Introduction
סרטן השד הוא הסרטן שאובחן הנפוץ ביותר אצל נשים ואת הסיבה המובילה השנייה של מקרי מוות הקשורים לסרטן 1. שיעור התמותה הגבוה של סרטן השד הוא בעיקר בשל כישלון הטיפול קונבנציונלי להמתיק ולחסל מחלה גרורתית; כ -90% ממקרי המוות מסרטן הן בשל גרורות 2. הבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס של המפל גרורתי היא בעל חשיבות עליונה בפיתוח תרופה יעילה הוא מוקדם סרטן השד בשלב מאוחר.
מחקרים שנערכו בעבר סייעו להבהיר את האופי הרב השלבים של גרורות סרטן שד ההיפותיזה הוא התוצאה של שתי התקדמות סרטן הגרורות תלויה במידה רבה על אינטראקציות בין תאים הסרטניים מארח הסביבה 3. תצפיות קליניות הראו כי סרטן רב להציג כמיהות איברים, כלומר., הנטייה גרורה ספציפי מועדפת organs.In את הרשויותדואר של סרטן השד, המחלה של מטופל בדרך כלל מתפשטת או גרורות עד 5 אתרים מרכזיים, כולל העצם, ריאות, בלוטה לימפה, כבד, ומוח 4-6. תאוריות רבות פותחו כדי להסביר את התהליך הזה, אבל רק מעטים מהם עמדו במבחן הזמן. התיאוריה של גרורות של יואינג, הציע בשנת 1920, שיערו thatthe חלוקת גרורות נבע אך ורק גורמים מכניים; לפיו תאים סרטניים מבוצעים בכל הגוף על ידי דפוסי זרימת דם פיסיולוגי מוגדרים נורמלים פשוט לעצור במיטת הנימים הראשונה שהם נתקלים 7. לעומת זאת, השערת 1889 "זרע ואדמה" של סטיבן פאג'ט הציעה אינטראקציות מולקולריות נוספות היו אחראי ההישרדות והצמיחה של גרורות, לפיו תאים סרטניים ( "זרעים") יכולים רק להקים לעצמם microenvironments איבר proliferatein המייצרים גורמים מולקולריים מתאימים ( "אדמה ") 8. כמעט מאה שנה מאוחר יותר, לאונרד וייס תחתלקח מטה-אנליזה של נתוני נתיחה שפורסמו בעבר ואשר תחזיתו של יואינג שגידולים גרורתי רבים שהתגלו בעת הנתיחה נמצאו בפרופורציות הצפויות כי יהיה צפויות אם נקבעו כמיהות איבר גרורתי ידי דפוסי זרימת דם לבד. עם זאת, ב manyinstances היו גרורות פחות או יותר נוצר באתרים מסויימים, יהיה צפוי על ידי גורמים מכניים המוצע של יואינג 9. חשבונות אלה והתיאוריות מראים כי microenvironments איבר מסוים לשחק תפקיד קריטי בדפוסי ההפצה והצמיחה הבאה והישרדות של סרטן רב, כוללים סרטן השד.
מאמצי מחקר בעבר התמקדו בעיקר על גורמים שהתקבלו תאים סרטניים תרומתם כמיהות האיבר שנצפו גרורות סרטן השד 10-12, מחקר קטן אולם יש גורמים בחנו נגזרים microenvironment האיבר שעשויה לספק נישה נוחה להקמהשל גרורות סרטן השד. זאת במידה רבה על האתגרים הטכניים של לימוד מרכיבי המיקרו-סביבת האיבר במבחנה.
המאמר הנוכחי מתאר מערכת מודל מקיף לשעבר vivo לחקר השפעת רכיבים מסיסים של קשרי לימפה, עצמות, ריאות, והמוח על התנהגות גרורתי של תאי סרטן שד אנושיים. מחקרים קודמים תוקפים מערכת מודל זה על ידי ההוכחה כי שורות תאי סרטן השד שונות להציג התנהגות ממאיר תא אונליין ספציפי איבר ספציפי בתגובת תקשורת ממוזג איבר שמתאים שלהם in vivo גרורתי 13 פוטנציאליים. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי לזהות ולהעריך גורמים מסיסים ספציפיים הנגזר איבר שעשוי לשחק תפקיד בהתנהגות גרורתי של שד וסוגים אחרים של תאים סרטניים, כוללים השפעות על צמיחה, הגירה, הגבעולי התנהגות, ביטוי גנים, כמו גם זיהוי שלמטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות לסרטן. זוהי מערכת מודל vivo לשעבר הראשון, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את ההתנהגות גרורתי איבר ספציפי בפירוט כדי להעריך את התפקיד של גורמים מסיסים הנגזרות איבר נהיגה לתהליך של גרורות סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים, תחת הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת המשנה השתמש בבעלי חיים באוניברסיטת המערבי.
1. בידוד איברים (ריאות, מוח, עצם, הלימפה)
- הכן ארבעה צינורות חרוטי 50 מ"ל סטרילי (אחד עבור כל איבר להיות מבודדת) המכיל כ 30 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט סטרילית (PBS). טרום לשקול צינור אחד של PBS באמצעות משקל אלקטרוניות.
- להרדים 6-12 בשבוע עכבר ישן משאיפת CO 2. עכברים יש להשאיר בתא CO 2 למשך כ 1 - 2 דקות או עד העכבר מפסיק לזוז ונשימה. המתת חסד מוצלחת ניתן אישור נוסף על ידי חוסר דופק כאשר בדקו באופן ידני עם אצבע. הימנע נקע בצוואר רחם כשיטה זה עלולה לגרום לפריצת כלי דם של הצוואר המוביל לקושי הסרת בלוטות הלימפה בבית השחי.
הערה: מחקרים קודמים המשמשים במיוחדעכברים עירום נשי בריא, HSD: athymic Nude- Foxn1 נו 13. - במנדף בתרבית רקמה סטרילית, במקום את העכבר על גבו על כרית קצף פוליסטירן, להפיץ את הגפיים ולהשתמש סיכות כדי לשמור אותם במקום.
- בעזרת מלקחיים ומספריים סטרילי, לחתוך את עור הבטן על קו האמצע על אברי המין ופצע כלפי מעלה לכיוון הפה. משוך בעדינות בחזרה את עור הבטן מן שרירי הבטן ואת הסיכה במקום על משטח קצף פוליסטירן.
- אתר את בית השחי, הזרוע, ואת בלוטות הלימפה מפשעתי.
הערה: בלוטות הלימפה בדרך כלל מוקפים רקמת שומן. בלוטות הלימפה מפשעתי הם הקלים ביותר לאיתור כפי שהם מצאו שטחי בצומת של שני כלי דם על עור הבטן משוך לאחור. בלוטות בית השחי והלימפה הזרוע נמצאות עמוקות בתוך הרקמה ודורשות תמרון עדין של רקמות.- לאחר שאיתרת את בלוטות הלימפה, השתמש במספריים בעדינות ובזהירות לחתוך את לימפה לאdes מהעור, שומן וכלי ולהסיר אותם מן העכבר. כדי לאשר דיסקציה נכונה, לגלגל את המלקחיים על הרקמה שהוסרה. אם גוש קשה קיים כאשר מתגלגלים מלקחיים על הרקמות, ולאחר מכן לימפה סבירה הוסרה בהצלחה.
- מניחים בלוטות לימפה שהוסרו ב PBS קר כקרח.
- באמצעות מלקחיים ומספריים, לפתוח את חלל הבטן על ידי חיתוך דרך דופן הבטן נחשף בתנועה כלפי מעלה לכיוון החזה. בזהירות לחתוך דרך עצם החזה, חושף את חלל בית החזה.
- אתר את הסרעפת מתחת הריאות לחתוך את הסרעפת. זה צריך למשוך לכיוון הצלעות בשל מתח.
- הרם את הריאות מתחת וחתך את הרקמה הבסיסית כלפי קנה הנשימה. זה מאפשר לריאות להסירו בחופשיות את חלל בית החזה. הסר את הלב והריאות כמקשה אחת ומניחים PBS קר כקרח. הלב ניתן להסיר מהריאות כאן או ממש לפני שקילת שלב 2.
- הסר אתסיכות, שמירה על העכבר במקום על משטח קצף פוליסטירן. סובבו את העכבר מעל לחתוך את העור של כל הגב התחתון הדרך מול ירך אל ירך.
- באמצעות פיסת סטרילית של גזה להחזיק את פלג הגוף העליון של העכבר, לקלף את העור האחורי של העכבר על הרגליים וכפות הרגליים של העכבר.
- שימוש באותה פיסת גזה סטרילי, להחזיק את הרגל התחתונה במקום, בזהירות לשבור את מפרק הקרסול של הרגל העכבר לקלף את העור מעל המפרק proximally כלפי מפרק הברך.
- בעזרת מספריים, להסיר את השוקה ללא מפרק הברך ומניחים PBS קר כקרח.
- חזור על שלבי 1.11) 1.12) עם איבר הפוך.
- בעזרת מלקחיים, להחזיק את הירך במקום, לחתוך משם לרקמות שרירות באמצעות המספריים להסיר את עצם הירך, הצבתו בקרח הקר PBS.
- חזור על שלב 1.14) עם איבר הפוך.
- באמצעות יצירה חדשה של גזה סטרילי, להחזיק את הראש של העכבר במקום. בעזרת מלקחיים ומספריים, להסיר את העור בעדינות כדי לחשוף את היםכול. בעזרת מספריים, לחתוך את הגולגולת העורפית בזהירות מהמרכז העליון בקו ישר וכלפי מטה כדי לחשוף את המוח האחורי.
- בעזרת מלקחיים, סקופ מתחת למוח לכיוון הקדמי והסר את המוח כולו. מניחים את המוח ב PBS קר כקרח.
- חזור על שלבים 1.1) ל 1.17) עבור ארבעה עכברים לפחות.
2. איברים שקילים
- בעקבות בידוד איברים, לשקול כל צינור PBS המכיל ריאות רקמת המוח באמצעות משקל אלקטרוניות.
- חשב את ההבדל במשקל על ידי הפחתת המשקל טרום בידוד (PBS בלבד) מן המשקל של הצינור + איברי PBS (ריאות ומוח).
- לקבוע את כמות תקשורת צריכה resuspend שברי רקמה מפער המשקל המחושב.
הערה: ריאות רקמת המוח היא משקל מתוקנן לפי resuspension בתוך 4: יחס רקמות (כרך / WT): 1 מדיה.
דור 3. Lung- ואת מוח מדיה אוויר
- בחולצת סטריליברדס נושא התרבות, להפוך צינורות PBS המכילים ריאות או מוח שלוש פעמים כדי להסיר דם שיורית מאיברים לשאוב PBS המכילים דם. חזור עם קר PBS הטרי עד הפתרון נראה ברור ומובן ללא ראיות דם.
- מניח ריאות ומוח בצלחות פטרי זכוכית נפרדות 60 מ"מ 2. באמצעות שני להבי אזמל סטרילי, ריאות בשר טחונות או מוח על ידי החיתוך הלוך ושוב מספר פעמים עד שברי רקמה כ ~ 1 מ"מ 3 בגודל.
- שברי הרקמה Resuspend בנפח המתאים (נקבע בעבר בשלב 2.3) של בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM): התקשורת F12 בתוספת 1x מרוכז תוספת mitogen ו פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל).
- להוסיף רקמת ריאה או המוח מושעה שבר כדי אחד טוב של צלחת 6 באר.
- דגירה שברי רקמה בתקשורת במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר דגירה, לאסוף מותנה מדיה לכל רקמות further לדלל על ידי הוספה שלושה כרכים מקבילים של תקשורת הטריה צינור חרוטי 50 מיליליטר.
- צנטריפוגה XG ב 1000 ב מדיה בדילול מותנית עבור כל איבר על 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להסיר שאריות רקמה גדולות. איסוף supernatant התקשורת ולסנן דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר.
- ברכת מותנית תקשורת מכל איבר (כלומר., ריאות עם ריאות ומוח עם מוח) מעכברים מרובים לתת דין וחשבון על השתנות עכבר אל עכבר. Aliquot ולאחסן מותנה התקשורת ב -80 ° C עד השימוש.
דור 4. של מח העצם ממוזג מדיה
- במנדף בתרבית רקמה סטרילית, לקצץ רקמה עודפת מהעצם ולהסיר אפיפיזות (חתיכות סוף) מהעצמות במספריים.
- באמצעות חלל מדולרי 27 ½ מחט G, סומק של עצמות ידי דחיפת 1 מ"ל של PBS דרך מרכז כל עצם. זה יאפשר לך לאסוף תאי סטרומה מח עצם (BMSC) לתוך צינור טרי המכיל PBS.
- צנטריפוגה ב 1,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ולשטוף BMSC פעמים עם PBS. בתאי סטרומה מח עצם Resuspend ב 20 מ"ל של התקשורת צמיחת תאים העצם סטרומה (DMEM: התקשורת F12 בתוספת 1x מרוכז תוספת mitogen, פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל) ו בסרום עוברי 10% Boven (FBS) ).
- פלייט 10 מ"ל של תאי סטרומה מח עצם resuspended ב בבקבוק T75 אחד.
הערה: שלב ותאי צלחת מכל 2 עכברים בכל בבקבוק T75; במשך ארבעה עכברים, שתי צלוחיות T75 נדרשות (כ 1 x 10 7 תאים / בקבוקון). - דגירת תאי סטרומה מח עצם בתקשורת צמיחת תא עצם סטרומה למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר דגירה, להסיר התקשורת משני T75 צלוחיות והכניסו בבקבוק T75 חדש, תווית הבקבוק הזה כמו "לרחפן Flask". הוסף מדיה צמיחת תאי העצם סטרומה טריה 2 צלוחיות קודמות דגירה כל 3 צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר התאים מגיעים כ 70% confluency (כ 5 - 7ימים) תאי מעבר. לשם כך, הסר בינוני לשטוף את התאים פעמיים עם PBS (3 מ"ל כל אחד לשטוף). הסר PBS ולהוסיף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין / EDTA, הבטחת טריפסין שמכסה את כל פני השטח של הבקבוק. לאחר התאים להרים את הבקבוק (~ 2 - 3 דקות), להפסיק trypsinization תגובה על ידי הוספת 3 מיליליטר תקשורת צמיחת תאי עצם סטרומה). צנטריפוגה 900 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך תקשורת, ותאי resuspend ב 10 מיליליטר של תקשורת צמיחת תאים הטריה עצם סטרומה.
- תאי ברכה מכל הצלוחיות והמעבר 1: 5 לשלוש צלוחיות T75 חדשות לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר תאים שוב להגיע ל -70%, וחזור על שלב 4.6 וברכה ומעבר לכל התאים החסידים בשנית. Re-צלחת כל התאים ארבע צלוחיות T75 דגירה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תקשורת צמיחת עצם תא סטרומה אמורה לשמש עבור כל השלבים.
- אפשר תאים מגיעים למפגש, לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף תקשורת אוסף תא עצם סטרומה (DMEM: F12 תקשורת + 1x su mitogen המרוכזpplement + פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל); 10 מ"ל / T75), ולוודא כי המדיה הזו היא ללא FBS. אסוף התקשורת עצם ממוזג מח 72 שעות מאוחר יותר, לסנן דרך 0.22 מיקרומטר מסנן, בריכה, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C עד השימוש.
- אם תרצה, לאשר את הפנוטיפ של תאי סטרומה מבודדים מח עצם (BMSC) באמצעות נוגדנים כנגד SCA-1 עכבר, CD105, CD29, CD73 ו, CD44, באמצעות זרימת תקן cytometry טכניקות כפי שתואר לעיל 13.
דור 5. לימפה צומת ממוזגת מדיה
- במנדף בתרבית רקמה סטרילית, ללא מרחב צינור PBS המכיל בלוטות הלימפה שלוש פעמים כדי להסיר דם שיורית בלוטות הלימפה לשאוב PBS הדמים. חזור עם קר PBS הטרי עד הפתרון נראה ברור ומובן ללא ראיות דם.
- מניחים בלוטות הלימפה ב -60 מ"מ 2 זכוכית בצלחות פטרי. באמצעות שני להבים אזמל סטרילי, בלוטות לימפה בשר טחון על ידי חיתוך הלוך ושוב מספר פעמים עד tissuשברי דואר הם כ 1 מ"מ 3 בגודל.
- בתוך צינור חרוטי, שברי הרקמה resuspend ב 10 מ"ל של מכון ממוריאל פארק רוזוול 1640 (RPMI1640) התקשורת השלימו עם פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל), 5 x 10 -5 M סטרילי β-mercaptoethanol ( 1.75 μl / 500 מ"ל מדיה) ו -10% FBS.
- צנטריפוגה ב 900 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו resuspend כל התאים 30 מ"ל התקשורת. הוסף 5 מ"ל מדיה / היטב צלחת 6-היטב דגירה במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר דגירה 7 יום, להשליך התקשורת, לשטוף תאים חסיד עם 5 מ"ל PBS חם ולהוסיף 5 מ"ל התקשורת טרי היטב כל אחד. אפשר לתאים לגדול כדי confluency (כ 5 - 7 ימים), trypsinize, בריכת כל התאים, ומעבר כמתואר בשלב 4.6. Re-צלחת תאים לצלחת 6 באר. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
- אחרי שלושה קטעים, ולאפשר לתאים לגדול confluency, לשטוף בארות שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף 2 מ"ל / היטב DMEM: F12 + 1xתוספת ו פניצילין mitogen מרוכז (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל), כדי להבטיח את המדיה הזו היא ללא FBS. אסוף התקשורת ממוזג בלוטת לימפה לאחר 72 שעות, בריכה, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C עד השימוש.
- אם תרצה, לאשר את הפנוטיפ של תאים סטרומה בלוטת לימפה מבודדים (LNSC) באמצעות נוגדנים כנגד CD45 העכבר gp38, באמצעות זרימה תקן cytometry טכניקות כפי שתואר לעיל 13.
6. שימוש מדיה איברים ממוזגים עבור מבחני Downstream קשורים להתנהגות גרורתי של תאי הסרטן
- ברגע התקשורת ממוזג האיבר נוצר כמתואר בשלבי 1 - 5, ולהשתמש בו כדי לבצע תא במורד זרם שונה מבחני ביולוגיה מולקולריים כדי לקבוע את השפעתם של גורמים מסיסים הנגזר איבר על ההתנהגות גרורתי של תאים סרטניים. דוגמאות של מבחני תקן (תארו במקום בספרות) כוללות מערכי חלבון 13, מבחני צמיחה הסלולר <sup> 13, הגירה הסלולר מבחני 13, tumorsphere היווצרות 14, ו RT-PCR 15. תקשורת הבסיס המקורית השתמשה כדי ליצור את התקשורת ממוזג איבר (כלומר, בלתי מותנית DMEM:. תקשורת F12 בתוספת 1x מרוכזת mitogen כתוספת פניצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) אמור לשמש כביקורת שלילית .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדור של מדיה איברים ממוזג
דיאגרמה סקירה / סכמטי של התהליך של בידוד איברי דור התקשורת המותנה מוצג באיור 1, עם דימויים מצולמים נציג של ההליך שמוצג באיור 2. יצוין כי כאשר בפרוטוקול זה היה ראשון בפיתוח, כבד נכלל בניתוח שלנו כי זה אתר משותף של גרורות סרטן השד. עם זאת, בשל הכמות הגדולה של פרוטאזות המיוצרת ומופרשת על ידי הכבד, קשה מאוד לשמור על כבד קיימא מספיק זמן כדי ליצור מדיה טובה מותנה באיכות. תקשורת כבדה ממוזג היא גם לא יציבה פעם מבודדת, ויש נוטה להיות הרבה משקע חלבון, סביר מאותה הסיבה. לכן כבד לא נכלל כל ניתוח נוסף.
r.within-page = "1"> עבור הדור של node- הלימפה ומדיה ממוזג עצם במיוחד, את הפנוטיפ של תאי סטרומה מבודדים (LNSCs ו BMSCs) יכול להיות מאושרת על ידי התבוננות המורפולוגיה הסלולר שלהם על ידי מיקרוסקופ בשילוב עם immunophenotyping ידי תקן cytometry זרימה. תאי סטרומה צריכים להיות דבקים בתרבות, עם LNSCs הוכחת פנוטיפ מאורך fibroblastic (איור 3 א) ו BMSCs הוכחת מראה קטן יותר (איור 3 ג). ניתוח תזרים cytometric מאשרת כי LNSCs הם בעיקר CD45 - ו gp38 +, עם ~ 60% של תאים בעלת CD45 - gp38 + פנוטיפ מעיד LNSCs 16 (איור 3 ב). BMSCs צריכה להיות חיובית עבור CD44 ו CD29, חיובי חלש עבור CD105 ו SCA-1, ושלילי עבור CD73 (איור 3D - H), מעיד על BMSCs 17,18.
תאי סרטן שד שו"תonse לדפוסי הגירה ושינויים ביטוי גנים איברים מתאימים
שימוש זה במערכת מודל vivo לשעבר, זה כבר הוכיח בעבר כי תאי סרטן השד אנושיים עם משתני רקע גנטי גירת התערוכה דיפרנציאלי דפוסי צמיחה כלפי תנאי איבר מסוימים. יש לציין, דפוסים אלה לשקף את דפוסי הפצת גרורתי הידוע של שורות תאים אלה in vivo 13. במחקר הנוכחי, עצם (231-BOM) - וריאות (231-LM2) -seeking גרסאות של גרסאות תא מד"א- MB-231 אנושיים סרטן השד (מתנה סוג מד"ר ג'ואן Massagué 11,12) היו גם השתמשו ב assay הגירה transwell לאשר דפוסי הנדידה איבר מתאים. התוצאות מראות כי העצם שוחר גרסת 231-BOM נודדת מועדפת לתקשורת העצם מותנה מח מעל המוח ו lung- תקשורת מותנה (איור 4 א, מהשמאל). באופן דומה, נודדת גרסת 231-LM2 שוחרת ריאות מועדפות למדיה ממוזגים ריאות פני אמצעי פרסום עצם ממוזג מח ומדיה ממוזג מוח (איור 4 א, מימין). יתר על כן, ניתוח RT-qPCR מראה שחשיפה של תאי סרטן השד הוריים מד"א- MB-231 כדי מעצם שוק או מדיה ממוזגת ריאות גורמת גברת ביטוי של גנים הקשורים גרורה עצם ספציפי (CXCR4, IL-11, TGFß1) או lung- גרורות ספציפיים (VCAM1) של תאים סרטניים בשד in vivo 11,12 (איור 4B). תוצאות אלו מראות את תוקפו של מערכת vivo לשעבר שונים מבחינת כמיהות האיבר הצפויות של תאי סרטן שד in vivo, ומציינת כי מסיסי גורמי נוכח תקשורת איבר ממוזג יכולים להשפיע פנוטיפ תא גרורתי בנוסף לקידום הגירה.
מדיה איברים ממוזגים מכילה מגשרים מסיסים פוטנציאל של התנהגות גרורתי
ביוטין מערך נוגדן עכבר תווית מבוסס שמש כדי להעריך את הנוכחות וזהות של גורמים מסיסים נפוצים מדיה איבר ממוזג מאיברים שונים. מערך זה כולל נוגדנים נגד 308 של מערך חלבון proteins.This עכבר המסיס הנפוץ ביותר כבר השתמש בעבר כדי לזהות גורמים מסיסים עניין הקשורים בהווה המפל גרורתי בתוך התקשורת מותנית ריאות ועצמות מח כמוצג צ'ו et al (2014) ו Pio ואח '(2015) בהתאמה 13,14. במחקר הנוכחי, תוצאות מערכי חלבונים מוצגות עבור מדיה הבזליים (איור 5 א) לעומת node- הלימפה (איור 5) ומדיה ממוזג מוח (איור 5 ג). מואר ליד כל מערך מסיסים גורמים נוכחיים בתקשורת כי כבר נמצאו יקושר עם צעדים במפל גרורתי בספרות 19-29. fac המסיס אלהtors עשוי להיות שווה לחקור כמתווכי פוטנציאל של גרורות משניות בתוך אתרי איבר אלה.
סקירה כללית באיור 1. סכמטי של התהליך של בידוד איברים הדור של מדיה אלפה. רקמות (ריאות, מוח, עצם ירך, שוקה ובלוטות לימפה) נקצר מן העכבר. ריאות, בלוטות מוח הלימפה טחונות עם אזמל. מוח עצם הוא שנקטף המחלל מדולרי של העצמות ידי דחיפת PBS דרך החלל עם מחט G 27½. שברי ריאות ומוח רקמות מודגרת לתקופה של 24 שעות לפני הדילול עם שלושה כרכים מקבילים של תקשורת הבסיסית רעננה ומיושבים לעשות lung- והמוח ממוזג תקשורת. מוח עצם ותאי סטרומה בלוטה לימפה הם passaged 2 - 3 פעמים לפני הדוגרים עם תקשורת בסיסית לעשות עצם והלימפה תקשורת צומת ממוזגת. תקשורת שנקטפה יכולה להיות pooled ומאוחסנים ב -80 ° C עד מוכן לשימוש מבחני במורד כגון מערכי חלבון, מבחני צמיחה הסלולר, מבחני הגירה הסלולר, tumorsphere היווצרות, ו RT-PCR. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. נציג תמונות צילום של נוהל בידוד איברים הדור של מדיה אילף. ביום 0, הריאות, המוח, עצם הירך, השוקה ובלוטות לימפה נאספים מן העכבר. הריאות, בלוטות המוח והלימפה ממוקמות בתוך צלחת פטרי מזכוכית 60 מ"מ 2 ו טחון עם שני להבי אזמל כ 1 מ"מ 3 בגודל. מח העצם נאסף המחלל מדולרי של העצמות ידי דחיפת PBS דרך החלל עם מחט 27 ½ G לתוך צינור טרישל PBS. שברי רקמת הריאה והמוח מודגרת לתקופה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפני הדילול עם שלושה כרכים מקבילים של תקשורת הטריה שנאספו לעשות lung- והמוח ממוזג תקשורת לאחר 24 שעות. סטרומה צומת מח עצם והלימפה התאים מודגרת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו passaged 2 - 3 פעמים (~ 3 שבועות סה"כ) לפני החלפת מדיה עם תקשורת בסיסית בסרום ללא לעשות עצם והלימפה תקשורת צומת ממוזגת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אפיון איור 3. הלימפה מבודדים סטרומה מח עצם תאים. (א) תמונת מיקרוסקופ שדה בהיר מראה את המורפולוגיה של תאי סטרומה בלוטת לימפה (LNSCs). (ב) תזרים נציגcytometry ניתוח LNSCs באמצעות Phycoerythrin (PE) מצומדות נוגדנים gp38 וכן isothiocyanate והעמסת (FITC), מצומדות נוגדן CD45. (C) תמונת מיקרוסקופ שדה מוארת מראה את המורפולוגיה של תאי סטרומה מח עצם (BMSCs). (DH) תזרים נציג cytometry ניתוח BMSCs באמצעות מצומדות PE (פרופילים שחורים) נוגדנים נגד (D) CD44, (E) CD106, (F) SCA-1, (G) CD29, (H) CD73 נוגדנים ביחס לשליטת אלוטיפ (פרופילים לבנים). מינימום של 10,000 אירועי קיימא נאסף לדגימה. נתון זה יש הבדל בין 13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. אורגן-מתאים דפוסי הגירה ותמורות ביטוי גנים בתגובת מדיה איברים ממוזגים. (א) עצם שוחר 231-BOM וריאנטים (משמאל, ברי פסים) או ריאות שוחרות 231-LM2 הגירסות (מימין, ברי פסים) של הקו הסלולרי מד"א- MB-231 אנושיים סרטן השד, כמו גם מד"א- MB- ההורית 231 תאים (שני הלוחות, מוטות מוצקות) היו מצופים על מוסיף מצופה ג'לטין (עם 8 מיקרומטר נקבוביים) לפני מיקום מדיה הבזליים (DMEM: F12 + תוספת mitogen מרוכזת) או איבר-CM. הצלחות הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 18 שעות. (ב) כל האוכלוסייה מד"א- MB-231 תאים ההורים נחשפו גם עצם-CM (משמאל) או ריאות-CM (מימין) עבור 48h. RNA היה מבודד לכמת באמצעות RT-qPCR. שינויים בביטוי גנים בתגובת איבר-CM (פסים שחורים) היו מנורמלים GAPDH והביעו ביחס ביטוי בסיס בתקשורת הבזליים (פסים אפורים). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (N = 3; לקפל-שינוי משליטה שלילית בהתאמה של תקשורת הבסיסית). * = שונה באופן מהותי מן התקשורת בסיסית; δ = שונה באופן מהותי מן הקו סלולארי הורים שטופל באותם תנאי התקשורת; P <0.05, ANOVA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. איברים ממוזגי מדיה מכילה מגשרים מסיסים פוטנציאל של התנהגות גרורתי. ביוטין תווית מבוסס עכבר נוגדן מערך שמש לזיהוי גורמים מסיסים הנמצאים לימפה צומת-CM ו-CM המוח. ממברנות הודגרו עם דגימות biotinylated של (א) התקשורת הבזליים (DMEM: F12 + תוספת mitogen מרוכז), (ב) לימפה הצומת-CM או (ג)-CM המוח ב 4 o CO / N ו דמיינו באמצעות chemiluminescence. אליפסות כחולות עולות בקרות פנימיות חיוביות, תיבות מרופדות מצביעים שולטים שלילי פנימי ותיבות מוצקות לציין את הגורמים מסיסים של עניין כי הם מעורבים פוטנציאליים בהתנהגות גרורתי של תאי סרטן השד אל קשרים לימפה או מוח. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה דמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גרורה היא תהליך מורכב שבאמצעותו סדרה של אירועים הסלולר היא בסופו של דבר אחראי על גידול פלישת רקמות ומרוחק ההקמה 4,30,31. מערכת מודל vivo לשעבר המוצגת כאן יכולה להיות מנוצלת כדי ללמוד שני היבטים חשובים של התקדמות גרורתי: ביות תאים סרטנית או הגירת איבר מסוים ( "להגיע לשם") וגידול האיבר ( "גדלתי שם"). מחקרים רבים בעבר התמקדו בזיהוי מאפיינים מולקולריים מפתח הקשורים לתאי הסרטן עצמם שתורמים לתהליך הגרור. לדוגמא, עבודה שנעשתה על ידי הקבוצה של ג'ואן Massagué זיהתה חתימות גן שונות הקשורות ריאות ספציפיות, עצם ספציפי, ודפוסים ספציפיים במוח של התפשטות 10-12,32. בעוד עבודה זו מספקת תובנות חשובות לגבי התרומה של תאים סרטניים לתהליך זה, הרבה פחות ידוע על תפקידם של גורמים ספציפיים איבר שנתרמו על ידי tהוא המיקרו-סביבה משנית, אשר נותר מאתגר יחסית ללמוד 13.
לשעבר זו מערכת מודל vivo תאומת בעבר ייצוג מדויק של microenvironment האיבר משני על ידי ההוכחה כי תאי סרטן השד ספציפי קו הגירה וצמיחת איבר-CM מראה קווי תאים אלה "בדפוס vivo של התפשטות גרורתית. מחקר שנערך על ידי צ'ו ועמיתיו השתמשו בארבע שורות תאי סרטן שד אנושיים שונים עם משתנים פוטנציאל גרורתי in vivo, כולל מד"א- MB-231 ו SUM-159 (מאוד גרורתי, גרורות אל הלימפה הצומת, ריאות, כבד, עצמות ומוח in vivo ) ואת ב in vivo SUM-149 ו מד"א- MB-468 (גרורתי בינונית, גרורות הלימפה וסרטן הריאות). שניהם מד"א- MB-231 ו SUM-159 שורות תאים מוצגות ההגירה מוגברת כלפי עצם מארו, לימפה node- וריאות-CM בעוד שורות תאים SUM-149 ו מד"א- MB-468 היגרו מועדף כלפי ריאות-CM 13. המחקר הנוכחי מוכיח כי מעצם השוק וריאות שוחרת מד"א- MB-231 גרסאות שניהם מעדיפים להגר מארו עצם וריאות-CM בהתאמה שחשיפה-CM איבר יכול לקדם את הביטוי של מעצם השוק וגנים גרורתי הקשורים ריאות בעבר זיהו ידי Massagué ועמיתיו 11,12. יחדיו, תוצאות אלה ממחישות כי האיבר-CM מספק נציג פלטפורמת vivo לשעבר של גורמים מסיסים ספציפי איבר נמצאים vivo המשפיעים על הפנוטיפ והתנהגות של תאי סרטן השד.
זיהוי גורמים מסיסים נוכחיים בתוך איברים ספציפיים הרמות היחסיות של ביטוי מהווה נקודת התחלה לקביעת ההשפעה אפשרית על התנהגות תאים סרטניים. יתר על כן, שימוש בטכניקות כגון immunodepletion יכולים לאפשר למשתמש לרוקן חלבון ביעילות עניין מצד-CM איבר כדי לקבוע את השפעתו על התנהגות הסלולר במבחנה. לדוגמה, גורמים מסיסים רבים נוכחים בתוך microenvironments איבר מסוים לתפקד chemoattractants ויש להם את הפוטנציאל לגרום גירת תרבות תאים. העבודות קודמות נעשו באמצעות-CM ריאות הובילו לזיהוי גורמים מסיסים רבים נוכחים ריאות-CM שעשוי לשמש chemoattractants עבור תאי סרטן השד, כולל osteopontin (OPN) ו- L-selectin (למכור) 13. על ידי immunodepleting הגורמים הללו מן-CM ריאות, צ'ו ועמיתיו הצליחו להדגים הגירה הסלולר צמצם ו / או צמיחה של גרורתי מאוד 13 מד"א- MB-231 סרטן השד תאים. תוצאות אלו מראות כי תקשורת מותנית המופקת איברים שלמים מספקים משאב יקר ערך עבור לומד את ההשפעות של גורמים מסיסים ספציפיים על התנהגות תאים סרטניים, תוך השימוש בטכניקות מסורתיות במבחנה.
למרות זאת היא מערכת מודל פשוטה למדי, יש כמה צעדים בפרוטוקול הניסוי כי הם קריטיים עבור successfuדור l של תקשורת ממוזג איברים. ראשית, השימוש של עכברים בגילאי המוגדר של 6-12 שבועות קציר האיברים חשוב כדי לשלוט על תופעות הקשורות לגיל, או הקשורים לפיתוח (לפני 6 שבועות) או הקשורים להזדקנות ב עכברים מבוגרים. שנית, עקרות הן בעל חשיבות עליונה בכל הפרוטוקול ניתן להבטיח בצורה הטובה ביותר באמצעות השימוש בטכניקה מזוהמת הקפדנית ולעבוד במנדף בתרבית רקמת סטרילית, באמצעות מתכלים בתרבית רקמה מעוקרים ריאגנטים וכן אנטיביוטיקה קלה בכל התקשורת והתרבות והתוספים ( כלומר., פניצילין / סטרפטומיצין). אחד האתגרים עם באמצעות in vivo או מערכות מודל vivo לשעבר הוא שונה חיה-אל-חיה הגלומה בו. אם זה ציין, שלבי הפתרון כוללים ואיגום התקשורת המותנה המתקבל מספר אצוות של עכברים לפני השימוש בניסויים במורד הזרם, כמו גם להבטיח כי במדיות lung- והמוח ממוזג הם במדויק משקל מנורמל בכל ליניסוי אוסף dia ידי resuspension בתוך 4: מדיה 1: יחס רקמות (נפח / משקל). בנוסף, מח הצומת ועצמות הלימפה העיקרי בתאי סטרומה אסורים יעלו על 70% confluency בכל מעבר שניתנו או להיות מבוגר מעבר 5 קטעי הכל, אחרת הם יבדילו סופנים.
עשיית שינויים הפרוטוקול המובא במאמר זה יכול להיות שחזה לאפשר יישום כדי בתחומים שונים של מחקר. למרות המודל הזה עד כה נעשה שימוש בלעדי למחקר סרטן השד, ניתן להשתמש בו באופן פוטנציאלי כדי ללמוד את התפקיד של גורמים מסיסים הנגזר איבר בסוגים אחרים של הסרטן, כמו גם מדינות פיסיולוגיות ומחלות נורמליות נוספות. בנוסף, בעוד בשיטה זו נעשתה שימוש כאן עם מודלי עכבר בעירום מדוכאי חיסון, טכניקה זו היא תיאורטית לא רק מין זה של עכברים ואפילו עלול לשמש עם סוגים אחרים של מודלים של בעלי חיים.
בעוד מודל זה מספק importaNT תובנה באשר תרומתם של גורמים מסיסים ספציפיים הנגזר איבר על התנהגות תאים סרטניים, זה לא בלי המגבלות. ראשית מודל זה מתמקד אך ורק על המרכיב המסיס של microenvironments איבר, אשר מזניח את החשיבות של מטריקס (ECM). ה ECM הוא הווה מרכיב בלתי תאי בתוך כל סוגי הרקמות והפונקציות כדי לספק הוא פיגום פיזי לתאים, כמו גם את יכולתו להשפיע על רמזים ביוכימיים ביומכנית חיוניים הדרוש תהליכים תאיים שונים, לרבות morphogenesis, התמיינות תאים ו -33 הומאוסטזיס -35. חשוב לציין, הרכב הפיזי ביוכימיים של ECM הוא הטרוגנית נרחבת יכול להשתנות במידה רבה בין סוגי רקמות. לכן, הרכב ספציפי הרקמות של ECM יכול להיות גם השפעה על כמיהות איבר במהלך גרורות סרטן ניתן להתעלם עם המודל הזה. ה ECM עשויה לפעול גם להתרכז גורמים מסיסים ספציפיים באופן appropriately מציג אותם תאים מסוימים, וללא כוונון עדין זה של ECM, האינדוקציה של איתות הסלולר עלולה להצטמצם או שינתה 36. למרות המודל שהוזכר במאמר זה חסר מרכיב ECM מתאים, מחקרים רבים יכולים להיות מחוזקים על ידי שימוש בגישה חינם ניצול הוא המודל שהוזכר כאן יחד עם מרכיב ECM מתאים. לדוגמה, פיברובלסטים איבר העיקרי זמינים מסחרית כי לסנתז ECM אנדוגני או רכיבים ECM רקומביננטי יכול לשמש בנוסף לאבר-CM שנוצר כדי לקבוע את מלוא היקף במיקרו-סביבה של איבר שלם על התנהגות הסלולר.
יתכן כי microenvironment המסיס שנוצר מהאיבר-CM לא יכול כראוי לחקות את מה הוא פיסיולוגי נוכח במהלך התהליך של גרורות. תא ההישרדות מסרטן, צמיחה והתקדמות הם תלויים במידה רבה על אינטראקציות בין מאכסן תאים סרטניים 4,30,31. הדור של איבר-CM כולו עשוי לגרום presence גורמים מסיסים לא הביעו בדרך כלל על ידי סוגי תאים היוצרים אינטראקציה עם תאים סרטניים במהלך התקדמות גרורתי. יתר על כן, זה כבר הוכיח בעבר כי הנוכחות של גידול ראשוני יכולה לווסת את המיקרו-הסביבה של גרורות מרוחקות, ובכך "תחול" אותם הגרורות 37. מאז הפרוטוקול הנוכחי משתמש איברים שמקורם בריאים, עכברי גידול שאינם נושא, כדאי להשוות את הגורמים המסיסים נגזרים איברים בעכברי נושאי גידול שד ראשוני.
בשל ההפרדה המכאנית של איברים שלמים בדור של איבר-CM השונה, גורמים תאיים עשויים להשתחרר לתוך תקשורתי סביב אשר לא יכול בדרך כלל להיות נתקל פיסיולוגי על ידי תאים סרטניים. בנוסף, צומת נגזרת מעצם שוק והלימפה תקשורת מותנה מחייב culturing של תאי סטרומה מבודדים מאיברים אלה לפני לאוסף שלהם. תא סוגים נוכחים במהלך vivo לשעבר cultuטבעת עלולה שלא לייצג את הרוחב מדויק של סוגי הסלולר נתקלו פיסיולוגי על ידי תאים סרטניים. בעוד תאים סטרומה בעיקר מפרישים גורמים רבים הקשורים במיקרו-סביבות שונות איבר, באמצעות שיטות אלה לא יכול להסביר את ההשפעה של סוגי תאים אחרים הנמצאים בתוך רקמות ואיברים 38. לבסוף, כללנו תוסף mitogen בתקשורת הבסיס המשמשת לייצור תקשורת איבר ממוזג, כי מצאנו כי הדבר דרוש כדי לשמור על יכולת הקיום של שני האיברים התרבותיים (ריאות ומוח) ואת BMSC מבודד LNSC. עם זאת, אנו מכירים אזהרה כי בנוכחות תוספת mitogen זה יכול היה מגורה האיברים לייצר גורמים מסיסים באופן מלאכותי כי הם עלולים לא לעשות בדרך כלל,
לסיכום, מחקרים רבים הראו כי microenvironments איבר מסוים יכול להשפיע עמוקות בביולוגיה תאים סרטניים. למרות המגבלות דנו, מערכת מודל vivo לשעבר הציג כאן represents טכניקה מקיפה ללימוד ההשפעה של microenvironment המסיס של איברים מוצקים רבים על התנהגות הסלולר. במעבדה של המחברים, מערכת מודל זה הייתה וממשיכה לשמש כאמצעי לחקר רב של אירועים הסלולר הקשורים גרור, כולל פלישה, הגירה, שגשוג, הגבעולי התנהגות ושינויי ביטוי גנים. הנתונים צברו ממחקרים אלה יכולים בתורו ליידע את היישום קליני הפוטנציאל של מערכת מודל זה לתאי סרטן השד ראשוניים מבודדים גידולים המטופל על מנת לקבוע את תגובתם microenvironments השונה המייצגים גרורים פוטנציאלית. יחדיו, הוא קיווה כי הבנה נוספת של אינטראקציה בין התאים המיקרו-סביבה ו הגידול בזמן תהליך של כמיהות איבר גרורתי יוביל לשיפור הטיפול בסרטן בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
- Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278 (1928).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
- Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
- Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
- Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
- Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
- Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
- Zlotnik, A. Chemokines and cancer. Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).
- Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
- Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
- Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805 (2014).
- Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
- Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
- Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).
- Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
- Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).
