apenas fatores de crescimento externo.
As células estaminais de iniciação do tumor (tiques) a partir de diferentes tumores foram isolados e são usados como modelos para compreender a progressão do tumor 27. Tiques são, no entanto, não é adequado para análise de EMT, EMT uma vez que já ocorreu em 27 de TIC. Para compreender primeiros e também passos tardios da indução EMT, é necessária uma população de células não-neoplásica primária. Idealmente, esta população não foi feito para sofrer EMT em primeiro lugar. Tinha sido anteriormente mostrado que as NSC embrionárias eram candidatos apropriados para esta finalidade9,28. Nomeadamente, migração e invasão pode ser induzida em NSC por FGF2 e BMP4 9,28. Migração induzida por BMP4 FGF2 / estava relacionada com genes individuais relacionadas com a EMT, no entanto, evidência completa faltava uma vez que as principais famílias EMT Zeb e torção não tinha sido investigado 8. Os resultados acima mostram que uma combinação específica de quatro factores, FGF2, BMP4, TGF-p1 e insulina causam uma indução EMT muito forte e completo, não observada anteriormente. O presente estudo demonstra que os genes EMT-chave da Zeb- e twist-famílias também são regulados positivamente. Assim, este estudo fornece a primeira evidência de que não existe regulação positiva selectiva de genes individuais, mas os resultados mostram que todos os grupos de códigos EMT são activas no sistema de cultura celular proposta.
EMT também foi observada em cancros epiteliais fora do cérebro, tais como pulmão, da mama, do cólon e cancro gástrico 29. Vários modelos para estudar EMT estão em uso para estes tumores 30-32, Que vêm, no entanto, com limitações significativas: (a) o uso de linhas de células de tumor transformadas com múltiplos genéticos e epigenéticos muda 33; para identificar inibidores da EMT para os estágios precoce do câncer, as células cancerosas em estágio final são inadequadas; (B) culturas dependentes de soro que contêm vários factores de crescimento não definidos; isto torna a identificação dos fatores críticos muito difícil. Além disso, experimento reprodutibilidade é prejudicada, pois a qualidade do soro varia de lote para lote; (C) contém soro e inibidores de actividades enzimáticas, eventualmente, de inactivação compostos exógenos potencialmente úteis; (D) necessidade de enzimas para a passagem em células que degradam moléculas da superfície celular; (E) para identificar agonistas EMT para promover EMT fisiológica, as células normais são necessários para testar a indução. modelos de células de tumor são inadequados para encontrar substâncias que promovem a regeneração em células estaminais normais.
Migração também é necessária para os processos normais, como a cicatrização de feridas e regeneração do cérebro feridos 18. Após a lesão cerebral traumática e acidente vascular cerebral, NSC são necessárias para migrar para o local da lesão para participar na regeneração 4,34. O sistema actual pode também ser utilizado para identificar substâncias que promovem a migração e invasão. Como mostrado acima, a migração é induzido na partida com BMP4-tratamento. Se as células não estão expostas a BMP, mas em vez disso a novos compostos, estes podem substituir para a acção de BMP que vai ajudar a identificar novos agonistas de BMP. Com um sistema repórter que indica a expressão PDPN, testes em larga escala para substâncias novas torna-se viável; Se um novo composto pode substituir para BMPs, as células que expressam PDPN pode ser identificado automaticamente.
O sistema proposto também é útil para investigar interacções de sinalização de células. Os nossos resultados mostram que o efeito sobre a migração BMP pode ser reforçada através da activação TGF-p1. Os resultados descobrir uma interação aditiva entre BMP- e TGFβ-sinalização. No entanto, as vias de sinalização adicionais, tais como Notch-, Wnt- ou EGFR / MAPK- e outras cascatas de sinalização pode estar envolvido. Portanto, são necessários mais investigações sobre BMP / TGF-interações e cross-talk para outras vias. Além disso, o córtex central responsivo pode ser isolado a partir de murganhos geneticamente modificados, que podem ajudar a elucidar os mecanismos subjacentes EMT condução. Em resumo, o sistema de modelo de EMT descrito aqui pode ser útil nos campos da biologia das células estaminais e de regeneração, bem como na pesquisa do cancro. Ele pode ser usado para o rastreio de bibliotecas de medicamentos para substâncias inibidoras ou melhorar a migração e invasão.
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Acknowledgments
O estudo foi apoiado pela Universidade de Basel Science Foundation ea National Science Foundation suíço por uma doação para MHS e AG (SNF IZLIZ3_157230). Agradecemos: Dr. Tania Rinaldi Burkat para generosamente fornecer infra-estrutura; todos os membros do grupo Bettler para discussões e comentários. Agradecemos Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Suíça) para a instalação profissional e competente da completa câmera de vídeo HD MC170 (Leica Microsystems, Suíça).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1,000. |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
