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Developmental Biology

EMT जांच के लिए एक Enzyme- और सीरम मुक्त तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति मॉडल ड्रग डिस्कवरी के लिए अनुकूल

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला उपकला mesenchyme में transdifferentiating की प्रक्रिया का वर्णन है। EMT भ्रूण विकास भी है कि आमतौर पर, glioblastoma में होता है सबसे अक्सर घातक ब्रेन ट्यूमर के दौरान एक मौलिक प्रक्रिया है। EMT भी स्तन कैंसर, फेफड़ों का कैंसर, पेट के कैंसर, गैस्ट्रिक कैंसर सहित मस्तिष्क के बाहर कई कार्सिनोमा में देखा गया है। EMT केन्द्र प्रवास, आक्रमण और मेटास्टेसिस गठन को बढ़ावा देने से द्रोह से जुड़ा हुआ है। EMT प्रेरण के तंत्र को पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं। यहाँ हम cortical तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) और बाद में EMT-प्रेरण के मानकीकृत अलगाव के लिए इन विट्रो प्रणाली का वर्णन है। इस प्रणाली के लचीलेपन या तो एकल कक्षों या explant संस्कृति का उपयोग करने के लिए प्रदान करता है। इस प्रणाली में, चूहे या माउस भ्रूण अग्रमस्तिष्क एनएससी एक परिभाषित माध्यम में सुसंस्कृत, सीरम और एंजाइमों से रहित हैं। एनएससी Olig2 और Sox10, दो प्रतिलेखन कारक व्यक्त oligodendroc में मनायाyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPCs)। इस प्रणाली का प्रयोग, FGF-, BMP- और बीच बातचीत TGFβ-संकेत Zeb1, Zeb2 शामिल है, और Twist2 मनाया गया जहां TGFβ सक्रियण काफी सेल प्रवास बढ़ाया, एक synergistic BMP- / TGFβ-बातचीत का सुझाव दे। परिणाम FGF-, BMP- और TGFβ-संकेतन के एक नेटवर्क EMT प्रेरण और रखरखाव में शामिल होने के लिए इशारा करते हैं। इस मॉडल प्रणाली इन विट्रो में EMT जांच करने के लिए प्रासंगिक है। यह लागत प्रभावी है और उच्च reproducibility पता चलता है। यह भी अपने प्रवास प्रतिक्रियाओं के संबंध में (मात्रात्मक दूरी की माप), और यौगिकों रोकना या EMT (गुणात्मक माप) बढ़ाने के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग के साथ विभिन्न यौगिकों की तुलना के लिए अनुमति देता है। मॉडल इसलिए अच्छी तरह से प्रभावित हो रहा EMT पदार्थों के लिए दवा पुस्तकालयों का परीक्षण करने के लिए अनुकूल है।

Introduction

भ्रूण के विकास के कई चरणों के दौरान उपकला कोशिकाओं को एक दूसरे (जैसे, तंग जंक्शनों) को अपने मजबूत पालन खोना और mesenchymal संक्रमण (EMT) 1 करने के लिए एक प्रक्रिया बुलाया उपकला में एक प्रवासी phenotype के अधिग्रहण। EMT ऐसे mesenchymal तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के रूप में अतिरिक्त प्रकार की कोशिकाओं के गठन, एक जनसंख्या है कि neuroepithelium 2 से segregates के लिए आवश्यक है। EMT भ्रूण चरणों के दौरान केवल आवश्यक है बल्कि घावों 4 demyelinating में इस तरह के घाव भरने 3 और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) उत्थान के रूप में वयस्क जीव में शारीरिक प्रक्रियाओं को बनाए रखने के वयस्क जीवन के बाद के चरणों में की आवश्यकता नहीं है।

उपकला ट्यूमर प्रवास, आक्रमण और मेटास्टेसिस के लिए एक दीक्षा कदम के रूप में EMT पुन: सक्रिय करने, अंततः कैंसर की प्रगति 1,3 करने के लिए अग्रणी जाना जाता है। EMT वास्तव में केन्द्र मजबूत प्रवास 1,3 से जुड़ा हुआ है। ग के सेलुलर कदमonditioning, की शुरुआत के दौर से गुजर और EMT को बनाए रखने के लिए पूरी तरह से समझ में आ रहा है और आगे की जांच की जरूरत नहीं कर रहे हैं।

इधर, एनएससी पर आधारित एक मानकीकृत इन विट्रो EMT मॉडल प्रणाली, परिभाषित वृद्धि कारक है और मीडिया (कोई सीरम और कोई एंजाइम उपयोग) के साथ प्रस्तुत किया है। इस मॉडल प्रणाली EMT पर काम कर रहे वैज्ञानिकों के लिए प्रासंगिक है। घोंघा, Zeb और ट्विस्ट प्रोटीन परिवारों दोनों के विकास और रोग 1 में EMT के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है। घोंघा, Zeb और ट्विस्ट परिवारों को भी प्रस्तुत प्रणाली में शामिल कर रहे हैं। प्रणाली अग्रमस्तिष्क कि सामान्य रूप से EMT EMT प्रेरण के दौरान प्रारंभिक घटनाओं के अध्ययन के लिए एक विशेष लाभ प्रदान करने गुजरना नहीं करता है की एक विशिष्ट क्षेत्र पर आधारित है।

मॉडल प्रणाली संभावित, सीएनएस के बाहर epithelia में EMT अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है क्योंकि इस तरह के घोंघा, Zeb और ट्विस्ट प्रोटीन के रूप में महत्वपूर्ण EMT inducers, यह भी सीएनएस के बाहर ऊतक प्रणालियों में EMT के दौरान पाए जाते हैं। इस मॉडल एसystem विशेष रूप से सामान्य में स्टेम सेल सुविधाओं और EMT अध्ययन करने के लिए विकासशील प्रांतस्था से एनएससी के मानकीकृत अलगाव की अनुमति देता है। इस प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम, एनएससी पृथक प्रेरित EMT और FGF2 और BMP4 के प्रभाव के तहत बाद में पलायन का अध्ययन किया। हमने देखा है कि FGF- और सेल प्रवास को बढ़ावा देने के TGFβ-संकेत के साथ बीएमपी संकेत का आदान प्रदान, इस प्रकार मॉडल प्रणाली को मान्य।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं का पालन 'की देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड' (एनआईएच प्रकाशन, 8 वें संस्करण, 2011) और बेसल के पशु कल्याण समिति (देखभाल और पशु के उपयोग के लिए स्विस दिशानिर्देश) द्वारा अनुमोदित किया गया। इन दिशानिर्देशों द्वारा पशु प्रोटोकॉल "सबसे कम पशु गंभीरता को ग्रेड" का माना जाता है।

1. विस्तार मध्यम की तैयारी

नोट: टिशू कल्चर के लिए मानक के रूप में सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में काम करते हैं।

  1. दो 15 मिलीलीटर ट्यूबों ले लो, और एल glutamine मुक्त DMEM / F12 के 5 मिलीलीटर जोड़ें: एक 500 मिलीलीटर की बोतल से मध्यम में दो 15 मिलीलीटर ट्यूबों के प्रत्येक (1: 1)। पहले 15 मिलीलीटर ट्यूब, 50 मिलीग्राम मानव APO-transferrin, प्यूटर्साइन 1 एम शेयर (0.1 मिमी अंतिम एकाग्रता) के 50 μl और सोडियम सेलेनियम 500 माइक्रोन शेयर (अंतिम एकाग्रता 30 एनएम) के 30 μl जोड़ें।
    1. मूल DMEM / F12 बोतल में एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर।
  2. सेकंड 15 मिलीलीटर ट्यूब, 12.5 मिलीग्राम इंसुलिन जोड़ें। जोड़ना6 - 1 एम NaOH के 9 बूँदें। भंवर इंसुलिन पूरी तरह से भंग करने के लिए। मूल DMEM / F12 बोतल में एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर।
    नोट: NaOH विषैले और संक्षारक है। सुरक्षात्मक दस्ताने, कोट, और सुरक्षा चश्मे का प्रयोग करें।
  3. 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन (10,000 इकाइयों / एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 माइक्रोग्राम / एमएल) / amphotericin बी (25 माइक्रोग्राम / एमएल) DMEM / F12 मध्यम बोतल में जोड़े।
  4. glutamine युक्त हौसले thawed 200 मिमी एल glutamine शेयर के 5 मिलीलीटर या ओलिगोपेप्टाइड जोड़ें (200 मिमी एल alanyl-एल glutamine dipeptide) DMEM / F12 मध्यम बोतल के लिए।
  5. अच्छी तरह से हिलाना। 50 मिलीलीटर aliquots तैयार करें।
    नोट: विस्तार मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है। Aliquoted नलियों 500 मिलीलीटर की बोतल में रखा मध्यम की तुलना में कम पीएच परिवर्तन दिखा।

2. Passaging मीडियम की तैयारी

  1. और 2 मिलीग्राम + मुक्त HBSS मीडिया, जोड़ने 990.85 मिलीग्राम ग्लूकोज (5 मिमी अंतिम एकाग्रता) और 840.10 मिलीग्राम NaHCO 3 - 1 एल सीए 2 + करने के लिए नोट: passaging मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है।

3. वृद्धि कारकों की तैयारी

  1. 1% बीएसए (पीबीएस बीएसए) अकेले या 4 मिमी (पीबीएस-बीएसए एचसीएल) में हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ साथ बाँझ 1x पीबीएस तैयार करें।
    सावधानी: एचसीएल संक्षारक और विषैला होता है और विशेष सुरक्षा उपायों (कोट, काले चश्मे, दस्ताने, हुड) की आवश्यकता है।
  2. भंग 10 माइक्रोग्राम / एमएल पुनः संयोजक मानव fibroblast वृद्धि कारक 2 पीबीएस BSA में (rhFGF2) (10 एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता), 10 माइक्रोग्राम / एमएल पुनः संयोजक मानव अस्थि Morphogenetic प्रोटीन 4 पीबीएस BSA में (rhBMP4) (10 एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता), और 20 माइक्रोग्राम / एमएल पुनः संयोजक मानव विकास बदलने पीबीएस बीएसए एचसीएल में फैक्टर बीटा 1 (rhTGFβ1) (40 एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता)।
    1. बाँझ फ़िल्टर न करें। aliquots तैयार करें।
      नोट: विकास कारक aliquots में संग्रहित किया जा सकता-20 डिग्री सेल्सियस के लिए कम से कम 2 साल।

4. सेल संस्कृति व्यंजन की कोटिंग

  1. एक 250x पीएलओ शेयर तैयार करने के लिए 1,875 मिलीग्राम पाली एल ओर्निथिन (पीएलओ) 500 मिलीलीटर में आसुत एच 2 ओ भंग। फ़िल्टर एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर बाँझ और 2 मिलीलीटर aliquots बनाते हैं।
    नोट: ये aliquots में कम से कम 2 साल के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. 1,000x फ़ाइब्रोनेक्टिन शेयर तैयार करने के लिए 1 मिलीलीटर बाँझ आसुत एच 2 ओ में 1 मिलीग्राम गोजातीय फ़ाइब्रोनेक्टिन भंग। भंवर के रूप में इस चिपचिपा प्रोटीन थक्का कर सकता है। 10 मिनट के लिए हाथ से धीरे से हिला।
    1. कभी-कभी झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। पूरा विघटन के लिए जाँच करें। फ़ाइब्रोनेक्टिन का पूरा विघटन के लिए कम से कम 37 डिग्री सेल्सियस का हल गर्म। न फिल्टर बाँझ।
      नोट: समाधान अप करने के लिए 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  3. प्लाज्मा pretreated प्लास्टिक सेल संस्कृति व्यंजन (100 मिमी या अन्य आकार का प्रयोग के रूप में करने के लिए आवश्यकप्रयोग)। पलायन का आकलन करने के लिए, के साथ 500 माइक्रोन ग्रिड 35 मिमी व्यंजन का उपयोग करें। बर्तन में रात भर एक 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए 2 मिलीलीटर 1x पीएलओ के साथ सेते हैं। पीबीएस 1x 2 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं।
  4. एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटा की एक न्यूनतम के लिए 2 मिलीलीटर 1x फ़ाइब्रोनेक्टिन (1 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) जोड़ें और व्यंजन सेते हैं। फ़ाइब्रोनेक्टिन हटाये सिर्फ चढ़ाना कोशिकाओं से पहले।
    नोट: fibronectin लेपित व्यंजन 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है।

5. मानकीकृत विच्छेदन और चमड़ा subventricular क्षेत्र की तैयारी (SVZ)

  1. प्राप्त चूहा भ्रूण दिन 14.5 (E14.5, Sprague-Dawley) और माउस E13.5 (C57BL / 6) समय पर संभोग से भ्रूण। 08:00 अगली सुबह तक 18:00 से जानवरों दोस्त। संभोग के दिन के बाद दोपहर E0.5 माना जाता है।
  2. 5% isoflurane और 0.8 एल / मिनट ऑक्सीजन का प्रवाह के साथ गर्भवती पशु anesthetize। तेज Diss साथ पंजा संपीड़न द्वारा प्रतिक्रिया की जाँचection संदंश। पशु सिर काटना। बचें सीओ 2 asphyxiation के रूप में सीओ 2 सेल वसूली स्टेम प्रभावित करता है।
  3. शल्यक्रिया से अनुभाग द्वारा भ्रूण निकालते हैं।
    1. लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ फर कीटाणुरहित। गर्भाशय के ऊपर पेट के निचले हिस्से में लगभग 8 सेमी के वी के आकार त्वचा चीरा बनाने के लिए शल्य चिकित्सा संदंश और कैंची का प्रयोग करें। फर के साथ ही त्वचा काटकर अलग कर देना मांसपेशियों की दीवारों को बरकरार रखते हुए।
    2. पेरिटोनियम में प्रवेश करने की मांसपेशियों और पेट की मांसपेशियों में दीवार काटकर अलग कर देना ताजा संदंश और कैंची का प्रयोग करें।
    3. निचले पीछे पेरिटोनियम में गर्भाशय को पहचानें। आसपास के ऊतकों से तेज जुदाई से गर्भाशय निकालें।
    4. ठंडा 1x पीबीएस में बाँझ 1x पीबीएस के साथ भ्रूण और जगह के साथ गर्भाशय धो लें।
    5. एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे भ्रूण से भ्रूण को रिहा करने के गर्भाशय की दीवारों को खोलने के लिए ठीक इत्तला दे दी कैंची का प्रयोग करें (3X बढ़ाई, चित्रा 1 बी)। भ्रूण हल्स दूर करने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें (
    6. विकास चूहा तंत्रिका तंत्र 5 एटलस द्वारा सही विकास मंच की जाँच करें। सही भ्रूण आकार चित्रा 1 बी में दिखाया गया है।
    7. चूहे forelimb (फ्लोरिडा) चित्रा 1 ए में सचित्र के रूप में अंकों के गठन की शुरुआत की मौजूदगी से आगे सही उम्र की जाँच करें।
      नोट: हिंद अंग (एच एल) ​​अभी तक अंकों जुदाई (चित्रा 1 बी) नहीं दिखा है।
  4. विच्छेदन के लिए, uncoated पेट्री ठंडा 1x पीबीएस के साथ भरा बर्तन करने के लिए भ्रूण हस्तांतरण। एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप (3X 20X बढ़ाई करने के लिए) autoclaved ठीक संदंश का उपयोग तहत विच्छेदन प्रदर्शन।
    नोट: पेट्री डिश प्लाज्मा लेपित सेल संस्कृति व्यंजन के साथ भी हो सकता है के रूप में पकवान की सतह के लिए ऊतक के लगाव को रोकने के। तीव्रता टंगस्टन तार सुई या इसी तरह की भी विच्छेदन के कुछ चरणों के लिए सहायक होते हैं।
  5. सिर की त्वचा और खोपड़ी inte पर शुरू हटायेविकासशील telencephalon (दूरभाष) और diencephalon (डी) (चित्रा 1 बी) के क्रम में विकासशील न्यूरल ट्यूब (चित्रा 1 सी) तक पहुंच हासिल करने में पूर्व से और दो ​​संदंश के साथ पीछे एक साथ खींच कर की rsection।
  6. , मध्यमस्तिष्क-hindbrain सीमा (एमएचबी, चित्रा 1 बी-डी में काला तीर सिर) को पहचानें rhombencephalon से mesencephalon (एमईएस) को अलग। बस या एमएचबी (चित्रा -1, त्रिकोणीय तीर) के नीचे rhombencephalon कट।
    नोट: एमएचबी पर अतिरिक्त चमड़े के नीचे अंतरिक्ष न्यूरल ट्यूब को नुकसान पहुँचाने के बिना त्वचा हटाने की सुविधा।
  7. चेहरे कंकाल (चित्रा 1E) के साथ खोपड़ी आधार पर telencephalon / diencephalon के बीच संबंध तोड़ने। इस telencephalon, diencephalon और mesencephalon (तेल-डि-एमईएस) (आंकड़े 1F-एच) युक्त एक ब्लॉक में यह परिणाम है।
  8. बर्फ पर विस्तार माध्यम में TEL-डि-एमईएस ब्लॉक स्थानांतरण। यह complet रखेंइली एक uncoated पेट्री डिश में विस्तार मध्यम में शामिल किया। संदंश की एक जोड़ी के साथ mesencephalon पर ब्लॉक पकड़ो telencephalon कि एनएससी के साथ cortical SVZ शामिल छू से बचने के लिए।
  9. दोहराएँ 5.5 सभी भ्रूण (चित्रा 1F-एच) के साथ 5.8 करने के लिए कदम।
  10. स्थानांतरण एक TEL-डि-एमईएस ताजा ठंडा 1x पीबीएस में ब्लॉक। पूर्वकाल mesencephalon (चित्रा 1F-एच) में बिंदीदार रेखा के साथ कट, diencephalon से mesencephalon को अलग करने के रूप में चित्रा 1 मैं में दिखाया गया है।
  11. चित्रा 1F में धराशायी तर्ज पर काटने से दूरभाष से डि अलग करें। चित्रा 1J में पृथक telencephalon देखें।
  12. दो telencephalic गोलार्द्धों विभाजित, चित्रा 1J में बिंदीदार रेखा के साथ काटने। के रूप में चित्रा 1K में सचित्र यह दो अलग गोलार्द्धों में यह परिणाम है।
    नोट: बाएँ गोलार्द्ध चित्रा 1L में बढ़ाया है।
  13. औसत दर्जे का गिरोह को पहचानेंlionic eminences (MGE, चित्रा 2A; *) और पार्श्व ganglionic eminences (LGE, चित्रा 2A +) भविष्य रंध्र interventriculare के माध्यम से दिखाई।
    1. संदंश या सुई का प्रयोग, MGE और LGE और पूर्वकाल प्रांतस्था (चींटी-CTX, चित्रा 2 बी) के बीच चौराहे पर एक सीधी रेखा के साथ काटना। प्रांतस्था, हिप्पोकैम्पस (हिप) और रंजित जाल (सीपी) के माध्यम से एक सीधी रेखा में कटौती। इस ganglionic eminences से घ्राण बल्ब (ओ) सहित पूर्वकाल प्रांतस्था अलग करती है (जीई, 2 बी, सी आंकड़े)।
  14. दुम ganglionic श्रेष्ठता (CGE, चित्रा -2 सी, डी) और पीछे कोर्टेक्स (चित्रा 2 सी) के चौराहे पर एक दूसरे सीधी रेखा में कटौती, फिर प्रांतस्था, हिप्पोकैम्पस और रंजित जाल के माध्यम से काटने।
  15. telencephalon बाहर समतल। पूरी तरह से पीछे ध्रुव और घ्राण बल्ब (चित्रा 2 डी) को हटा दें। की पहचानcortical हेम हिप्पोकैम्पस और रंजित जाल (चित्रा -2) युक्त, जैसा कि पहले 6.7 परिभाषित किया।
    नोट: हिप्पोकैम्पस कोर्टेक्स तुलना में एक पतली neuroepithelium है। सीपी लाल जहाजों में शामिल है।
    1. कोर्टेक्स से cortical हेम अलग, कोर्टेक्स ganglionic eminences (चित्रा 2 डी) के आकार के समान आकार की जा रही है। इस कोर्टेक्स (लक्ष्य ऊतक) और ganglionic eminences (जीई, चित्रा 2 डी) के एक ब्लॉक में यह परिणाम है।
  16. पकवान की सतह के लिए वेंट्रिकुलर (आंतरिक) की ओर से कॉर्टेक्स-जीई ब्लॉक पलटें।
    नोट: गोलार्द्ध की बाहरी सतह प्रयोगकर्ता (चित्रा 2 ई) का सामना करना पड़ेगा। बाहरी सतह पर रक्त वाहिका युक्त तानिका (चित्रा 2 ई) कर रहे हैं।
    1. बाएँ हाथ के साथ पकवान की सतह के लिए जीई पिन और (सही (प्रमुख) के हाथ में संदंश की एक जोड़ी के साथ बंद तानिका छील चित्रा 2 एफ नोट: यह तकनीकी रूप से सबसे ज्यादा मांग कदम है क्योंकि तानिका जोरदार कोर्टेक्स का पालन करें। कोर्टेक्स से तानिका की जुदाई कदम 5.13.1 और 5.14 में एक पूरी तरह से सीधी रेखा (दांतेदार नहीं) काटने से मदद की है।
  17. दोहराएँ अन्य गोलार्द्ध और सभी भ्रूण के लिए 5.16 करने के लिए 5.12 कदम। LGE (चित्रा 2 जी, 2H) के आधे मुख्य व्यास की दूरी में LGE साथ कोर्टेक्स कट। विच्छेदित कोर्टेक्स 1.2 मिमी x 2.4 मिमी (चित्रा 2H) के एक क्षेत्र तक फैला है और एनएससी के साथ SVZ / कीटाणु परत भी शामिल है।

6. explant संस्कृतियों की तैयारी

  1. कम से कम 400 मीटर व्यास (चित्रा 2I) की explants में कोर्टेक्स कट। एक 400 माइक्रोन ग्रिड (पूरक चित्रा 1) संदर्भ (चित्रा 2H और 2I) के लिए विच्छेदन पेट्री डिश नीचे तैनात प्रयोग करें। बर्फ सह के साथ एक ताजा पेट्री डिश में सभी explants स्थानांतरणएलडी विस्तार मध्यम।
  2. एक टिशू कल्चर पकवान (कदम 4.4) से फ़ाइब्रोनेक्टिन निकालें। यह शुष्क करने की अनुमति दें। 10 मिमी x 10 मिमी (चित्रा 3) की ग्रिड आयाम के साथ 35 मिमी पकवान के केंद्र के लिए ठंड के विस्तार के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें। मध्यम एक गोलाकार ड्रॉप (चित्रा 3) के रूप में करने की अनुमति दें।
  3. बूंद के केंद्र के लिए 8 explants के लिए ऊपर डालें। explants आदर्श प्रवास के विश्लेषण के लिए एक दूसरे के बीच कम से कम 3 मिमी दूरी के साथ ग्रिड पर स्थित होना चाहिए (धारा 8 देखें)।
  4. Explants की कुर्की के लिए एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में लगभग 1 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस, 21% ओ 2, 5% सीओ 2) के लिए पकवान सेते हैं। explants बसा है और fibronectin लेपित सतह को संलग्न करने की अनुमति दें। पकवान हिला नहीं है, क्योंकि explants अलग और इष्टतम ग्रिड केंद्र से बाहर स्थानांतरित कर सकते हैं।
  5. 1 घंटा ऊष्मायन के बाद (37 डिग्री सेल्सियस, 21% ओ 2, 5% सीओ 2), ऊपर डिश 2 मिलीलीटर विस्तार मध्यम की कुल मात्रा के साथ साथ विकास च को भरनेअभिनेता या हित के पदार्थों का परीक्षण और सेते हैं।
    नोट: न enzymatic पाचन, और न ही सीरम या centrifugation explant तैयारी के लिए जरूरी हैं। यह सेल अखंडता के लिए इष्टतम है।

7. एनएससी सिंगल सेल संस्कृति की तैयारी

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार और passaging मध्यम गर्म।
  2. ठंड विस्तार मध्यम (ट्यूब) के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में (कदम 5.17 से) विच्छेदित कोर्टेक्स टुकड़े स्थानांतरण। 1200 में 5 मिनट के लिए कोर्टेक्स टुकड़े अपकेंद्रित्र x जी। सतह पर तैरनेवाला aspirate। 200 μl पूर्व गरम विस्तार मध्यम कोर्टेक्स टुकड़े resuspend में जोड़े।
  3. एक P1,000 टिप (ट्यूब) के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब को पूर्व गर्म passaging माध्यम के 700 μl जोड़ें। धीरे गोली resuspend। 15 मिलीलीटर ट्यूब के नीचे टिप जगह है। और धीरे धीरे P1,000 टिप के साथ तीन बार suctioning द्वारा ऊतक के टुकड़े को अलग कर देना।
    नोट: passaging मध्यम सेल जुदाई को बढ़ावा देता है और एंजाइमों के उपयोग से बचने के लिए आवश्यक है।
  4. ट्यूब बड़ा (भारी) undissociated तल पर व्यवस्थित करने के लिए टुकड़े के लिए 30 से 60 सेकंड के लिए बैठने के लिए अनुमति दें। एकल अलग कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला में रहेगा। एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब (ट्यूब बी) के लिए सतह पर तैरनेवाला के बारे में 700 μl स्थानांतरण।
  5. दोहराएँ 7.3 और 7.4 बड़े टुकड़े को अलग कर देना कदम।
  6. दोहराएँ कदम 7.3 और 7.4 बड़े टुकड़े को अलग कर देना एक दूसरी बार। ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब (ट्यूब बी) के लिए सभी सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  7. 5 मिलीलीटर की कुल मात्रा के विस्तार के माध्यम जोड़ें। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। trypan नीले रंग धुंधला द्वारा मृत कोशिकाओं का आकलन करें।
    नोट: छोटे एनएससी 7.2 7.6 करने के लिए कदम बड़ा कोशिकाओं की तुलना में बेहतर सहन। 10 भ्रूण से 10% मृत कोशिकाओं के साथ के बारे में 4 x 10 6 कोशिकाओं की उम्मीद है।
  8. एनएससी के विस्तार के लिए, 8 मिलीलीटर विस्तार मध्यम की मात्रा में प्रति 10 सेमी fibronectin लेपित टिशू कल्चर पकवान 1.5 x 10 6 कोशिकाओं थाली। मानक विस्तार के लिए, 1,000x rhFGF2 शेयर के 8 μl जोड़ें। हर दिन rhFGF2 μl 8 जोड़ें और मुझे बदलनेहर दूसरे दिन दीया।
    नोट: इस विकास के चरण में कोर्टेक्स एनएससी के बहुमत है और केवल विभेदित कोशिकाओं के एक अल्पसंख्यक शामिल हैं। विभेदित कोशिकाओं अल्पसंख्यक rhFGF2 उपचार के लिए प्रतिक्रिया और विस्तार संस्कृति के दौरान मर नहीं है।
  9. पारित होने के 60% संगम पर एनएससी का विस्तार किया।
    1. पारित होने के एनएससी करने के लिए, विस्तार मध्यम निकालें। धो कोशिकाओं को जल्दी 5 मिलीलीटर passaging माध्यम के साथ तीन बार। 4 मिनट - 2 रुको। सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + कोशिकाओं के बिना धीरे-धीरे सतह से अलग है, ऊपर गोलाई। चरण खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की टुकड़ी की जाँच करें। , एक और कुछ मिनट तक प्रतीक्षा करें, अगर जरूरत है जब तक सतह से दृश्य टुकड़ी मनाया जाता है।
      नोट: एकल कोशिकाओं को पूरी तरह अलग होगा, लेकिन सबसे अधिक कोशिकाओं को अभी भी पकवान सतह का पालन करना होगा। अवधि टुकड़ी के लिए आवश्यक फ़ाइब्रोनेक्टिन कोटिंग की अवधि पर निर्भर है। एक छोटी फ़ाइब्रोनेक्टिन कोटिंग (12 घंटा या इससे कम) तेजी से सेल टुकड़ी में यह परिणाम है। अब प्रयोगों के लिए (>; 1 सप्ताह) अधिक से अधिक 24 घंटा के फ़ाइब्रोनेक्टिन कोटिंग की सिफारिश की है।
  10. एक 10 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग धीरे सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए। कोशिकाओं के साथ 5 मिलीलीटर passaging मध्यम लीजिए और एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण। passaging माध्यम की एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर के साथ दोहराएँ।
  11. ऊपर pipetting द्वारा और तीन बार नीचे 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को अलग कर देना, ट्यूब के नीचे 10 मिलीलीटर pipet रखकर। कमरे के तापमान पर 1,200 XG पर 15 मिनट के लिए ट्यूब स्पिन। तैरनेवाला निकालें और 2 मिलीलीटर विस्तार मध्यम में गोली resuspend। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। मृत कोशिकाओं का आकलन करने के trypan नीले रंग का प्रयोग करें।
    नोट: 60% संगम विस्तार के बाद, 4 की उम्मीद है - लगभग 10% से कम एक मृत कोशिकाओं की संख्या के साथ 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं।
  12. प्रति प्लेट आगे मार्ग के लिए 10 सेमी पकवान 8 x 10 5 कोशिकाओं।

8. प्रवासन आकलन

  1. पलायन मूल्यांकन के लिए, में explants धारा 5. बीज के हिसाब से अलग-थलग explants35 मिमी ग्रिड व्यंजन। चढ़ाना के बाद एक घंटे, FGF2 (rhFGF2) जोड़ें। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बर्तन 2 दिनों के लिए रखें।
    नोट: इष्टतम explant कुर्की के लिए, बर्तन चलती से बचें।
  2. 1,000 μl टिप से मध्यम निकालें। 1,000 μl टिप इनर सर्कल में शुरू (चित्रा 3) द्वारा विस्तार के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें। यह explants पर सतह के तनाव को कम करता है।
  3. के रूप में प्रयोग के लिए आवश्यक वृद्धि कारक अकेले या संयोजन में जोड़ें। FGF2 / BMP4 / TGFβ1 के रूप में सकारात्मक नियंत्रण का प्रयोग करें। नोट: इस प्रयोग में 35 मिमी पकवान प्रति 2 μl FGF2, 2 μl BMP4 और 4 μl TGFβ1 अकेले और संयोजन (चित्रा 5) में जोड़ा गया था।
    1. अतिरिक्त कारकों और / या परीक्षण योग्य पदार्थों जोड़ें। व्यंजन फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए अछूता रखें।
  4. एक औंधा माइक्रोस्कोप पर explants की तस्वीरें ले लो।
    नोट: लिविंग explants तय कोशिकाओं की तुलना में बेहतर चरण विपरीत छवियों उपज। दोनों का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. माइग्रेशन के लिएमूल्यांकन, एक ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर है कि पिक्सेल माप की अनुमति देता है (जैसे, फिजी 8) का उपयोग करें।
  6. पिक्सल में 500 माइक्रोन दूरी के पकवान ग्रिड उपाय और आंतरिक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल करते हैं।
  7. पलायन शुरू बिंदु के रूप में explant के केंद्र को परिभाषित करें। explant के केंद्र और 10 कोशिकाओं की सबसे बाहरी समूह के बीच की दूरी को मापने।
    नोट: सभी कोशिकाओं केन्द्रापसारतया explant से दूर पलायन। वे सहज परिस्थितियों का परीक्षण (चित्रा 5) के तहत परिधि में एक पत्रक के रूप में।

9. आक्रमण आकलन

  1. प्रोटोकॉल की धारा 4 के अनुसार fibronectin लेपित टिशू कल्चर 24 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें।
  2. सेल आक्रमण कक्षों के शीर्ष में अच्छी तरह से गर्म विस्तार मध्यम के 300 μl रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए कक्षों सेते हैं।
  3. शीर्ष अच्छी तरह से विस्तार के माध्यम से निकालें और लेपित 24 अच्छी तरह से थाली में Boyden चैम्बर जगह है।
  4. 50 जोड़ेअच्छी तरह से नीचे तक rhFGF2 के 0.5 μl और 0.5 μl rhBMP4 के साथ गर्म विस्तार मध्यम से 0 μl।
  5. पैसेज एनएससी और 1 से 4 धारा में वर्णित 7. मार्ग के रूप में गिनती उपयुक्त हैं।
  6. प्लेट rhFGF2 के 0.3 μl और Boyden कक्ष के शीर्ष में अच्छी तरह से rhBMP4 के 0.3 μl के साथ गर्म विस्तार मध्यम के 300 μl की मात्रा में 5 एक्स 10 5 कोशिकाओं।
  7. संस्कृति 24 घंटे के लिए वरीयता प्राप्त एनएससी।
  8. एक और 48 घंटे के लिए कोशिकाओं कक्ष और संस्कृति के लिए अतिरिक्त कारकों और / या परीक्षण योग्य पदार्थों जोड़ें।
    नोट: कोशिकाओं आक्रामक रहे हैं, वे ऊपर से नीचे तक अच्छी तरह से तहखाने झिल्ली परत के माध्यम से अच्छी तरह से समाप्त हो जाएगी। आक्रामक कोशिकाओं Boyden कक्ष के नीचे से जुड़े हुए होंगे।
  9. निर्माता द्वारा प्रदान प्रोटोकॉल का पालन करें। कपास swabs (आक्रमण परख किट में शामिल है) का प्रयोग दो बार सफाई से शीर्ष में अच्छी तरह से गैर इनवेसिव कोशिकाओं को हटाने के लिए।
  10. कुओं से मध्यम निकालें और के साथ 500 μl विस्तार के माध्यम जोड़ेंजीवित कोशिकाओं के लिए और वेल्स को परमाणु डाई DAPI के साथ एक प्लाज्मा झिल्ली दाग।
  11. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
    नोट: रंगों इष्टतम दृश्य 8 के लिए क्रमश: झिल्ली और आक्रामक कोशिकाओं के नाभिक में एकीकृत जाएगा। विकल्प: न आना प्लाज्मा झिल्ली डाई यदि बहुरंगा immunocytochemistry की योजना बनाई है।
  12. रंगों के साथ मध्यम निकालें और विस्तार मध्यम के साथ दो बार धो लें। कल्पना और के रूप में पहले 8 प्रदर्शन एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ आक्रामक कोशिकाओं की गिनती।
    नोट: कुछ आक्रामक कोशिकाओं कक्ष के नीचे से अलग हो सकता है और जहाँ वे लेपित सतह के लिए छड़ी अच्छी तरह से नीचे की सतह के लिए गिरा दिया है। पूरा विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से सतह पर कोशिकाओं शामिल हैं।
  13. मध्यम निकालें और 10 मिनट के लिए ठंडा ताजा 4% पीएफए ​​में कोशिकाओं को ठीक। 1x पीबीएस के साथ धो 3x। के रूप में पहले 8-10 वर्णित, आक्रामक कोशिकाओं पर immunocytochemistry प्रदर्शन करना।

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Representative Results

इस EMT मॉडल प्रणाली दोनों एकल कक्षों के रूप में या विकासशील न्यूरल ट्यूब के एक विशिष्ट क्षेत्र से explants के रूप में एनएससी के मानकीकृत अलगाव पर आधारित है, केंद्रीय प्रांतस्था (आंकड़े 1 और 2)। मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए, explants एक 500 माइक्रोन ग्रिड संस्कृति पकवान (चित्रा 3) के केंद्र में सही वरीयता प्राप्त थे। केंद्रीय कोर्टेक्स से explants पहले दो दिनों के लिए FGF2 से अवगत कराया गया, वृद्धि कारक (तालिका 1) के विभिन्न संयोजनों में अतिरिक्त दो दिनों के बाद। हम कोर्टेक्स जो विकासशील न्यूरल ट्यूब के अन्य क्षेत्रों की तुलना में बड़ा है के साथ शुरू कर दिया। हमने देखा है कि केवल BMP4 में सभ्य explants एक प्रवासी प्रतिक्रिया (1 टेबल और पूरक चित्रा 2) से पता चला है।

अगली podoplanin (PDPN) अभिव्यक्ति परिभाषित परिस्थितियों में विश्लेषण किया गया था। PDPN एक transmembrane s हैialomucin की तरह प्रोटीन है कि कई तरह के कैंसर 11,12 और भी एनएससी 8 में आक्रमण के साथ संबद्ध किया गया है। PDPN व्यक्त कोशिकाओं के अनुपात में उच्च ग्रेड gliomas 13 में बढ़ जाती है। PDPN भी ग्लियोब्लास्टोमा रोगियों में 14 गरीब अस्तित्व के साथ जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, PDPN स्तन, फेफड़े, पेट कार्सिनोमा 15,16 सहित कई ट्यूमर में घातक प्रगति के एक मार्कर होना दिखाया गया है। PDPN दोनों आक्रामक के साथ ही प्रवासी एनएससी 8 में व्यक्त किया जाता है। ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग करना, PDPN अभिव्यक्ति पर नियंत्रण की तुलना में था, FGF2 केवल TGFβ1 और अकेले BMP4 करने के लिए या संयोजन में उजागर explants में। PDPN अभिव्यक्ति सभी BMP4 और TGFβ1 / BMP4 इलाज explants में पाया गया था। इसके विपरीत, कोई PDPN अकेले FGF2 में या अकेले TGFβ1 (2 टेबल और चित्रा 4) के साथ explants में नियंत्रण explants में मनाया गया। इसके अलावा एक प्रवासी phenotype के साथ कोशिकाओं BMP4 और TGFβ1 / BMP4- में प्रेरित कर रहे थेउजागर explants, जबकि नियंत्रण explants (केवल FGF2) और TGFβ1 अकेले प्रवासी कोशिकाओं (तालिका 1) नहीं दिखा था। प्रवासी कोशिकाओं के अवलोकन के एक कम लागत, सीधे आगे गुणात्मक मूल्यांकन प्रदान करता है।

इसके अलावा, हम BMP4 (तालिका 2) के लिए विकासशील न्यूरल ट्यूब के कई क्षेत्रों के प्रवासी प्रतिक्रिया और EMT प्रेरण का परीक्षण किया। चित्र 1 में संकेत दिया 400 माइक्रोन explants, केंद्रीय कोर्टेक्स, पीछे कोर्टेक्स (लेबल पीछे ध्रुव), MGE और mesencephalon से तैयार थे। Explants सभी BMP4 साथ FGF2 में दो दिनों के लिए FGF2 से अवगत कराया गया, दो दिनों के बाद । प्रवासन एक अग्रणी और अनुगामी किनारे (चित्रा 5 और पूरक चित्रा 2) के साथ फ्लैट प्रवासी कोशिकाओं की उपस्थिति से परिभाषित किया गया था। पीछे कोर्टेक्स से प्रवासी कोशिकाओं का एक मजबूत प्रेरण और MGE और एमईएस से एक मध्यवर्ती प्रतिक्रियाencephalon (तालिका 2) मनाया गया। केंद्रीय कॉर्टेक्स के 146 explants की 145 FGF2 / BMP4 में एक प्रवासी प्रतिक्रिया देखी गई। इस प्रकार, केंद्रीय कोर्टेक्स सभी explants परीक्षण (तालिका 2) के प्रवासी कोशिकाओं की सबसे मजबूत प्रेरण का प्रदर्शन किया। BMP4 की चूक किसी भी प्रवासी प्रतिक्रिया को समाप्त कर दिया (तालिका 1 और 2, और नहीं दिखाया डेटा)।

वृद्धि कारक शक्ति के मात्रात्मक आकलन के लिए, माइग्रेशन दूरी कई विकास के कारकों में संवर्धित explants में मापा गया था। Explants सुसंस्कृत ऊपर के रूप में दो दिनों के लिए FGF2 में, बिना कारकों (नियंत्रण) या एकल या संयुक्त BMP4 और TGFβ1 थे तो FGF2 में अतिरिक्त दो दिनों के लिए। नियंत्रण explants में एक मजबूत प्रसार FGF2 के जवाब में मनाया गया, जैसा कि उम्मीद थी। Explants cortical SVZ से ली गई है और एक बड़ा हिस्सा एनएससी जो FGF2 17 के जवाब में पैदा करने के लिए जाना जाता है के लिए होते हैं। नियंत्रण सीईlls 689 ± 14, TGFβ1 कोशिकाओं 582 ± 49 माइक्रोन (चित्रा 5.) पर पहुंच गया। BMP4-समूह 935 ± 91 माइक्रोन का एक मतलब पलायन दूरी दिखाया। इसकी तुलना में TGFβ1 / BMP4 कोशिकाओं, आगे काफी चले 1,150 ± 23 माइक्रोन (चित्रा 5) के लिए। परिणाम बताते हैं कि BMP4 FGF2 उजागर एनएससी में एक प्रवास उत्प्रेरण है। इस माइग्रेशन आगे TGFβ1 द्वारा बढ़ाया जा सकता है। FGF2, BMP4 और TGFβ1 के संयोजन इसलिए सबसे प्रभावी प्रवास के लिए प्रेरित करने के लिए है। सारांश में, सेल संस्कृति मॉडल प्रणाली दोनों गुणात्मक रूप में अच्छी तरह के रूप में मात्रात्मक प्रवास आकलन अनुमति देता है।

EMT ऐसे Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2, Twist1, ऐसे स्तन कैंसर, पेट के कैंसर, फेफड़ों के कैंसर के रूप में उपकला कैंसर सहित विभिन्न प्रणालियों में Twist2 के रूप में प्रतिलेखन कारक (TFS), से जोड़ा गया है और यह भी दिमाग में 1,18 ट्यूमर। हम जविज्ञापन पहले कि FGF2 दिखाया गया है और BMP2 या BMP4 Snail1 और Snail2 8,9 पैदा कर सकते हैं। ऊपर प्रणाली का उपयोग करते हुए हम अन्य EMT से संबंधित TFS की अभिव्यक्ति के स्तर की जांच की। Twist1 अभिव्यक्ति में कोई परिवर्तन नहीं पता लगाया जा सकता है; Twist1 FGF2 प्रदर्शन के दौरान कम अभिव्यक्ति के स्तर पर होने के साथ (डेटा) नहीं दिखाया। सेल संस्कृति मॉडल में FGF2 / BMP4-प्रदर्शन के दौरान FGF2-प्रदर्शन के दौरान और Twist2 की Zeb1 और Zeb2 की एक अपरेगुलेशन (चित्रा 6) मनाया गया।

एनएससी oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPCs) 8,19,20 की आबादी के लिए योगदान करने के लिए जाना जाता है। सबूत की कई लाइनों से संकेत मिलता है एनएससी और विशेष रूप से OPCs में gliomas 21,22 के लिए मूल के सेल हो सकता है। आगे ऊपर मॉडल को चिह्नित करने के लिए, हम ओपीसी मार्करों की अभिव्यक्ति की जांच की। हमने देखा है कि FGF2 उजागर एनएससी का प्रदर्शन किया Olig2 / Nestin एक के सह-अभिव्यक्तिडी Sox10 90% से अधिक में / Nestin (चित्रा 7)। इस अवलोकन दर्शाता है कि एनएससी हमारी प्रणाली में ओपीसी-सुविधाओं को दिखाने के। दरअसल, OPC-सुविधाओं Zeb'1 और Zeb'2 की upregulation के साथ सहसंबद्ध (आंकड़े 6 और 7)। इन परिणामों का सुझाव है कि FGF2 विस्तार एक ओपीसी पहचान के रूप में, Olig2 और Sox10 द्वारा न्याय, जबकि एक ही समय में शुरू की पहली Zeb आधारित EMT के कदम infers।

आकृति 1
चित्रा 1: मानकीकृत भ्रूण और अग्रमस्तिष्क विच्छेदन एनएससी अलगाव और EMT शामिल करने के लिए। (ए) सीजेरियन सेक्शन के बाद चूहे E14.5 भ्रूण के वाम forelimb। हर अंग सामने अंकों एक काला तीर टिप के साथ चिह्नित है। नोट शुरुआत अंकों गठन E14.5 के लिए विशिष्ट। पतवार हटाने के बाद (बी) चूहा E14.5 भ्रूण। पृष्ठीय diencephalon डब्ल्यू पर हैश (#) नोटhich त्वचा / खोपड़ी anlage को हटाने के शुरू करने के लिए आदर्श है। (सी) त्वचा / खोपड़ी पहले से ही ज्यादातर निकाल दिया जाता है। हटा दिया है और unremoved त्वचा के बीच सीमा दो त्रिकोणीय तीर के साथ चिह्नित है। त्वचा पीछे तीर से पूर्वकाल तीर से पूर्व और पीछे खुली किया जा सकता है। (डी) त्वचा / खोपड़ी अब पूरी तरह से हटा दिया जाता है। यह करने के लिए ध्यान दें मध्यमस्तिष्क hindbrain सीमा (तीर) और कटौती की पायदान सिर्फ दुमदारी, एक नोक के साथ चिह्नित। (ई) telencephalon-diencephalon-mesencephalon (तेल-डि-एमईएस) ब्लॉक भ्रूण के बाकी हिस्सों से हटा दिया जाता है । (एफ) TEL-डि-एमईएस ब्लॉक के सुपीरियर देखें। कपाल ऊपर से छोड़ दिया है। (G) तिर्यक दृश्य। (एच) TEL-डि-एमईएस ब्लॉक के अवर दृश्य। (मैं) mesencephalon और diencephalon का हिस्सा diencephalon के पूर्वकाल भाग के साथ telencephalon से अलग हो रहे हैं। शीर्ष: दोनों telencephalic पुटिकाओं के पूर्वकाल देखें। नीचे: Righmesencephalon के पार्श्व दृश्य टी, शीर्ष cranially चेहरे (जे) के शीर्ष पर:। दोनों diencephalon बिना telencephalic पुटिकाओं। अवर देखें diencephalon का पूरी तरह हटाने वर्णन करने के लिए। Asterisk MGE दर्शाया गया है। नीचे:। Diencephalon के पूर्वकाल हिस्सा (कश्मीर) ऊपर: दोनों गोलार्द्धों interhemispheric विदर में अलग हो रहे हैं। बाईं ओर बाएँ गोलार्द्ध। Asterisk MGE दर्शाया गया है। प्लस पर हस्ताक्षर LGE (एल) मंझला दृश्य के साथ छोड़ दिया गोलार्द्ध की बढ़ाई दर्शाया गया है।। सही सामना करना पड़ता है cranially, दुमदारी छोड़ दीजिए पृष्ठीय, नीचे उदर, क्रमशः है। तारांकित (*) MGE पर स्थित है। धन चिह्न (+) LGE पर स्थित है। सीएच, cortical हेम; फ्लोरिडा, forelimb; Di, diencephalon; एमईएस, mesencephalon; एमएचबी, मध्यमस्तिष्क hindbrain सीमा; एच एल, हिंद अंग; LGE, पार्श्व ganglionic श्रेष्ठता; MGE, औसत दर्जे का ganglionic श्रेष्ठता; ओ, घ्राण बल्ब; पीसी, पीछे कोर्टेक्स; रो, rhombencephalon; दूरभाष, telencephalon। हर छवि पर ग्रिड पतली लाइनों के साथ चार चौराहे के साथ 2 मिमी मोटी लाइनों से पता चलता हर400 माइक्रोन। सभी छवियों पर स्केल पट्टी:। 2 मिमी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: मानकीकृत एनएससी अलगाव और EMT शामिल करने के लिए चमड़ा SVZ विच्छेदन। (ए) को छोड़ दिया गोलार्द्ध के माध्य देखें। मोनरो MGE और LGE के रंध्र के माध्यम से दिखाई, तारांकन और धन चिह्न द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। (बी) घ्राण बल्ब MGE-LGE का सिर्फ cranially निकाल दिया जाता है। (सी) कोर्टेक्स के पीछे ध्रुव सिर्फ CGE पीछे हटा दिया जाता है । (डी) शीर्ष पर: हेम cortical कोर्टेक्स से अलग है। वाम: पीछे ध्रुव। मध्य: जटिल कोर्टेक्स और CGE-LGE-MGE ब्लॉक के मध्य भाग से युक्त। सही करने के लिए MGE और LGE चेहरा। अधिकार: घ्राण Bulख। (ई) CGE-LGE-MGE-कोर्टेक्स ब्लॉक क्षैतिज रूप से फ़्लिप किया जाता है। अब telencephalon की बाहरी सतह माइक्रोस्कोप का सामना करना पड़ रहा है। MGE और LGE अब बाईं ओर का सामना करना पड़ता। (एफ) लाल तानिका उज्ज्वल पारदर्शी कोर्टेक्स से हटा रहे हैं। CGE-MGE-LGE-CTX ब्लॉक अब अगले कदम है। (जी, एच) एक ही प्रक्रिया दाएँ गोलार्द्ध के साथ दोहराया है के लिए वापस क्षैतिज फ़्लिप किया है। केंद्रीय कोर्टेक्स CGE-MGE-LGE ब्लॉक से दूर अलग है। नोट एक मध्यवर्ती कोर्टेक्स क्षेत्र है कि CGE-MGE-LGE ब्लॉक पर छोड़ दिया है, दो तीर के साथ चिह्नित नहीं है। इस मध्यवर्ती कोर्टेक्स मोटाई LGE के व्यास के आधे से मेल खाती है। बिंदीदार रेखा LGE-CGE और कोर्टेक्स के बीच सीमा का प्रतिनिधित्व। (I) केन्द्रीय कोर्टेक्स कम से कम 400 मीटर व्यास की explants में विभाजित है। स्केल पट्टी: 2 मिमी, हर छवि पर ग्रिड चार चौराहों (पतली लाइनों) हर 400 माइक्रोन के साथ 2 मिमी मोटी लाइनों से पता चलता है। तारांकित (*) स्थित है एकटी MGE। धन चिह्न (+) LGE पर स्थित है। लघुरूप: चींटी-CTX, पूर्वकाल प्रांतस्था; CEN-CTX, केंद्रीय कोर्टेक्स; CGE, दुम ganglionic श्रेष्ठता; सीएच, cortical हेम; सीपी, रंजित जाल; CTX, कोर्टेक्स; LGE, पार्श्व ganglionic श्रेष्ठता; पुरुषों, तानिका; MGE, औसत दर्जे का ganglionic श्रेष्ठता; ओ, घ्राण बल्ब; पीसी, पीछे कोर्टेक्स। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Explant सीडिंग 35 मिमी ग्रिड सेल संस्कृति व्यंजन पर 500 माइक्रोन ग्रिड डिश के केंद्र में विस्तार के माध्यम से 1 मिलीलीटर रखें। बूंद ग्रिड रिम (छोटे तीर) द्वारा निहित है। सही 1 मिलीलीटर बूंद के केंद्र में जगह explants। explants ग्रिड के बाहर फैल रहे हैं, तो दपएक धीमी परिपत्र गति में पकवान IRL और explants गड़बडिय़ों बल द्वारा केंद्र के लिए कदम होगा। नोट: explants केवल मात्र आंख (काला तीर सिर) द्वारा दिखाई दे रहे हैं। स्केल पट्टी: 35 मिमी।

चित्रा 4
चित्रा 4:। PDPN बीएमपी 4 की उपस्थिति में प्रेरित किया है Explants प्रोटोकॉल धारा 8 (FGF2 में 2 दिन ही है, तो के रूप में संकेत कारकों के साथ FGF2 के बाद) के अनुसार सुसंस्कृत थे। नियंत्रण (ए) (अकेले FGF2) और TGFβ1 (सी) explants PDPN पॉजिटिव कोशिकाओं (हरा) को शामिल नहीं किया था। नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग रहे हैं। BMP4 (बी) और TGFβ1 / BMP4 (डी) explants PDPN पॉजिटिव कोशिकाओं की एक उच्च अनुपात से पता चला है। explant केंद्र छोड़ दिया, सही पर परिधि में है। नोट: PDPN पॉजिटिव कोशिकाओं ज्यादातर फाउंडेशन थेपरिधि में और explant के केंद्र में नहीं घ। TGFβ1 / BMP4 चापलूसी निहित explants, अधिक PDPN पॉजिटिव कोशिकाओं सविस्तार। (ई) अलग अलग परिस्थितियों में explants में PDPN पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत प्रतिनिधित्व किया है। नियंत्रण और TGFβ1 दोनों BMP4 के साथ स्थितियों से काफी अलग हैं। इसका मतलब है ± SEM के दिखाए जाते हैं। नियंत्रण बनाम TGFβ1 महत्वपूर्ण (एनएस) नहीं है। नियंत्रण और TGFβ1 बनाम BMP4: पी <0.0001 (***)। TGFβ1 बनाम TGFβ1 / BMP4: पी <0.0001 (***)। BMP4 बनाम TGFβ1 + BMP4 महत्वपूर्ण नहीं है: पी = 0.0981 (एन एस)। बनाम TGFβ1 + BMP4 नियंत्रण: पी <0.0001 (***)। सभी छवियों के लिए स्केल बार, (ए) में दिखाया गया है:। 50 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5 चित्रा 5: मात्रात्मक प्रवासन आकलन। बीएमपी 4 और TGF 1 शो additive प्रभाव बीटा सेल प्रवास पर। Explants प्रोटोकॉल अनुभाग 8. (क) नियंत्रण explant। (बी) अकेले BMP4 में Explant के अनुसार सुसंस्कृत थे। (सी) अकेले TGFβ1 में Explant। (डी) में Explant TGFβ1 और BMP4 का संयोजन। (ई) माइक्रोन में प्रवासन की दूरी। 500 माइक्रोन ग्रिड संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया था। नियंत्रण और TGFβ1 explants अन्य शर्तों में से एक बड़ा explant व्यास के साथ एक मजबूत प्रसार दिखा रहे हैं। इसका मतलब है ± SEM के दिखाए जाते हैं। ध्यान दें कि BMP4 और TGFβ1 / BMP4 explants आंशिक रूप से explant कोर बिखर और कोशिकाओं केन्द्रापसारतया इससे दूर बसने। नियंत्रण बनाम TGFβ1 महत्वपूर्ण (एनएस) नहीं है। TGFβ1 बनामBMP4: पी = 0.0353 (*)। बनाम BMP4 नियंत्रण: पी = 0.0351 (*)। BMP4 बनाम TGFβ1 + BMP4: पी = 0.0372 (*)। बनाम TGFβ1 + BMP4 नियंत्रण: पी <0.0001 (***)। स्केल पट्टी: 500 माइक्रोन। explant के केंद्र धन चिह्न (+) द्वारा चिह्नित है। पलायन कोशिकाओं के बाहरी छोर त्रिकोणीय तीर के साथ चिह्नित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6:।। QRT- पीसीआर द्वारा EMT से संबंधित प्रतिलेखन कारक EMT Zeb- और ट्विस्ट-परिवार की कुंजी प्रतिलेखन कारक से जुड़ा हुआ है की upregulation (ए, बी) Zeb'1 और Zeb'2 पहले चरण के दौरान upregulated थे FGF2-जोखिम के। (सी) Twist'2 secon दौरान upregulated थाFGF2 / BMP4-जोखिम के डी चरण। सापेक्ष अभिव्यक्ति QRT- पीसीआर पर आधारित स्तरों को दिखाया जाता है (एन = 2)। mRNA स्तर GAPDH के लिए सामान्यीकृत थे। इसका मतलब है ± SEM के दिखाए जाते हैं। FGF2 अवधि mRNA काटा गया था के 0 दिन में, आगे mRNA FGF2 में चार दिनों के बाद काटा गया था, तब FGF2 में एक दिन के बाद / BMP4 Zeb'1:। नियंत्रण बनाम FGF2, पी = 0.0002 Zeb'2:। नियंत्रण बनाम FGF2, पी = 0.0206 Twist'2:। नियंत्रण बनाम। FGF2 + BMP4, पी = 0.003।

चित्रा 7
चित्रा 7:। एनएससी मॉडल प्रणाली में ओपीसी लक्षण दिखाने एनएससी केंद्रीय कोर्टेक्स से अलग और (धारा 5 के अनुसार) FGF2 की उपस्थिति में एकल कक्षों के रूप में सुसंस्कृत थे। बाद संस्कृति में 8 डी (के बाद पारित होने धारा 7.9 के अनुसार 4 डी) कोशिकाओं छोटे एनएससी कालोनियों का गठन और बी में, Olig2 (लाल के लिए दाग थे, सी), Sox10 (लाल, ई, एफ) और Nestin (में हरे, ए, सी, डी, एफ)। कोशिकाओं के एक उच्च अनुपात सह व्यक्त Olig2 / Nestin (एसी) और Sox10 / Nestin (डीएफ)। (G) Olig2 / Nestin और Sox10 / Nestin के सह अभिव्यक्ति सभी कोशिकाओं के प्रतिशत में दिखाया गया है। इसका मतलब है ± SEM के दिखाए जाते हैं। (ए) में सचित्र के रूप में सभी छवियों के लिए स्केल पट्टी और (डी):। 20 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

शर्त कुल explants (केंद्रीय कोर्टेक्स) प्रवासी प्रतिक्रिया के साथ explants % Podoplanin अभिव्यक्ति के साथ explants %
नियंत्रण 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

तालिका 1। बीएमपी 4 और TGF का संयोजन बीएमपी 4 के साथ 1 बीटा एक मजबूत प्रवासी प्रतिक्रिया उत्पन्न। Explants से केंद्रीय कोर्टेक्स चार दिनों की कुल के लिए विस्तार मध्यम और FGF2 में बनाए रखा गया। पहले के बाददो दिन, explants तो अकेले (नियंत्रण) या FGF2 और इसके अलावा में TGFβ1, BMP4 या संयोजन के रूप में TGFβ1 / BMP4 FGF2 प्राप्त करने के लिए जारी रखा। नियंत्रण और TGFβ1- explants न तो एक प्रवासी प्रतिक्रिया है और न ही PDPN अभिव्यक्ति दिखा था। BMP4 और TGFβ1 / BMP4 सभी explants में दोनों प्रवासी कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से PDPN अभिव्यक्ति प्रेरित किया।

क्षेत्र कुल explants FGF2 / BMP4 में प्रवासी प्रतिक्रिया के साथ explants %
केंद्रीय कोर्टेक्स 146 145 99.3
पोस्टीरियर कोर्टेक्स 52 48 92.0
MGE 56 29 51.7
Mesencephalon 53 28 52.8

तालिका 2। केंद्रीय कॉर्टेक्स FGF के जवाब में सबसे मजबूत प्रवासन से पता चलता 2 / बीएमपी 4 Explants विकासशील चूहे E14.5 न्यूरल ट्यूब के विभिन्न क्षेत्रों से तैयार किए गए थे। केंद्रीय कोर्टेक्स, पीछे कोर्टेक्स, औसत दर्जे का ganglionic श्रेष्ठता (MGE) और mesencephalon। सभी explants FGF2 / BMP4 (धारा 8) में हूबहू संवर्धन किया गया। BMP4 बिना इलाज explants किसी भी प्रवासी प्रतिक्रिया (डेटा) नहीं दिखाया नहीं दिखा था। सभी explants explant प्रति किसी भी प्रवासी कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए जांच की गई। सभी क्षेत्रों के प्रवास के साथ BMP4 साथ FGF2 के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम थे। केंद्रीय कोर्टेक्स, हालांकि, सबसे मजबूत प्रतिक्रिया देखी गई। ध्यान दें कि किसी भी BMP4 प्रवासी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक था। FGF2 में सभ्य explants अकेले प्रसार से पता चला है, लेकिन कोईपलायन; और कोई फ्लैट प्रवासी कोशिकाओं अकेले FGF2 (1 टेबल और पूरक चित्रा 2) में मनाया गया।

Supp चित्रा 1
पूरक चित्रा 1. 400 माइक्रोन ग्रिड फ़ाइल। ग्रिड फ़ाइल मुद्रित किया जा सकता है और इसके बाद के चरणों के दौरान विच्छेदन संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया और के रूप में आंकड़े 1 और 2 में दिखाया गया है। बड़े चौराहों 400 माइक्रोन उप विभाजनों के साथ 2 मिमी प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा के एक पीडीएफ संस्करण को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Supp चित्रा 2
पूरक चित्रा 2। बीएमपी 4 -exposed Explants श्रीओउ फ्लैट प्रवासी प्रकोष्ठों। चित्रा 5 में दिखाया कोशिकाओं की बढ़ाई। (ए) नियंत्रण (FGF2 अकेले) और (सी) TGFβ1-explants छोटे गोल कोशिकाओं के साथ एक मजबूत कोशिका विभाजन का प्रदर्शन किया। (बी) BMP4- और (डी) TGFβ1 / BMP4-explants लगातार फ्लैट लम्बी कोशिकाओं से पता चला है। सभी छवियों के लिए स्केल बार, (ए) में दिखाया गया है:। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1
पूरक चित्रा 3। EMT जांच। E14.5 चूहा केंद्रीय कोर्टेक्स के लिए इन विट्रो मॉडल प्रणाली का सारांश एनएससी युक्त SVZ में शामिल है। केंद्रीय कोर्टेक्स यू भी नहीं हैexplant टुकड़े के रूप में या एकल कक्षों के रूप में sed। Explant टुकड़े मात्रात्मक प्रवास विश्लेषण (धारा 8) के लिए और अधिक सुविधाजनक हैं। एकल कक्षों ऐसे जीन या प्रोटीन विश्लेषण (धारा 9.13) के रूप में, गुणात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं।

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Discussion

इस अध्ययन EMT विश्लेषण के उपयोग एनएससी के लिए एक मानकीकृत प्रणाली में वर्णित किया है (पूरक चित्रा 3 में संक्षेप)। मानकीकरण reproducibility (तालिका 1 और 2) सुनिश्चित करता है। एनएससी, विकासशील कोर्टेक्स से प्राप्त कर रहे एक ऊतक है कि सामान्य रूप से EMT गुजरना नहीं करता है। इस EMT में प्रारंभिक कदम के विश्लेषण के लिए लाभ की है। EMT में प्रारंभिक कदम पर्याप्त रूप से ट्यूमर कोशिकाओं है कि आनुवंशिक परिवर्तन जमा किया है और पहले से ही EMT सुविधाओं को अपनाया हो सकता है में अध्ययन नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, प्राथमिक ट्यूमर के नमूनों EMT को समझने के बाद से सबसे घातक ट्यूमर विषम दोनों आक्रामक और गैर इनवेसिव कोशिकाओं से युक्त कर रहे हैं आदर्श नहीं हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल EMT प्रेरण के प्रारंभिक चरणों का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास मॉडल के साथ EMT शोधकर्ताओं प्रदान करता है। यहां हम बताते हैं कि Zeb और ट्विस्ट परिवार के प्रमुख EMT inducers क्रमिक रूप से सक्रिय कर रहे हैं: पहले चरण Zeb1 और Zeb2 दौरान upregulated रहे हैं दूसरे चरण Twist2 दौरान, (Figurई 6)। इससे पहले, हम दिखाया गया था कि पहले से ही Snail1 BMP4 जोखिम 8 के बाद कई घंटे upregulated है। हम यह भी है कि BMP4-जोखिम पर केंद्रीय कोर्टेक्स से neuroepithelial स्टेम कोशिकाओं mesenchymal कोशिकाओं, चिकनी पेशी actin (SMA) और calponin 9 के लिए सकारात्मक में अंतर दिखाया गया था। परिणामों के ऊपर प्रदर्शित किया कि तीन ज्ञात कुंजी EMT नियामकों की सभी प्रणाली में शामिल कर रहे हैं में पिछले अध्ययन पूरा करें। इसके अलावा, हम ने कहा कि TGFβ1 काफी अकेला FGF2 / BMP4 के प्रवासी प्रभाव बढ़ा सकते हैं। इन परिणामों के EMT प्रेरण दौरान FGF-, BMP- और TGFβ-संकेतन के बीच एक नेटवर्क को इंगित करें।

EMT और प्रवास के विश्लेषण के लिए एनएससी के सफल अलगाव के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: सही ढंग से, भ्रूण उम्र पहचान विकसित भ्रूण के संरचनात्मक स्थलों, ताजा संस्कृति मीडिया की तैयारी और (कम से कम रातोंरात) लेपित प्लेटें, ठीक इत्तला दे दी उपकरणों के उपयोग की पहचान और समर्थकविकासशील कोर्टेक्स के मध्य भाग के विच्छेदन के प्रति cortical explants की स्थापना।

प्रस्तुत तकनीक कुछ संशोधनों के द्वारा बढ़ाया जा सकता है। जैसा कि ऊपर का सुझाव दिया है, कई explants एक ग्रिड के साथ एक एकल पकवान पर चढ़ाया जाता है। कई यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए, तथापि, यह अधिक एक 96 अच्छी तरह से थाली के हर कुएं में एकल explants जगह के लिए सुविधाजनक हो सकता है। इसके अलावा, मॉडल प्रणाली में बड़े पैमाने पर दवाओं की खोज के लिए परिष्कृत किया जा सकता है। जैसा कि ऊपर वर्णित है, PDPN नये अधिग्रहीत प्रवासी सुविधाओं के लिए एक मूल्यवान मार्कर के बाद से PDPN आक्रामक एनएससी 8 में पाया जाता है। एक PDPN संवाददाता EMT शामिल होने से पहले सामान्य एनएससी में ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है। एक परिणाम के रूप में PDPN व्यक्त कोशिकाओं सेल परिवर्तन के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं के बाद से PDPN सामान्य एनएससी (चित्रा 4 और 1 टेबल) में व्यक्त नहीं कर रहा है। कई अतिरिक्त एनएससी मार्कर ऐसे Nestin, कि EMT प्रेरण 8 के बाद खो रहे हैं के रूप में उपलब्ध हैं। एक परिणाम के रूप में,दोनों प्रारंभिक अवस्था, "गैर-प्रवासी / गैर इनवेसिव / Nestin +", और अंतिम राज्य, "प्रवासी / आक्रामक / PDPN +", नजर रखी जा सकती है, जो स्वचालित दवाओं की खोज के लिए सक्षम बनाता है। कई कुओं (जैसे, 96 अच्छी तरह प्लेटें और बड़ा) प्रारंभिक कोशिकाओं के साथ बड़े सेल संस्कृति प्लेटों में वरीयता प्राप्त और स्थापित दवाओं या ज्ञात समारोह के बिना यौगिकों के साथ इलाज किया जा सकता है। इस प्रकार, multiwell प्लेटों स्वचालित रूप से PDPN या अन्य माइग्रेशन / आक्रमण मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए स्कैन किया जा सकता। एक अवरोध स्क्रीन का मुख्य लक्ष्य है, तो PDPN अभिव्यक्ति के लापता होने के कथित रोचक उपन्यास निरोधात्मक यौगिकों की पहचान करने में मदद कर सकते हैं।

एक उपन्यास पदार्थ के परीक्षण के दौरान explants पलायन नहीं दिखा सकते हैं और / या explants दौर और पकवान से अलग हो सकती है। इस स्थिति में, यह मीडिया का केवल आधा (हर दूसरे दिन पूर्ण मीडिया परिवर्तन के बजाय) हर दिन बदलने के लिए सबसे अच्छा है। यह जब ताजा मीडिया के साथ की जगह सतह तनाव से तनाव कम कर देता है।explants प्रारंभिक चढ़ाना के बाद संलग्न नहीं कर सकता है। इस स्थिति में, फ़ाइब्रोनेक्टिन कम से कम 36 घंटे के लिए पकवान सतह के साथ संपर्क में हो गया है। कोटिंग के लिए इस्तेमाल किया fibronectin हौसले के बाद से फ़ाइब्रोनेक्टिन प्लास्टिक के लिए छड़ी कर सकते हैं और अधिक से अधिक 10 मिनट के लिए एक प्लास्टिक की ट्यूब के लिए जोखिम के बिना तैयार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, explants ग्रिड के बाहर बसने सकता है। इस स्थिति में, यह एक धीमी परिपत्र गति में पकवान चक्कर आने की सलाह दी जाती है। यह explants गड़बडिय़ों बल (सीएफ चित्रा 3) द्वारा केंद्र के लिए स्थान बदलने के लिए अनुमति देता है।

मजबूत सबूत है कि gliomas एनएससी और / या OPCs एनएससी 23,24 से निकाली गई से प्राप्त कर रहे है। Ink4 / एआरएफ की कमी चूहों से Sampetrean एट अल पृथक एनएससी और मजबूर एच रास 25 की overexpression: एक परिणाम के रूप में अन्य समूहों एनएससी के आधार पर glioma विकास मॉडल की स्थापना की है।। उच्च ग्रेड घातक ट्यूमर है कि प्रत्यारोपण के बाद 25 प्रसार और आक्रमण से पता चला हुई। mcneill एट अल। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से भी पृथक एनएससी (floxed Rb1, NF1, क्रास, PTEN अकेले और संयोजन में) 26। जीन Cre-वायरस के संक्रमण से निष्क्रिय किया गया और एनएससी 26 प्रत्यारोपित किया गया। ये दोनों मॉडल प्रणाली लाभ यह है कि आक्रमण विवो और संभावित नए विरोधी आक्रमण दवाओं में नजर रखी जा सकती परीक्षण किया जा सकता है। उनका मुख्य नुकसान यह है कि आक्रमण की शुरुआत अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है और यह स्पष्ट नहीं है कि कोशिकाओं glioma-ठेठ EMT आक्रमण (EMT जीन) या केवल स्थानीय प्रवास दिखाने के लिए कि क्या है। इसके अलावा केवल एक ही दवा प्रति पशु परीक्षण किया जा सकता है और विश्लेषण के कई हफ्तों की आवश्यकता है। एक उपन्यास विरोधी आक्रमण दवा की पहचान करने के लिए, दवा कंपनियों या कई हजार यौगिकों के लिए (एक) स्क्रीन पर एक बार और अधिक करने के लिए (ख) परीक्षण और (ग) को दोहराने के लिए अलग-अलग दवा सांद्रता की कोशिश करने की जरूरत है। कई हजार प्रत्यारोपित जानवरों तैयार करते हैं, उन्हें विभिन्न दवाओं के साथ इलाज के लिए और अंत में histochemical या bioluminescence द्वारा प्रभाव के लिए परीक्षणविश्लेषण बहुत संसाधन लेने वाली है। यहाँ EMT से संबंधित आक्रमण के लिए एक उपन्यास एनएससी आधारित मॉडल प्रणाली का वर्णन किया है कि यौगिकों के हजारों की लागत कुशल स्क्रीनिंग की अनुमति देता है।

हालांकि इस मॉडल यौगिकों के उच्च throughput प्रदर्शन के लिए सक्षम बनाता है, यह केवल एक प्राथमिक स्क्रीनिंग मंच है। एक बार ब्याज की यौगिकों इस मॉडल में पहचाने जाते हैं, वे अतिरिक्त सत्यापन की आवश्यकता होगी। में विवो परीक्षण और प्रत्यारोपण मॉडल की पहचान की किसी भी परिसर के लिए सुरक्षा और प्रभावकारिता मापदंडों के लिए जरूरी है कि ऊपर के रूप में महत्वपूर्ण 25,26 बनने का वर्णन किया। मॉडल भी सच है कि यह कृंतक कोशिकाओं पर आधारित है द्वारा सीमित है। हालांकि मॉडल चूहे या माउस EMT जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह स्पष्ट नहीं है कि अगर एक ही तंत्र मानव कोशिकाओं में या मानव रोगी में जगह में हैं। आगे के प्रयोगों की जांच करने के लिए अगर एनएससी इन विट्रो में न केवल आक्रामक, लेकिन यह भी प्रत्यारोपण के बाद कर रहे हैं की जरूरत है। सबूत की कई लाइनों एनएससी की भूमिका का समर्थनglioma गठन में। Tenascin सी, Hey1, स्पार्क, Snail1 और Snail2, FGFR +, BMPR1a, EGFR, PDGFRβ, Sox2, Podoplanin, Gli3 और p75NGFR 8: Glioma प्रगति निम्नलिखित जीन से जोड़ा गया है। इन जीनों के सभी भी आक्रामक mesenchymal कोशिकाओं से 8 सामान्य गैर-आक्रामक एनएससी के परिवर्तन के दौरान व्यक्त कर रहे हैं। समय होने पर, यह एनएससी बाह्य विकास कारकों केवल द्वारा ट्यूमर के रूप में तब्दील किया जा सकता है कि क्या स्पष्ट नहीं है।

ट्यूमर की शुरुआत स्टेम सेल (tics) विभिन्न ट्यूमर से पृथक किया गया है और ट्यूमर प्रगति 27 समझने के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। Tics कर रहे हैं, हालांकि, अच्छी तरह से EMT विश्लेषण के लिए अनुकूल नहीं है, क्योंकि पहले से ही EMT tics 27 में होती थी। जल्दी और भी EMT प्रेरण के देर से कदम समझने के लिए, एक प्राथमिक गैर नवोत्पादित सेल की आबादी की जरूरत है। आदर्श रूप में इस आबादी पहली जगह में EMT गुजरना करने के लिए मतलब नहीं था। यह पहले से दिखाया गया था कि भ्रूण एनएससी इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त उम्मीदवार थे9,28। अर्थात्, प्रवास और आक्रमण FGF2 और BMP4 9,28 द्वारा एनएससी में प्रेरित किया जा सकता है। FGF2 / BMP4 प्रेरित प्रवास एकल EMT से संबंधित जीन से संबंधित था, हालांकि, पूरा सबूत के बाद से प्रमुख EMT परिवारों Zeb और ट्विस्ट 8 जांच नहीं की गई थी की कमी थी। शो से ऊपर परिणाम है कि चार कारकों की एक विशिष्ट संयोजन, FGF2, BMP4, TGFβ1 और इंसुलिन एक बहुत मजबूत है और पूरा EMT प्रेरण कारण, इससे पहले नहीं देखा गया। वर्तमान अध्ययन दर्शाता है कि Zeb- और ट्विस्ट-परिवारों की कुंजी EMT जीन भी upregulated रहे हैं। यह अध्ययन इसलिए पहला सबूत वहाँ एकल जीन के चुनिंदा अपरेगुलेशन नहीं है कि प्रदान करता है, लेकिन परिणाम बताते हैं कि सभी प्रमुख EMT परिवारों प्रस्तावित सेल संस्कृति प्रणाली में सक्रिय हैं।

EMT भी इस तरह के फेफड़े, स्तन, पेट और पेट के कैंसर 29 के रूप में मस्तिष्क के बाहर उपकला कैंसर, में देखा गया है। EMT अध्ययन करने के लिए कई मॉडल इन ट्यूमर 30-32 के लिए उपयोग में हैंहै, जो आने बहरहाल, महत्वपूर्ण सीमाओं के साथ: (क) में तब्दील ट्यूमर कोशिका कई आनुवंशिक और epigenetic बदलता 33 ले जाने लाइनों का उपयोग; जल्दी कैंसर चरणों के लिए EMT के अवरोधकों की पहचान करने के लिए, देर चरण कैंसर की कोशिकाओं को अपर्याप्त हैं; (ख) सीरम निर्भर संस्कृतियों जो विभिन्न अपरिभाषित वृद्धि कारक होते हैं; इस महत्वपूर्ण कारकों की पहचान बहुत मुश्किल बना देता है। इसके अलावा, प्रयोग reproducibility बिगड़ा बाद सीरम गुणवत्ता बैच के बैच से भिन्न होता है; (ग) सीरम अवरोधकों और enzymatic गतिविधियों संभवतः संभावित रूप से उपयोगी बहिर्जात यौगिकों निष्क्रिय होता है; (घ) सेल passaging के लिए एंजाइमों कि कोशिका की सतह अणुओं नीचा की ज़रूरत नहीं है; (ई) शारीरिक EMT बढ़ावा देने के लिए EMT एगोनिस्ट की पहचान करने के लिए, सामान्य कोशिकाओं प्रेरण का परीक्षण करने की जरूरत है। ट्यूमर कोशिका मॉडल पदार्थों है कि सामान्य स्टेम कोशिकाओं में पुनर्जनन को बढ़ावा मिल अपर्याप्त हैं।

प्रवासन भी इस तरह के घाव भरने और Regene के रूप में सामान्य प्रक्रियाओं, के लिए आवश्यक हैघायल मस्तिष्क 18 का राशन। घाव मस्तिष्क की चोट और स्ट्रोक के बाद, एनएससी घाव साइट को विस्थापित करने के उत्थान 4,34 में भाग लेने के लिए आवश्यक हैं। वर्तमान प्रणाली को भी पदार्थ है कि प्रवास और आक्रमण को बढ़ावा देने की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऊपर दिखाया गया है, प्रवास BMP4 उपचार के साथ शुरुआत पर प्रेरित किया है। कोशिकाओं BMPs करने के लिए, लेकिन इसके बजाय उपन्यास यौगिकों को उजागर नहीं कर रहे हैं, तो इन बीएमपी कार्रवाई की है जो उपन्यास बीएमपी एगोनिस्ट की पहचान करने में मदद मिलेगी के लिए विकल्प हो सकता है। एक संवाददाता प्रणाली है कि PDPN अभिव्यक्ति को इंगित करता है के साथ, उपन्यास पदार्थों के लिए बड़े पैमाने पर परीक्षण संभव हो जाता है; यदि एक उपन्यास यौगिक BMPs के लिए स्थानापन्न कर सकते हैं, PDPN व्यक्त कोशिकाओं स्वचालित रूप से पहचाना जा सकता है।

प्रस्तावित प्रणाली को भी सेल संकेत बातचीत की जांच करने के लिए उपयोगी है। हमारे परिणाम बताते हैं कि प्रवास पर बीएमपी प्रभाव TGFβ1 सक्रियण द्वारा बढ़ाया जा सकता है। परिणाम BMP- और TGFβ- के बीच एक additive बातचीत उजागरसंकेत है। हालांकि, इस तरह Notch-, Wnt- के रूप में अतिरिक्त संकेत दे रास्ते, या EGFR- / MAPK- और अन्य cascades संकेत शामिल हो सकता है। इसलिए, बीएमपी / TGFβ-संबंधों और अन्य रास्ते को पार बात पर आगे की जांच की जरूरत है। इसके अलावा, उत्तरदायी केंद्रीय कोर्टेक्स आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों, जो EMT ड्राइविंग अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं से अलग किया जा सकता है। सारांश में, EMT मॉडल प्रणाली यहाँ वर्णित स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और उत्थान के क्षेत्र में उपयोगी है, साथ ही कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में हो सकता है। यह बाधा या प्रवास और आक्रमण को बढ़ाने पदार्थों के लिए दवा पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Acknowledgments

अध्ययन एमएचएस और एजी (एसएनएफ IZLIZ3_157230) के लिए एक अनुदान द्वारा बेसल विज्ञान फाउंडेशन के विश्वविद्यालय और स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया। हम धन्यवाद: उदारता बुनियादी सुविधाएं उपलब्ध कराने के लिए डॉ तानिया Rinaldi Burkat; चर्चाओं और टिप्पणियों के लिए Bettler समूह के सभी सदस्यों को। हम पूर्ण HD MC170 वीडियो कैमरा के पेशेवर और सक्षम स्थापना के लिए गेरहार्ड Dorne (Leica माइक्रोसिस्टम्स, स्विट्जरलैंड) (Leica माइक्रोसिस्टम्स, स्विट्जरलैंड) धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 114 तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं mesenchymal संक्रमण के लिए उपकला प्रवास, glioma कैंसर आक्रमण Snail1 भ्रूण गोजातीय सीरम मुक्त FGF2 BMP4 TGFβ
EMT जांच के लिए एक Enzyme- और सीरम मुक्त तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति मॉडल ड्रग डिस्कवरी के लिए अनुकूल
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