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Developmental Biology

Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

Epiteliale di transizione mesenchimale (EMT) descrive il processo dell'epitelio transdifferentiating in mesenchima. EMT è un processo fondamentale durante lo sviluppo embrionale, che comunemente si verifica nel glioblastoma, la più frequente tumore maligno al cervello. EMT è stato osservato anche in più carcinomi di fuori del cervello, tra cui il cancro al seno, il cancro del polmone, cancro del colon, cancro gastrico. EMT è legata in posizione centrale per malignità, promuovendo la migrazione, l'invasione e la formazione di metastasi. I meccanismi di EMT induzione non sono pienamente compresi. Qui si descrive un sistema in vitro per l'isolamento standardizzato di cellule corticali neurali staminali (NSC) e la successiva EMT-induzione. Questo sistema fornisce la flessibilità necessaria per utilizzare sia singole cellule o espianto. In questo sistema, ratto o topo embrionali NSC proencefalo sono coltivate in un mezzo definito, privo di siero e enzimi. Le NSC espresso Olig2 e Sox10, due fattori di trascrizione osservata in oligodendroccellule precursori yte (OPC). Utilizzando questo sistema, le interazioni tra FGF-, BMP- e TGFβ di segnalazione che coinvolge Zeb1, Zeb2, e Twist2 sono stati osservati in cui TGFβ-attivazione significativamente migliorata la migrazione delle cellule, suggerendo un sinergico / TGFβ-interazione BMP-. I risultati indicano una rete di FGF-, BMP- e TGFβ-segnalazione di essere coinvolti in induzione e mantenimento EMT. Questo sistema modello è rilevante per indagare EMT in vitro. E 'conveniente e mostra elevata riproducibilità. Permette anche per il confronto delle mescole diverse rispetto alle loro risposte migrazione (misurazione quantitativa di distanza), e high-throughput screening di composti di inibire o migliorare EMT (misurazione qualitativa). Il modello è quindi adatto per testare le librerie di droga per le sostanze che interessano EMT.

Introduction

Durante diversi stadi di sviluppo embrionale, le cellule epiteliali perdono la loro forte aderenza tra loro (ad esempio, giunzioni strette) e acquisiscono un fenotipo migratorio in un processo chiamato la transizione epitelio mesenchimale (EMT) 1. EMT è necessaria per la formazione di tipi cellulari aggiuntivi, come le cellule della cresta neurale mesenchimali, una popolazione che segrega dal neuroepitelio 2. EMT non è essenziale solo durante le fasi embrionali, ma richiesto anche nelle fasi successive della vita adulta a mantenere processi fisiologici nell'organismo adulto, come ad esempio la guarigione della ferita 3 e del sistema nervoso centrale di rigenerazione (SNC) in lesioni demielinizzanti 4.

Tumori epiteliali sono noti per riattivare EMT come un passo di iniziazione per la migrazione, invasione e metastasi, in ultima analisi, che porta alla progressione del cancro 1,3. EMT è infatti legata in posizione centrale ad una forte migrazione 1,3. I passi cellulari di conditioning, avviando, in fase e il mantenimento di EMT non sono pienamente compresi e hanno bisogno di ulteriori indagini.

Qui, viene presentato un standardizzato in vitro sistema modello EMT sulla base di NSC, con fattori di crescita definiti e media (senza siero e senza l'utilizzo di enzimi). Questo sistema modello è rilevante per gli scienziati che lavorano su EMT. Le famiglie di proteine ​​Lumaca, Zeb e Twist hanno dimostrato di essere fondamentale per EMT, sia in fase di sviluppo e di malattia 1. La lumaca, Zeb e Twist famiglie sono anche coinvolti nel sistema presentato. Il sistema è basato su una specifica regione del proencefalo che normalmente non subisce EMT fornire un vantaggio particolare per lo studio di eventi iniziali durante EMT induzione.

Il sistema modello potrebbe potenzialmente essere applicato a studiare EMT in epiteli all'esterno del SNC, poiché induttori EMT chiave, come la chiocciola, Zeb e proteine ​​torsione, si riscontrano anche durante EMT in sistemi tessuto fuori del SNC. Questo modello sistema permette l'isolamento standardizzato di NSC dalla corteccia in via di sviluppo per studiare le caratteristiche di cellule staminali in generale e, in particolare, EMT. Utilizzando questo sistema, abbiamo isolato le cellule staminali neurali, EMT indotta e studiato la successiva migrazione sotto l'effetto di FGF2 e BMP4. Abbiamo osservato che interagisce FGF- e BMP di segnalazione con TGFβ di segnalazione per promuovere la migrazione delle cellule, convalidando così il modello di sistema.

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Protocol

Tutte le procedure sugli animali hanno seguito la 'Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio "(pubblicazione NIH, 8 ° edizione, 2011) e sono stati approvati dal Comitato per il benessere degli animali di Basilea (Linee direttive per la cura e l'uso di animali). Con queste linee guida il protocollo animale è considerato di "gravità grado più basso degli animali".

1. Preparazione del mezzo Expansion

Nota: Il lavoro in condizioni asettiche come standard per coltura di tessuti.

  1. Dai due provette da 15 ml, e aggiungere 5 ml di DMEM / F12 senza L-glutammina (1: 1) da un flacone 500 ml medio in ciascuna delle due provette da 15 ml. Per il primo tubo da 15 ml, aggiungere 50 mg umano apo-transferrina, 50 ml di putrescina 1 m stock (0,1 mm concentrazione finale) e 30 ml di selenio di sodio 500 mM magazzino (concentrazione finale 30 Nm).
    1. Filtrare attraverso un filtro siringa da 0,2 micron nel flacone DMEM / F12 originale.
  2. Per il secondo tubo 15 ml, aggiungere 12,5 mg di insulina. Aggiungere6 - 9 gocce di 1 M NaOH. Vortex per sciogliere completamente l'insulina. Filtrare attraverso un filtro siringa da 0,2 micron nel flacone DMEM / F12 originale.
    Nota: NaOH è tossico e corrosivo. Utilizzare guanti di protezione, cappotto, e occhiali di protezione.
  3. Aggiungere 5 ml di penicillina (10.000 unità / ml) / streptomicina (10.000 mg / ml) / amfotericina B (25 mg / ml) al / F12 bottiglia DMEM.
  4. Aggiungere 5 ml di 200 mm L-glutammina magazzino appena scongelati o oligopeptidi contenenti glutammina (200 mm L-alanil-L-glutammina dipeptide) per il medio / F12 bottiglia DMEM.
  5. Agitare bene. Preparare 50 ml aliquote.
    Nota: media espansione può essere conservato per almeno 2 settimane a 4 ° C. tubi aliquotati mostra meno variazioni di pH rispetto alla media conservato in bottiglie da 500 ml.

2. Preparazione di Passaging Media

  1. Per 1 L Ca 2 + - e Mg 2 + -free HBSS media, aggiungere 990,85 mg di glucosio (5 mm concentrazione finale) e 840,10 mg NaHCO 3 Nota: media Passaging può essere conservato per almeno 4 settimane a 4 ° C.

3. Preparazione di fattori di crescita

  1. Preparare sterile 1x PBS con 1% BSA (PBS-BSA) da solo o con acido cloridrico (HCl) a 4 mM (PBS-BSA-HCl).
    Attenzione: HCl è corrosivo e tossico e richiede speciali misure di sicurezza (cappotti, occhiali, guanti, cappuccio).
  2. Sciogliere 10 mg / ml umana ricombinante Fibroblast Growth Factor 2 (rhFGF2) in PBS-BSA (10 ng / concentrazione finale ml), 10 mg / ml ricombinante proteina morfogenetica umana 4 (rhBMP4) in PBS-BSA (10 ng / ml finale concentrazione), e 20 mg Factor / ml ricombinante umano di crescita trasformante ß 1 (rhTGFβ1) in PBS-BSA-HCl (40 ng / ml concentrazione finale).
    1. Non filtrare sterilizzare. Preparare aliquote.
      Nota: crescita aliquote fattore può essere conservato a-20 ° C per almeno 2 anni.

4. Rivestimento di colture cellulari Piatti

  1. Sciogliere 1.875 mg Poli-L-ornitina (OLP) in 500 ml di acqua distillata H 2 O per preparare un PLO magazzino 250X. Filtro sterilizzare usando un filtro a siringa da 0,2 micron e fare 2 ml.
    Nota: Queste aliquote possono essere conservati a -20 ° C per almeno 2 anni.
  2. Sciogliere 1 mg fibronectina bovina in 1 ml sterile distillata H 2 O per preparare 1,000x fibronectina magazzino. Non vortice in quanto ciò potrebbe coagulare la proteina appiccicosa. Agitare delicatamente a mano per 10 min.
    1. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione occasionale. Verificare la completa dissoluzione. Riscaldare la soluzione a meno di 37 ° C per la dissoluzione completa della fibronectina. Non filtrare-sterilizzare.
      Nota: La soluzione può essere conservato a 4 ° C per 6 mesi.
  3. Usare piatti al plasma pre-trattati con plastica di coltura cellulare (100 mm o altre misure, come richiesto perl'esperimento). Per valutare la migrazione, utilizzare 35 mm piatti con griglia di 500 micron. Incubare piatti notte con 2 ml 1x PLO per 12 ore a 37 ° C in CO 2 coltura tissutale incubatore 5%. Lavare due volte con 2 ml di PBS 1X.
  4. Aggiungere 2 ml 1x fibronectina (/ ml concentrazione finale 1 mg) e incubare piatti per un minimo di 12 ore a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Rimuovere fibronectina poco prima placcatura le cellule.
    Nota: i piatti fibronectina rivestite possono essere conservati per almeno 2 settimane a 37 ° C.

5. standardizzata dissezione e preparazione del subventricolare zona corticale (SVZ)

  1. Ottenere ratto giorno embrionale 14,5 (E14.5, Sprague-Dawley) e E13.5 il mouse (C57BL / 6) embrioni di temporizzato-accoppiamento. Mate animali dalle 18:00 alle 08:00 del mattino successivo. Mezzogiorno dopo il giorno di accoppiamento è considerato E0.5.
  2. Anestetizzare l'animale in stato di gravidanza con il 5% isoflurano e il flusso di ossigeno 0,8 l / min. Controllare la risposta per compressione zampa con diss taglienteforcipe ezione. Decapitare l'animale. Evitare di CO 2 asfissia come CO 2 colpisce staminali recupero delle cellule.
  3. Recupero di embrioni da taglio cesareo.
    1. Mettere animale in posizione supina e disinfettare pelliccia con il 70% di etanolo. Utilizzare pinze chirurgiche e forbici per rendere a forma di V incisione cutanea di circa 8 cm nel basso addome sopra l'utero. Incidere solo la pelle con pelliccia, mantenendo intatte le pareti muscolari.
    2. Utilizzare pinze freschi e forbici per incidere i muscoli e la parete muscolare addominale per entrare peritoneo.
    3. Identificare l'utero nel peritoneo posteriore inferiore. Rimuovere l'utero con netta separazione dai tessuti circostanti.
    4. Lavare l'utero con embrioni con sterili 1x PBS e posto in 1x PBS ghiacciato.
    5. Usare le forbici a punta fine per aprire le pareti uterine a rilasciare embrioni da embrioni al microscopio dissezione (ingrandimento 3x, Figura 1B). Utilizzare un paio di pinze per rimuovere gli scafi embrionali (
    6. Verificare la corretta fase di sviluppo per l'Atlante della Sviluppo Rat Sistema Nervoso 5. La dimensione embrione corretta è mostrata in Figura 1B.
    7. Verificare la corretta età ulteriormente la presenza di iniziare la formazione di cifre nella zampa anteriore del ratto (FL), come illustrato in Figura 1A.
      Nota: L'arto posteriore (HL) non ha ancora mostrare separazione cifre (Figura 1B).
  4. Per la dissezione, trasferire gli embrioni ai piatti non rivestiti di Petri riempite con ghiaccio-freddo 1x PBS. Eseguire la dissezione al microscopio dissezione stereo (3X a 20X di ingrandimento) utilizzando una pinza sottile autoclave.
    Nota: Le piastre Petri impediscono fissaggio del tessuto alla superficie piatto come può accadere con piatti al plasma rivestite di coltura cellulare. aghi filo di tungsteno affilati o simili sono anche utili per alcune fasi di dissezione.
  5. Togliere la pelle della testa e il cranio a partire dalla intersection del telencefalo sviluppo (TEL) e diencefalo (DI) (Figura 1B) tirando contemporaneamente anteriormente e posteriormente con due pinze per accedere al tubo neurale sviluppo (Figura 1C).
  6. Identificare il mesencefalo-rombencefalo-confine (MHB, nero freccia testa nella figura 1B-D), che separa il mesencefalo (MES) dal rhombencephalon. Tagliare il rhombencephalon appena pari o inferiore al MHB (Figura 1D, freccia triangolare).
    Nota: Lo spazio sottocutaneo supplementare alla MHB facilita la rimozione della pelle senza danneggiare il tubo neurale.
  7. Recidere il collegamento tra il telencefalo / diencefalo alla base del cranio con scheletro facciale (Figura 1E). Ciò si traduce in un blocco contenente telencefalo, diencefalo e mesencefalo (Tel-DI-MES) (figure 1F-H).
  8. Trasferire il blocco TEL-DI-MES in media espansione sul ghiaccio. Keep it completely coperto di media espansione in un piatto non rivestito di Petri. Tenere il blocco al mesencefalo con un paio di pinze per evitare di toccare il telencefalo che contiene la SVZ corticale con NSC.
  9. Ripetere i passaggi 5,5-5,8 con tutti gli embrioni (Figura 1F-H).
  10. Trasferire una TEL-di-MES blocco nella fresca ghiacciata PBS 1x. Tagliare lungo la linea tratteggiata nel mesencefalo anteriore (Figura 1F-H), separando mesencefalo dal diencefalo, come mostrato nella Figura 1I.
  11. Separare il DI dalla TEL tagliando lungo le linee tratteggiate in Figura 1F. Vedere telencefalo isolato nella figura 1J.
  12. Dividere i due emisferi telencefalici, tagliando lungo la linea tratteggiata in figura 1J. Ciò comporta due emisferi separati, come illustrato nella figura 1K.
    Nota: L'emisfero sinistro è ingrandito in Figura 1L.
  13. Identificare la banda medialeeminenze lionic (MGE, figura 2a; *) e eminenze gangliari laterali (LGE, figura 2a; +) visibile attraverso il futuro Forame interventriculare.
    1. Utilizzando pinze o aghi, sezionare lungo una linea retta nel punto di intersezione tra la MGE e LGE e la corteccia anteriore (ant-CTX, figura 2B). Tagliare una linea retta attraverso la corteccia, ippocampo (anca) e plesso coroideo (CP). Questo separa la corteccia anteriore compreso il bulbo olfattivo (ob) dalle eminenze gangliari (GE, Figure 2B, C).
  14. Tagliare una seconda retta all'intersezione della caudale eminenza gangliare (CGE, Figura 2C, D) e la corteccia posteriore (Figura 2C), nuovo taglio attraverso la corteccia, ippocampo e del plesso coroide.
  15. Appiattire il telencefalo. Rimuovere completamente il polo posteriore e il bulbo olfattivo (Figura 2D). Identificarel'orlo corticale che contiene l'ippocampo e il plesso coroide (Figura 2C), come definito in precedenza 6,7.
    Nota: L'ippocampo ha un neuroepitelio più sottile della corteccia. Il CP contiene vasi rossi.
    1. Separare l'orlo corticale dalla corteccia, lasciando la dimensione della corteccia identica alla dimensione delle eminenze gangliari (Figura 2D). Ciò si traduce in un blocco della corteccia (tessuto bersaglio) e eminenze gangliari (GE, Figura 2D).
  16. Vibrazione blocco cortex-GE con il ventricolo laterale (interno) alla superficie del disco.
    Nota: La superficie esterna del emisfero affrontare sperimentatore (figura 2E). Sulla superficie esterna sono le meningi vasi contenenti sangue (Figura 2E).
    1. Pin il GE alla superficie piatto con la mano sinistra e sbucciare le meningi con un paio di pinze nella mano destra (dominante) (Figura 2F Nota: Questo è il passo tecnicamente più impegnativa perché le meningi aderiscono fortemente alla corteccia. La separazione delle meningi dalla corteccia è facilitato dal taglio di una linea completamente diritta (non frastagliate) in passi 5.13.1 e 5.14.
  17. Ripetere i passaggi 5,12-5,16 per l'altro emisfero e tutti gli embrioni. Tagliare la corteccia lungo la LGE in una distanza di metà del diametro principale del LGE (figura 2G, 2H). La corteccia sezionato estende su una superficie di 1,2 mm x 2,4 millimetri (figura 2H) e comprende il / strato germinale SVZ con le NSC.

6. Preparazione delle Culture Explant

  1. Tagliare la corteccia in espianti di meno di 400 micron di diametro (Figura 2I). Utilizzare una griglia micron 400 (figura supplementare 1) posizionato al di sotto della dissezione Petri di rinvio (figura 2H e 2I). Trasferire tutti espianti in un piatto fresco di Petri con ghiaccio-comedia espansione ld.
  2. Rimuovere la fibronectina da un piatto di coltura di tessuti (passo 4.4). Lasciare asciugare. Aggiungere 1 ml di terreno di espansione fredda al centro della piastra da 35 mm dimensione griglia da 10 mm x 10 mm (figura 3). Lasciar formare una goccia sferica (figura 3).
  3. Inserire fino a 8 espianti al centro della goccia. Gli espianti devono trovarsi in posizione sulla griglia di partenza con la distanza di almeno 3 mm tra di loro per l'analisi della migrazione (vedere la sezione 8).
  4. Incubare il piatto per circa 1 ora in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 21% O 2, 5% CO 2) di attacco degli espianti. Lasciare le espianti di stabilirsi e di allegare alla superficie fibronectina rivestite. Non agitare il piatto, dato che gli espianti possono staccare e spostare fuori dal centro della griglia ottimale.
  5. Dopo 1 ora di incubazione (37 ° C, 21% O 2, 5% CO 2), riempire il piatto per un volume totale di 2 ml di mezzo di espansione più la crescita fattori o sostanze di interesse per testare e incubare.
    Nota: Né la digestione enzimatica, né siero o centrifugazione sono necessari per la preparazione espianto. Questo è ottimale per l'integrità delle cellule.

7. Preparazione del NSC Cultura Single Cell

  1. Warm up espansione e medie passaging a 37 ° C.
  2. Trasferire i pezzi corteccia sezionati (dal punto 5.17) in un tubo da 15 ml con il mezzo di espansione fredda (tubo A). Centrifugare i pezzi corteccia per 5 min a 1200 x g. Aspirare il surnatante. Aggiungere media espansione pre-riscaldato a 200 microlitri per risospendere i pezzi di corteccia.
  3. Aggiungere 700 ml di media passaging pre-riscaldato per il tubo da 15 ml con una punta P 1.000 (tubo A). Risospendere delicatamente il pellet. Posizionare la punta sul fondo della provetta 15 ml. Delicatamente e lentamente dissociare i pezzi di tessuto, aspirando tre volte con la punta P 1.000.
    Nota: Passaging media promuove separazione cellulare ed è necessario per evitare l'uso di enzimi.
  4. Lasciare che il tubo a sedere per 30 a 60 secondi per i più grandi (più pesanti) pezzi indissociate per risolvere in fondo. Singole cellule dissociate rimarranno nel surnatante. Trasferire circa 700 ml di surnatante in una provetta da 15 ml fresco (provetta B).
  5. Ripetere i punti 7.3 e 7.4 di dissociare i pezzi più grandi.
  6. Ripetere le fasi 7.3 e 7.4 una seconda volta per dissociare i pezzi più grandi. Trasferire tutto surnatante al tubo 15 ml fresco (provetta B).
  7. Aggiungere media espansione ad un volume totale di 5 ml. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Valutare le cellule morte dalla colorazione trypan-blu.
    Nota: I piccoli NSC tollerano i passi 7,2 a 7,6 meglio di celle più grandi. Da 10 embrioni aspettare circa 4 x 10 6 celle con 10% di cellule morte.
  8. Per l'espansione di NSC, piastra 1,5 x 10 6 cellule per 10 cm fibronectina rivestite piatto di coltura tissutale in un volume di 8 ml di mezzo di espansione. Per l'espansione di serie, aggiungere 8 ml di 1,000x rhFGF2 magazzino. Aggiungere 8 ml rhFGF2 ogni giorno e mi cambiadia ogni altro giorno.
    Nota: La corteccia in questa fase di sviluppo contiene una maggioranza di NSC e solo una minoranza di cellule differenziate. Le cellule differenziate di minoranza non rispondono al rhFGF2-trattamento e muoiono durante la cultura di espansione.
  9. Passaggio ampliato NSC al 60% di confluenza.
    1. Per NSC passaggio, rimuovere media espansione. Lavare le cellule rapidamente tre volte con 5 ml di media passaging. Attendere 2-4 min. Senza Ca 2 + e Mg 2 + cellule lentamente staccarsi dalla superficie, arrotondamento. Verificare il distacco delle cellule al microscopio fase. Attendere qualche minuto, se necessario, fino a quando si osserva il distacco visivo dalla superficie.
      Nota: le celle singole saranno completamente staccare, ma la maggior parte delle cellule sarà ancora aderire alla superficie piatto. La durata necessaria per il distacco dipende dalla durata del rivestimento fibronectina. Un rivestimento fibronectina breve (12 ore o meno) si traduce in più veloce il distacco delle cellule. Per gli esperimenti più lunghi (>; Si raccomanda 1 settimana) rivestimento fibronectina di oltre 24 ore.
  10. Utilizzare una pipetta 10 ml di staccare delicatamente le cellule dalla superficie. Raccogliere il medium passaging 5 ml con le cellule e trasferirlo in una nuova provetta 15 ml. Ripetere con altri 5 ml di terreno passaging.
  11. Dissociare le cellule nel tubo 15 ml pipettando su e giù tre volte, ponendo la pipetta 10 ml al fondo della provetta. Spin la provetta per 15 min a 1200 xga temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di mezzo di espansione. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Utilizzare trypan blu per valutare le cellule morte.
    Nota: Dopo l'espansione al 60% di confluenza, si aspettano 4 - 5 x 10 6 cellule con una conta di cellule morte intorno al 10%.
  12. Piastra 8 x 10 5 cellule per 10 centimetri piatto per ulteriori passaggi.

8. Valutazione migrazione

  1. Per la valutazione della migrazione, isolare espianti secondo la sezione 5. Seed gli espianti in35 piatti mm griglia. Un'ora dopo la placcatura, aggiungere FGF2 (rhFGF2). Porre le capsule in un incubatore a 37 ° per 2 giorni.
    Nota: Per il fissaggio ottimale espianto, evitare di spostare i piatti.
  2. Rimuovere media da 1.000 ml punta. Aggiungere 2 ml di terreno di espansione da 1.000 punta microlitri partendo dal cerchio interno (Figura 3). Questo riduce la tensione superficiale su espianti.
  3. Aggiungere fattori di crescita da soli o in combinazione come richiesto per esperimento. Utilizzare FGF2 BMP4 / TGFβ1 controllo / positivo. Nota: In questo esperimento, 2 microlitri FGF2 a piatto 35 mm, 2 microlitri BMP4 e 4 microlitri TGFβ1 stati aggiunti solo e in combinazione (figura 5).
    1. Aggiungere fattori aggiuntivi e / o sostanze verificabili. Mantenere i piatti ancora intatto per 2 giorni a 37 ° C.
  4. Scattare fotografie di espianti su un microscopio invertito.
    Nota: espianti viventi producono immagini a contrasto di fase migliori rispetto cellule fissate. Entrambi possono essere utilizzati.
  5. per la migrazionela valutazione, utilizzare un software di grafica che permette di misurare in pixel (ad esempio, Fiji 8).
  6. Misurare la griglia piatto di 500 micron distanza in pixel e usarlo come riferimento interno.
  7. Definire il centro del espianto come punto di inizio della migrazione. Misurare la distanza tra il centro del trapianto e il gruppo più esterno di 10 celle.
    Nota: Tutte le cellule migrano centrifuga dalla espianto. Essi formano spontaneamente un foglio alla periferia nelle circostanze testati (Figura 5).

9. La valutazione Invasion

  1. Preparare coltura dei tessuti piastre da 24 pozzetti fibronectina a polvere secondo protocollo Sezione 4.
  2. Mettere 300 ml di media espansione caldo nel pozzo superiore delle camere di invasione delle cellule. Incubare le camere per 30 minuti a 37 ° C e 5% CO 2.
  3. Rimuovere il supporto di espansione dal pozzo superiore e posizionare la camera di Boyden nel rivestito 24-pozzetti.
  4. Aggiungere 500 l di media espansione caldo con 0,5 ml di rhFGF2 e 0,5 ml rhBMP4 verso il basso pure.
  5. NSC passaggio e contano come descritto nella Sezione 7. Passaggi da 1 a 4 sono adatti.
  6. Piastra 5 x 10 5 cellule in un volume di 300 ml di media espansione caldo con 0,3 ml di rhFGF2 e 0,3 ml di rhBMP4 nel pozzo superiore della camera di Boyden.
  7. Cultura le NSC teste di serie per 24 ore.
  8. Aggiungere fattori aggiuntivi e / o sostanze verificabili alla camera e coltivare le cellule per un altro 48 ore.
    Nota: Se le cellule sono invasivi, passeranno dalla parte superiore bene attraverso lo strato di membrana basale in fondo bene. cellule invasive si aggrappano al fondo della camera di Boyden.
  9. Seguire il protocollo fornito dal produttore. Usare tamponi di cotone (inclusi nel kit di test di invasione) per rimuovere le cellule non invasive nel pozzo in alto con la pulizia due volte.
  10. Rimuovere il supporto dai pozzetti e aggiungere media espansione con 500 microlitriuna macchia membrana plasmatica di cellule viventi e con il colorante nucleare DAPI ai pozzetti.
  11. Incubare per 10 minuti a 37 ° C e 5% CO 2.
    Nota: I coloranti integrerà nella membrana e il nucleo delle cellule invasive, rispettivamente, per la visualizzazione ottimale 8. Opzione: Omettere colorante membrana plasmatica se multicolore immunocitochimica è prevista.
  12. Rimuovere il mezzo con i coloranti e lavare due volte con media espansione. Visualizzare e contare le cellule invasive con un microscopio a fluorescenza invertito, come dimostrato in precedenza 8.
    Nota: Alcune cellule invasive potrebbero essere staccata dal fondo della camera e sono scesi alla superficie ben sotto dove si attaccano alla superficie rivestita. Per l'analisi completa includere le cellule sulla superficie bene.
  13. Rimuovere il supporto e fissare le cellule in ghiaccio-freddo fresco 4% PFA per 10 min. Lavare 3x con PBS 1x. Eseguire immunocitochimica sulle cellule invasive, come precedentemente descritto 8-10.

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Representative Results

Questo sistema modello EMT è basato sull'isolamento standardizzata di NSC sia come singole cellule o espianti come da una regione specifica del tubo neurale sviluppo, la corteccia centrale (figure 1 e 2). Per la valutazione quantitativa, espianti sono stati seminati proprio al centro di 500 micron cultura griglia piatto (Figura 3). Espianti da corteccia centrale sono stati esposti a FGF2 per due giorni, seguiti da altri due giorni in diverse combinazioni di fattori di crescita (Tabella 1). Abbiamo iniziato con la corteccia che è più grande rispetto ad altre regioni del tubo neurale sviluppo. Abbiamo osservato che solo espianti coltivati ​​in BMP4 mostrato una risposta migratoria (Tabella 1 e complementare figura 2).

Successivo podoplanin (PDPN) espressione è stata analizzata in condizioni definite. PDPN è un transmembrana sproteine ​​ialomucin-like che è stata associata con l'invasione in tumori multipli 11,12 e anche in NSC 8. La proporzione di cellule che esprimono PDPN è aumentata in alto grado gliomi 13. PDPN è anche associata con la sopravvivenza nei pazienti più poveri glioblastoma 14. Inoltre, PDPN ha dimostrato di essere un marker di progressione maligna in tumori multipli inclusi carcinomi del seno, del polmone, del colon 15,16. PDPN si esprime sia in invasive così come migratori NSC 8. Utilizzando il protocollo di cui sopra, l'espressione PDPN è stato confrontato con il controllo, FGF2 solo, in espianti esposti a TGFβ1 e da solo BMP4 o in combinazione. espressione PDPN è stato rilevato in tutti BMP4 e TGFβ1 / espianti BMP4-trattata. Al contrario, senza PDPN stato osservato nei espianti di controllo in soli FGF2 o espianti con solo TGFβ1 (Tabella 2 e Figura 4). Inoltre le cellule con un fenotipo migratorio sono state indotte in BMP4 e TGFβ1 / BMP4-espianti a vista, mentre gli espianti di controllo (solo FGF2) e TGFβ1 da solo non hanno mostrato cellule migratorie (Tabella 1). L'osservazione di cellule migratorie fornisce un basso costo, valutazione qualitativa straight-forward.

Inoltre, abbiamo testato la risposta e EMT migratoria induzione di diverse regioni del tubo neurale in via di sviluppo a BMP4 (Tabella 2). 400 micron espianti sono stati preparati dalla corteccia centrale, corteccia posteriore (polo posteriore etichettato), il MGE e del mesencefalo, come indicato in figura 1. Gli espianti sono stati tutti esposti a FGF2 per due giorni, seguiti da due giorni in FGF2 con BMP4 . Migrazione è stata definita dalla comparsa di cellule migranti piatte con un bordo di uscita (Figura 5 e Figura integrativa 2). Un forte induzione di cellule migranti dalla corteccia posteriore e una risposta intermedia dalla MGE ei mesencefalo è stata osservata (Tabella 2). 145 di 146 espianti della corteccia centrale, ha mostrato una risposta migratoria in FGF2 / BMP4. Così, la corteccia centrale dimostrato l'induzione più robusto di cellule migranti di tutti espianti testate (Tabella 2). L'omissione di BMP4 abolito qualsiasi risposta migratoria (Tabella 1 e 2, e dati non mostrati).

Per la valutazione quantitativa del fattore di crescita di potenza, la distanza di migrazione è stato misurato in espianti coltivati ​​in molteplici fattori di crescita. Espianti sono state coltivate come sopra per due giorni in FGF2, poi per altri due giorni in FGF2 senza fattori (controllo) o BMP4 singolo o combinato e TGFβ1. Nelle espianti di controllo una forte proliferazione è stata osservata in risposta a FGF2, come previsto. Gli espianti sono derivati ​​dalla SVZ corticale e contengono in larga parte NSCs che sono noti a proliferare in risposta a FGF2 17. Il ce di controllolls raggiunto 689 ± 14, le cellule TGFβ1 582 ± 49 micron (Figura 5.). Il BMP4-gruppo ha mostrato una distanza di migrazione media di 935 ± 91 micron. In confronto i / BMP4 cellule TGFβ1 migrate in modo significativo in seguito, a 1.150 ± 23 micron (Figura 5). I risultati mostrano che BMP4 è inducendo una migrazione in NSCs FGF2-esposto. Questa migrazione può essere ulteriormente rafforzata da TGFβ1. La combinazione di FGF2, BMP4 e TGFβ1 è la più efficace per indurre la migrazione. In sintesi, il sistema di coltura modello cellulare permette sia di tipo qualitativo, nonché la valutazione quantitativa della migrazione.

EMT è stato collegato a fattori di trascrizione (TFS), come Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2, TWIST1, Twist2 in vari sistemi, tra cui i tumori epiteliali, come il cancro al seno, cancro del colon, cancro del polmone e anche in tumori al cervello 1,18. noi hannuncio precedentemente dimostrato che FGF2 e BMP2 o BMP4 può indurre Snail1 e Snail2 8,9. Utilizzando il sistema di cui sopra abbiamo studiato i livelli di espressione degli altri TFs EMT-related. Non ci sono variazioni di espressione TWIST1 potrebbero essere rilevati; con TWIST1 essendo a bassi livelli di espressione durante l'esposizione FGF2 (dati non mostrati). Nel modello di coltura cellulare una sovraregolazione di Zeb1 e Zeb2 durante FGF2-esposizione e di Twist2 durante FGF2 / BMP4-esposizione è stata osservata (Figura 6).

NSC sono noti per contribuire alla popolazione di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) 8,19,20. Molte evidenze indicano che la NSC e in particolare OPC possono essere la cella di origine per gliomi 21,22. Per caratterizzare ulteriormente il modello di cui sopra, abbiamo studiato l'espressione di marcatori OPC. Abbiamo osservato che le cellule staminali neurali FGF2 esposti dimostrato co-espressione di Olig2 / Nestin und Sox10 / Nestin in più del 90% (Figura 7). Questa osservazione dimostra che le NSC mostrano OPC-caratteristiche del nostro sistema. In effetti, l'OPC-caratteristiche correlate con upregulation di Zeb'1 e Zeb'2 (figure 6 e 7). Questi risultati suggeriscono che FGF2-espansione deduce un'identità OPC, come giudicato da Olig2 e Sox10, mentre allo stesso tempo inizia prima Zeb a base di fasi di EMT.

Figura 1
Figura 1: Embryo standardizzato e Forebrain dissezione per NSC Isolamento e EMT induzione. (A) zampa anteriore sinistra del ratto E14.5 embrione dopo taglio cesareo. Ogni ribalta cifre arto è contrassegnato da una punta di freccia nera. Si noti la formazione di cifre che inizia tipico per E14.5. (B) Rat E14.5 embrione dopo la rimozione dello scafo. Si noti il ​​cancelletto (#) alla dorsale diencefalo which è ideale per iniziare la rimozione della pelle Anlage / cranio. (C) La pelle / cranio è già in gran parte rimosso. Il confine tra la pelle rimosso e non rimossi è contrassegnato con due frecce triangolari. La pelle può essere sfogliato anteriormente dalla freccia anteriore e posteriormente dalla freccia posteriore. (D) La pelle / cranio è ora completamente rimosso. Si noti la tacca del confine mesencefalo-rombencefalo (freccia) e il taglio appena caudalmente ad essa, segnato con una freccia. (E) Il telencefalo-diencefalo-mesencefalo (TEL-di-MES) blocco viene rimossa dal resto dell'embrione . (F) vista superiore del blocco TEL-dI-MES. Cranial è sinistra. (G) vista obliqua dall'alto. (H) vista inferiore del blocco TEL-DI-MES. (I) La mesencefalo e parte del diencefalo sono separati dal telencefalo con la parte anteriore del diencefalo. In alto: vista anteriore di entrambe le vescicole telencefalici. In basso: Right vista laterale del mesencefalo, top affronta cranialmente (J) Top:. entrambe le vescicole telencefalici senza diencefalo. vista inferiore per illustrare la completa rimozione del diencefalo. Asterisk raffigura MGE. In basso:. Parte anteriore della diencefalo (K) Top: entrambi gli emisferi sono separati nella fessura interemisferica. emisfero sinistro sul lato sinistro. Asterisk raffigura MGE. Segno più raffigura LGE. (L) ingrandimento di emisfero sinistro con vista mediana. facce destra cranialmente, a sinistra caudale, parte superiore è dorsale, basso ventrali, rispettivamente. Asterisco (*) si trova a MGE. Segno più (+) si trova a LGE. ch, orlo corticale; FL, zampa anteriore; di, diencefalo; mes, mesencefalo; MHB, confine mesencefalo-rombencefalo; HL, degli arti posteriori; LGE, laterale eminenza gangliare; MGE, mediale eminenza gangliare; OB, bulbo olfattivo; pc, corteccia posteriore; rho, rhombencephalon; tel, telencefalo. La griglia su ogni immagine mostra 2 mm di spessore con linee a quattro intersezione con linee sottili ogni400 micron. Barra di scala su tutte le immagini:. 2 millimetri Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: standardizzato dissezione corticale SVZ per NSC Isolamento e EMT induzione. (A) Vista mediana della emisfero sinistro. Attraverso il forame di Monro MGE e LGE sono visibili, contrassegnato da asterisco e segno più. (B) il bulbo olfattivo è stato rimosso solo cranialmente del MGE-LGE. (C) Il polo posteriore della corteccia viene rimossa proprio dietro la CGE . (D) superiore: l'orlo corticale è separato dalla corteccia. Sinistra: polo posteriore. Medio: complesso contenente la porzione centrale della corteccia e il blocco CGE-LGE-MGE. MGE e LGE volto a destra. A destra: bul olfattivab. (E) Il blocco CGE-LGE-MGE-corteccia è capovolto in senso orizzontale. Ora la superficie esterna del telencefalo è di fronte al microscopio. MGE e LGE ora faccia a sinistra. (F) Le meningi rossastri vengono rimossi dalla corteccia luminoso traslucido. Il blocco CGE-MGE-LGE-CTX è ora girato indietro in senso orizzontale per il passo successivo. (G, H) La stessa procedura si ripete con l'emisfero destro. La corteccia centrale è separato dal blocco CGE-MGE-LGE. Si noti che non vi è una zona della corteccia intermedia che viene lasciato al blocco CGE-MGE-LGE, contrassegnato con due frecce. Questo spessore corticale intermedia corrisponde alla metà del diametro della LGE. La linea tratteggiata che rappresenta il confine tra LGE-CGE e la corteccia. (I) La corteccia centrale è divisa in espianti di meno di 400 micron di diametro. Barra di scala: 2 mm; griglia su ogni immagine mostra 2 mm di spessore con quattro linee di intersezioni (linee sottili) ogni 400 micron. Asterisco (*) si trova unt MGE. Segno più (+) si trova a LGE. Abbreviazioni: ant-CTX, corteccia anteriore; CEN-CTX, corteccia centrale; CGE, caudale eminenza gangliare; ch, orlo corticale; cp, plesso coroideo; CTX, corteccia; LGE, laterale eminenza gangliare; gli uomini, le meningi; MGE, mediale eminenza gangliare; OB, bulbo olfattivo; pc, corticale posteriore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Explant Semina su 35 mm Griglia per colture cellulari Piatti Inserire 1 ml di terreno di espansione al centro del piatto di griglia 500 pm. Il calo è contenuto dal bordo della griglia (piccole frecce). Luogo espianti proprio al centro della goccia 1 ml. Se gli espianti sono distribuite al di fuori della griglia, SWIrl il piatto in un movimento circolare lento e gli espianti si sposteranno verso il centro con la forza centripeta. Nota: gli espianti sono a malapena visibili a occhio (punte di freccia nera). Barra di scala: 35 mm.

Figura 4
Figura 4:. PDPN è indotta in presenza di BMP 4 espianti sono state coltivate in base alla sezione protocollo 8 (2 giorni in FGF2 solo, poi seguita da FGF2 con fattori come indicato). Controllo (A) (FGF2 solo) e espianti TGFβ1 (C) non contengono cellule PDPN-positivi (verde). I nuclei sono colorati con DAPI (blu). BMP4 (B) e TGFβ1 / BMP4 (D) espianti hanno mostrato un'alta percentuale di cellule PDPN-positivi. Il centro espianto è a sinistra, la periferia a destra. Nota: Le celle PDPN-positivi erano per lo più found alla periferia e non al centro del trapianto. Gli espianti TGFβ1 / BMP4 contenuti più piatta, più elaborato cellule PDPN-positivi. (E) La percentuale di cellule PDPN-positivi in espianti a condizioni differenti è rappresentato. Controllo e TGFβ1 entrambi sono significativamente diversi da condizioni con BMP4. I mezzi sono mostrati ± SEM. Controllo vs TGFβ1 non è significativo (ns). Controllo e TGFβ1 vs. BMP4: p <0,0001 (***). TGFβ1 vs. TGFβ1 / BMP4: p <0.0001 (***). BMP4 vs. TGFβ1 + BMP4 non è significativa: p = 0.0981 (ns). Controllo vs. TGFβ1 + BMP4: p <0,0001 (***). Barra di scala per tutte le immagini, come illustrato in (A):. 50 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5 Figura 5: valutazione quantitativa migrazione. BMP 4 e TGF beta 1 mostrano effetto additivo sulla migrazione cellulare. Espianti sono stati coltivati ​​secondo la sezione protocollo 8. (a) Il controllo espianto. (B) Espianto nel solo BMP4. (C) Espianto nel solo TGFβ1. (D) Espianto nel combinazione di TGFβ1 e BMP4. (e) la distanza di migrazione in micron. La griglia 500 micron è stato utilizzato come riferimento. Il controllo e gli espianti TGFβ1 mostrano una forte proliferazione di diametro espianto maggiore rispetto alle altre condizioni. I mezzi sono mostrati ± SEM. Si noti che i espianti BMP4 e TGFβ1 / BMP4 in parte disintegrano il nucleo espianto e le cellule emigrano via da esso centrifugo. Controllo vs TGFβ1 non è significativo (ns). TGFβ1 vs.BMP4: p = 0,0353 (*). Controllo vs BMP4: p = 0,0351 (*). BMP4 vs. TGFβ1 + BMP4: p = 0,0372 (*). Controllo vs. TGFβ1 + BMP4: p <0,0001 (***). barra della scala: 500 micron. Centro di espianto è contrassegnato da un segno più (+). Bordo esterno di cellule migranti è contrassegnato con la freccia triangolare. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6:.. Sovraregolazione di EMT relativi fattori di trascrizione da qRT-PCR EMT è legata ai fattori di trascrizione chiave del Zeb- e Twist-famiglia (A, B) e Zeb'1 Zeb'2 sono stati upregulated durante la prima fase di FGF2-esposizione. (C) è stata Twist'2 upregulated durante la secondaFase D di FGF2 / BMP4-esposizione. livelli di espressione relativi basato su qRT-PCR sono mostrati (n = 2). I livelli di mRNA sono stati normalizzati per GAPDH. I mezzi sono mostrati ± SEM. Al giorno 0 del periodo di FGF2 mRNA è stato raccolto, ulteriormente mRNA è stato raccolto dopo quattro giorni di FGF2, poi dopo un giorno di FGF2 / BMP4 Zeb'1:. Controllo vs FGF2, p = 0,0002 Zeb'2:. Controllo vs. FGF2, p = 0,0206 Twist'2:. controllo vs. FGF2 + BMP4, p = 0,003.

Figura 7
Figura 7:. NSC mostrano OPC Caratteristiche del sistema modello NSC sono stati isolati dalla corteccia centrale e coltivate come singole cellule in presenza di FGF2 (secondo la sezione 5). Dopo 8 d in coltura (passaggio dopo 4 d secondo il punto 7.9) le cellule formano piccole colonie NSC e sono state colorate per Olig2 (rosso, in B, C), Sox10 (rosso, in E, F) e Nestin (verde, A, C, D, F). Un'alta percentuale di cellule co-espressi Olig2 / Nestin (AC) e Sox10 / Nestin (DF). (G) Co-espressione di Olig2 / Nestin e Sox10 / Nestin è mostrato in percentuale di tutte le cellule. I mezzi sono mostrati ± SEM. Barra di scala per tutte le immagini come illustrato in (A) e (D):. 20 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Condizione Espianti totali (corteccia centrale) Espianti con risposta migratoria % Espianti con l'espressione Podoplanin %
Controllo 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

Tabella 1. BMP 4 e la combinazione di TGF ß 1 con BMP 4 indurre una risposta Migratoria robusta. Espianti dalla corteccia centrale sono state mantenute in terreno di espansione e FGF2 per un totale di quattro giorni. Dopo la primadue giorni, gli espianti sia continuato a ricevere FGF2 da solo (controllo) o FGF2 e in aggiunta TGFβ1, BMP4 o TGFβ1 / BMP4 come combinazione. Di comando e di TGFβ1- espianti hanno né mostrano una risposta migratoria né espressione PDPN. BMP4 e TGFβ1 / BMP4 indotto entrambe le cellule migratorie, nonché espressione PDPN in tutti espianti.

Regione espianti totali Espianti con risposta migratoria in FGF2 / BMP4 %
corteccia centrale 146 145 99,3
posteriore corteccia 52 48 92,0
MGE 56 29 51,7
mesencefalo 53 28 52.8

Tabella 2. Il Cortex centrale mostra la migrazione più robusto in risposta alla FGF 2 / BMP 4 espianti sono stati preparati da diverse regioni del tubo neurale topo E14.5 in via di sviluppo:. La corteccia centrale, la corticale posteriore, mediale eminenza gangliare (MGE) e la mesencefalo. Tutti gli espianti sono stati coltivati ​​in modo identico in FGF2 / BMP4 (sezione 8). Espianti trattati senza BMP4 non hanno mostrato alcuna risposta migratoria (dati non riportati). Tutti gli espianti sono stati sottoposti a screening per comparsa di eventuali cellule migratorie per espianto. Tutte le regioni sono stati in grado di rispondere alle FGF2 con BMP4 con la migrazione. La corteccia centrale, tuttavia, ha mostrato la risposta più robusto. Si noti che BMP4 è stato richiesto per indurre le cellule migratorie. Espianti coltivati ​​in FGF2 solo ha mostrato la proliferazione, ma nonmigrazione; e non le cellule migratorie piatti sono stati osservati nel solo FGF2 (Tabella 1 e Figura integrativa 2).

Supp Figura 1
Figura complementare 1. 400 micron Griglia File. Il file griglia può essere stampato e utilizzato come riferimento durante le fasi di dissezione sopra e come illustrato nelle figure 1 e 2. Le grandi incroci rappresentano 2 mm con 400 micron suddivisioni. Cliccate qui per scaricare una versione PDF di questa figura.

Supp Figura 2
Figura integrativa 2. BMP 4 -exposed espianti Show piatte cellule migranti. Ingrandimento di cellule mostrati nella Figura 5. (A) controllo-(FGF2 alone) e (C) TGFβ1-espianti dimostrato una forte divisione cellulare con cellule piccole arrotondati. (B) BMP4- e (D) TGFβ1 / BMP4-espianti hanno mostrato cellule allungate costantemente piatte. Barra di scala per tutte le immagini, come illustrato in (A):. 100 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 1
Figura 3 supplementare. Sintesi di modello in vitro sistema per EMT indagini. E14.5 ratto corteccia centrale contiene la SVZ NSC-contenenti. La corteccia centrale è o used come pezzi espianto o come singole cellule. pezzi espianto sono più convenienti per l'analisi quantitativa della migrazione (sezione 8). Singole cellule sono adatti per l'analisi qualitativa, come il gene o analisi delle proteine ​​(Sezione 9.13).

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Discussion

In questo studio un sistema standardizzato per EMT analisi NSC che utilizzano è descritta (riassunti nella figura supplementare 3). La standardizzazione assicura riproducibilità (Tabella 1 e 2). I NSCs sono derivati ​​dalla corteccia di sviluppo, un tessuto che normalmente non subisce EMT. Questo è un vantaggio per l'analisi dei primi passi in EMT. Primi passi in EMT non possono essere adeguatamente studiati nelle cellule tumorali che si sono accumulati i cambiamenti genetici e potrebbe aver già adottato caratteristiche EMT. Inoltre, campioni di tumore primari non sono l'ideale per capire EMT poiché la maggior parte dei tumori maligni sono eterogenee contenenti cellule sia invasive e non invasive. Il protocollo presentato fornisce ai ricercatori di EMT con un nuovo modello per studiare i primi passi di EMT induzione. Qui mostriamo che gli induttori EMT chiave della Zeb e la famiglia Twist sono sequenzialmente attivati: durante la prima fase Zeb1 e Zeb2 sono upregulated, durante la seconda fase Twist2 (Figure 6). In precedenza, avevamo dimostrato che Snail1 è già upregulated parecchie ore dopo l'esposizione BMP4-8. Abbiamo anche dimostrato che al momento BMP4 esposizione le cellule staminali neuroepiteliale dalla corteccia centrale differenziarsi in cellule mesenchimali, positive per actina muscolo liscio (SMA) e calponin 9. I risultati sopra completato lo studio precedente dimostra che tutte le tre noti regolatori EMT chiave sono coinvolti nel sistema. Inoltre, abbiamo osservato che TGFβ1 può migliorare in modo significativo l'effetto migratorio di FGF2 / BMP4 solo. Questi risultati indicano una rete tra FGF-, BMP- e TGFβ-segnalazione durante EMT induzione.

Le fasi più critiche per l'isolamento di successo del NSC per EMT e l'analisi della migrazione sono: identificare correttamente l'età embrionale, individuando punti di riferimento anatomici dell'embrione in via di sviluppo, la preparazione di terreni di coltura freschi e (almeno per una notte) piastre rivestite, l'uso di strumenti a punta fine e proper dissezione della porzione centrale della corteccia sviluppare per stabilire espianti corticali.

Le tecniche presentate possono essere aumentati con alcune modifiche. Come suggerito in precedenza, diversi espianti sono placcati su un singolo piatto con una griglia. Per lo screening di composti multipli, tuttavia, può essere più conveniente per posizionare singoli espianti in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Inoltre, il sistema modello può essere raffinato per la scoperta di farmaci su larga scala. Come descritto in precedenza, PDPN è un marker utile per caratteristiche migratorie di nuova acquisizione da PDPN si trova in invasiva NSC 8. Un giornalista PDPN può essere trasfettati in NSC normale prima EMT induzione. Come conseguenza PDPN cellule esprimenti possono servire come controllo interno per la trasformazione cellulare poiché PDPN non è espresso in NSC normali (Figura 4 e Tabella 1). Diversi altri marcatori NSC sono disponibili, come ad esempio Nestin, che si perdono dopo EMT induzione 8. Come conseguenza,sia lo stato iniziale, "non migratori / non-invasiva / Nestin +", e lo stato finale, "migratoria / invasiva / PDPN +", possono essere monitorati, che consente la scoperta di farmaci automatizzato. Nelle grandi piastre di coltura delle cellule con più pozzetti (per esempio, piastre da 96 pozzetti e più grandi), le cellule iniziale può essere seminato e trattati con farmaci o composti senza funzione nota stabiliti. Così, piastre a pozzetti multipli possono essere analizzati automaticamente per l'espressione di PDPN o di altri marcatori di migrazione / invasione. Se un inibitore è l'obiettivo principale dello schermo, la scomparsa di espressione PDPN può aiutare ad identificare putativamente interessanti nuovi composti inibitori.

Durante il test di una sostanza nuova espianti non possono mostrare migrazione e / o gli espianti possono arrotondare e staccare dal piatto. In questa situazione, è preferibile modificare solo metà dei media ogni giorno (invece di modifica di supporto pieno ogni altro giorno). Questo riduce lo stress da tensione superficiale in caso di sostituzione con mezzi freschi. Ilespianti non possono attaccare dopo la placcatura iniziale. In questa situazione, fibronectina deve essere in contatto con la superficie piatto per almeno 36 h. Fibronectina utilizzato per il rivestimento deve essere preparata senza esposizione a un tubo di plastica per più di 10 minuti dal momento che la fibronectina può aderire alla plastica. Inoltre, gli espianti possono depositarsi di fuori della griglia. In questa situazione, si consiglia di agitare il piatto in un lento movimento circolare. Questo permette ai espianti per riposizionare al centro da forza centripeta (vedi figura 3).

C'è una forte evidenza che gliomi sono derivati ​​da NSC e / o OPC derivati ​​da NSC 23,24. Di conseguenza altri gruppi hanno stabilito modelli di crescita glioma sulla base del NSC:. Sampetrean et al NSC isolate da topi INK4 / ARF-deficienti e sovraespressione di H-Ras 25 forzato. Tumori maligni Di alta qualità sono risultati che hanno mostrato la proliferazione e l'invasione dopo il trapianto 25. McNeill et al. anche NSC isolate da topi geneticamente modificati (Rb1 floxed, Nf1, Kras, Pten da solo e in combinazione) 26. I geni sono stati inattivati ​​da infezione da Cre-virus e le NSC sono stati trapiantati 26. Entrambi questi sistemi modello hanno il vantaggio che l'invasione può essere monitorato in vivo e potenziali nuovi farmaci anti-invasione può essere testato. Il loro svantaggio principale è che l'insorgenza di invasione non è ben definito e non è chiaro se le cellule mostrano glioma-tipico EMT invasione (geni EMT) o solo la migrazione locale. Ulteriore solo farmaco può essere testato per animale e l'analisi richiede diverse settimane. Per identificare un nuovo farmaco anti-invasione, le aziende farmaceutiche hanno bisogno di (a) per lo screening per diverse migliaia di composti o più in una sola volta, (b) per replicare i test e (c) per provare diverse concentrazioni di farmaco. Per preparare diverse migliaia di animali trapiantati, trattarli con diversi farmaci e, infine, verificare gli effetti di istochimica o bioluminescenzaanalisi è molto risorsa-consumo. Qui un nuovo sistema modello NSC-based per l'invasione EMT-correlati è descritto che permette lo screening proficuo di migliaia di composti.

Anche se questo modello permette di throughput screening alta di composti, è solo una piattaforma di screening primario. Una volta composti di interesse sono identificati in questo modello, di cui avranno bisogno di ulteriori convalide. Sperimentazione in vivo è necessario per parametri di sicurezza e di efficacia per qualsiasi composto identificato e modelli di trapianto come descritto sopra diventato importante 25,26. Il modello è inoltre limitata dal fatto che essa si basa su cellule di roditore. Anche se il modello può essere usato per studiare ratto o EMT mouse, non è chiaro se gli stessi meccanismi sono in atto in cellule umane o nel paziente umano. Ulteriori esperimenti sono necessari per verificare se le cellule staminali neurali sono invasive, non solo in vitro, ma anche dopo il trapianto. Diverse linee di evidenza supportano il ruolo di NSCnella formazione glioma. Progressione glioma è stata collegata alle seguenti geni: Tenascin C, Hey1, SPARC, Snail1 e Snail2, FGFR +, BMPR1A, EGFR, PDGFRβ, Sox2, Podoplanin, GLI3 e p75NGFR 8. Tutti questi geni sono espressi anche durante la trasformazione di NSCs non invasivi normali cellule mesenchimali invasive 8. Al momento,, non è chiaro se le cellule staminali neurali possono essere trasformati in tumori di soli fattori di crescita esterna.

Le cellule staminali tumorali-inizio (alle TIC) provenienti da diversi tumori sono stati isolati e sono utilizzati come modelli per comprendere la progressione del tumore 27. TIC sono, tuttavia, non è adatto per l'analisi EMT, poiché EMT ha già verifica in TIC 27. Per comprendere primi e anche passi in ritardo di EMT induzione, è necessaria una popolazione di cellule non neoplastica primaria. Idealmente questa popolazione non era destinata a subire EMT, in primo luogo. Era stato precedentemente dimostrato che NSC embrionali sono idonei per questo scopo9,28. Vale a dire, la migrazione e l'invasione potrebbero essere indotti in NSC di FGF2 e BMP4 9,28. Migrazione FGF2 / BMP4 indotta era legato a singoli geni EMT-correlate, tuttavia, la prova completa mancava dal momento che le famiglie EMT chiave Zeb e Twist non erano stati indagati 8. I risultati di cui sopra dimostrano che una specifica combinazione di quattro fattori, FGF2, BMP4, TGFβ1 e insulina causano una forte e completa l'induzione EMT, non osservati prima. Il presente studio dimostra che i geni EMT chiave del Zeb- e Twist-famiglie sono anche sovraregolati. Questo studio fornisce quindi la prima evidenza che non c'è upregulation selettiva di singoli geni, ma i risultati mostrano che tutte le famiglie EMT chiave sono attivi nel sistema di coltura cellulare proposto.

EMT è stato osservato anche in tumori epiteliali di fuori del cervello, come il polmone, della mammella, del colon e cancro gastrico 29. Diversi modelli per studiare EMT sono in uso per questi tumori 30-32, Che vengono, però, con significative limitazioni: (a) l'utilizzo di linee cellulari tumorali trasformate trasportano multiple genetica e epigenetica cambia 33; per identificare inibitori della EMT per le fasi precoce del cancro, le cellule tumorali in fase avanzata sono inadeguati; (B) colture di siero-dipendente che contengono vari fattori di crescita non definiti; questo rende identificazione dei fattori critici molto difficile. Inoltre, esperimento riproducibilità è compromessa in quanto la qualità del siero varia da lotto a lotto; (C) siero contiene inibitori e attività enzimatiche, eventualmente, inattivanti composti esogeni potenzialmente utili; (D) necessità di enzimi per passaging cellule che degradano le molecole della superficie cellulare; (E) per identificare agonisti EMT per promuovere EMT fisiologico, le cellule normali sono necessari per verificare l'induzione. modelli cellulari tumorali sono inadeguati per trovare sostanze che favoriscono la rigenerazione delle cellule staminali normali.

è necessaria anche la migrazione per i processi normali, come la guarigione delle ferite e Regenerazione del cervello feriti 18. Dopo traumi cerebrali e ictus, sono necessari per migrare verso il sito della lesione di partecipare alla rigenerazione 4,34 NSC. L'attuale sistema può anche essere utilizzato per identificare sostanze che favoriscono la migrazione e l'invasione. Come indicato in precedenza, la migrazione è indotto all'avvio con BMP4-trattamento. Se le cellule non siano esposti a BMP ma invece di nuovi composti, questi possono sostituire l'azione BMP che contribuirà a identificare nuovi BMP agonisti. Con un sistema reporter che indica l'espressione PDPN, test su larga scala per le sostanze nuove diventa possibile; se un nuovo composto può sostituire BMP, cellule esprimenti PDPN possono essere identificati automaticamente.

Il sistema proposto è utile anche per studiare le interazioni delle cellule di segnalazione. I nostri risultati mostrano che l'effetto BMP sulla migrazione potrebbe essere rafforzata attraverso l'attivazione TGFβ1. I risultati scoprono una interazione additiva tra il BMP- e TGFβ-segnalazione. Tuttavia, vie di segnalazione aggiuntivi, come notch, Wnt- o EGFR / MAPK- e altre cascate di segnalazione possono essere coinvolti. Pertanto, sono necessari ulteriori indagini su BMP / TGFβ-interazioni e cross-talk ad altri percorsi. Inoltre, la corteccia centrale reattivo può essere isolato da topi geneticamente modificati, che possono aiutare a chiarire i meccanismi alla base EMT guida. In sintesi, il sistema modello EMT qui descritto può essere utile nel campo della biologia delle cellule staminali e rigenerazione, nonché nella ricerca sul cancro. Può essere usato per lo screening di librerie di droga per le sostanze che inibiscono o migliorando la migrazione e l'invasione.

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Acknowledgments

Lo studio è stato sostenuto dall'Università di Basilea Science Foundation e la National Science Foundation svizzero da una sovvenzione di MHS e AG (SNF IZLIZ3_157230). Ringraziamo: Dr. Tania Rinaldi Burkat per fornire generosamente infrastrutture; tutti i membri del gruppo Bettler per discussioni e commenti. Ringraziamo Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Svizzera) per l'installazione professionale e competente della telecamera video Full HD MC170 (Leica Microsystems, Svizzera).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

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References

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Biologia dello Sviluppo Numero 114 le cellule staminali neurali epiteliali di transizione mesenchimale la migrazione, glioma l'invasione del cancro Snail1 fetale bovino privo di siero FGF2 BMP4 TGFβ
Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery
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Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D.,… More

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

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