Summary
Dit protocol richt efficiënt muis embryonale stamcellen afgeleide definitieve endoderm aan de luchtwegen rijpen epitheelcellen. Deze differentiatie techniek maakt gebruik van 3-dimensionale cellen ontdane long scaffolds rechtstreekse long lijn specificatie, in een gedefinieerd serumvrij cultuurmedium setting.
Abstract
Lung lineage differentiatie vereist de integratie van complexe omgevingssignalen dat groeifactor signaaltransductie, cel-cel interacties en cel-matrix interacties omvatten. Door deze complexiteit, herhaling van longontwikkeling in vitro differentiatie van stamcellen long epitheelcellen bevorderen is een uitdaging. In dit protocol wordt gedecellulariseerde long scaffolds gebruikt om de 3-dimensionale omgeving nabootsen van de long en het genereren van stamcellen afgeleide epitheelcellen. Muis embryonale stamcel eerst gedifferentieerd om de endoderm lijn met een embryoid body (EB) kweekmethode met activine A. Endoderm cellen worden vervolgens gezaaid op ontceld steigers en gekweekt bij lucht-vloeistof-grensvlak tot 21 dagen. Deze techniek bevordert differentiatie van gezaaide cellen functionele epitheelcellen (haarcellen, club cellen en basale cellen) zonder bijkomende groeifactor suppletie. Deze cultuur setup is gedefinieerd, Serum-vrij, goedkoop en reproduceerbaar. Hoewel er weinig vervuiling van niet-long endoderm lineages in cultuur, dit protocol genereert alleen luchtwegepitheelcellen populaties en niet leidt tot alveolaire epitheelcellen geven. Luchtwegepitheel die met dit protocol kan worden gebruikt om cel-matrix interacties te bestuderen bij long organogenese en ziektemodel of drug-ontdekkingsplatformen van luchtwegen pathologieën zoals cystische fibrose.
Introduction
Gerichte differentiatie van pluripotente cellen aan de long lijn afhankelijk is nauwkeurig signaleringsgebeurtenissen in de micro 1,2. Vanwege de dynamische aard van dit proces is een uitdaging om de precieze gebeurtenissen long organogenese bootsen in vitro. Recente rapporten hebben stapsgewijze lijn beperking strategieën oplosbare groeifactor aanvulling van tweedimensionale culturen gebruikt long differentiatie 3-8 bereiken. Bij stapsgewijze differentiatie protocollen pluripotente cellen of embryonale stamcellen (ESC) of geïnduceerde pluripotente stamcellen werden eerst gedifferentieerd om de definitieve endoderm kiemlaag. Endodermale cellen werden vervolgens geduwd om een anterieure endoderm lot en daarna naar de longen stamcellen, zoals aangegeven door de expressie van homeodomein bevatten transcriptiefactor NKX2-1. Deze long voorlopers werden verder gedifferentieerd om proximale (de luchtwegen) of distale (alveolaire) long epitheelcellen with aanhoudende groei factor suppletie. Dergelijke 2-dimensionale strategieën hebben enig succes in het genereren longepitheelcellen had, maar er zijn verschillende beperkingen zoals duidelijk efficiëntie mogelijke verontreiniging van andere endodermale lineages, ontbreken van een 3-dimensionaal (3D) structuur en in sommige gevallen het gebruik van ongedefinieerde culturen met serum supplementatie. Cultuur van pluripotente of gedifferentieerde cellen op cellen ontdane long stellages wordt steeds meer gebruikt als een test om de regeneratieve mogelijkheden van gezaaide cellen voor het vormen longepitheelcellen structuren 3,5,6,8,9 beoordelen. Dergelijke rapporten cultuur gezaaide cellen op steigers met een aanhoudende groei factor of serum suppletie.
Longontwikkeling omvat de afdeling, migratie, genexpressie en differentiatie van individuele cellen als reactie op omgevingsfactoren. De extracellulaire matrix (ECM) is een rooster van glycoproteïnen die naast het verstrekken van structurele ondersteuning, verbindt tissue morfogenese door de integratie en de regulering van deze processen 10,11. Via de longen ECM skelet als natuurlijk bruggenhoofd endoderm cultuur beter bootsen de in vivo ontwikkeling longen milieu, hebben we gegenereerd stamcellen afgeleide epitheelcellen in een gedefinieerde 3D-kweek omgeving met hoge efficiëntie en reproduceerbaarheid.
Ratlong ECM scaffolds werden gegenereerd door ontcelling en muis ESC-afgeleide endodermale cellen werden gegenereerd en vervolgens gezaaid op deze scaffolds. Dual expressie van CXCR4 & c-KIT eiwitten duidt op een definitieve endoderm cel identiteit en cellen positief voor zowel SOX2 & NKX2-1 expressie worden geïdentificeerd als de luchtwegen (proximale long) stamcellen. Definitieve endoderm cellen werden gekweekt bij Air Liquide interface (ALI) gedurende drie weken functionele epitheelcellen in vitro genereren.
Dit protocol bevordert long lineage differentiatie van definitieve endoderm zo vroeg als 7 dagen, waargenomen met de opkomst van NKX2-1 + / SOX2 + vroege proximale long voorouders. Op dag 14 en 21 van de cultuur volwassen luchtwegen epitheelcellen populaties emerge waaronder trilharen (TUBB4A +), club (SCGB1A1 +), en basale (TRP63 +, KRT5 +) cellen met morfologische en functionele gelijkenis met inheemse muis luchtwegen. Dit protocol toont het belang van de 3D-matrix micro-omgeving voor het bereiken robuuste differentiatie epitheelcellen van de luchtwegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen Animal Care Committee van het Hospital for Sick Children Research Institute.
1. Steiger Voorbereiding
- Decellularisatie longen
- Euthanaseren volwassen Wistar ratten met behulp van CO 2 kamer. Plaats dier in de kamer en beginnen met 100% CO 2 blootstelling bij een fill rate van 10-30% van de kamer volume per minuut.
- Observeren van dieren voor bewusteloosheid; Dit vindt plaats na ca. 2-3 min. Als bewusteloosheid niet voorkomt in deze periode, controleer fill rate en kamermuziek afdichting. Naar aanleiding van bewusteloosheid, observeren van dieren voor vervaagde oogkleur en het ontbreken van de ademhaling. Als beide worden waargenomen, te behouden CO 2 vulling voor 1-2 min en verwijder dier uit de kamer voor de procedure.
- Secure dier om het ontleden van het oppervlak door de vaststelling van voorpoten en achterpoten, en spuit langs de borst en de buik met 70% ethanol. Toegang tot het hart en de lungs door het openen van de borstholte via een verticale snede langs het borstbeen.
- Maak kleine incisies tot diafragma eerste zorgen de longen trekken, waardoor de kans op doorprikken van de longen. Ligeren van de inferior vena cava met een hechtdraad en plaats een kleine incisie in het linker atrium met kleine ontleden schaar.
- Met behulp van een voorbereide 10 ml spuit met een 25 G naald gevuld met gehepariniseerde Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) (10 U / ml heparine in HBSS), start longperfusie door de naald in de rechter ventrikel naar de buffer duwen door de pulmonaire circulatie (snelheid van 2 ml / min). Herhaal deze procedure totdat de longen wit worden en de vloeistof die uit het linker atrium loopt duidelijk.
- Na perfusie, bloot de luchtpijp en canule met een plastic katheter in de buurt van de schildklier kraakbeen en vast te zetten met een hechting.
- Setup een zwaartekracht perfusie-systeem door de vaststelling van een 10 ml spuit om een retort stand en klem. Verwijder en discard zuiger. Verzeker maximum vulpunt op spuit op 20 cm boven de longen. Bevestig een twee-weg kraan naar het einde van de injectiespuit, en een lange kunststof slang aan het andere uiteinde van de afsluiter voor het leveren van cellen ontdoen oplossing van de trachea canule. Giet oplossing in spuit en laat oplossing bijgevoegde plastic buizen en de katheter in te vullen.
- Lavage van de longen vult aan totale longcapaciteit (ongeveer 12 ml) gedurende 1 min en verwijder de plastic katheter van de trachea om het fluïdum uit de longen stroomt. Heeft spuit meer dan 10 ml niet vullen wanneer lavaging longen druk onder 20 cm H 2 O. houden
- Herhaling lavage van de longen acht maal met ontcelling oplossing, gevolgd door 10 spoelen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Ontleden de luchtpijp en longen vrij van de nek en borstholte en uit het dier. Houd weefsel in koude PBS bij 4 ° C totdat voorbereiding vibratome sectioning.
- Euthanaseren volwassen Wistar ratten met behulp van CO 2 kamer. Plaats dier in de kamer en beginnen met 100% CO 2 blootstelling bij een fill rate van 10-30% van de kamer volume per minuut.
- Dikke sectie generatie
- Bereid ongeveer 15 ml van 2% en 4% (w / v) agarose, en voldoende 6% (w / v) agarose voor het inbedden alle lobben in kleinere rechthoekige blokken. Ontbinden laag smeltpunt agarose poeder in PBS door de magnetron. Breng de agarose 50 ml buizen op een verwarmingsblok en handhaven temperatuur boven 40 ° C geleren te vermijden.
- Ontleden van cellen ontdane long aan het einde van elke kwab bronchus naar elke lob (craniale, midden, accessoires en caudale rechts lobben en de linker kwab) met behulp van kleine schaar los. Pat droog elke lob absoberend vellen om overmaat PBS halen en binnen 2% (w / v) agarose tijdens het verwarmingsblok.
- Verwijder elke kwab na 5 min van coating in agarose, plaatsen in een petrischaal en laat het oppervlak gel gedurende 1 minuut op een koude plaat.
- Plaats voorzichtig lobben terug in 4% (w / v) agarose, koel na 5 min en herhaal coating nogmaals met 6% (w / v) agarose.
- Na sequentiële coAting van elke lob, insluiten elke lob afzonderlijk op 6% (w / v) agarose met metalen base vormen met tenminste 3 mm agarose rond het weefsel van de randen. Orient elke lob behulp van een tang door het zo kwab grootste vlakke rand aan het oppervlak van de metalen mal tegenover de experimentator. Deze rand zal de zijde met het model plaat voor vibratome snijden vaste zijn.
- Allow blocks geleren op koude plaat gedurende tenminste 30 minuten voor het snijden met vibratome. WINKEL blokken in een vochtige kamer gedurende 12 uur bij 4 ° C voorafgaand aan Vibratome snijden.
- Stel de vibratome door het invullen van het snijden kamer met koude PBS 12. Handhaaf koude temperatuur tijdens het snijden met de omringende ijsbad. Verwijderen blokken van metalen matrijzen en gebruik een scheermesje worden weggesneden agarose rond lobben, terwijl ongeveer 3 mm van de rand van het weefsel.
- Bevestig weefsel naar het centrum van het monster plaat met behulp van lijm, en dompel plaat in tHij PBS gevulde snijden kamer. Setup snijden grenzen op vibratome door het selecteren van de volgende snelheid, de amplitude, en de dikte waarden respectievelijk 0,2 mm / sec, 1,85 mm en 350 micrometer.
Opmerking: Zowel langs- en dwarsdoorsneden van de lob oriëntatie aanvaardbaar. - Sectie elke kwab volledig. Handmatig snijvlakken vrije behulp van kleine schaar of een sectie niet volledig aan het eind van de sectie sequentie wordt gescheiden afgestempeld. Verzamel steiger secties voorzichtig en houdt in PBS op ijs tot de volgende stap.
Opmerking: Secties gegenereerd zal zowel de proximale en distale longgebieden en beide bronnen kunnen worden gebruikt voor hercellularisatie; Het merendeel van het oppervlak distale long omvatten.
- Ontsmetting van steiger secties
- Breng de 350 micron dik steiger secties van PBS om microcentrifugebuizen (tot 30 secties / tube) en behandelen met nuclease (90 U / ml in PBS) (zie lijst van materialen) voor 12-24 uur bij KT, opeen rotator.
- Na nuclease behandeling, overdracht secties behulp van een tang om nieuwe microcentrifugebuizen en behandel met antimicrobiële oplossing (200 U / ml penicilline streptomycine en 25 ug / ml amfotericine B in PBS) onder steriele omstandigheden gedurende 6 uur bij kamertemperatuur op een rotator.
Opmerking: steigers kunnen antimicrobiële oplossing worden bewaard tot één week bij 4 ° C voor gebruik. - Na de sanering stap met antimicrobiële oplossing, spoel steigers tweemaal met PBS onder steriele omstandigheden en over te dragen aan serumvrije differentiatie media (SFDM) voorafgaand aan het zaaien met cellen.
2. endodermale Cell Voorbereiding
- Definitieve Endoderm Inductie
- Handhaaf muis ESC lijnen onder feeder-free, serum vrije cultuur met behulp van 2i omstandigheden 13. Begin endoderm inductie door het verwijderen van cellen uit aanhangend pluripotente cultuur door behandeling met trypsine.
- Resuspendeer cellen in SFDM en zaad bij een dichtheid van 20.000cellen / ml in lage hechtende platen gedurende drie dagen zonder wisselen van materiaal om voor EB vorming.
- Na drie dagen voorzichtig de EBS overbrengen naar 50 ml conische buizen met behulp van een 10 ml pipet en voor de verzameling bij de bodem voor 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Zorgvuldig aspireren de media en voeg verse SFDM media aangevuld met 50 ng / ml activine A.
- Zaadcellen terug op het lage hechtende platen bij een 1: 2 dichtheid en kweek gedurende drie opeenvolgende dagen om definitieve endoderm differentiatie bereiken.
- Definitieve endoderm verrijking
- Verzamel dag 6 EBS, distantiëren met trypsine en label voor c-KIT en CXCR4 expressie met behulp van geconjugeerde fluorescente antilichamen 14.
- Sorteer gelabelde cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) voor expressie van beide markers om een verrijkte populatie definitieve endoderm 15 verkrijgen.
3. hercellularisatie Setup
- Lucht-vloeistof grensvlakcultuur setup
- Transfer elke gedecellulariseerde steiger sectie (stap 1.2.9) van SFDM op een hydrofoob zwevende membraan (8 urn poriegrootte) met behulp van een steriel pincet. Zorg ervoor steiger secties zijn gelijkmatig verspreid over het membraan.
- Bereid 6- of 12-well platen vult putjes met 1 of 0,5 ml SFDM respectievelijk. Plaats voorzichtig membranen in putten, zodat de membraan zweven boven media, het creëren van een cultuur opstart lucht-vloeistof.
- Het zaaien van 3D steigers
- Na FACS definitieve endoderm markers (stap 2.2.2) tellen gesorteerde cellen met behulp van een hemocytometer, spin down bij 400 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer in SFDM. Resuspendeer cellen een hoeveelheid die ongeveer 100.000 cellen / 10 ul / scaffold verkrijgen.
- Om steigers recellularize, pipet 10 ul van cellen direct op elke bereid deel uit stap 3.1.2.
- Vervang SFDM media in culturen per 48 uur. Zuig het oude media door met de plaat op een lichte hellingniet te verstoren de kweek. Voeg langzaam vers SFDM cultuur langs de kant van de put te voorkomen zinken of drijven membraan.
- Onderhouden air-vloeibare kweken gedurende maximaal 21 dagen differentiatie van gezaaide cellen bereiken om rijpe luchtwegepitheel.
Opmerking: Recellularized secties kunnen worden verwerkt voor weefsel kleuring en immunofluorescentie (IF) microscopie op elk tijdstip tijdens de celcultuur 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals beschreven in dit protocol, robuuste differentiatie van definitieve endoderm aan epitheelcellen kan worden bereikt met behulp van uitgebreide cultuur van de gezaaide cellen op cellen ontdane long schavot secties rijpen. Aanbevolen wordt cellen ontdane steigers worden gekarakteriseerd om te garanderen (1) gastheercellen worden volledig verwijderd, en (2) extracellulaire matrixeiwitten worden vóór gebruik draagstructuren voor differentiatie behouden. Decellularisatie kan worden beoordeeld met behulp van weefsel kleuring met hematoxyline en eosine (H & E) en 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), zoals geïllustreerd in figuur 1A. Sterk vergrotende scanning elektronenmicroscoop (SEM) analyse van steigers bevestigt de afwezigheid van gastheercellen en intacte matrix architectuur, zie figuur 1B. Bijkomende karakterisering van de resterende steiger door trekproeven en immunokleuring voor matrixeiwitten kunnen worden uitgevoerd om corrosie M waarborgenion van de ECM volgende decellularisatie 16.
Niet-hechtende kweek SER in SFDM media zes dagen resulteert in de vorming van cel aggregaten (EBS) zoals geïllustreerd in figuur 2A. Drie dagen van activine A behandeling leidt tot een definitieve endoderm inductie. Lineage beperking van ESC om definitieve endoderm kan worden bevestigd door opregulatie en expressie van endoderm-lineage geassocieerde genen en eiwitten 17, en kan niet morfologisch worden gesteld. Endoderm-inductie efficiency varieert van 50-70%, afhankelijk van de ESC-lijn gebruikt. De experimenten werden uitgevoerd in de muis ESC lijnen uitgevoerd: R1 (Nkx2-1 mCherry), G4 (DsRed -MST), en 129 / Ola (Bry-GFP / FOXA2-hCD4), terwijl alle gegevens geïllustreerd in dit handschrift wordt met behulp van de R1 cel lijn. De dubbele positieve CXCR4 + / c-KIT + definitieve endoderm bevolking gesorteerd zoals afgebeeld in figuur 2B, geëntop 3D long scaffolds, en gedurende maximaal 21 dagen in lucht-vloeistof-grensvlak in SFDM. Het is belangrijk om te sorteren en verrijken definitieve endoderm die naamloze organisatie en differentiatie wordt bereikt met kweek van cellen van ongesorteerde heterogene dag 6 EBS zoals geïllustreerd in figuur 2C. Structuren gevormd door gesorteerde cellen op steigers doen denken ontwikkelen long (embryonale dag 13,5) zoals geïllustreerd in figuur 2C-D. In onze ervaring, heeft een seeding dichtheid van 100.000 gesorteerde cellen / steiger de beste steiger herbevolking opgeleverd.
Differentiatie aan de long lijn wordt reeds na 7 dagen na kweek scaffold. Luchtwegepitheelcellen progenitorcellen positief voor NKX2-1 en SOX2 worden gedetecteerd met behulp IF confocale analyse zoals getoond in figuur 3A. SOX2 positief, NKX2-1 negatieve cellen zijn waarschijnlijk pluripotente endodermale cellen die niet gedifferentieerd naar de longen lineage. Bij langere kweek deze cellen kunnen beginnen te NKX2-1 uiten of apoptose te ondergaan zonder adequate ondersteuning in de micro-omgeving. IF analyse van dag 21 kweken onthult een volwassen populatie luchtwegepitheelcellen met TUBB4A + haarcellen, SCGB1A1 + club cellen en TRP63 + / + KRT5 basale cellen zoals geïllustreerd in figuur 3B. SEM analyse van het oppervlak van dag 21 kweken onthult morfologische gelijkenis van stamcellen afgeleide culturen muis luchtwegen.
Zowel geïsoleerd matrixeiwitten (collageen I, collageen IV, fibronectine, laminine) en cellen ontdane rat nier scaffolds konden long-lineage differentiatie bevorderen na enting met definitieve endoderm en gekweekt onder dezelfde omstandigheden als hierboven 16 beschreven. Hieruit blijkt dat de 3D micro door long afgeleide steigers verschilt van de nier afgeleide steigers in zijn vermogen om long-lineage differentiatie van zaad bevorderend endodermale cellen.
Figuur 1. Decellularisatie techniek verwijdert cellulaire componenten en behoudt ECM. (A) H & E (bovenste paneel) en DAPI (onderste paneel) kleuring van natuurlijke en cellen ontdane longweefsel toont de afwezigheid van kernen volgende decellularisatie. Rechter paneel toont voorbeelden van coupes van longen zonder optimale decellularisatie. Pijlpunten tonen overige kernen op steigers als gevolg van onvolledige decellularisatie, met de nadruk op het belang van het optimaliseren van techniek voor hercellularisatie. Schaal bar = 25 pm. (B) SEM beelden van de natuurlijke en gedecellulariseerde long, toont afwezigheid van cellen en het behoud van matrix architectuur op gedecellulariseerde steigers. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hiervoor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Gesorteerd ESC-afgeleide definitieve endoderm resulteert in een optimale hercellularisatie. (A) Dag 6 embryo organen (EBS) na drie dagen van activine A behandeling voor het bevorderen van de definitieve endoderm differentiatie. (B) De EBS worden gesorteerd door FACS voor dubbele expressie van oppervlaktemerkers CXCR4 en c-KIT de definitieve endoderm populatie te isoleren. Deze populatie wordt gezaaid op gedecellulariseerde steigers. (C) H & E kleuring van recellularized steigers op dag 7 en dag 21 van de cultuur. Linkerpaneel vertegenwoordigt georganiseerd, luchtweg-achtige structuren na enten met gesorteerde cellen, en het rechter paneel vertegenwoordigt ongeorganiseerd, zeer proliferatieve ongesorteerde cellen op steigers waarin het belang van het sorteren van de cellen voorafgaand aan hercellularisatie. Schaalbar = 30 micrometer. (D) H & E kleuring van embryonale dag 13,5 muis longen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Extended cultuur van definitieve endoderm op natuurlijke long steigers leidt differentiatie aan epitheelcellen van de luchtwegen. (A) Proximale long stamcellen (NKX2-1 + / SOX2 +) worden opgespoord na zeven dagen van cultuur op gedecellulariseerde steigers. Schaal bar = 15 micrometer. (B) image shows Links volwassen pseudostratified epitheelcellen (CDH1 +) structuren omzoomd door basaal membraan eiwit laminine op de basale kant van structuren. Midden en rechts beeld tonen volwassen luchtwegepithelen compleet met trilharen cellen (TUBB4A +), cluB-cellen (SCGB1A1 +) en basale cellen (KRT5 + / TRP63 +). Linker afbeelding schaal bar = 30 urn; midden en rechts beeld schaal bar = 15 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven protocol genereert volwassen ESC-afgeleide luchtwegepithelen met uitsluitend natuurlijke long steigers aan direct differentiatie met geen andere suppletie. Deze cultuur setup is gedefinieerd, serumvrij, goedkoop en reproduceerbaar. Geen groeifactor suppletie base differentiatie media vereist. Eerder gepubliceerde werkwijzen voor het genereren stamcellen afgeleide longepitheelcellen gebruikt 2-dimensionale strategieën groeifactor suppletie van afstamming beperking 3,4,8,18,19 promoten. De hier beschreven techniek is voordelig ten opzichte van deze werkwijzen om verschillende redenen, waaronder: gedefinieerde kweekomstandigheden, hoge efficiency differentiatie functionele cellen luchtwegen, beperkte verontreinigingen uit andere geslachten endodermale (schildklier, lever, pancreas), en een 3D differentiatie micromilieu. Deze techniek levert vergelijkbare resultaten met muis afgeleide ECM en kan daarom worden gewijzigd cellen ontdane draagstructuren via muizenlongen genereren. -Rat afgeleide SER gedifferentieerd om definitieve endoderm en gezaaid op steigers met dit protocol ook differentiëren naar luchtwegepithelen.
Cellen ontdane scaffolds kan tot 7 dagen voor hercellularisatie worden opgeslagen in decontaminatie oplossing bij 4 ° C. Steigers gedurende langere tijdsduren functioneel zijn, maar we hebben niet getest om dit te bevestigen. Efficiënte organisatie en differentiatie te bereiken is het noodzakelijk om te verrijken voor de definitieve endoderm door FACS na inductie met activine A. Niet-endoderm cellen in 6 dagen EBS zeggen vaak pluripotentie marker Oct4 en als gezaaid op steigers blijft verspreiden zonder organisatie en de specificatie long afkomst. De zaaidichtheid kan ook worden aangepast op basis cellijn-specificiteit om volledige hercellularisatie van steigers bereiken.
Een beperking van dit protocol is in het onvermogen om differentiatie bevorderen alveolaire epitheelcellen. Hoewel NKX2-1 + / + SOX9 distale progenitorcellen worden gedetecteerd na zeven dagen kweken op steigers, deze populatie niet aanwezig op dag 14 en dag 21. Markers van volwassen type I alveolaire epitheelcellen (AQP5) en type II alveolaire epitheelcellen (SFTPB, SFTPC) worden niet gedetecteerd in elk stadium tijdens de steiger cultuur. Dit kan komen door een behoefte aan extra groeifactor suppletie en ondergedompelde kweekcondities alveolaire lineage specificatie bevorderen, terwijl hier beschreven matrixeiwitten en het overblijfsel-matrix gebonden groeifactoren op cellen ontdane steigers voldoende luchtwegen lineage differentiatie bevorderen.
De kritische stap voor het bevorderen van differentiatie van definitieve endoderm epitheelcellen via long steigers luchtweg optimalisering van het proces decellularisatie. Cellulaire componenten moeten volledig worden verwijderd terwijl matrix componenten behouden blijven. Weefsel kleuring voor nucleair materiaal met behulp van DAPI, ultra-structuurural analyse van steigers met scanning en transmissie elektronenmicroscopie, en DNA-assays kunnen worden gebruikt voor verwijdering van alle cellulaire componenten te bevestigen. ECM eiwitsamenstelling van steigers kunnen worden beoordeeld met behulp van IF vlekken en immunoblot-analyse voor matrix eiwitten: collageen I, collageen IV, elastine, fibronectine, heparine sulfaat proteoglycanen en laminine 16.
Deze stamcellen afgeleide longepitheel kan in ziektemodel en drug discovery-platforms van luchtwegen pathologieën zoals cystische fibrose. Het potentieel van deze celmatrixconstructen regeneratieve toepassingen zoals weefselherstel en celtherapie kunnen worden onderzocht door in vivo transplantatie van gemodificeerde constructen in verschillende muismodellen. Bovendien kan deze 3D in vitro werkwijze voor de differentiatie luchtwegen eenvoudig worden aangepast aan verschillende parameters bewerkstelligen long lineage specificatie bestuderen door het manipuleren groeifactor beschikbaarheid en cel-matrix signaleringculturen tijdens de verschillende stadia van differentiatie steigers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen concurrerende financiële belangen te verklaren.
Acknowledgments
Wij willen Dr. Rossant en Dr. Bilodeau bedanken voor de Nkx2-1 mCherry ESC gebruikt in experimenten afgebeeld in figuren 1-3. FACS werd uitgevoerd in De SickKids-UHN flowcytometrie Facility. Dit werk werd ondersteund door het bedienen van subsidies van de Canadese Institutes for Health Research en een infrastructuur subsidie (CSCCD) van de Canadese Stichting voor Innovatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10 U/ml heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8 mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25 mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1 M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90 U/ml Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200 U/ml penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25 μg/ml amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200 mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4 μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05 mg/ml ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1,000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1,000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
