Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

Epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) beschrijft het proces van epitheel transdifferentiating in mesenchym. EMT is een fundamenteel proces tijdens de embryonale ontwikkeling die ook voorkomt bij glioblastoma, de meest voorkomende kwaadaardige hersentumor. EMT is ook waargenomen in meerdere carcinomen buiten de hersenen waaronder borstkanker, longkanker, darmkanker, maagkanker. EMT is centraal verbonden met maligniteit door het bevorderen migratie, invasie en metastasering. De mechanismen van EMT inductie zijn niet volledig begrepen. Hier beschrijven we een in vitro systeem voor gestandaardiseerde corticale isoleren van neurale stamcellen (NSC's) en daaropvolgende EMT-inductie. Dit biedt de flexibiliteit om hetzij enkele cellen of explantaatkweek gebruiken. In dit systeem, rat of muis embryonale voorhersenen NSC's gekweekt in een gedefinieerd medium zonder serum en enzymen. De NSCs uitgedrukt Olig2 en Sox10, twee transcriptiefactoren waargenomen in oligodendrocYTE precursorcellen (OPC). Met behulp van dit systeem, interacties tussen FGF-, BMP en TGF-signalering waarbij Zeb1, Zeb2 en Twist2 waargenomen, waar TGF-activering aanzienlijk verbeterd cel migratie, hetgeen duidt op een synergetische BMP / TGF-interactie. De resultaten wijzen op een netwerk van FGF-, BMP en TGF-signalering te worden betrokken bij EMT inductie en onderhoud. Dit modelsysteem is relevant EMT in vitro. Het is kostenefficiënt en geeft hoge reproduceerbaarheid. Het staat ook voor de vergelijking van verschillende verbindingen met betrekking tot hun migratie reacties (kwantitatief afstandsmeting) en high-throughput screening van verbindingen voor het remmen of verbeteren EMT (kwalitatieve meting). Het model is dan ook zeer geschikt voor drug bibliotheken testen voor stoffen van invloed zijn EMT.

Introduction

Gedurende verschillende stadia van embryonale ontwikkeling, epitheelcellen verliezen hun sterke hechting aan elkaar (bijv tight junctions) en het verwerven van een trekkende fenotype in een proces genaamd epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) 1. EMT is nodig voor de vorming van andere celtypen, zoals mesenchymale neurale cellen, een populatie die scheidt van de neuroepithelium 2. EMT is niet alleen essentieel tijdens embryonale stadia maar ook vereist in latere volwassen leven fysiologische processen in het volwassen organisme, zoals wondgenezing 3 en centraal zenuwstelsel (CNS) regeneratie handhaven demyeliniserende laesies 4.

Epitheliale tumoren is bekend dat EMT reactiveren als een initiatie stap voor de migratie, invasie en metastase, wat uiteindelijk leidt tot de progressie van kanker 1,3. EMT inderdaad centraal gekoppeld aan een sterke migratie 1,3. De cellulaire stappen conditioning, initiëren, ondergaan en onderhouden van EMT niet volledig begrepen en moet verder onderzoek.

Hier wordt een gestandaardiseerde in vitro modelsysteem EMT basis van NSC, met gedefinieerde groeifactoren en media (geen serum en geen enzym gebruik) gepresenteerd. Dit model systeem van belang is voor wetenschappers die werken aan EMT. De Slak, Zeb en Twist eiwit families is aangetoond van cruciaal belang voor EMT, zowel in ontwikkeling en ziekte 1 te zijn. De Slak, Zeb en Twist families zijn ook betrokken bij de gepresenteerde systeem. Het systeem is gebaseerd op een bepaalde regio van de voorhersenen die normaal ondergaat EMT verschaffen van een bijzonder voordeel voor de studie van begingebeurtenissen gedurende EMT inductie.

Het modelsysteem zou kunnen worden toegepast op EMT in epithelia buiten het CZS te bestuderen, aangezien belangrijke EMT inductoren, zoals de slak, en Zeb Twist eiwitten, zijn gedurende EMT in weefsel dat zich buiten het CZS. Dit model system laat de gestandaardiseerde isolatie van NSCs uit de ontwikkelingslanden cortex om stamcellen functies in het algemeen en EMT in het bijzonder te bestuderen. Met dit systeem geïsoleerde we NSC geïnduceerde EMT en bestudeerden de daaropvolgende migratie onder invloed van FGF2 en BMP4. We zagen dat FGF- en BMP-signalering interageert met TGFp-signalering naar cel migratie te bevorderen, waardoor de validatie van het model systeem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierlijke procedures volgden de 'Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren' (NIH publicatie, 8e editie, 2011) en goedgekeurd door de Animal Welfare Comité van Basel (Zwitserland Richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van dieren). Door deze richtlijnen het dier protocol wordt beschouwd van de "laagste dierlijke ernstgraad".

1. Bereiding van Expansion Medium

Opmerking: Het werk in aseptische omstandigheden als standaard voor de weefselkweek.

  1. Neem twee 15 ml buisjes en voeg 5 ml L-glutamine-vrij DMEM / F12 (1: 1) van een 500 ml medium fles in elk van de twee 15 ml buisjes. Om de eerste buis van 15 ml, voeg 50 mg humane apo-transferrine, 50 pi putrescine 1 M voorraad (0,1 mM uiteindelijke concentratie) en 30 pi van natrium selenium 500 uM voorraad (eindconcentratie 30 nM).
    1. Filteren door middel van een 0,2 um spuit filter in de originele DMEM / F12 fles.
  2. Om de tweede buis van 15 ml, voeg 12,5 mg insuline. Toevoegen6-9 druppels 1 M NaOH. Vortex voor insuline volledig op te lossen. Filteren door middel van een 0,2 um spuit filter in de originele DMEM / F12 fles.
    Let op: NaOH is giftig en bijtend. Gebruik beschermende handschoenen, jas, en een veiligheidsbril.
  3. Voeg 5 ml penicilline (10.000 eenheden / ml) / streptomycine (10.000 ug / ml) / amfotericine B (25 ug / ml) aan de DMEM / F12 medium fles.
  4. Voeg 5 ml 200 mM L-glutamine voorraad vers ontdooid of oligopeptiden die glutamine (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) aan de DMEM / F12 medium fles.
  5. Goed schudden. Bereid 50 ml aliquots.
    Opmerking: Expansion medium kunnen worden opgeslagen gedurende ten minste 2 weken bij 4 ° C. Porties verdeeld buizen vertoon minder pH veranderingen ten opzichte van medium in 500 ml flesjes bewaard.

2. Voorbereiding van de Passage Medium

  1. Om 1 L Ca 2 + - en Mg 2 + -vrij HBSS media, voeg 990,85 mg Glucose (5 mM uiteindelijke concentratie) en 840,10 mg NaHCO3 Opmerking: passage medium kunnen worden opgeslagen gedurende ten minste 4 weken bij 4 ° C.

3. Bereiding van groeifactoren

  1. Bereid steriele 1x PBS met 1% BSA (PBS-BSA) alleen of met zoutzuur (HCl) en 4 mM (PBS-BSA-HCl).
    Let op: HCl is bijtend en giftig en vereist speciale veiligheidsmaatregelen (jassen, bril, handschoenen, afzuigkap).
  2. Los 10 gg / ml recombinant humaan fibroblast groeifactor 2 (rhFGF2) in PBS-BSA (10 ng / ml eindconcentratie), 10 ug / ml recombinant humaan botmorfogenetisch eiwit 4 (rhBMP4) in PBS-BSA (10 ng / ml uiteindelijke concentratie), en 20 ug / ml recombinant humaan transformerende groeifactor ß 1 (rhTGFβ1) in PBS-BSA-HCl (40 ng / ml uiteindelijke concentratie).
    1. Heeft steriliseren niet filteren. Bereid hoeveelheden.
      Opmerking: Groeifactor monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C gedurende ten minste 2 jaar.

4. Coating van celcultuurschalen

  1. Ontbinding 1875 mg poly-L-ornithine (PLO) in 500 ml gedestilleerd H2 O een 250x PLO voorraad te bereiden. Filter steriliseren onder toepassing van een 0,2 urn spuitfilter en maak 2 ml aliquots.
    Opmerking: Deze monsters kunnen gedurende ten minste 2 jaar worden opgeslagen bij -20 ° C.
  2. Los 1 mg bovine fibronectine in 1 ml steriel gedestilleerd H 2 O tot 1000x fibronectine voorraad bereiden. Niet vortex als dit de kleverige eiwit kan stollen. Schud voorzichtig met de hand gedurende 10 min.
    1. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder af en toe schudden. Controleer op volledig oplossen. Verwarm de oplossing tot minder dan 37 ° C voor de volledige oplossing van fibronectine. Niet filteren-steriliseren.
      Opmerking: De oplossing kan maximaal 6 maanden worden bewaard bij 4 ° C.
  3. Gebruik plasma voorbehandelde plastic celcultuurschalen (100 mm of andere formaten zoals vereist voorhet experiment). Om migratie te beoordelen, gebruiken 35 mm gerechten met 500 urn rooster. Incubeer overnacht schotels met 2 ml 1x PLO 12 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 weefselkweek incubator. Was tweemaal met 2 ml 1x PBS.
  4. Voeg 2 ml 1x fibronectine (1 ug / ml eindconcentratie) en incubeer gerechten gedurende ten minste 12 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Fibronectine verwijderen net voor het uitplaten van de cellen.
    Opmerking: fibronectine beklede schalen worden opgeslagen gedurende ten minste 2 weken bij 37 ° C.

5. Gestandaardiseerde Dissection en voorbereiding van de corticale subventricular zone (SVZ)

  1. Verkrijgen van rat embryonale dag 14,5 (E14.5, Sprague-Dawley) en muis E13.5 (C57BL / 6) embryo's door getimede-paring. Mate dieren van 18:00 tot 08:00 uur de volgende ochtend. 'S middags na de dag van de paring wordt beschouwd E0.5.
  2. Verdoven de zwangere dier met 5% isofluraan en 0,8 l / min zuurstof flow. Controleer reactie van poot compressie met scherpe dissectie tang. Onthoofden het dier. Vermijd CO 2 stikken als CO 2 beïnvloedt stamcel herstel.
  3. Ophalen embryo's door een keizersnede.
    1. Plaats dier in liggende positie en desinfecteren bont met 70% ethanol. Gebruik chirurgische pincet en schaar V-vormige incisie van ongeveer 8 cm te maken in de onderbuik boven de baarmoeder. Incise alleen de huid met bont terwijl gespierde muren intact.
    2. Gebruik verse pincet en een schaar om de spieren en de buik- spierwand incise om het buikvlies in te voeren.
    3. Identificeer de baarmoeder in de onderste achterste buikvlies. Verwijder de baarmoeder door scherpe scheiding van de omringende weefsels.
    4. Was de baarmoeder met embryo's met steriel 1x PBS en plaats in ijskoude 1x PBS.
    5. Gebruik fijne punt schaar om de baarmoeder muren te openen om embryo's vrij te maken door embryo onder een dissectie microscoop (3x vergroting, figuur 1B). Gebruik een pincet om de embryonale rompen verwijderen (
    6. Controleer of de juiste ontwikkelingsstadium door de Atlas van de ontwikkelingslanden Rat Nervous System 5. De embryo juiste grootte wordt getoond in Figuur 1B.
    7. Controleer de juiste leeftijd verder door de aanwezigheid van beginnende vorming cijfer bij ratten voorpoot (FL) zoals weergegeven in figuur 1A.
      Opmerking: Het achterste been (HL) maakt scheiding cijfer (Figuur 1B) nog niet vertonen.
  4. Voor dissectie, transfer embryo ongecoate petrischalen gevuld met ijskoude 1x PBS. Voer dissectie onder een stereo dissectie microscoop (3x tot 20x vergroting) met behulp van een autoclaaf fijn pincet.
    Opmerking: De Petrischalen voorkomen hechting van weefsel om de schotel oppervlak kan gebeuren met plasma bekleed celcultuurschalen. Wolfraamdraad geslepen naalden en dergelijke kunnen ook nuttig voor bepaalde stappen van dissectie.
  5. Verwijder de hoofdhuid en de schedel te beginnen bij de intersection van de ontwikkeling telencephalon (TEL) en diencephalon (DI) (Figuur 1B) door gelijktijdig ventraal en dorsaal met twee tang trekken om toegang tot de zich ontwikkelende neurale buis (figuur 1C) te verkrijgen.
  6. Identificeer de middenhersenen-achterhersenen-grens (MHB, zwarte pijlpunt in Figuur 1B-D), het scheiden van het mesencephalon (MES) vanaf het rhombencephalon. Snijd de rhombencephalon net op of onder de MHB (figuur 1D, driehoekige pijl).
    Opmerking: De extra subcutane ruimte bij de MHB vergemakkelijkt verwijdering huid zonder nadelige gevolgen voor de neurale buis.
  7. Verbreken de verbinding tussen de telencephalon / diencephalon aan de schedelbasis met het gezicht skelet (figuur 1E). Dit resulteert in een blok met het telencephalon, diencephalon en mesencephalon (TEL-DI-MES) (figuren 1F-H).
  8. Breng de TEL-DI-MES blok in uitbreiding medium op ijs. Keep it completely bedekt met uitbreiding medium in een niet-gecoate petrischaal. Houd het blok aan het mesencephalon met een pincet aan raak de telencephalon de corticale SVZ met NSC bevat.
  9. Herhaal stap 5,5-5,8 alle embryo's (Figuur 1F-H).
  10. Transfer een TEL-DI-MES te blokkeren in de frisse ijskoude 1x PBS. Snijd langs de stippellijn in de voorste mesencephalon (Figuur 1F-H), scheiden van het mesencephalon van het diencephalon, zie figuur 1I.
  11. Scheid de DI van de TEL door te snijden langs de stippellijnen in figuur 1F. Zie geïsoleerde telencephalon in figuur 1J.
  12. Splits de twee hersenhelften telencephalic, snijden langs de gestippelde lijn in figuur 1J. Dit resulteert in twee afzonderlijke helften zie figuur 1K.
    Opmerking: de linker hersenhelft wordt uitvergroot in figuur 1L.
  13. Identificeer de mediale bendelionic eminenties (MGE, figuur 2A; *) en laterale ganglion grootheden (LGE, figuur 2A; +) zichtbaar door de toekomst foramen interventriculare.
    1. Met behulp van een tang of naald, ontleden langs een rechte lijn op de kruising tussen de MGE en LGE en de voorste cortex (ant-CTX, Figuur 2B). Snijd een rechte lijn door cortex, hippocampus (heup) en choroid plexus (CP). Dit scheidt de anterieure cortex inclusief de bulbus olfactorius (ob) vanaf het ganglion grootheden (GE, figuren 2B, C).
  14. Snijd een tweede rechte lijn op de kruising van de caudale ganglion eminence (CGE, figuur 2C, D) en het achterste cortex (figuur 2C), opnieuw snijden door cortex, hippocampus en choroid plexus.
  15. Plat uit het telencephalon. Volledig verwijderen van de achterste paal en de olfactorische bulb (figuur 2D). Identificerenhet corticale zoom die de hippocampus en de choroid plexus (figuur 2C), zoals eerder gedefinieerd 6,7.
    Opmerking: De hippocampus is een dunnere neuroepithelium dan de cortex. De CP bevat rode vaartuigen.
    1. Scheid de corticale zoom van de cortex, waardoor de grootte van de cortex identiek aan de grootte van de ganglion grootheden (figuur 2D). Dit resulteert in een blok van de cortex (het doelweefsel) en de ganglion grootheden (GE figuur 2D).
  16. Flip de cortex-GE blok met de ventriculaire (binnen) kant van de schotel oppervlak.
    Opmerking: Het buitenoppervlak van de hemisfeer de experimentator (figuur 2E) geconfronteerd. Op het buitenoppervlak is de bloed- vat dat meninges (figuur 2E).
    1. Speld de GE om de schotel oppervlak met de linkerhand en schil de hersenvliezen met een pincet in de juiste (dominant) met de hand (zie figuur 2F Let op: Dit is de technisch meest veeleisende stap, omdat de meningen sterk hechten aan de cortex. De scheiding van hersenvliezen van de cortex wordt vergemakkelijkt door het snijden van een volledig rechte lijn (niet gekarteld) in stappen 5.13.1 en 5.14.
  17. Herhaal stap 5,12-5,16 de andere halfrond alle embryo. Snijd de cortex langs de LGE op een afstand van de halve diameter van de belangrijkste LGE (figuur 2G, 2H). De ontleed cortex beslaat een oppervlakte van 1,2 mm x 2,4 mm (figuur 2H) en omvat de SVZ / germinal laag met de NSC.

6. Bereiding van explantkweken

  1. Snijd de cortex in explantaten van minder dan 400 urn diameter (figuur 2I). Gebruik een 400 pm rooster (aanvullende figuur 1) onder de dissectie petrischaal geplaatst voor de referentie (figuur 2H en 2I). Breng alle explantaten in een frisse petrischaal met ijs-cold expansie medium.
  2. Verwijder het fibronectine uit een weefselkweek schotel (stap 4.4). Laat ze drogen. Voeg 1 ml koude expansie medium naar het midden van de 35 mm schaal met rastermaat van 10 mm x 10 mm (figuur 3). Het medium laten een bolvormige druppel (figuur 3) te vormen.
  3. Plaats maximaal 8 explantaten naar het midden van de druppel. De explantaten moet idealiter worden gevestigd op de grid met minstens 3 mm afstand tussen elkaar voor de migratie-analyse (zie paragraaf 8).
  4. Incubeer de schaal gedurende ongeveer 1 uur in een celkweek incubator (37 ° C, 21% O2, 5% CO 2) voor bevestiging van de explantaten. Laat de explantaten om zich te vestigen en hechten aan de fibronectine gecoate oppervlak. Niet schudden het gerecht, omdat de explantaten kan los te maken en uit te gaan van de optimale rooster centrum.
  5. Na 1 uur incubatie (37 ° C, 21% O2, 5% CO2), vul de schaal tot een totaal volume van 2 ml medium met de expansie groei facteurs of stoffen die van belang zijn voor testen en te broeden.
    Opmerking: Noch enzymatische digestie, of serum of centrifugatie die nodig zijn voor explantatie bereiden zijn. Dit is optimaal voor celintegriteit.

7. Voorbereiding van de NSC Single Cell Culture

  1. Warmen expansie en passage van medium bij 37 ° C.
  2. Breng de ontleed cortex stukken (uit stap 5.17) in een 15 ml buis met koude expansie medium (tube A). Centrifugeer de cortex stukken voor 5 min bij 1200 x g. Zuig het supernatant. Voeg 200 ul voorverwarmd medium expansie naar de cortex stukken resuspenderen.
  3. Voeg 700 ul voorverwarmde passages medium aan de 15 ml buis met een P1,000 uiteinde (buis A). Voorzichtig resuspendeer de pellet. Plaats het uiteinde onder aan de 15 ml buis. Voorzichtig en langzaam te distantiëren van het weefsel stukken van uitzuigen drie keer met de P1,000 tip.
    Opmerking: Passage medium bevordert celscheiding en vereist het gebruik van enzymen voorkomen.
  4. Laat de buis zitten 30 tot 60 seconden voor grotere (zwaardere) gedissocieerde stukken bezinken op de bodem. Één gedissocieerde cellen in het supernatant blijven. Breng ongeveer 700 pl van het supernatant naar een nieuwe 15 ml buis (tube B).
  5. Herhaal de stappen 7,3 en 7,4 om de grotere stukken dissociëren.
  6. Herhaal stap 7.3 en 7.4 een tweede keer om de grotere stukken te scheiden. Breng alle bovenstaande aan de verse 15 ml buis (tube B).
  7. Voeg expansie medium tot een totaal volume van 5 ml. Aantal cellen met een hemocytometer. Beoordelen van dode cellen door trypan-blauw kleuring.
    Opmerking: Kleine NSC tolereren stappen 7,2-7,6 beter dan grotere cellen. Van 10 embryo's verwachten ongeveer 4 x 10 6 cellen met 10% dode cellen.
  8. Uitzetting van NSC, plaat 1,5 x 10 6 cellen per 10 cm met fibronectine beklede weefselkweekplaat in een volume van 8 ml medium expansie. Voor standaard uitbreiding, voeg 8 pi 1000x rhFGF2 voorraad. Voeg 8 ul rhFGF2 elke dag en veranderen media om de andere dag.
    Opmerking: De cortex in deze ontwikkelingsfase bevat een meerderheid van NSCs en slechts een minderheid van de gedifferentieerde cellen. De gedifferentieerde cellen minderheid niet reageren op de rhFGF2-behandeling en sterven tijdens de expansie cultuur.
  9. Passage geëxpandeerde NSC bij 60% confluentie.
    1. Om passage NSCs, verwijder uitbreiding medium. Was de cellen snel driemaal met 5 ml medium passage. Wacht 2-4 min. Zonder Ca 2 + en Mg 2 + de cellen langzaam los te maken van het oppervlak, oppakken. Controleer loslaten van cellen onder de microscoop fase. Wacht een paar minuten, indien nodig, totdat visuele loslating van het oppervlak waargenomen.
      Let op: Single cellen helemaal los, maar de meeste cellen zullen blijven aan de schotel oppervlak. De tijdsduur nodig voor onthechting afhankelijk van de duur van fibronectine coating. Een korte fibronectine coating (12 uur of minder) resulteert in een snellere mobiele onthechting. Voor langere experimenten (>; 1 week) fibronectine coating van meer dan 24 uur geadviseerd.
  10. Gebruik een 10 ml pipet voorzichtig los van de cellen van het oppervlak. Verzamel de passage 5 ml medium met cellen en overbrengen naar een verse 15 ml buis. Herhaal met 5 ml medium passage.
  11. Distantiëren de cellen in 15 ml buisje en neer te pipetteren drie maal, het plaatsen van de 10 ml pipet op de bodem van de buis. Spin de buis gedurende 15 minuten bij 1200 xg bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 ml medium expansie. Aantal cellen met een hemocytometer. Gebruik trypan blauw om dode cellen te beoordelen.
    Opmerking: Na expansie tot 60% confluentie verwachten 4-5 x 10 6 cellen met dode cellen op ongeveer 10%.
  12. Plaat 8 x 10 5 cellen per 10 cm schotel voor verdere passages.

8. Migration Assessment

  1. Voor migratie assessment, isoleren explantaten volgens hoofdstuk 5. Seed de explantaten in35 mm raster gerechten. Een uur na plating, voeg FGF2 (rhFGF2). De schaaltjes worden in een 37 ° C incubator gedurende 2 dagen.
    Opmerking: Voor een optimale explantaat bevestiging, vermijd het verplaatsen van de gerechten.
  2. Verwijder medium door 1.000 III tip. Voeg 2 ml medium expansie van 1000 gl punt vanaf de binnencirkel (figuur 3). Dit vermindert de oppervlaktespanning op explantaten.
  3. Voeg groeifactoren alleen of in combinatie zoals vereist voor experiment. Gebruik FGF2 / BMP4 / TGFB1 als een positieve controle. Opmerking: In dit experiment werden 2 pi FGF2 per 35 mm schaal, 2 pl BMP4 en 4 pl TGFB1 alleen en in combinatie (figuur 5) toegevoegd.
    1. Voeg extra factoren en / of toetsbaar stoffen. Houd gerechten weer onaangeroerd gedurende 2 dagen bij 37 ° C.
  4. Neem foto's van de explantaten op een omgekeerde microscoop.
    Opmerking: Living explantaten op een betere fase contrast beelden dan vaste cellen. Beide kunnen worden gebruikt.
  5. voor de migratieassessment, gebruik dan een grafische software die pixel metingen mogelijk maakt (bv, Fiji 8).
  6. Meet de schotel raster van 500 pm afstand in pixels en gebruik het als interne referentie.
  7. Bepaal het midden van het explantaat migratie startpunt. Meet de afstand tussen het middelpunt van het explantaat en de buitenste groep 10 cellen.
    Let op: Alle cellen migreren centrifugaal weg van het explantaat. Ze vormen spontaan een vel aan de omtrek onder de geteste omstandigheden (Figuur 5).

9. Invasion Assessment

  1. Bereid met fibronectine gecoate weefselkweek 24-well platen volgens protocol afdeling 4.
  2. Plaats 300 ul warm expansie medium in de top put van cel invasie kamers. Incubeer de kamers gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
  3. Verwijder het medium expansie van de bovenste wellen en plaats de Boyden-kamer in de gecoate 24-well plaat.
  4. Voeg 500 ul warm expansie medium met 0,5 pi rhFGF2 en 0,5 ul rhBMP4 naar de bodem ook.
  5. Passage NSCs en tel zoals beschreven in paragraaf 7. Passages 1-4 zijn geschikt.
  6. Plaat 5 x 10 5 cellen in een volume van 300 pl warm expansie medium met 0,3 gl rhFGF2 en 0,3 pl van rhBMP4 in de bovenste put van de Boyden-kamer.
  7. De cultuur van de gezaaide NSCs gedurende 24 uur.
  8. Voeg extra factoren en / of testbaar stoffen aan de kamer en kweken van de cellen gedurende nog 48 uur.
    Opmerking: Als de cellen invasief, zullen ze gaan van de bovenste wellen door het basaal membraanlaag naar beneden ook. Invasieve cellen vasthouden aan de bodem van de Boyden-kamer.
  9. Volg het protocol van de fabrikant. Wattenstaafjes (bij de invasie assay kit) aan de niet-invasieve cellen in de bovenste wellen verwijderen door reinigen tweemaal.
  10. Verwijder het medium uit de putjes en voeg 500 ul medium met expansieeen plasmamembraan kleuring van levende cellen en met de nucleaire kleurstof DAPI aan de putjes.
  11. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
    Opmerking: De kleurstoffen te integreren in het membraan en de kern van de invasieve cellen, respectievelijk voor optimale visualisatie 8. Optie: weglaten plasmamembraan kleurstof als multicolor immunocytochemie is gepland.
  12. Verwijder het medium met de kleurstoffen en tweemaal wassen met groei medium. Visualiseren en tellen invasieve cellen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop zoals eerder 8 getoond.
    Opmerking: Sommige invasieve cellen kunnen uit de bodem van de kamer zijn losgemaakt en zijn gedaald tot het bronoppervlak hieronder waar zij zich aan de beklede oppervlak. Voor volledige analyse omvatten de cellen op het putoppervlak.
  13. Verwijder het medium en vast de cellen in ijskoude vers 4% PFA gedurende 10 min. Wash 3x met 1x PBS. Voeren immunocytochemie invasieve cellen, zoals eerder beschreven 8-10.

    14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit EMT model is gebaseerd op de gestandaardiseerde isolatie van NSC zowel als enkele cellen of als explantaten van een specifiek gebied van de ontwikkeling van neurale buis, de centrale cortex (figuren 1 en 2). Voor kwantitatieve beoordeling werden explantaten geënt exact in het midden van een 500 urn rooster kweekschaal (figuur 3). Explantaten van de centrale cortex werden eerst blootgesteld aan FGF2 twee dagen, gevolgd door twee extra dagen in verschillende combinaties van groeifactoren (tabel 1). We begonnen met de cortex die groter is dan andere delen van de zich ontwikkelende neurale buis. We vonden dat alleen explantaten gekweekt in BMP4 toonde een trekkende respons (Tabel 1 en aanvullende figuur 2).

Volgende podoplanin (PDPN) expressie werd geanalyseerd onder bepaalde omstandigheden. PDPN is een transmembraan sialomucin-achtige eiwit dat is geassocieerd met inval in meerdere kankers 11,12 en ook NSCs 8. Het aandeel PDPN expressie brengende cellen wordt verhoogd hooggradig glioom 13. PDPN wordt ook geassocieerd met slechtere overleving bij patiënten glioblastoma 14. Verder is PDPN aangetoond dat het een marker van maligne progressie multipele tumoren zoals borst-, long-, colon- carcinomen 15,16 zijn. PDPN wordt uitgedrukt in zowel invasieve als trekkende NSC 8. Onder toepassing van bovenstaande protocol werd PDPN expressie vergeleken met controle, FGF2 alleen in explantaten blootgesteld aan TGFB1 en BMP4 alleen of in combinaties. PDPN expressie werd gedetecteerd in alle BMP4 en TGFB1 /-BMP4 behandelde explantaten. Daarentegen werd geen PDPN waargenomen in de controlegroep explantaten in alleen FGF2 of explantaten met TGFB1 alleen (tabel 2 en figuur 4). Naast cellen met een trekkende fenotype werden geïnduceerd in BMP4 en TGFB1 / BMP4-explantaten blootgesteld, terwijl de controlegroep explantaten (alleen FGF2) en TGFB1 alleen niet migrerende cellen (Tabel 1) tonen. De waarneming van trekkende cellen zorgt voor een lage kostprijs, straight-forward kwalitatieve beoordeling.

Verder testten we de trekkende EMT respons en inductie van verschillende regio's van de ontwikkeling van neurale buis BMP4 (tabel 2). 400 urn explantaten werden uit de centrale cortex, de achterste cortex (gelabeld achterpool) MGE en het mesencephalon, zoals in figuur 1. De explantaten werden alle blootgesteld aan FGF2 twee dagen, gevolgd door twee dagen in FGF2 met BMP4 . Migratie werd vastgesteld door het optreden van vlakke migrerende cellen met een leidende en achterrand (figuur 5 en aanvullende Figuur 2). Een sterke inductie van migrerende cellen van de cortex posterior en een tussengelegen reactie van de MGE en mesencephalon werd waargenomen (Tabel 2). 145 van 146 explantaten van de centrale cortex bleek een trekkende reactie in FGF2 / BMP4. Dus de centrale cortex aangetoond dat de meest robuuste inductie van migrerende cellen van alle geteste explantaten (tabel 2). Weglating van BMP4 afgeschaft een trekkende respons (Tabel 1 en 2, en gegevens niet getoond).

Voor kwantitatieve beoordeling van groeifactor potentie werd migratieafstand gemeten explantaten gekweekt in meerdere groeifactoren. Explantaten werden gekweekt zoals hierboven gedurende twee dagen in FGF2, vervolgens gedurende nog eens twee dagen in FGF2 factoren zonder (controle) of enkelvoudige of gecombineerde BMP4 en TGFB1. In de controlegroep explantaten werd een sterke proliferatie waargenomen in respons op FGF2, zoals verwacht. De explantaten worden afgeleid uit de corticale SVZ en bevatten een groot deel NSC waarvan bekend is dat ze prolifereren in reactie op FGF2 17. De controle-cells bereikte 689 ± 14, de TGFB1 cellen 582 ± 49 pm (Figuur 5). De BMP4-groep toonde een gemiddelde migratie afstand van 935 ± 91 micrometer. In vergelijking migreerden de TGFB1 / BMP4-cellen aanzienlijk verder naar 1150 ± 23 pm (Figuur 5). De resultaten tonen dat BMP4 induceert een migratie-FGF2 blootgesteld NSC. Deze migratie kan verder worden verbeterd door TGFB1. De combinatie van FGF2, BMP4 en TGFB1 dus de meest effectieve migratie te induceren. Samengevat, de celkweek model systeem maakt het mogelijk zowel kwalitatieve als kwantitatieve migratie assessment.

EMT is gekoppeld aan transcriptiefactoren (TF), zoals Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2, TWIST1, Twist2 in diverse systemen waaronder epitheliale kankers, zoals borstkanker, darmkanker, longkanker en ook bij hersentumoren 1,18. we had eerder aangetoond dat FGF2 en BMP2 of BMP4 kunnen Snail1 en Snail2 8,9 induceren. Met de bovengenoemde systeem hebben we de expressie van de andere EMT gerelateerde TF. Geen wijzigingen in TWIST1 expressie kunnen worden opgespoord; met TWIST1 die bij lage expressie bij blootstelling FGF2 (gegevens niet getoond). In de celkweek model een opregulatie van Zeb1 en Zeb2 tijdens FGF2-exposure en Twist2 tijdens FGF2 / BMP4 blootstelling werd waargenomen (Figuur 6).

NSC is gekend dat ze de populatie van oligodendrocyt precursor cellen (OPC) 8,19,20. Verschillende feiten wijzen erop dat NSCs en met name OPC de cel van oorsprong voor gliomen 21,22 kan zijn. Om bovenstaand model verder te karakteriseren onderzochten we de expressie van markers OPC. We zagen dat-FGF2 blootgesteld NSCs toonde co-expressie van Olig2 / Nestin eend Sox10 / Nestin in meer dan 90% (zie figuur 7). Deze waarneming toont aan dat de NSCs tonen OPC-functies in ons systeem. Inderdaad, de OPC-functies gecorreleerd met opregulatie van Zeb'1 en Zeb'2 (figuren 6 en 7). Deze resultaten suggereren dat FGF2-expansie leidt een OPC identiteit, zoals beoordeeld door Olig2 en Sox10, terwijl tegelijkertijd initieert eerste Zeb gebaseerde stappen EMT.

Figuur 1
Figuur 1: Gestandaardiseerde Embryo en voorhersenen Dissection voor NSC Isolatie en EMT inductie. (A) Linker voorpoot van rat E14.5 embryo na een keizersnede. Elke voorgrond ledemaat digit is gemarkeerd met een zwarte pijl tip. Let op de beginnende vorming cijfer typisch voor E14.5. (B) Rat E14.5 embryo na romp te verwijderen. Let op de hekje (#) en dorsale diencephalon which is ideaal om het verwijderen van de huid / schedel anlage starten. (C) De huid / schedel is al grotendeels verwijderd. De grens tussen verwijderd en niet verwijderde huid is gemarkeerd met twee driehoekige pijlpunten. De huid kan naar voren uit de voorste pijl en naar achteren worden afgepeld van de achterste pijl. (D) de huid / schedel is nu volledig verwijderd. Let op de inkeping van de middenhersenen-achterhersenen grens (pijl) en de gesneden net caudaal te, aangegeven met een pijl. (E) Het telencephalon-diencephalon-mesencephalon (TEL-DI-MES) blok verwijderd van de rest van het embryo . (F) Superior uitzicht op TEL-DI-MES block. Craniale overblijft. (G) Schuine bovenaanzicht. (H) inferior Gezien TEL-DI-MES block. (I) Het mesencephalon en een deel van het diencephalon worden gescheiden van het telencephalon met het voorste deel van het diencephalon. Top: Anterior uitzicht op zowel telencephalic blaasjes. Bottom: Right zijaanzicht van mesencephalon, top gezichten craniaal (J) Top:. beide telencephalic blaasjes zonder diencephalon. Inferieur teneinde volledige verwijdering van diencephalon illustreren. Asterisk toont MGE. Bottom:. Voorste deel van diencephalon (K) Top: beide halfronden zijn gescheiden in de interhemisferische spleet. Linker hersenhelft aan de linkerkant. Asterisk toont MGE. Plusteken toont LGE. (L) Vergroting van de linker hersenhelft met een mediane uitzicht. Rechts gezichten craniaal, links caudaal, top is rug-, bodem ventrale respectievelijk. Sterretje (*) is gelegen op MGE. Plusteken (+) is gelegen aan LGE. ch, corticale boord; FL, voorpoot; di, diencephalon; mes, mesencephalon; MHB, middenhersenen-achterhersenen grens; HL, achterste ledematen; LGE, laterale ganglion eminentie; MGE, mediale ganglion eminentie; ob, olfactorische bulb; pc, posterior cortex; Rho, rhombencephalon; tel, telencephalon. Het raster op elke afbeelding toont 2 mm dikke lijnen met vier kruispunt met dunne lijnen elke400 um. Schaal bar voor alle afbeeldingen:. 2 mm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Gestandaardiseerde corticale SVZ dissectie voor NSC Isolatie en EMT inductie. (A) Mediaan gezien linker hersenhelft. Door het foramen van Monro de MGE en LGE zichtbaar zijn, gekenmerkt door sterretje en plusteken. (B) Het reukorgaan is net craniaal van de MGE-LGE verwijderd. (C) De achterste pool van de cortex is net achter de CGE verwijderd . (D) Bovenste: de corticale zoom wordt gescheiden van de cortex. Links: posterior pole. Midden: complex dat het centrale deel van de cortex en de CGE-LGE MGE-block. MGE en LGE gezicht naar rechts. Rechts: olfactorische bulb. (E) Het CGE-LGE-MGE-cortex blok wordt horizontaal gespiegeld. Nu het buitenoppervlak van het telencephalon wordt geconfronteerd met de microscoop. MGE en LGE nu het gezicht naar links. (F) De roodachtige hersenvliezen worden verwijderd uit de heldere doorzichtige cortex. De CGE-MGE-LGE-CTX blok nu omgedraaid weer horizontaal voor de volgende stap. (G, H) Dezelfde werkwijze wordt herhaald met de rechter hersenhelft. De centrale cortex wordt van de CGE-MGE-LGE blok gescheiden. Merk op dat er een tussenliggende zone die cortex bij de CGE-MGE-LGE blok wordt achtergelaten, aangegeven met twee pijlen. Dit tussenproduct cortex dikte correspondeert met de helft van de diameter van de LGE. Gestippelde lijn die de grens tussen LGE-CGE en de cortex. (I) De centrale cortex wordt gescheiden in explantaten van minder dan 400 urn diameter. Schaal bar: 2 mm; raster op elke afbeelding toont 2 mm dikke lijnen met vier snijpunten (dunne lijnen) elke 400 micrometer. Asterisk (*) ligt opt MGE. Plusteken (+) is gelegen aan LGE. Afkortingen: ant-CTX, anterior cortex; cen-CTX, centrale cortex; CGE, caudale ganglion eminentie; ch, corticale boord; cp, choroid plexus; ctx, cortex; LGE, laterale ganglion eminentie; mannen, hersenvliezen; MGE, mediale ganglion eminentie; ob, olfactorische bulb; pc, posterieure cortex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3:. Explantatie zaaien op 35 mm hoog celcultuurschalen Breng 1 ml medium expansie in het midden van de schotel 500 urn rooster. De daling wordt opgenomen door het rooster rand (kleine pijltjes). Explantaten plaats midden in het centrum van de druppel 1 ml. Als de explantaten verspreid buiten het rooster, swIRL het gerecht in een langzame cirkelvormige beweging en de explantaten zal verhuizen naar het centrum met de middelpuntzoekende kracht. Let op: de explantaten zijn nauwelijks zichtbaar met het blote oog (zwarte pijlpunten). Schaal bar: 35 mm.

figuur 4
Figuur 4:. PDPN wordt geïnduceerd in de aanwezigheid van BMP 4 explantaten werden gekweekt volgens het protocol paragraaf 8 (2 dagen in FGF2 alleen, gevolgd door FGF2 met factoren zoals vermeld). Control (A) (FGF2 alleen) en TGFB1 (C) explantaten geen PDPN-positieve cellen (groen) bevatten. Kernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). BMP4 (B) en TGFB1 / BMP4 (D) explantaten bleek een groot deel van PDPN-positieve cellen. Het explantaat centrum ligt aan de linkerkant, de periferie aan de rechterkant. Opmerking: De PDPN-positieve cellen waren meestal found aan de omtrek en niet in het midden van het explantaat. De TGFB1 / BMP4 explantaten bevatten vlakker, meer uitgewerkte PDPN-positieve cellen. (E) Het percentage PDPN-positieve cellen in explantaten op verschillende omstandigheden wordt weergegeven. Controle en TGFB1 beide zijn significant verschillend van de voorwaarden BMP4. Middelen zijn getoond ± SEM. Controle vs. TGFB1 niet significant (ns). Controle en TGFB1 vs. BMP4: p <0,0001 (***). TGFB1 vs. TGFB1 / BMP4: p <0,0001 (***). BMP4 vs. TGFB1 + BMP4 is niet significant: p = 0,0981 (ns). Controle vs. TGFB1 + BMP4: p <0,0001 (***). Schaal bar voor alle beelden, zoals geïllustreerd in (A). 50 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5 Figuur 5: Kwantitatieve Migration Assessment. BMP 4 en TGF ß 1 tonen additief effect op celmigratie. Explantaten werden gekweekt volgens het protocol van hoofdstuk 8. (A) Controle explantatie. (B) Explantatie alleen al in BMP4. (C) Explantatie in TGFB1 alleen. (D) explantatie in de combinatie van TGFB1 en BMP4. (E) migratie afstand in um. De 500 urn rooster werd gebruikt als referentie. De controle en de TGFB1 explantaten tonen een sterke proliferatie met een grotere diameter explantaat dan in andere omstandigheden. Middelen zijn getoond ± SEM. Merk op dat de BMP4 en TGFB1 / BMP4 explantaten gedeeltelijk uiteenvallen de explantaat kern en cellen emigreren weg van centrifugaal. Controle vs. TGFB1 niet significant (ns). TGFB1 vs.BMP4: p = 0,0353 (*). Controle vs. BMP4: p = 0,0351 (*). BMP4 vs. TGFB1 + BMP4: p = 0,0372 (*). Controle vs. TGFB1 + BMP4: p <0,0001 (***). Schaal bar: 500 pm. Centrum van explantaat wordt gekenmerkt door een plusteken (+). Buitenrand van migrerende cellen is gemarkeerd met driehoekige pijl. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6:.. Opregulatie van EMT-gerelateerde transcriptiefactoren door qRT-PCR EMT is verbonden met de belangrijkste transcriptiefactoren van de Zeb- en Twist-familie (A, B) en Zeb'1 Zeb'2 werden opgereguleerd gedurende de eerste fase van FGF2-exposure. (C) Twist'2 werd opgereguleerd tijdens de second fase van FGF2 / BMP4-exposure. Relatieve expressieniveaus gebaseerd op qRT-PCR worden getoond (n = 2). De mRNA-niveaus waren genormaliseerd op GAPDH. Middelen zijn getoond ± SEM. Op dag 0 van de FGF2 periode mRNA werd geoogst, werd verder mRNA geoogst na vier dagen in FGF2, dan na een dag in FGF2 / BMP4 Zeb'1:. Controle vs. FGF2, p = 0,0002 Zeb'2:. Controle vs. FGF2, p = 0,0206 Twist'2. Controle vs. FGF2 + BMP4, p = 0,003.

figuur 7
Figuur 7:. NSC tonen OPC Kenmerken in Modelsysteem NSC's werden geïsoleerd uit de centrale cortex en gekweekt als afzonderlijke cellen in de aanwezigheid van FGF2 (overeenkomstig sectie 5). Na 8 d in cultuur (passage na 4 d overeenkomstig afdeling 7.9) de cellen gevormd kleine NSC kolonies en werden gekleurd voor Olig2 (rood, in B, C), Sox10 (rood, E, F) en Nestin (groen, A, C, D, F). Een groot deel van de cellen co-uitgedrukt Olig2 / Nestin (AC) en Sox10 / Nestin (DF). (G) Co-expressie van Olig2 / Nestin en Sox10 / Nestin wordt weergegeven in percentage van alle cellen. Middelen zijn getoond ± SEM. Schaal bar voor alle beelden, zoals weergegeven in (A) en (D):. 20 urn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staat Totaal explantaten (centrale cortex) Explantaten met trekkende reactie % Explantaten met podoplanin expressie %
Controle 33 0 0 0 0
TGFB1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFB1 + BMP4 22 22 100 22 100

Tabel 1. BMP 4 en de combinatie van TGF ß 1 met BMP 4 leiden tot een robuuste trekkende Response. Explantaten van de centrale cortex in de uitbreiding medium en FGF2 voor een totaal van vier dagen werden gehandhaafd. Na de eerstetwee dagen, hetzij de explantaten verder FGF2 alleen (controle) of FGF2 en bovendien TGFB1, BMP4 of TGFB1 / BMP4 als combinatietherapie ontvangen. Controle- en TGFβ1- explantaten hadden noch tonen een trekkende reactie noch PDPN expressie. BMP4 en TGFB1 / BMP4 geïnduceerde zowel migrerende cellen, evenals PDPN uitdrukking in alle explantaten.

Regio Totaal explantaten Explantaten met trekkende respons in FGF2 / BMP4 %
Central cortex 146 145 99.3
posterieure cortex 52 48 92.0
MGE 56 29 51.7
mesencephalon 53 28 52.8

Tabel 2. De centrale Cortex toont de meest robuuste migratie in reactie op FGF 2 / BMP 4 Explantaten werden bereid uit verschillende regio's van de ontwikkelingslanden rat E14.5 neurale buis. De centrale cortex, het achterste cortex, de mediale ganglion eminence (MGE) en de mesencephalon. Alle explantaten werden op identieke wijze gekweekt in FGF2 / BMP4 (rubriek 8). Explantaten behandeld zonder BMP4 heeft een trekkende respons (data niet getoond) vertonen. Alle explantaten werden gescreend op verschijnen van migrerende cellen per explantaat. Alle regio's in staat waren om te reageren op FGF2 met BMP4 met migratie. De centrale cortex, toonde echter de meest robuuste respons. Merk op dat BMP4 was verplicht om migrerende cellen te induceren. Explantaten gekweekt in FGF2 alleen toonden proliferatie, maar geenmigratie; en geen vlakke migrerende cellen waargenomen in FGF2 alleen (Tabel 1 en aanvullende figuur 2).

Supp Figuur 1
Aanvullende Figuur 1. 400 urn gridbestand. Het rooster bestand kan worden afgedrukt en gebruikt als referentie tijdens bovenstaande stappen dissectie en zoals getoond in figuren 1 en 2. De grote kruispunten vertegenwoordigen 2 mm met 400 pm onderverdelingen. Klik hier om een PDF-versie van deze figuur te downloaden.

Figuur 2 Supp
Aanvullend Figuur 2. BMP 4 -exposed Explantaten Show Flat trekkende cellen. Vergroting cellen figuur 5. (A) Control- (FGF2 alleen) en (C) TGFB1-explantaten vertoonde een sterke celdeling met kleine ronde cellen. (B) BMP4- en (D) TGFB1 / BMP4-explantaten vertoonden consequent platte langgerekte cellen. Schaal bar voor alle beelden, zoals geïllustreerd in (A):. 100 um Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 1
Aanvullende Figuur 3. Samenvatting van de in vitro modelsysteem voor EMT onderzoek. E14.5 rat centrale cortex bevat de NSC-bevattende SVZ. De centrale cortex is ofwel used als explantaat stukken of enkele cellen. Explantatie stukken zijn meer geschikt voor de kwantitatieve analyse van de migratie (rubriek 8). Enkele cellen zijn geschikt voor kwalitatieve analyse, zoals gen of eiwitanalyse (paragraaf 9.13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In deze studie gestandaardiseerd systeem voor EMT analyse gebruik NSC is beschreven (samengevat in aanvullende figuur 3). De reproduceerbaarheid Standaardisatie (Tabel 1 en 2). De NSCs zijn afgeleid van de ontwikkeling cortex, een weefsel dat normaliter EMT niet ondergaat. Dit is van voordeel voor de analyse van de eerste stappen in EMT. Eerste stappen in EMT kan niet voldoende worden bestudeerd in tumorcellen die genetische veranderingen hebben opgebouwd en kunnen al EMT kenmerken vastgesteld. Bovendien primaire tumormonsters niet ideaal EMT begrijpen omdat de meeste kwaadaardige tumoren heterogeen zowel invasieve en niet-invasieve cellen met. De gepresenteerde protocol biedt EMT onderzoekers met een nieuw model om eerste stappen van EMT inductie te bestuderen. Hier laten we zien dat de belangrijkste EMT inductoren van de Zeb en Twist familie achtereenvolgens worden geactiveerd: tijdens de eerste fase Zeb1 en Zeb2 worden opgereguleerd, tijdens de tweede fase Twist2 (Figure 6). Eerder hadden we aangetoond dat Snail1 al enkele uren wordt opgereguleerd na BMP4 blootstelling 8. We hebben ook aangetoond dat na blootstelling BMP4 de neuro-epitheliale stamcellen uit het centrale cortex differentiëren in mesenchymale cellen positief voor gladde spier actine (SMA) en calponine 9. De bovenstaande resultaten vullen de eerdere studie tonen dat alle drie bekende EMT belangrijkste regulatoren zijn betrokken bij het systeem. Daarnaast zagen we dat TGFB1 aanzienlijk migratie effect van FGF2 / BMP4 kan verbeteren alleen. Deze resultaten wijzen op een netwerk tussen FGF-, BMP en TGF-signalering tijdens EMT inductie.

De meest kritische stappen voor een succesvolle isolatie van NSCs voor EMT en migratie analyse zijn: de juiste identificatie van de embryonale leeftijd, het identificeren van anatomische oriëntatiepunten van het zich ontwikkelende embryo, de voorbereiding van verse cultuur media en (tenminste 's nachts) beklede platen, gebruik van fijne punt instrumenten en proper dissectie van het centrale gedeelte van de ontwikkeling cortex corticale explantaten stellen.

De gepresenteerde technieken kunnen worden verbeterd door een aantal wijzigingen. Zoals hierboven gesuggereerd, worden meerdere explantaten uitgezet op een schotel met een raster. Voor het screenen van meerdere verbindingen, kan het echter handiger om één explantaten plaatsen in elk putje van een 96-putjesplaat zijn. Verder kan het modelsysteem worden verfijnd voor grootschalige geneesmiddelenonderzoek. Zoals hierboven beschreven, PDPN een waardevolle marker van overgenomen trekkende functies sinds PDPN wordt gevonden in invasieve NSCs 8. Een PDPN reporter kan worden getransfecteerd in normale NSCs voordat EMT inductie. Bijgevolg PDPN expressie brengende cellen kunnen dienen als een interne controle voor celtransformatie aangezien PDPN niet tot expressie wordt gebracht in normale NSCs (Figuur 4 en Tabel 1). Aantal extra NSC markers beschikbaar, zoals Nestin, die verloren na inductie EMT 8. Bijgevolgde initiële toestand "diffusievaste / non-invasieve / Nestin +", en de eindtoestand, "trekkende / invasieve / PDPN +", kan worden gecontroleerd, zodat geautomatiseerde geneesmiddelen mogelijk maakt. In grote celkweek platen met meerdere putjes (bijvoorbeeld 96 putjes en grotere) oorspronkelijke cellen worden gezaaid en behandeld met gangbare geneesmiddelen of verbindingen zonder bekende functie. Zo kan multi- platen automatisch gescand op de expressie van PDPN of andere migratie / invasie markers. Als een remmer is het belangrijkste doelwit van het scherm, kan het verdwijnen van PDPN expressie helpen om vermoedelijk interessante nieuwe remmende verbindingen te identificeren.

Tijdens het testen van een nieuwe stof de explantaten mag geen migratie te tonen en / of explantaten kan afronden en losmaken van het gerecht. In deze situatie is het beter om slechts de helft van de media dagelijks (in plaats van volledige media veranderen afwisselende dagen) wijzigen. Dit vermindert stress door de oppervlaktespanning bij het vervangen met verse media. Deexplantaten kan niet bevestigen na de eerste plating. In deze situatie, fibronectine moet in contact met het schaaloppervlak ten minste 36 uur. Fibronectine gebruikt voor het bekleden moet vers worden bereid zonder blootstelling aan een plastic buis voor meer dan 10 minuten sinds fibronectine vastplakken aan de kunststof. Verder kan de explantaten buiten het raster regelen. In deze situatie, is het raadzaam om de schotel in een langzame cirkelvormige beweging wervelen. Hierdoor kan de explantaten te verplaatsen naar het midden van centripetale kracht (zie figuur 3).

Er zijn sterke aanwijzingen dat gliomen zijn afgeleid van NSC en / of OPC afgeleid van NSC 23,24. Dientengevolge andere groepen glioma groei hebben opgesteld op basis van NSC. Sampetrean et al geïsoleerd NSC van INK4 / ARF-deficiënte muizen en gedwongen overexpressie van H-Ras 25. Hoogwaardige kwaadaardige tumoren resulteerde dat proliferatie en de invasie toonde na transplantatie 25. McNeill et al. Ook geïsoleerd NSCs van genetisch gemodificeerde muizen (floxed Rb1, Nf1, Kras, Pten alleen en in combinaties) 26. De genen werden geïnactiveerd door Cre-virusinfectie en de NSC's werden getransplanteerd 26. Beide modelsystemen het voordeel dat invasie in vivo als potentiële anti-invasie middelen kan worden bewaakt kunnen worden getest. Hun voornaamste nadeel is dat het begin van invasie is niet goed gedefinieerd en het is onduidelijk of de cellen vertonen glioom atypische EMT invasie (EMT genen) of alleen lokale migratie. Verder slechts één geneesmiddel kan worden getest per dier en de analyse vereist een aantal weken. Een nieuwe anti-drug invasie identificeren, farmaceutische bedrijven moet (a) het screenen op enkele duizenden verbindingen of meer tegelijk, (b) de tests en (c) herhalen proberen verschillende geneesmiddelconcentraties. Tot enkele duizenden getransplanteerde dieren bereiden, behandel ze met verschillende drugs en tenslotte testen op effecten door histochemische of bioluminescentieanalyse is zeer resource-consumeren. Hier wordt een nieuwe NSC-gebaseerde modelsysteem voor EMT-gerelateerde invasie is beschreven dat de kostenefficiënte screening van duizenden verbindingen mogelijk maakt.

Hoewel dit model maakt hoge doorvoer screening van verbindingen, is een primaire screening enige platform. Zodra verbindingen van belang zijn die in dit model niet alleen zelf extra geldig worden. In vivo tests nodig zijn voor de veiligheid en werkzaamheid parameters voor elke verbinding geïdentificeerd en transplantatiemodellen zoals hierboven beschreven belangrijke 25,26 geworden. Het model is ook beperkt door het feit dat het gebaseerd is op knaagdiercellen. Hoewel het model kan worden gebruikt voor rat of muis EMT onderzoeken, is het onduidelijk of dezelfde mechanismen zijn in humane cellen of in de humane patiënt. Verdere experimenten zijn nodig om te onderzoeken of NSC niet alleen invasief in vitro, maar ook na transplantatie. Verscheidene lijnen van bewijs ondersteunen de rol van NSCin glioma formatie. Glioom progressie is gekoppeld aan de volgende genen: Tenascin C, Hey1, SPARC, Snail1 en Snail2, FGFR +, BMPR1a, EGFR, PDGFRß, Sox2, podoplanin, Gli3 en p75NGFR 8. Al deze genen ook die tijdens de transformatie van normale niet-invasieve NSC invasieve mesenchymale cellen 8. Op het moment zijn, is het onduidelijk of NSC kan worden omgezet in tumoren door alleen externe factoren de groei.

Tumor-initiërende stamcellen (TIC) van verschillende tumoren werden geïsoleerd en worden gebruikt als modellen om tumorprogressie 27 begrijpen. TIC zijn echter niet geschikt voor EMT zijn, doordat EMT heeft reeds voorkomen in TICs 27. Te vroeg en ook de late stappen van EMT inductie te begrijpen, is een primaire niet-neoplastische celpopulatie nodig. Idealiter deze populatie niet bedoeld EMT ondergaan in de eerste plaats. Het was eerder aangetoond dat embryonale NSCs waren geschikte kandidaten daarvoor9,28. Namelijk, migratie en invasie kunnen worden geïnduceerd door NSCs FGF2 en BMP4 9,28. FGF2 / BMP4-geïnduceerde migratie was gerelateerd aan single-EMT-gerelateerde genen, echter compleet bewijs ontbrak, omdat de sleutel EMT families Zeb en Twist was niet onderzocht 8. De bovenstaande resultaten tonen aan dat een specifieke combinatie van vier factoren, FGF2, BMP4, TGFB1 en insuline leiden tot een zeer sterke en complete EMT inductie, niet eerder waargenomen. De huidige studie toont aan dat de belangrijkste EMT genen van de Zeb- en Twist-families zijn ook opgereguleerd. Deze studie geeft dus het eerste bewijs dat er geen selectief opregulatie van een enkel gen, maar de resultaten zien dat alle belangrijke families EMT actief in de voorgestelde celcultuur.

EMT is ook waargenomen in epitheliale kankers buiten de hersenen, zoals long-, borst-, colon- en maagkanker 29. Verschillende modellen om EMT studeren in gebruik zijn voor deze tumoren 30-32, Waarvan eerst echter met significante beperkingen: (a) gebruik van getransformeerde tumorcellijnen meedragen van meerdere genetische en epigenetische veranderingen 33; remmers van de EMT te identificeren voor de vroege stadia van kanker, laat stadium kankercellen ontoereikend zijn; (B) serum-afhankelijke culturen die verschillende undefined groeifactoren bevatten; Dit maakt identificatie van de kritische factoren moeilijk. Verder wordt experiment reproduceerbaarheid verminderd sinds kwaliteit serum verschilt van partij tot partij; (C) het serum remmers en enzymactiviteiten eventueel inactiveren van potentieel bruikbare exogene verbindingen; (D) nodig enzymen voor cellulaire passage die celoppervlak moleculen afbreken; (E) EMT agonisten identificeren fysiologische EMT bevorderen, zijn normale cellen nodig inductie testen. Tumorcel modellen zijn ontoereikend om stoffen die de regeneratie in normale stamcellen te bevorderen vinden.

Migratie is ook vereist voor normale processen zoals wondgenezing en REGENErantsoen van de benadeelde hersenen 18. Na traumatisch hersenletsel en beroerte, NSC noodzakelijk om te migreren naar de laesie te nemen aan de regeneratie 4,34. Het huidige systeem kan ook worden gebruikt om stoffen die migratie en invasie te bevorderen identificeren. Zoals hierboven aangegeven, is de migratie veroorzaakt bij het opstarten met BMP4-behandeling. Als de cellen niet worden blootgesteld aan BMP's maar op nieuwe verbindingen, kunnen deze vervangen BMP maatregelen die bijdragen aan nieuwe BMP agonisten te identificeren. Met een verslaggever systeem dat PDPN uitdrukking aangeeft, op grote schaal testen van nieuwe stoffen wordt haalbaar is; Als een nieuwe verbinding kan vervangen BMPs, kan PDPN exprimerende cellen automatisch geïdentificeerd.

Het voorgestelde systeem is ook nuttig om cel signalering interacties te onderzoeken. Onze resultaten tonen dat het BMP effect op migratie kunnen worden verbeterd door TGFB1 activering. De resultaten onthullen een additieve interactie tussen BMP en TGFβ-signalering. Echter, extra signaalwegen, zoals notch-, Wnt- of EGFR / MAPK- en andere signalering cascades kunnen worden betrokken. Daarom zijn verdere onderzoek naar BMP / TGF-interacties en cross-talk naar andere trajecten nodig. Bovendien kan de reagerende centrale cortex worden geïsoleerd uit genetisch gemodificeerde muizen, die kunnen helpen om de onderliggende mechanismen die EMT helderen. Samenvattend kan het EMT modelsysteem beschreven nuttig op het gebied van stamcel biologie en regeneratie, alsook in kankeronderzoek. Het kan worden gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen bibliotheken van stoffen remmen of verbeteren migratie en invasie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De studie werd ondersteund door de Universiteit van Basel Science Foundation en de Zwitserse National Science Foundation door een subsidie ​​aan MHS en AG (SNF IZLIZ3_157230). Wij danken: Dr. Tania Rinaldi Burkat voor royaal verstrekken van infrastructuur; alle leden van de Bettler groep voor discussies en commentaar. Wij danken Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Zwitserland) voor de professionele en deskundige installatie van de Full HD MC170 videocamera (Leica Microsystems, Zwitserland).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Tags

Developmental Biology neurale stamcellen epitheliale naar mesenchymale transitie migratie, glioom kanker invasie Snail1 foetaal serum-vrij FGF2 BMP4 TGFp
Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D.,… More

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter