Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En enzym- och Serumfritt Neural Stem Cell Culture modell för EMT undersökning Lämplig för Drug Discovery

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

Epitelial till mesenkymala övergång (EMT) beskriver processen för epitel transdifferentiating i mesenkym. EMT är en fundamental process under fosterutvecklingen som också ofta förekommer i glioblastom, den vanligaste elakartade hjärntumör. EMT har också observerats i flera karcinom utanför hjärnan, inklusive bröstcancer, lungcancer, tjocktarmscancer, magsäckscancer. EMT är centralt kopplad till malignitet genom att främja migration, invasion och metastasbildning. Mekanismerna i EMT-induktion är inte helt klarlagda. Här beskriver vi ett in vitro-system för standardiserad isolering av kortikala neurala stamceller (NSCs) och efterföljande EMT-induktion. Detta system ger möjlighet att använda antingen enskilda celler eller Explantation kultur. I detta system, råtta eller mus embryonala framhjärnan NSCs odlas i ett definierat medium, som saknar serum och enzymer. De NSCs uttryckte Olig2 och Sox10, två transkriptionsfaktorer observerades i oligodendrocYTE prekursorceller (OPCs). Med detta system, interaktioner mellan FGF-, BMP- och TGF-signalering involverar Zeb1, Zeb2 och Twist2 observerades där TGFp-aktivering förbättras avsevärt cellmigration, vilket tyder på en synergistisk BMP- / TGF-interaktion. Resultaten pekar på ett nätverk av FGF-, BMP- och TGF-signaleringen att vara involverad i EMT induktion och underhåll. Detta modellsystem är relevant att undersöka EMT in vitro. Det är kostnadseffektiv och visar hög reproducerbarhet. Det gör det också möjligt för jämförelse av olika föreningar med avseende på deras migrations svar (kvantitativ avståndsmätning), och high-throughput screening av föreningar för att hämma eller förbättra EMT (kvalitativ mätning). Modellen är därför väl lämpad att testa bibliotek läkemedels för ämnen som påverkar EMT.

Introduction

Under flera stadier av embryonal utveckling, epitelceller förlorar sin starka vidhäftning till varandra (t.ex. tight junctions) och skaffa en vandrande fenotyp i en process som kallas epitelceller till mesenkymala övergång (EMT) 1. EMT krävs för bildandet av ytterligare celltyper, såsom de mesenkymala neurallist-celler, en population som segregerar från neuroepitelet 2. EMT är inte bara nödvändig under embryonala stadier men också krävs i senare skeden av vuxenlivet för att upprätthålla fysiologiska processer i den vuxna organismen, såsom sårläkning 3 och centrala nervsystemet (CNS) förnyelse i demyeliniserande lesioner 4.

Epiteliala tumörer är kända för att aktivera EMT som ett inledande steg för migration, invasion och metastas, vilket slutligen leder till cancer progression 1,3. EMT är verkligen centralt kopplad till stark migration 1,3. De cellulära stegen att conditioning, initiera, genomgår och upprätthålla EMT är inte helt klarlagda och behöver ytterligare utredning.

Här används ett standardiserat in vitro-EMT modellsystem baserat på NSCs, med definierade tillväxtfaktorer och media (inget serum och inget enzym användning) presenteras. Detta modellsystem är av betydelse för forskare som arbetar på EMT. Snigeln, Zeb och Twist proteinfamiljer har visat sig vara avgörande för EMT både i utveckling och sjukdom en. Snigel, Zeb och Twist familjer är också involverade i den presenterade systemet. Systemet bygger på en specifik region av framhjärnan som normalt inte genomgår EMT ger en särskild fördel för att studera inledande händelser under EMT induktion.

Modellsystemet skulle kunna användas för att studera EMT i epitel utanför CNS, eftersom viktiga EMT inducerare, såsom snigel, Zeb och Twist proteiner, finns också under EMT i vävnadssystem utanför CNS. Denna modell ssystemprogram medger standardiserad isolering av NSCs från utvecklings cortex att studera stamceller funktioner i allmänhet och EMT i synnerhet. Med detta system, isolerade vi NSCs, inducerad EMT och studerade den efterföljande migration under inverkan av FGF2 och BMP4. Vi observerade att FGF- och BMP-signalering samverkar med TGFp-signalering för att främja cellmigration, vilket validerar modellsystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök följde "Guide för vård och användning av försöksdjur" (NIH publikation, 8: e upplagan, 2011) och har godkänts av djurskyddskommittén Basel (schweiziska riktlinjer för skötsel och användning av djur). Genom dessa riktlinjer djuret protokollet anses av "lägsta djur svårighetsgrad".

1. Framställning av Expansion Medium

Obs: Arbete under aseptiska förhållanden som standard för vävnadsodling.

  1. Ta två 15 ml rör, och tillsätt 5 ml L-glutamin-fritt DMEM / F12 (1: 1) från en 500 ml medium flaska i vardera av de två 15 ml rör. Till den första 15 ml rör, tillsätt 50 mg humant apo-transferrin, 50 | il av putrescin 1 M lager (0,1 mM slutlig koncentration) och 30 | il av natrium selen 500 ^ M lager (slutlig koncentration 30 nM).
    1. Filtrera genom ett 0,2 | im sprutfilter in i den ursprungliga DMEM / F12 flaska.
  2. Till den andra 15 ml rör, tillsätt 12,5 mg insulin. Lägg till6 - 9 droppar av 1 M NaOH. Vortex för att lösa upp insulinet fullständigt. Filtrera genom ett 0,2 | im sprutfilter in i den ursprungliga DMEM / F12 flaska.
    Obs: NaOH är giftigt och frätande. Använd skyddshandskar, rock och skyddsglasögon.
  3. Tillsätt 5 ml penicillin (10.000 enheter / ml) / streptomycin (10000 pg / ml) / amfotericin B (25 | j, g / ml) till DMEM / F12-medium flaska.
  4. Tillsätt 5 ml 200 mM L-glutamin lager färskt tinade eller oligopeptider innehållande glutamin (200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptid) till DMEM / F12-medium flaska.
  5. Skaka väl. Förbered 50 ml alikvoter.
    Notera: Expansionsmediet kan lagras i minst 2 veckor vid 4 ° C. Alikvoteras rör visa färre pH-förändringar jämfört med medel förvaras i 500 ml flaskor.

2. Framställning av Aging Medium

  1. Till en L Ca 2 + - och Mg 2 + -fri HBSS medier, tillsätt 990,85 mg Glukos (5 mM slutlig koncentration) och 840,10 mg NaHCOa 3 Notera: Passmediet kan förvaras i minst 4 veckor vid 4 ° C.

3. Beredning av tillväxtfaktorer

  1. Förbereda sterilt 1x PBS med 1% BSA (PBS-BSA) enbart eller med saltsyra (HCl) vid 4 mM (PBS-BSA-HCl).
    Varning: HCI är frätande och giftigt och kräver speciella säkerhetsåtgärder (rockar, glasögon, handskar, huva).
  2. Lös upp 10 | ig / ml rekombinant human fibroblasttillväxtfaktor 2 (rhFGF2) i PBS-BSA (10 ng / ml slutkoncentration), 10 | ig / ml rekombinant humant benmorfogenetiskt protein 4 (rhBMP4) i PBS-BSA (10 ng / ml slutlig koncentration), och 20 | ig / ml rekombinant human transformerande tillväxtfaktor p 1 (rhTGFβ1) i PBS-BSA-HCl (40 ng / ml slutkoncentration).
    1. Filtrera inte sterilisera. Förbered alikvoter.
      Obs: tillväxtfaktor portioner kan lagras vid-20 ° C under minst 2 år.

4. Beläggning av cellodlingsskålar

  1. Upplösa 1875 mg Poly-L-ornitin (PLO) i 500 ml destillerat H2O för att framställa en 250x PLO lager. Filtersterilisera med användning av ett 0,2 | im sprutfilter och göra 2 ml alikvoter.
    Obs: Dessa portioner kan lagras vid -20 ° C under minst 2 år.
  2. Lös 1 mg bovint fibronektin i 1 ml sterilt destillerat H2O för att förbereda 1,000x fibronektin lager. Inte virvel eftersom detta kan koagulera den klibbiga protein. Skaka försiktigt för hand under 10 min.
    1. Inkubera under 1 h vid rumstemperatur med skakning då och då. Kontrollera om fullständig upplösning. Värm lösningen till mindre än 37 ° C för fullständig upplösning av fibronektin. Filtrera inte sterilisera.
      Anmärkning: Lösningen kan förvaras vid 4 ° C i upp till 6 månader.
  3. Använd plasma-förbehandlade plast cellodlingsskålar (100 mm eller andra format som krävs förexperimentet). För att bedöma migration, använd 35 mm rätter med 500 pm nätet. Inkubera rätter över natten med 2 ml 1x PLO för 12 h vid 37 ° C i en 5% CO2 vävnadsodlingsinkubator. Tvätta två gånger med 2 ml 1x PBS.
  4. Tillsätt 2 ml 1x fibronektin (1 | ig / ml slutlig koncentration) och inkubera rätter för ett minimum av 12 h vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Ta bort fibronektin precis innan plätering cellerna.
    Obs: fibronektin-belagda rätter kan förvaras i minst 2 veckor vid 37 ° C.

5. Standardiserade Dissekering och Beredning av kortikal subventrikulära zonen (SVZ)

  1. Skaffa råtta embryonala dag 14,5 (E14.5, Sprague-Dawley) och mus E13.5 (C57BL / 6) embryon genom tidsinställd-parning. Mate djur från 18:00 till 08:00 på morgonen. Noon efter dagen för parning anses E0.5.
  2. Söva den gravida djur med 5% isofluran och 0,8 l / min syreflöde. Kontrollera svar från tass kompression med skarp dissvsnitt pincett. Decapitate djuret. Undvik CO2 kvävning som CO2 påverkar stamcells återhämtning.
  3. Hämta embryon genom kejsarsnitt.
    1. Placera djuret i ryggläge och desinficera päls med 70% etanol. Använd kirurgisk pincett och sax för att göra V-formad hud snitt på ca 8 cm i nedre delen av buken ovanför livmodern. Incisionsfilm bara huden med päls samtidigt muskel väggar intakt.
    2. Använd färska pincett och sax för att incisionsfilm muskler och buken muskelväggen för att komma in i bukhinnan.
    3. Identifiera livmodern i den nedre bakre bukhinnan. Ta bort livmodern genom skarp separation från omgivande vävnader.
    4. Tvätta livmodern med embryon med sterilt 1x PBS och lägg i iskallt 1x PBS.
    5. Använd spetsig sax för att öppna livmoderväggarna för att frigöra embryo av embryo under ett dissektionsmikroskop (3X förstoring, figur 1B). Använd en pincett för att ta bort de embryonala skrov (
    6. Kontrollera att rätt utvecklingsstadiet av Atlas av utvecklings Rat nervsystemet 5. Rätt embryo storlek visas i figur 1B.
    7. Kontrollera korrekt ålder ytterligare genom närvaron av början siffra bildning i rått forelimb (FL) såsom illustreras i figur 1A.
      Obs! Bakbenet (HL) ännu inte visar siffra separation (Figur 1B).
  4. För dissekering, överföra embryon till obelagda petriskålar fyllda med iskall 1x PBS. Utföra dissektion under ett stereo dissektionsmikroskop (3X till 20X förstoring) med användning av autoklave fin pincett.
    Notera: Petriskålarna förhindrar fastsättning av vävnad till diskytan, vilket kan inträffa med plasmabelagda cellodlingsskålar. Vässade volframtråd nålar eller liknande är också till hjälp för vissa steg i dissekering.
  5. Ta bort skinnet på huvudet och skalle börjar vid Intersection av utvecklings telencephalon (TEL) och diencephalon (DI) (Figur 1B) genom att dra samtidigt anteriort och posteriort med två pincett för att få tillgång till utvecklings neuralrörsdefekter (Figur 1C).
  6. Identifiera mellanhjärnan-hindbrain-gränsen (MHB, svart pilspets i figur 1B-D), separera hjärnan (MES) från rhombencephalon. Skär rhombencephalon precis vid eller under MHB (figur 1D, triangulär pil).
    Obs: Den extra subkutana utrymmet på MHB underlättar borttagning huden utan att skada neuralröret.
  7. Sever sambandet mellan telencephalon / diencephalon vid skallbasen med ansiktsskelettet (figur 1E). Detta resulterar i ett block som innehåller telencephalon, diencephalon och hjärnan (TEL-di-MES) (Siffror 1F-H).
  8. Överför TEL-DI-MES blocket i expansions medium på is. Håll det COMPLETely omfattas av expansionsmedium i en obelagd petriskål. Håll blocket vid hjärnan med en pincett för att undvika att röra telencephalon som innehåller den kortikala SVZ med NSCs.
  9. Upprepa steg 5,5-5,8 med alla embryon (figur 1F-H).
  10. Överför en TEL-di-MES blockerar i färsk iskall 1x PBS. Skär längs den streckade linjen i den främre mesencephalon (figur 1F-H), separering av mesencefalon från diencefalon, såsom visas i figur 1I.
  11. Separera DI från TEL genom att skära längs de streckade linjerna i figur 1F. Se isolerad telencephalon i figur 1J.
  12. Dela upp de två telencephalic halvklot, skär längs den streckade linjen i figur 1J. Detta resulterar i två separata halvkloten som visas i figur 1K.
    Obs: Den vänstra hjärnhalvan är förstorat i figur 1L.
  13. Identifiera den mediala gänglionic höjder (MGE, figur 2A, *) och sido ganglieblockerande höjder (LGE, figur 2A, +) syns genom framtida foramen interventriculare.
    1. Använd pincett eller nål, dissekera längs en ​​rak linje i skärningspunkten mellan MGE och LGE och främre cortex (ant-CTX, figur 2B). Skär en rak linje genom cortex, hippocampus (höft) och koroidea plexus (CP). Detta skiljer den främre cortex inklusive luktloben (ob) från ganglieblockerande höjder (GE, fig 2B, C).
  14. Skär en andra rak linje i skärningspunkten mellan den bakre ganglionär eminens (CGE, figur 2C, D) och den bakre cortex (Figur 2C), återigen skära igenom cortex, hippocampus och choroid plexus.
  15. Platta ut telencephalon. Helt ta bort den bakre stolpen och luktbulben (figur 2D). Identifieradet kortikala fåll innehållande hippocampus och koroidea plexus (fig 2C), som tidigare 6,7 definierats.
    Obs: Hippocampus har en tunnare neuroepithelium än cortex. CP innehåller röda fartyg.
    1. Separera det kortikala fållen från cortex, lämnar storleken på cortex identisk med storleken på de ganglieblockerande höjder (figur 2D). Detta resulterar i ett block av hjärnbarken (målvävnaden) och ganglieblockerande höjder (GE, figur 2D).
  16. Vänd cortex-GE block med kammar (inre) sidan till diskytan.
    Obs: Den yttre ytan av hemisfären kommer att möta den som utför experimentet (Figur 2E). På utsidan är blodkärlsinnehållande hjärnhinnorna (Figur 2E).
    1. Stift GE och diskytan med vänster hand och skala hjärnhinnorna bort med en pincett i den högra (dominant) hand (figur 2F Obs: Detta är den tekniskt mest krävande steget eftersom mening vidhäfta starkt till cortex. Separationen av hjärnhinnorna från cortex underlättas genom att skära en helt rak linje (inte hackiga) i steg 5.13.1 och 5.14.
  17. Upprepa steg från 5,12 till 5,16 för den andra halvklotet och alla embryon. Skär cortex längs LGE på ett avstånd av halva huvuddiameter av LGE (figur 2G, 2H). Dissekerade cortex spänner över en yta på 1,2 mm x 2,4 mm (Figur 2H) och inkluderar SVZ / bildande skikt med NSCs.

6. Beredning av Explantation kulturer

  1. Skär cortex i explantat av mindre än 400 pm diameter (Figur 2I). Använd en im galler 400 (Kompletterande Figur 1) placerad under dissektion petriskål för referens (Figur 2H och 2I). Överför alla explants i en ny petriskål med is-cold expansionsmedium.
  2. Avlägsna fibronektin från en vävnadsodlingsskål (steg 4,4). Låt det torka. Tillsätt 1 ml kall expansionsmedium till mitten av 35 mm skål med rutnät dimensionen av 10 mm x 10 mm (figur 3). Tillåta medium för att bilda en sfärisk droppe (Figur 3).
  3. Sätt upp till 8 explantat till mitten av nedgången. Explantaten bör idealiskt beläget på nätet med minst 3 mm avstånd mellan varandra för analys migration (se avsnitt 8).
  4. Inkubera skålen under ca 1 h i en cellkultur inkubator (37 ° C, 21% O2, 5% CO2) för fastsättning av explantaten. Tillåta explantaten sedimentera och fäster vid fibronektin-belagda ytan. Skaka inte skålen, eftersom explantaten kan lossna och flytta ut den optimala galler centrum.
  5. Efter 1 h inkubation (37 ° C, 21% O2, 5% CO2), fylla upp skålen till en total volym av 2 ml expansionsmedium samt tillväxten faktörer eller ämnen av intresse för att testa och inkubera.
    Obs: Varken enzymatisk spjälkning eller serum eller centrifugering är nödvändiga för Explantation förberedelse. Detta är optimalt för cellernas integritet.

7. Framställning av NSC Single Cell Culture

  1. Värma upp expansion och passage medium vid 37 ° C.
  2. Överför dissekerade cortex bitar (från steg 5,17) i en 15 ml tub med kall expansionsmedium (rör A). Centrifugera Cortex stycken för 5 minuter vid 1200 x g. Aspirera supernatanten. Tillsätt 200 pl förvärmas expansionsmedium för att resuspendera cortex bitar.
  3. Lägg 700 pl förvärmda passage medium till 15 ml rör med en P1,000 spets (rör A). Försiktigt resuspendera pelleten. Placera spetsen på botten av den 15 ml rör. Försiktigt och långsamt dissociera vävnaden bitar genom att suga tre gånger med P1,000 spets.
    Obs: Passmediet gynnar cellseparation och krävs för att undvika användningen av enzymer.
  4. Låt röret stå under 30 till 60 sek för större (tyngre) icke dissocierade bitar att avsätts i botten. Enkel dissocierade celler kommer att förbli i supernatanten. Överför ca 700 | il av supernatanten till ett nytt 15 ml rör (rör B).
  5. Upprepa steg 7,3 och 7,4 för att dissociera de större bitarna.
  6. Upprepa steg 7,3 och 7,4 en andra gång för att skilja de större bitarna. Överföra all supernatanten till färska 15 ml rör (rör B).
  7. Lägg expansions medium till en total volym av 5 ml. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Bedöma döda celler genom trypan-blå färgning.
    Obs: Små NSCs tolerera steg 7,2 till 7,6 bättre än större celler. Från 10 embryon förväntar ca 4 x 10 6 celler med 10% döda celler.
  8. För expansion av NSCs, plattan 1,5 x 10 6 celler per 10 cm fibronektin-belagda vävnadsodlingsskål i en volym av 8 ml expansionsmedium. För standard expansionen, tillsätt 8 | il av 1,000x rhFGF2 lager. Tillsätt 8 l rhFGF2 varje dag och ändra migdia varannan dag.
    Obs: cortex på detta utvecklingsstadium innehåller en majoritet av NSCs och endast en minoritet av differentierade celler. De differentierade minoritets celler inte svara på rhFGF2-behandling och dö under expansionskultur.
  9. Passage expanderade NSCs vid 60% konfluens.
    1. Passage NSCs bort expansionsmedium. Tvätta cellerna snabbt tre gånger med 5 ml passage medium. Vänta 2-4 minuter. Utan Ca 2 + och Mg 2 + cellerna sakta lossna från ytan, avrundning uppåt. Kontrollera avlossning av celler under fas mikroskop. Vänta ytterligare några minuter, om det behövs, tills visuell lossnar från ytan observeras.
      Obs: Enstaka celler kommer att helt ta bort, men de flesta celler kommer fortfarande hålla sig till diskytan. Varaktigheten behövs för lossnar är beroende på hur länge fibronektin beläggning. En kort fibronektin beläggning (12 timmar eller mindre) resulterar i snabbare cell lossnar. För längre experiment (>; 1 vecka) fibronektin beläggning av mer än 24 timmar rekommenderas.
  10. Använd en 10 ml pipett för att försiktigt lossa cellerna från ytan. Samla 5 ml passage medium med celler och överföra det till ett nytt 15 ml rör. Upprepa med ytterligare 5 ml passagemedium.
  11. Dissociera cellerna i 15 ml rör genom pipettering upp och ned tre gånger, placera 10 ml pipett i botten av röret. Snurra röret i 15 min vid 1200 xg vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 2 ml expansionsmedium. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Använd trypanblått att bedöma döda celler.
    Obs: Efter expansion till 60% sammanflödet, förväntar 4 - 5 x 10 6 celler med en död cellräkning på cirka 10%.
  12. Plattan 8 x 10 5 celler per 10 cm skål för ytterligare passager.

8. Migration Bedömning

  1. För bedömning migration, isolera explantat enligt 5 § Seed explantaten i35 mm rutnät rätter. En timme efter plätering, lägga FGF2 (rhFGF2). Placera skålarna i en 37 ° C inkubator under 2 dagar.
    Obs: För optimal Explantation fäste, undvika att flytta disken.
  2. Ta medium genom 1000 l spets. Tillsätt 2 ml av expansionsmediet genom 1000 l spets börjar vid den inre cirkeln (Figur 3). Detta minskar ytspänningen på explantat.
  3. Lägg tillväxtfaktorer enbart eller i kombination som krävs för experiment. Använd FGF2 / BMP4 / TGFβ1 som positiv kontroll. Obs: I detta experiment var 2 pl FGF2 per 35 mm skål, 2 pl BMP4 och 4 pl TGFβ1 sättas ensamma och i kombination (Figur 5).
    1. Lägg till ytterligare faktorer och / eller testbara ämnen. Håll rätter igen orörd under 2 dagar vid 37 ° C.
  4. Ta fotografier av explantat på ett inverterat mikroskop.
    Obs: Living explants ger bättre faskontrast bilder än fixerade celler. Båda kan användas.
  5. för migreringbedömning använda en grafikprogram som gör mätningar pixel (t.ex. Fiji 8).
  6. Mäta skålen rutnät av 500 | j, m avståndet i pixlar och använda det som inre referens.
  7. Definiera centrum av explantatet såsom ett övergångsstartpunkten. Mäta avståndet mellan centrum av explantatet och den yttersta grupp av 10 celler.
    Obs: Alla celler migrerar centrifugalt bort från explantatet. De bildar spontant ett ark vid periferin enligt de testade förhållanden (Figur 5).

9. Invasion Bedömning

  1. Förbereda fibronektinbelagda vävnadsodlings 24-brunnars plattor enligt protokollenheten 4.
  2. Placera 300 pl varm expansionsmedium i den övre brunnen av cellinvasion kammare. Inkubera kamrarna under 30 min vid 37 ° C och 5% CO2.
  3. Avlägsna expansionsmedium från toppen väl och placera Boyden-kammare in i den belagda 24-brunnsplatta.
  4. tillsätt 500 il varmt expansionsmedium med 0,5 pl rhFGF2 och 0,5 pl rhBMP4 till botten också.
  5. Passage NSCs och räknas som beskrivs i avsnitt 7. Passager 1-4 är lämpliga.
  6. Plattan 5 x 10 5 celler i en volym av 300 pl varm expansionsmedium med 0,3 | il rhFGF2 och 0,3 | il av rhBMP4 i topp brunn i Boyden-kammare.
  7. Kultur de sådda NSCs för 24 timmar.
  8. Lägga till ytterligare faktorer och / eller testbara ämnen till kammaren och odla cellerna under ytterligare 48 timmar.
    Obs: Om cellerna är invasiva, kommer de att passera från den övre väl genom basalmembranskiktet till botten också. Invasiva celler kommer klamra sig fast vid botten av Boyden-kammare.
  9. Följa det protokoll som tillhandahålls av tillverkaren. Använd bomullspinnar (ingår i invasionen analyskitet) för att avlägsna de icke-invasiva celler i den övre väl genom att rengöra två gånger.
  10. Avlägsna mediet från brunnarna och tillsätt 500 | il expansionsmedium meden plasmamembran fläck för levande celler och med kärn färgämnet DAPI till brunnarna.
  11. Inkubera i 10 min vid 37 ° C och 5% CO2.
    Obs: Färgerna kommer att integreras i membranet och kärnan av invasiva celler, respektive, för optimal visualisering 8. Alternativ: Uteslut plasmamembranet färgämne om multi immunocytokemi planeras.
  12. Avlägsna mediet med färgämnen och tvätta två gånger med expansionsmedium. Visualisera och räkna invasiva celler med ett inverterat fluorescensmikroskop som tidigare 8 visade.
    Obs! Vissa invasiva celler kan ha lossnat från botten av kammaren och har sjunkit till brunnens yta nedanför där de håller sig till den belagda ytan. För fullständig analys inkluderar cellerna vid brunnens yta.
  13. Avlägsna mediet och fixera cellerna i iskall färsk 4% PFA under 10 minuter. Tvätta 3x med 1 x PBS. Utföra immunocytokemi på invasiva celler, som tidigare beskrivits 8-10.

    14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta EMT modellsystem bygger på standardiserad isolering av NSCs både som enskilda celler eller som explantat från en specifik region av utvecklings neuralrörsdefekter, den centrala cortex (Figur 1 och 2). För kvantitativ bedömning, var explantat seedade mitt i centrum av en 500 um rutnät odlingsskål (Figur 3). Explantat från den centrala cortex först exponerades för FGF2 i två dagar, följt av ytterligare två dagar i olika kombinationer av tillväxtfaktorer (tabell 1). Vi började med hjärnbarken som är större än andra regioner i utvecklings neuralrörsdefekter. Vi observerade att endast explantat odlade i BMP4 visade en vandrande svar (Tabell 1 och kompletterande Figur 2).

Nästa podoplanin (PDPN) uttryck analyserades under definierade betingelser. PDPN är en transmembran sialomucin-liknande protein som har associerats med invasion i flera cancerformer 11,12 och även i NSCs 8. Andelen PDPN uttryckande celler ökar i hög grad gliom 13. PDPN är också förknippat med sämre överlevnad i glioblastom patienter 14. Vidare har PDPN visats vara en markör av malign progression i ett flertal tumörer inkluderande bröst-, lung-, kolonkarcinom 15,16. PDPN uttrycks både i invasiva samt flytt NSCs 8. Med användning av ovanstående protokoll, var PDPN expression jämfört med kontroll, endast FGF2, i explantat som exponerats för TGFβ1 och BMP4 ensamma eller i kombinationer. PDPN uttryck detekterades i alla BMP4 och TGFβ1 / BMP4-behandlade explantat. Däremot var ingen PDPN observerades i kontroll explantat enbart FGF2 eller explantat med TGFβ1 ensamt (tabell 2 och figur 4). Dessutom celler med en vandrande fenotyp inducerades i BMP4 och TGFβ1 / BMP4-exponerade explantat, medan kontroll explants (endast FGF2) och TGFβ1 ensamt visade inte migrationsceller (Tabell 1). Observation av flyttande celler ger en låg kostnad, rättfram kvalitativ bedömning.

Vidare testade vi migrations respons och EMT induktion av flera regioner i utvecklings neuralrörsdefekter till BMP4 (tabell 2). 400 | j, m explantat framställdes från den centrala cortex, den bakre cortex (märkt bakre polen), MGE och mesencefalon, såsom anges i fig 1. Explantaten alla utsatta för FGF2 i två dagar, följt av två dagar i FGF2 med BMP4 . Migration definierades av uppkomsten av platta migrations celler med en främre och bakre kant (figur 5 och kompletterande Figur 2). En stark induktion av migrations celler från den bakre cortex och ett mellanliggande svar från MGE och mesencephalon observerades (tabell 2). 145 av 146 explantat i centrala cortex uppvisade en vandrande respons i FGF2 / BMP4. Således, den centrala cortex visade den mest robusta induktion av flyttande celler av alla testade explants (tabell 2). Utelämnande av BMP4 avskaffade något migratory svar (tabell 1 och 2, och data ej visade).

För kvantitativ bedömning av tillväxtfaktorn potens var migration avståndet mätt i explantat odlas i flera tillväxtfaktorer. Explantat odlades som ovan under två dagar i FGF2, sedan för ytterligare två dagar i FGF2 utan faktorer (kontroll) eller enstaka eller kombinerad BMP4 och TGFβ1. I kontroll explants en stark proliferation observerades som svar på FGF2, som förväntat. Explantaten är härledda från den kortikala SVZ och innehåller till en stor del NSCs som är kända för att proliferera som svar på FGF2 17. Kontroll cells nådde 689 ± 14, de TGFβ1 cellerna 582 ± 49 pm (Figur 5). Den BMP4-gruppen visade en genomsnittlig migration avstånd av 935 ± 91 nm. I jämförelse migrerade de TGFβ1 / BMP4-celler betydligt längre, till 1150 ± 23 ^ m (Figur 5). Resultaten visar att BMP4 är att framkalla en migration i FGF2 exponerade NSCs. Denna migration kan förbättras ytterligare genom TGFβ1. Kombinationen av FGF2, BMP4 och TGFβ1 är därför det mest effektiva för att inducera migration. Sammanfattningsvis gör cellodlingsmodellsystemet både kvalitativ och kvantitativ bedömning migration.

EMT har kopplats till transkriptionsfaktorer (TFS), såsom Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2, TWIST1, Twist2 i olika system inklusive epiteliala cancrar, såsom bröstcancer, koloncancer, lungcancer och även i hjärntumörer 1,18. vi hannons tidigare visat att FGF2 och BMP2 eller BMP4 kan inducera Snail1 och Snail2 8,9. Användning av ovanstående system vi undersökte uttrycksnivåer av de andra EMT-relaterade TF. Inga förändringar i TWIST1 uttryck kunde påvisas; med TWIST1 är på låga nivåer under FGF2 exponering (data visas ej). I cellodlingsmodell en uppreglering av Zeb1 och Zeb2 under FGF2-exponering och Twist2 under FGF2 / BMP4-exponering observerades (Figur 6).

NSCs är kända för att bidra till befolkningen i oligodendrocyt prekursorceller (OPCs) 8,19,20. Flera bevislinjer tyder på att NSCs och särskilt OPCs kan vara cellen ursprungs för gliom 21,22. För att karakterisera den ovannämnda modellen ytterligare undersökte vi uttrycket av OPC markörer. Vi observerade att FGF2 exponerade NSCs visade samuttryck av Olig2 / nestin end Sox10 / nestin i mer än 90% (Figur 7). Denna observation visar att NSCs visar OPC-funktioner i vårt system. I själva verket, OPC-funktioner korrelerade med uppreglering av Zeb'1 och Zeb'2 (figur 6 och 7). Dessa resultat tyder på att FGF2-expansionen härleder en OPC identitet, såsom bedömdes genom Olig2 och Sox10, medan på samma gång initierar först Zeb -baserade stegen av EMT.

Figur 1
Figur 1: Standardiserad Embryo och framhjärnan Dissection för NSC Isolering och EMT induktion. (A) Vänster framben rått E14.5 embryo efter kejsarsnitt. Varje främre lem siffran är markerad med en svart pil spets. Notera början siffra bildning typiskt för E14.5. (B) Rat E14.5 embryo efter skrovet bort. Notera hash (#) på rygg diencephalon which är perfekt att starta avlägsnande av huden / skull anlage. (C) Huden / skull redan mestadels bort. Gränsen mellan avlägsnas och unremoved hud är märkt med två triangulära pilspetsar. Huden kan skalas anteriort från den främre pil och posteriort från den bakre pil. (D) Huden / skull är nu helt bort. Notera skåran på mitthjärnan-hindbrain gränsen (pilen) och snitt strax kaudalt till den, märkt med en pilspets. (E) telencephalon-diencephalon-hjärnan (TEL-di-MES) plintarna avlägsnas från resten av embryot . (F) Överlägsen syn på TEL-DI-MES-block. Cranial är kvar. (G) sned vy från ovan. (H) Inferior vy av TEL-DI-MES-block. (I) Den mesencefalon och en del av diencefalon separeras från telencephalon med den främre delen av diencefalon. Top: Främre tanke på båda telencephalic vesiklar. Botten: Right sidovy av mitthjärnan, ansikten topp cranially (J) Top. både telencephalic vesiklar utan diencephalon. Sämre för att illustrera fullständigt avlägsnande av diencephalon. Asterisk visar MGE. Nederst:. Främre delen av diencephalon (K) Top: båda hjärnhalvorna separeras i interhemispheric spricka. Vänstra hjärnhalvan på vänster sida. Asterisk visar MGE. Plustecken visar LGE. (L) Förstoring av vänstra hjärnhalvan med median utsikt. Rätt ansikten cranially, lämnade caudally, toppen är rygg, botten ventrala respektive. Asterisk (*) ligger på MGE. Plustecken (+) ligger på LGE. ch, kortikal hem; FL, forelimb; di, diencefalon; mes, hjärnan; MHB, mitthjärnan-hindbrain gränsen; HL, bakbens; LGE, lateral ganglionär eminens; MGE, medial ganglionär eminens; ob, luktloben; pc, bakre cortex; Rho, rhombencephalon; tel, telencephalon. Gallret på varje bild visar två mm tjocka linjer med fyra korsningen med tunna linjer varje400 | j, m. Skala bar på alla bilder. 2 mm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Standardiserad kortikal SVZ dissektion för NSC Isolering och EMT induktion. (A) Median vy av vänster hemisfär. Genom foramen av Monro MGE och LGE är synliga, präglad av asterisk och plustecken. (B) luktloben avlägsnas precis kranialt av MGE-LGE. (C) Den bakre pol cortex avlägsnas precis bakom CGE . (D) Överst: det kortikala fållen separeras från cortex. Vänster: bakre stolpen. USA: komplex innehållande den centrala delen av hjärnbarken och CGE-LGE-MGE block. MGE och LGE ansikte till höger. Höger: lukt bulb. (E) Den CGE-LGE-MGE-cortex blocket vänds horisontellt. Nu den yttre ytan av telencephalon är vänd mikroskopet. MGE och LGE nu står inför till vänster. (F) den rödaktiga meninges avlägsnas från den ljusa genomskinliga cortex. CGE-MGE-LGE-CTX blocket nu vänt tillbaka horisontellt för nästa steg. (G, H) Samma procedur upprepas med den högra hjärnhalvan. Den centrala cortex separeras bort från CGE-MGE-LGE block. Observera att det finns en mellanliggande cortex zon som är kvar på CGE-MGE-LGE blocket, markerad med två pilar. Denna mellanliggande cortex tjocklek motsvarar halva diametern på LGE. Prickade linjen som representerar gränsen mellan LGE-CGE och cortex. (I) Den centrala cortex separeras i explantat av mindre än 400 ^ m diameter. Skala bar: 2 mm; rutnät på varje bild visar 2 mm tjocka linjer med fyra korsningar (tunna linjer) varje 400 pm. Asterisk (*) är belägen ent MGE. Plustecken (+) ligger på LGE. Förkortningar: ant-CTX, främre cortex; CEN-CTX, central cortex; CGE, stjärtfenan ganglionär eminens; ch, kortikal hem; cp, choroid plexus; ctx, cortex; LGE, lateral ganglionär eminens; män, mening; MGE, medial ganglionär eminens; ob, luktloben; pc, bakre cortex. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Explantation sådd på 35 mm Grid cellodlingsskålar Placera 1 ml av expansionsmedium vid centrum av den 500 ^ m galler skålen. Droppen finns av gallret kanten (små pilar). Placera explants mitt i centrum av en ml droppe. Om explantaten är spridda utanför gallret, swirl skålen i en långsam cirkelrörelse och explantaten kommer att flytta till centrum med centripetalkraften. Obs: explantaten är bara knappt synlig med blotta ögat (svart pilhuvuden). Skala bar: 35 mm.

figur 4
Figur 4:. PDPN induceras i närvaro av BMP fyra explants odlades enligt protokollet avsnitt 8 (2 dagar i FGF2 endast sedan följt av FGF2 med faktorer som anges). Kontroll (A) (ensamt FGF2) och TGFβ1 (C) explantat innehöll inte PDPN-positiva celler (gröna). Kärnor färgades med DAPI (blå). BMP4 (B) och TGFβ1 / BMP4 (D) explantat visade en hög andel av PDPN-positiva celler. Explantatet centrum är på den vänstra, periferin till höger. Obs! PDPN-positiva celler var mestadels found vid periferin och inte i mitten av Explantation. De TGFβ1 / BMP4 explants innehöll plattare, mer utarbetade PDPN-positiva celler. (E) Andelen PDPN-positiva celler i explantat vid olika förhållanden representeras. Kontroll och TGFβ1 båda skiljer sig avsevärt från de förhållanden med BMP4. Organ är visat ± SEM. Kontroll vs. TGFβ1 är inte signifikant (ns). Kontroll och TGFβ1 vs. BMP4: p <0,0001 (***). TGFβ1 vs. TGFβ1 / BMP4: p <0,0001 (***). BMP4 vs. TGFβ1 + BMP4 är inte signifikant: p = 0,0981 (ns). Kontroll vs. TGFβ1 + BMP4: p <0,0001 (***). Skalstrecket för alla bilder, som visas i (A). 50 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 5 Figur 5: Kvantitativ Migration bedömning. BMP 4 och TGF p en show additiv effekt på cellmigration. Explantaten odlades enligt protokoll avsnitt 8. (A) Kontroll Explantation. (B) Explantation enbart BMP4. (C) Explantation i TGFβ1 ensam. (D) Explantation i kombinationen av TGFβ1 och BMP4. (E) Migration avstånd i pm. Den 500 ^ m galler användes som referens. Kontrollen och TGFβ1 explants visar en stark spridning med en större explantat diameter än i övriga villkor. Organ är visat ± SEM. Observera att BMP4 och TGFβ1 / BMP4 explants delvis upplösas Explantation kärna och celler emigrera från den centrifugalkraft. Kontroll vs. TGFβ1 är inte signifikant (ns). TGFβ1 vs.BMP4: p = 0,0353 (*). Styrning kontra BMP4: p = 0,0351 (*). BMP4 vs. TGFβ1 + BMP4: p = 0,0372 (*). Kontroll vs. TGFβ1 + BMP4: p <0,0001 (***). Skala bar: 500 nm. Center of explantat markeras med ett plustecken (+). Ytterkant migrerande celler är märkt med triangulär pil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6:.. Uppreglering av EMT-relaterade transkriptionsfaktorer av QRT-PCR EMT är kopplad till de viktigaste transkriptionsfaktorer i Zeb- och Twist-familj (A, B) Zeb'1 och Zeb'2 var uppreglerade under den första fasen av FGF2-exponering. (C) Twist'2 uppreglerades under second fas av FGF2 / BMP4-exponering. Relativa uttrycksnivåer baserade på QRT-PCR visas (n = 2). MRNA nivåerna normaliserades till GAPDH. Organ är visat ± SEM. Vid dag 0 av FGF2 perioden mRNA skördades ytterligare mRNA skördades efter fyra dagar i FGF2, sedan efter en dag i FGF2 / BMP4 Zeb'1:. Kontroll vs. FGF2, p = 0,0002 Zeb'2:. Kontroll vs. FGF2, p = 0,0206 Twist'2. Kontroll vs. FGF2 + BMP4, p = 0,003.

figur 7
Figur 7:. NSCs visar OPC Egenskaper i modellsystemet NSCs isolerades från den centrala cortex och odlas som enskilda celler i närvaro av FGF2 (enligt punkt 5). Efter 8 d i kultur (passage efter 4 d enligt avsnitt 7.9) cellerna bildade små NSC kolonier och färgades för Olig2 (röd, i B, C), Sox10 (röd, i E, F) och nestin (grön, A, C, D, F). En stor andel av celler co-uttryckte Olig2 / nestin (AC) och Sox10 / nestin (DF). (G) Samuttryck av Olig2 / nestin och Sox10 / nestin visas i procent av alla celler. Organ är visat ± SEM. Skalstrecket för alla bilder som visas i (A) och (D). 20 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Skick Totalt explants (central cortex) Explantat med flyttande svar % Explantat med Podoplanin expression %
Kontrollera 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

Tabell 1. BMP 4 och kombinationen av TGF P 1 med BMP 4 inducerar en robust flyttande svar. Explants från centrala cortex hölls i expansionsmedium och FGF2 för totalt fyra dagar. Efter den förstatvå dagar, explantaten antingen fortsatt att ta emot FGF2 enbart (kontroll) eller FGF2 och dessutom TGFβ1, BMP4 eller TGFβ1 / BMP4 som kombination. Styr- och TGFβ1- explants gjorde varken visa en vandrande respons eller PDPN uttryck. BMP4 och TGFβ1 / BMP4 inducerade både flytt celler samt PDPN uttryck i alla explants.

Område totala explantat Explantat med vandrande respons i FGF2 / BMP4 %
centrala cortex 146 145 99,3
posterior cortex 52 48 92,0
MGE 56 29 51,7
mesencephalon 53 28 52,8

Tabell 2. Den centrala Cortex visar mest robusta migration som svar på FGF 2 / BMP 4 explants framställdes från olika regioner i utvecklings råtta E14.5 neuralrörsdefekter. Central cortex, den bakre cortex, den mediala ganglionär eminens (MGE) och mesencephalon. Alla explantat odlades identiskt i FGF2 / BMP4 (§ 8). Explantat behandlade utan BMP4 visade inte någon flyttande svar (data visas ej). Alla explants screenades för uppkomsten av eventuella flytt celler per explantat. Alla regioner kunde svara på FGF2 med BMP4 med migration. Den centrala cortex, visade dock det mest robusta svar. Observera att BMP4 krävdes för att inducera några flytt celler. Explantat odlade i FGF2 visade enbart spridning men ingenmigration; och ingen platta flytt celler observerades enbart FGF2 (Tabell 1 och kompletterande Figur 2).

Supp Figur 1
Kompletterande Figur 1. 400 ^ m Grid File. Gallret fil kan skrivas ut och användas som referens under ovanstående dissektion steg och såsom visas i figurerna 1 och 2. De stora korsningar representerar 2 mm med 400 um underavdelningar. Klicka här för att ladda ner en PDF-version av denna siffra.

Supp Figur 2
Kompletterande Figur 2. BMP 4 -exposed explants Show Platta vandrande celler. Förstoring av celler som visas i figur 5. (A) Control- (FGF2 ensam) och (C) TGFβ1-explantat visat en stark celldelning med små rundade celler. (B) BMP4- och (D) TGFβ1 / BMP4-explantat visade genomgående platta långsträckta celler. Skalstrecket för alla bilder, som visas i (A). 100 um klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1
Kompletterande Figur 3. Sammanfattning av in vitro modellsystem för EMT undersökning. E14.5 råtta central cortex innehåller NSC-innehållande SVZ. Den centrala cortex är antingen used som Explantation bitar eller som enskilda celler. Explantation bitar är mer bekvämt för kvantitativ migration analys (avsnitt 8). Enstaka celler lämpar sig för kvalitativ analys, såsom gen eller proteinanalys (avsnitt 9.13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna studie ett standardiserat system för EMT analys använder NSCs beskrivs (sammanfattas i tilläggs Figur 3). Standardiseringen säkerställer reproducerbarhet (tabell 1 och 2). De NSCs är härledda från framkallnings cortex, en vävnad som normalt inte genomgår EMT. Detta är en fördel för analys av tidiga stegen i EMT. De första stegen i EMT kan inte studerats tillräckligt i tumörceller som har ackumulerats genetiska förändringar och kanske redan har antagit EMT funktioner. Dessutom primära tumörprover är inte idealiskt att förstå EMT eftersom de flesta maligna tumörer heterogena innehållande både invasiva och icke-invasiva celler. De presenterade protokoll ger EMT forskare med en ny modell för att studera tidiga stegen av EMT induktion. Här visar vi att de viktigaste EMT inducerare av Zeb och Twist familj sekventiellt aktiveras: under den första fasen Zeb1 och Zeb2 uppregleras under den andra fasen Twist2 (Figure 6). Tidigare hade vi visat att Snail1 redan uppregleras flera timmar efter BMP4-exponering 8. Vi hade också visat att neuro stamceller från det centrala cortex vid BMP4-exponering differentiera till mesenkymala celler, positiva för glatt muskulatur aktin (SMA) och calponin 9. Resultaten ovan slutföra den tidigare studien i att visa att alla de tre kända nyckel EMT regulatorer är involverade i systemet. Dessutom observerade vi att TGFβ1 avsevärt kan förbättra migrations effekten av FGF2 / BMP4 ensam. Dessa resultat pekar på ett nätverk mellan FGF-, BMP- och TGF-signaleringen under EMT induktion.

De mest kritiska stegen för framgångsrik isolering av NSCs för EMT och migration analys: korrekt identifiera embryonala ålder, identifiera anatomiska landmärken i det växande embryot, beredning av färsk odlingsmedia och (åtminstone över natten) belagda plattor, användning av fina spets instrument och proper dissektion av det centrala partiet av den utveckla cortex för att fastställa kortikala explantat.

De presenterade teknikerna kan förbättras genom vissa modifieringar. Såsom föreslagits ovan, är flera explants placeras i en enda maträtt med ett rutnät. För screening av multipla föreningar, kan det emellertid vara mer praktiskt att placera enstaka explantat i varje brunn i en 96-brunnsplatta. Vidare kan modellsystemet att förfinas för storskalig läkemedelsupptäckt. Som beskrivits ovan, är PDPN en värdefull markör för nyförvärvade flytt funktioner eftersom PDPN finns i invasiva NSCs 8. En PDPN reporter kan transfekteras i normala NSCs före EMT induktion. Som en konsekvens PDPN uttryckande celler kan tjäna som en intern kontroll för celltransformation eftersom PDPN inte uttrycks i normala NSCs (Figur 4 och Tabell 1). Flera ytterligare NSC markörer är tillgängliga, såsom nestin, som går förlorade efter EMT induktion 8. Som en konsekvens,både det ursprungliga tillståndet, "icke-vandrande / icke-invasiv / nestin +", och det slutliga tillståndet, "flyttande / invasiva / PDPN +", kan övervakas, vilket gör automatiserad läkemedelsforskning. I stora cellodlingsplattor med flera brunnar (t.ex. 96-brunnars plattor och större) initiala celler kan sås och behandlas med etablerade läkemedel eller föreningar utan känd funktion. Således kan flerbrunnsplattor automatiskt skannas för uttryck av PDPN eller andra migration / invasion markörer. Om en inhibitor är det främsta målet för skärmen, kan försvinnandet av PDPN uttryck bidra till att identifiera förmodat intressanta nya hämmande föreningar.

Under testning av en ny substans explantaten inte kan visa migration och / eller explantaten får avrunda upp och lossna från skålen. I denna situation är det bäst att bara ändra hälften av media varje dag (i stället för fullständig media förändring varannan dag). Detta minskar stress genom ytspänning vid byte med färskt medium. Deexplantat får inte fästa efter den initiala pläteringen. I denna situation, har fibronektin för att vara i kontakt med diskytan under åtminstone 36 timmar. Fibronektin som används för beläggningen bör beredas utan exponering för ett plaströr för mer än 10 minuter sedan fibronektin kan fastna på plast. Vidare kan explantaten sedimentera utanför gallret. I denna situation är det lämpligt att virvla skålen i en långsam cirkelrörelse. Detta tillåter explantaten att ompositionera till centrum med centripetalkraften (se Figur 3).

Det finns starka bevis för att gliom härrör från NSCs och / eller OPCs härrör från NSCs 23,24. Som en konsekvens andra grupper har etablerat gliom tillväxtmodeller på basis av NSCs:. Sampetrean et al isolerade NSCs från INK4 / ARF-brist möss och tvångsöveruttryck av H-Ras 25. Högkvalitativ maligna tumörer resulte som visade proliferation och invasion efter transplantation 25. McNeill et al. också isolerade NSCs från genetiskt modifierade möss (floxed Rb1, NF1, Kras, PTEN ensam och i kombination) 26. Generna inaktiverades genom Cre-virusinfektion och NSCs transplanterades 26. Båda dessa modellsystem har den fördelen att invasionen kan övervakas in vivo och potentiella nya anti-invasions läkemedel kan testas. Deras huvudsakliga nackdel är att uppkomsten av invasionen inte är väl definierad och det är oklart om cellerna visar gliom-typisk EMT invasion (EMT-gener) eller lokalt migration. Vidare endast ett läkemedel kan testas per djur och analys kräver flera veckor. För att identifiera en ny anti-invasion läkemedel, läkemedelsföretagen behöver (a) att screena för flera tusen föreningar eller mer på en gång, (b) att replikera de tester och (c) att prova olika läkemedelskoncentrationer. För att framställa flera tusen transplanterade djur, behandla dem med olika läkemedel och slutligen testa effekter genom histokemisk eller bioluminiscensanalys är mycket resurskrävande. Här en ny NSC-baserade modellsystem för EMT-relaterad invasionen beskrivs som möjliggör kostnadseffektiv screening av tusentals föreningar.

Även om denna modell möjliggör hög throughput screening av föreningar, är det en primär screening enda plattform. När föreningar av intresse identifieras i denna modell, kommer de att kräva ytterligare verifiering. In vivo-testning är nödvändigt av säkerhetsskäl och effektparametrar för varje förening identifierad och transplantationsmodeller såsom beskrivits ovan blir viktig 25,26. Modellen är också begränsad av det faktum att den är baserad på gnagarceller. Trots att modellen kan användas för att undersöka råtta eller mus EMT, är det oklart om samma mekanismer finns på plats i mänskliga celler eller i den mänskliga patienten. Ytterligare experiment behövs för att undersöka om NSCs är inte bara invasiva in vitro, men också efter transplantation. Flera bevis stödja den roll som NSCsi gliom bildning. Gliom progression har kopplats till följande gener: tenascin C, Hey1, SPARC, Snail1 och Snail2, FGFR +, BMPR1a, EGFR, PDGFRp, Sox2, Podoplanin, Gli3 och p75NGFR 8. Alla dessa gener uttrycks också under omvandlingen av normala icke-invasiva NSCs invasiva mesenkymala celler 8. Vid tidpunkten varelse, är det oklart om NSCs kan omvandlas till tumörer genom extern tillväxt enda faktorerna.

Tumör initiera stamceller (tics) från olika tumörer har isolerats och används som modeller för att förstå tumörprogression 27. Tics är dock inte väl lämpade för EMT analys, eftersom EMT redan skedde i TIC 27. För att förstå tidiga och även sena stegen av EMT-induktion, krävs en primär icke-neoplastisk cellpopulation. Helst denna population inte var tänkt att genomgå EMT i första hand. Det hade tidigare visat att embryonala NSCs var lämpliga kandidater för detta ändamål9,28. Nämligen, kan migration och invasion induceras i NSCs av FGF2 och BMP4 9,28. FGF2 / BMP4-inducerad migration var relaterad till enstaka EMT relaterade gener, dock var fullständig bevisning saknas eftersom nyckel EMT familjer Zeb och Twist inte hade utretts 8. Resultaten ovan visar att en viss kombination av fyra faktorer, FGF2, BMP4, TGFβ1 och insulin orsakar en mycket stark och komplett EMT induktion, inte observerats tidigare. Den aktuella studien visar att de viktigaste EMT gener i Zeb- och Twist-familjer också uppreglerade. Denna studie ger därför det första beviset på att det inte är selektiv uppreglering av enskilda gener, men resultaten visar att alla viktiga EMT familjer är aktiva i det föreslagna cellodlingssystem.

EMT har också observerats i epitelceller cancer utanför hjärnan, såsom lung-, bröst-, kolon och magcancer 29. Flera modeller för att studera EMT är i bruk för dessa tumörer 30-32, Som kommer emellertid med betydande begränsningar: (a) användning av transformerade tumörcellinjer som bär multipla genetiska och epigenetiska förändringar 33; att identifiera hämmare av EMT för tidiga skeden cancer, slutskedet cancerceller är otillräckliga; (B) serumberoende kulturer som innehåller olika odefinierade tillväxtfaktorer; detta gör identifiering av kritiska faktorer mycket svårt. Vidare experiment reproducerbarhet försämras eftersom serum kvalitet varierar från parti till parti, (C) serum innehåller inhibitorer och enzymaktiviteten eventuellt inaktive potentiellt användbara exogena föreningar; (D) Behovet av enzymer för cell passage som försämrar cellytemolekyler; (E) att identifiera EMT-agonister för att främja fysiologiska EMT är normala celler som behövs för att testa induktion. Tumörcellmodeller är otillräckliga för att hitta ämnen som främjar förnyelse i normala stamceller.

Migration krävs också för normala processer, såsom sårläkning och regeneranson av den skadade hjärnan 18. Efter traumatisk hjärnskada och stroke, NSCs är nödvändiga för att migrera till skadestället för att delta i regenere 4,34. Det nuvarande systemet kan också användas för att identifiera ämnen som främjar migration och invasion. Som framgår ovan, är migration induceras vid start med BMP4-behandling. Om cellerna inte utsätts för BMP utan nya föreningar, kan dessa ersätta BMP åtgärd som kommer att bidra till att identifiera nya BMP-agonister. Med ett reportersystem som indikerar PDPN uttryck blir storskalig testning av nya ämnen genomförbart; om en ny förening kan ersätta BMP, kan PDPN uttryckande celler identifieras automatiskt.

Det föreslagna systemet är också användbart för att undersöka cellsignalering interaktioner. Våra resultat visar att BMP effekten på migration skulle kunna förbättras genom TGFβ1 aktivering. Resultaten avslöja en additiv interaktion mellan BMP- och TGFβ-signal. Emellertid ytterligare signalvägar, såsom notch, Wnt- eller EGFR / MAPK- och andra signaleringskaskader kan vara inblandade. Därför behövs ytterligare undersökningar om BMP / TGF-interaktioner och överhörning till andra vägar. Dessutom kan lyhörd centrala cortex isoleras från genetiskt modifierade möss, som kan bidra till att klarlägga bakomliggande mekanismer som driver EMT. Sammanfattningsvis kan EMT modellsystemet som beskrivs här vara till hjälp inom områdena stamcellsbiologi och regenerering, såväl som inom cancerforskningen. Den kan användas för screening av bibliotek läkemedels för substanser som hämmar eller förbättrar migration och invasion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Studien stöddes av University of Basel Science Foundation och Swiss National Science Foundation genom ett bidrag till MHS och AG (SNF IZLIZ3_157230). Vi tackar Dr. Tania Rinaldi Burkat för generöst tillhandahålla infrastruktur; alla medlemmar i Bettler grupp för diskussioner och synpunkter. Vi tackar Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Schweiz) för professionell och kompetent installation av Full HD MC170 videokamera (Leica Microsystems, Schweiz).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Tags

Utvecklingsbiologi neurala stamceller epitelceller till mesenkymala övergång migration, gliom cancer invasion Snail1 fetalt bovint serumfritt FGF2 BMP4 TGF
En enzym- och Serumfritt Neural Stem Cell Culture modell för EMT undersökning Lämplig för Drug Discovery
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D.,… More

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter