Introduction
سرطان الثدي هو الأكثر تشخيص كثير من الأحيان السرطان في النساء والسبب الرئيسي الثاني لوفيات المرتبطة بالسرطان 1. ويرجع ذلك أساسا إلى فشل العلاج التقليدي لتخفيف والقضاء على المرض المنتشر ارتفاع معدل الوفيات بسرطان الثدي؛ و ومن المقرر أن الانبثاث 2 ما يقرب من 90٪ من الوفيات الناجمة عن السرطان. فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء سلسلة النقيلي أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة في كل من سرطان الثدي في وقت متأخر من مرحلة مبكرة و.
وقد ساعدت الأبحاث السابقة توضيح طبيعة متعددة الخطوات الانبثاث سرطان الثدي والافتراض بأن نتائج كل تطور السرطان والانبثاث تعتمد إلى حد كبير على التفاعل بين الخلايا السرطانية والبيئة المضيفة 3. وتشير الملاحظات السريرية أن العديد من أنواع السرطان عرض مع الأجسام الجهاز، أي، الميل إلى metastasize تفضيلي محددة organs.In في الاكاديمية(ه) من سرطان الثدي، مرض المريض ينتشر عادة أو مستطير إلى 5 المواقع الرئيسية، بما في ذلك العظام والرئتين والعقد اللمفاوية والكبد والدماغ 4-6. وقد وضعت العديد من النظريات لتفسير هذه العملية، ولكن فقط عدد قليل صمدت أمام اختبار الزمن. افترضت نظرية يوينغ من ورم خبيث، واقترح في 1920s، وكان يدفع الكروب توزيع ورم خبيث المناسب بدقة العوامل الميكانيكية. يتم بموجبها الخلايا السرطانية في جميع أنحاء الجسم عن طريق أنماط تدفق الدم الفسيولوجي محددة العادية وببساطة اعتقال في السرير الشعرية الأولى التي تصادف 7. في المقابل، اقترح ستيفن باجيت 1889 "البذور والتربة" فرضية أن التفاعلات الجزيئية إضافية هي المسؤولة عن بقاء ونمو الانبثاث، حيث الخلايا السرطانية ( "بذور") يمكن تأسيس أنفسهم فقط وmicroenvironments الجهاز proliferatein التي تنتج عوامل الجزيئية المناسبة ( "التربة ") 8. بعد قرن تقريبا، ليونارد فايس تحتأخذ التحليل التلوي من البيانات التشريح نشرت سابقا، وأكد التنبؤ يوينغ أن العديد من الأورام النقيلي الكشف في وقت تشريح الجثة وجدت في نسب المتوقع أن يتوقع إذا تم تحديد النقيلي مع الأجسام الجهاز من أنماط تدفق الدم وحدها. ومع ذلك، في manyinstances كان هناك عدد أقل أو أكثر الانبثاث شكلت في بعض المواقع ثم يتوقع من العوامل الميكانيكية المقترحة يوينغ 9. هذه الحسابات والنظريات تشير إلى أن microenvironments الجهاز معينة تلعب دورا حاسما في أنماط نشر والنمو اللاحق وبقاء العديد من أنواع السرطان بما فيها سرطان الثدي.
فقد ركزت جهود الأبحاث السابقة أساسا على عوامل مستمدة ورم خلايا ومساهمتها في الجهاز مع الأجسام التي لوحظت في سرطان الثدي النقيلي 10-12، والعوامل ولكن القليل من البحث واستكشاف المستمدة من المكروية الجهاز الذي يمكن أن يوفر مكانة مواتية لإنشاءالانبثاث سرطان الثدي. ويعزى هذا إلى حد كبير إلى التحديات التقنية لدراسة مكونات المكروية الجهاز في المختبر.
توضح هذه المقالة الحالية المجراة سابقا نظام نموذج شامل لدراسة تأثير مكونات قابلة للذوبان من العقدة الليمفاوية والعظام والرئة، والمخ على السلوك المنتشر من خلايا سرطان الثدي البشرية. والتحقق من صحة دراسات سابقة هذا النظام النموذج من قبل مما يدل على أن مختلف خطوط خلايا سرطان الثدي تعرض سلوك الخلية خط محددة وهيئة محددة الخبيث ردا على وسائل الإعلام مكيفة الجهاز الذي يتوافق مع في الجسم الحي النقيلي المحتملة 13. هذا النظام النموذجي يمكن استخدامها لتحديد وتقييم العوامل القابلة للذوبان المستمدة من الجهاز المحددة التي قد تلعب دورا في سلوك النقيلي سرطان الثدي وأنواع أخرى من الخلايا السرطانية، بما في ذلك التأثيرات على النمو والهجرة ووقف مثل السلوك، والتعبير الجيني، فضلا عن تحديدالأهداف العلاجية الجديدة المحتملة لمرض السرطان. وهذا هو أول فيفو السابقين نموذج النظام التي يمكن استخدامها لدراسة سلوك جهاز معين المنتشر في التفاصيل، وتقييم دور العوامل القابلة للذوبان المستمدة من الجهاز في دفع عملية الانبثاث سرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا لتوصيات المجلس الكندي للرعاية الحيوان، تحت البروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة ويسترن الحيوان استخدام الفرعية.
1. الجهاز عزل (الرئة، المخ، العظام، العقدة الليمفاوية)
- إعداد أربعة العقيمة 50 مل أنابيب مخروطية (واحد لكل عضو أن تكون معزولة) التي تحتوي على حوالي 30 مل من العقيمة مخزنة المالحة الفوسفات (PBS). قبل تزن كل أنبوب من برنامج تلفزيوني باستخدام ميزان الكتروني.
- الموت ببطء 6-12 أسبوع الماوس القديم CO 2 الاستنشاق. يجب ترك الفئران في غرفة CO 2 لحوالي 1-2 دقائق أو حتى يتوقف الماوس المتحركة والتنفس. القتل الرحيم ناجحة يمكن وأكد كذلك بسبب عدم وجود ضربات القلب عند فحصها يدويا مع إصبع. تجنب التفكك عنق الرحم لأن هذا الأسلوب قد تمزق الأوعية الدموية في الرقبة مما يؤدي إلى صعوبة إزالة الغدد الليمفاوية الإبطية.
ملاحظة: استخدمت العمل السابق على وجه التحديدصحية الفئران عارية الإناث، HSD: Athymic Nude- Foxn1 نو 13. - في نسيج الثقافة هود العقيمة، ضع الماوس على ظهرها على وسادة رغوة البوليسترين، ونشر أطرافه واستخدام الدبابيس لإبقائها في مكانها.
- باستخدام ملقط معقم والمقص، وقطع الجلد في منطقة البطن في خط الوسط على الأعضاء التناسلية وقطع صعودا نحو الفم. برفق إلى الخلف جلد البطن من عضلات البطن ويعلقون في مكان على لوحة البوليسترين رغوة.
- تحديد موقع إبطي، العضدية، والغدد الليمفاوية الأربية.
ملاحظة: محاصرون العقد الليمفاوية عادة الأنسجة الدهنية. الغدد الليمفاوية الأربية هي أسهل لتحديد مكان كما هي موجودة بشكل سطحي عند تقاطع اثنين من الأوعية الدموية على انسحبت جلد البطن. تقع الإبطين والليمفاوية العضدية العقد أعمق داخل النسيج، وتتطلب المناورة لطيف من الأنسجة.- بعد أن كنت قد تقع الغدد الليمفاوية، استخدم مقص لقطع بلطف وعناية الليمفاوية لاقصر بعيدا عن الجلد والدهون والسفن وإزالتها من الماوس. لتأكيد تشريح السليم، ولفة ملقط على الأنسجة التي تمت إزالتها. في حالة وجود ورم الثابت عند المتداول ملقط على الأنسجة، ثم تمت على الأرجح تم إزالة العقدة الليمفاوية بنجاح.
- وضع الغدد الليمفاوية إزالة الجليد الباردة في برنامج تلفزيوني.
- باستخدام ملقط ومقص، وفتح تجويف البطن من خلال قطع جدار البطن كشفها في حركة تصاعدية نحو الصدر. قطع بعناية من خلال القص، وفضح التجويف الصدري.
- موقع الحجاب الحاجز تحت الرئتين وقطع الحجاب الحاجز. يجب أن سحب نحو الأضلاع بسبب التوتر.
- رفع الرئتين من تحت وقطع الأنسجة الكامنة نحو القصبة الهوائية. وهذا يسمح للرئتين لإزالتها بحرية من التجويف الصدري. إزالة القلب والرئتين ككتلة ومكان في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. يمكن إزالة القلب من الرئتين هنا أو قبل وزنها في الخطوة 2.
- مسح الدبابيس، والحفاظ على الماوس في مكان على لوحة البوليسترين رغوة. تحويل الماوس فوق وقطع الجلد من أسفل الظهر على طول الطريق عبر من الجناح إلى الجناح.
- باستخدام قطعة معقمة من الشاش لعقد الجذع من الفأرة، قشر الجلد الخلفي من الماوس فوق الساقين والقدمين من الفأرة.
- باستخدام نفس قطعة من الشاش المعقم، عقد الجزء الأسفل من الساق في المكان، بعناية كسر مفصل الكاحل للقدم الماوس وقشر الجلد فوق المفصل قريب نحو مفصل الركبة.
- باستخدام مقص، وإزالة الساق خالية من مفصل الركبة ومكان في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
- كرر الخطوات من 1.11) إلى 1.12) مع الطرف الآخر.
- باستخدام ملقط، مع الاستمرار على عظم الفخذ في مكان، وقطع بعيدا المحيطة الأنسجة العضلية باستخدام مقص وإزالة عظم الفخذ، ووضعها في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
- كرر الخطوة 1.14) مع الطرف الآخر.
- باستخدام قطعة جديدة من الشاش المعقم، عقد رئيس الماوس في المكان. باستخدام ملقط ومقص، وإزالة بلطف الجلد لفضح الصورةكول. باستخدام مقص، وقطع بعناية الجمجمة القفوية من مركز أعلى في خط مستقيم والهبوط لفضح الدماغ الخلفي.
- باستخدام ملقط، مغرفة تحت الدماغ نحو الجزء الأمامي وإزالة الدماغ كله. وضع الدماغ في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
- كرر 1.1) إلى 1.17) خطوات للا يقل عن أربعة الفئران.
2. الجهاز يزن
- بعد العزلة الجهاز، تزن كل أنبوب برنامج تلفزيوني يحتوي على أنسجة الرئة والدماغ باستخدام ميزان الكتروني.
- حساب الفرق الوزن عن طريق طرح الوزن قبل العزل (PBS فقط) من وزن أنبوب برنامج تلفزيوني + أجهزة (الرئة والدماغ).
- تحديد كمية وسائل اللازمة ل resuspend شظايا الأنسجة من الفرق الوزن المحسوب.
ملاحظة: الرئة وأنسجة المخ هي الوزن تطبيع قبل إعادة تعليق في 4: 1 وسائل الإعلام: نسبة الأنسجة (المجلد / وزن).
3. الجيل من وسائل الإعلام Lung- والعقول مكيفة
- في تي معقمقضية الثقافة غطاء محرك السيارة، عكس أنابيب تحتوي على برنامج تلفزيوني الرئة أو الدماغ ثلاث مرات لإزالة الدم المتبقي من الأجهزة ونضح برنامج تلفزيوني يحتوي على الدم. كرر مع برنامج تلفزيوني الباردة العذبة حتى يظهر حل واضح مع عدم وجود دليل على الدم.
- وضع الرئتين والعقول في 60 ملم 2 أطباق بتري زجاجي منفصلة. باستخدام اثنين شفرات المشرط المعقم والرئتين اللحم المفروم أو العقول التي كتبها تشريح مرارا ذهابا وإيابا حتى شظايا الأنسجة ما يقرب من ~ 1 مم 3 في حجم.
- شظايا الأنسجة resuspend في حجم مناسب (التي سبق تحديدها في الخطوة 2.3) من Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM): وسائل الإعلام F12 تستكمل مع 1X تتركز ملحق mitogen والبنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل).
- إضافة معلق الرئة أو أنسجة المخ شظايا في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا.
- احتضان شظايا الأنسجة في وسائل الإعلام لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد الحضانة، وجمع مكيفة وسائل الإعلام لكل الأنسجة ووurther يخفف بإضافة ثلاثة مجلدات معادلة من وسائل الإعلام الجديد في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج في وسائل الإعلام مكيفة المخفف لكل جهاز في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة الحطام الأنسجة كبير. جمع طاف وسائل الإعلام وتصفية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون.
- تجمع مشروطة وسائل الإعلام من كل جهاز (أي والرئة مع الرئة والدماغ مع الدماغ) من الفئران متعددة لحساب التباين الماوس إلى ماوس. قسامة ومخزن واشترطت وسائل الإعلام في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. الجيل من وسائل الإعلام مكيفة نخاع العظام
- في العقيمة هود زراعة الأنسجة، وتقليم الأنسجة الزائدة من العظام وإزالة المشاش (نهاية القطع) من العظام مع مقص.
- باستخدام 27 ½ G إبرة، تجويف النخاع دافق من العظام عن طريق دفع 1 مل من برنامج تلفزيوني من خلال مركز كل العظام. وهذا سوف يسمح لك لجمع خلايا نخاع العظام اللحمية (BMSC) في أنبوب الطازجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني.
- أجهزة الطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وغسل BMSC مرتين مع برنامج تلفزيوني. و resuspend نخاع العظم خلايا انسجة في 20 مل من وسائل الاعلام نمو الخلايا اللحمية العظام (DMEM: وسائل الإعلام F12 تستكمل مع 1X تتركز mitogen ملحق، البنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل) و 10٪ بوفن الجنين المصل (FBS) ).
- لوحة 10 مل من خلايا انسجة نخاع العظم معلق في قارورة T75 واحد.
ملاحظة: الجمع بين والخلايا لوحة من كل الفئران 2 في كل قارورة T75. لمدة أربعة الفئران، وهناك حاجة إلى اثنين من قوارير T75 (حوالي 1 × 10 7 خلايا / قارورة). - احتضان العظام خلايا نخاع اللحمية في انسجة العظام وسائل الاعلام نمو الخلايا لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد الحضانة، وإزالة وسائل الإعلام من كل من قوارير T75 ووضعها في قارورة T75 الجديدة، تسمية هذه القارورة ب "العوام قارورة". إضافة انسجة العظام وسائل الاعلام نمو الخلايا جديدة لقوارير السابقة 2 واحتضان جميع القوارير 3 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- بعد خلايا تصل إلى ما يقرب من 70٪ confluency (حوالي 5-7أيام) خلايا مرور. للقيام بذلك، وإزالة المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني (3 مل كل غسل). إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل من محلول التربسين / EDTA، وضمان أن التربسين يغطي كامل سطح القارورة. بعد خلايا رفع قبالة قارورة (~ 2-3 دقيقة)، ووقف trypsinization رد فعل بإضافة 3 مل العظام انسجة وسائل الاعلام نمو الخلايا). الطرد المركزي 900 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونبذ وسائل الإعلام، والخلايا resuspend في 10 مل من انسجة العظام وسائل الاعلام نمو الخلايا جديدة.
- خلايا تجمع من كل قوارير والمرور 1: 5 إلى ثلاث قوارير T75 الجديدة واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد خلايا مرة واحدة تصل مرة أخرى 70٪، كرر الخطوة 4.6 وبركة ومرور جميع الخلايا الملتصقة مرة ثانية. إعادة لوحة كافة الخلايا أربع قوارير T75 واحتضان 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. وينبغي استخدام وسائل الإعلام العظام نمو الخلايا اللحمية لجميع الخطوات.
- وسائل الاعلام F12 + 1X تتركز mitogen سو: تسمح للخلايا للوصول إلى نقطة التقاء، وغسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة العظام انسجة وسائل الاعلام جمع الخلية (DMEMpplement + البنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل). 10 مل / T75)، والتأكد من أن هذا الإعلام هو خال من FBS. جمع العظام وسائل الإعلام مكيفة نخاع بعد 72 ساعة، من خلال تصفية 0.22 ميكرون فلتر، حوض سباحة، قسامة، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إذا رغبت في ذلك، تأكيد النمط الظاهري للخلايا نخاع العظام انسجة معزولة (BMSC) باستخدام أجسام مضادة ضد الماوس هيئة السلع التموينية-1، CD105، CD29، CD73 و، CD44، وذلك باستخدام تدفق قياسي الخلوي التقنيات كما هو موضح سابقا (13).
5. الجيل من وسائل الإعلام مكيفة عقدة الليمفاوية
- في نسيج الثقافة هود العقيمة، عكس أنبوب برنامج تلفزيوني يحتوي على الغدد الليمفاوية ثلاث مرات لإزالة الدم المتبقي من العقد الليمفاوية ونضح الدموي برنامج تلفزيوني. كرر مع برنامج تلفزيوني الباردة العذبة حتى يظهر حل واضح مع عدم وجود دليل على الدم.
- وضع الغدد الليمفاوية في أطباق بتري 60 مم 2 الزجاج. باستخدام اثنين شفرات المشرط العقيمة، والعقد الليمفاوية اللحم المفروم التي كتبها تشريح مرارا ذهابا وإيابا حتى TISSUشظايا ه ما يقرب من 1 مم 3 في حجم.
- في أنبوب مخروطي الشكل، شظايا الأنسجة resuspend في 10 مل من روزويل معهد الحديقة التذكارية 1640 (RPMI1640) وسائل الإعلام تستكمل مع البنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل)، 5 × 10 -5 M العقيمة β-المركابتويثانول ( 1.75 ميكرولتر / 500 مل وسائل الاعلام) و 10٪ FBS.
- أجهزة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و resuspend جميع الخلايا في 30 مل سائل الإعلام. إضافة 5 مل وسائل الاعلام / بشكل جيد في لوحة 6 جيدا واحتضان لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- بعد الحضانة مدة 7 أيام، تجاهل وسائل الإعلام، وغسل الخلايا الملتصقة مع 5 مل PBS الحار وإضافة 5 مل وسائل الإعلام الجديدة إلى كل بئر. تسمح للخلايا أن تنمو إلى confluency (حوالي 5-7 أيام)، ويعرض للتريبسين، تجمع كل الخلايا، والمرور كما هو موضح في الخطوة 4.6. خلايا إعادة لوحة لوحة 6 جيدا. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- بعد ثلاثة مقاطع، تسمح للخلايا أن تنمو إلى confluency، وغسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل / بئر DMEM: F12 + 1Xملحق المركز mitogen والبنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل)، وضمان أن هذا الإعلام هو خال من FBS. جمع الليمفاوية وسائل الإعلام مكيفة عقدة بعد 72 ساعة وحمام سباحة وقسامة، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إذا رغبت في ذلك، تأكيد النمط الظاهري للخلايا العقدة الليمفاوية انسجة معزولة (LNSC) باستخدام أجسام مضادة ضد CD45 الماوس وgp38، وذلك باستخدام تدفق قياسي الخلوي التقنيات كما هو موضح سابقا (13).
6. استخدام وسائل الإعلام مكيفة الجهاز لفحوصات المصب فيما يتعلق بالسلوك النقيلي من خلايا السرطان
- وبمجرد أن وسائل الإعلام مكيفة الجهاز قد ولدت كما هو موضح في الخطوات 1-5، واستخدامها لتنفيذ مختلف خلية المصب والمقايسات البيولوجيا الجزيئية من أجل تحديد تأثير العوامل المشتقة من الجهاز القابلة للذوبان على السلوك المنتشر من الخلايا السرطانية. وتشمل الأمثلة على فحوصات القياسية (موضح في مكان آخر في الأدب) صفائف البروتين 13، فحوصات النمو الخلوية <سوب> 13، والهجرة الخلوية فحوصات 13، tumorsphere تشكيل 14، وRT-PCR 15. استخدمت وسائل الإعلام القاعدة الأصلية لتوليد وسائل الإعلام مكيفة الجهاز (أي غير المشروط DMEM: وسائل الإعلام F12 تستكمل مع 1X تتركز ملحق mitogen والبنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل) يجب أن تستخدم لمراقبة سلبية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
جيل الإعلام مكيفة الجهاز
يتم تقديم مخطط الشامل / التخطيطي لعملية عزل الجهاز وتوليد وسائل الإعلام مشروط في الشكل رقم 1، مع الصور الفوتوغرافية تمثيلية من الإجراء هو موضح في الشكل (2). وتجدر الإشارة إلى أنه عندما كان هذا البروتوكول الأول قيد التطوير، أدرج الكبد في تحليلنا لأنه هو موقع مشترك للالانبثاث سرطان الثدي. ومع ذلك، نظرا لكمية كبيرة من الإنزيمات البروتينية ينتج ويفرز عن طريق الكبد، فإنه من الصعب جدا للحفاظ على الكبد قابلة للحياة طويلة بما فيه الكفاية لتوليد نوعية جيدة وسائل الإعلام مكيفة. وسائل الإعلام مكيفة الكبد هو أيضا غير مستقر مرة واحدة معزولة، وهناك يميل إلى أن يكون الكثير من راسب البروتين، والأرجح لنفس السبب. لذلك لم يكن مدرجا الكبد في أي تحليل آخر.
r.within الصفحات = "1"> بالنسبة لجيل من node- الليمفاوية وسائل الإعلام مكيفة العظام على وجه التحديد، والنمط الظاهري للخلايا انسجة معزولة (LNSCs وBMSCs) ويمكن التأكد من خلال مراقبة التشكل الخلوي من خلال المجهر جنبا إلى جنب مع المناعي وفق المعايير التدفق الخلوي. يجب أن تكون الخلايا اللحمية اللصق في الثقافة، مع LNSCs مما يدل على النمط الظاهري ممدود وأرومي ليفي (الشكل 3A) وBMSCs يدل على مظهر أصغر (الشكل 3C). يؤكد تحليل تدفق cytometric أن LNSCs هي CD45 إلى حد كبير - وgp38 +، مع ~ 60٪ من خلايا امتلاك CD45 - gp38 + النمط الظاهري يدل على LNSCs 16 (الشكل 3B). يجب أن يكون BMSCs إيجابية لCD44 و CD29 إيجابي ضعيف لCD105 وهيئة السلع التموينية-1، والسلبية لCD73 (الشكل 3D - H)، مما يدل على BMSCs 17،18.
سرطان الثدي خلية التنonse إلى أنماط الهجرة والتغييرات التعبير الجيني الجهاز ملائمة لل
باستخدام هذا النظام النموذجي خارج الحي، وقد سبق أن ثبت أن خلايا سرطان الثدي البشرية مع خلفيات وراثية مختلفة الهجرة المعرض التفاضلية وأنماط النمو نحو ظروف الجهاز محددة. والجدير بالذكر أن هذه الأنماط تعكس أنماط نشر النقيلي يعرف هذه السطور خلية في الجسم الحي 13. وكانت والرئة (231 LM2) -seeking المتغيرات من MDA-MB-231 المتغيرات خلايا سرطان الثدي البشرية (هدية عينية من الدكتور جوان Massagué 11،12) أيضا - في الدراسة الحالية، العظام (231 BOM) المستخدمة في فحص transwell الهجرة لتأكيد أنماط الهجرة من الجهاز المناسب. وتظهر النتائج أن الساعية العظام 231-بوم البديل يهاجر تفضيلي إلى وسائل الإعلام مكيفة نخاع العظام على العقول وlung- سائل الإعلام مكيفة (الشكل 4A، يسار). وبالمثلوالتي تسعى الرئة 231 LM2 البديل يهاجر تفضيلي إلى وسائل الإعلام مكيفة الرئة على العظام وسائل الإعلام مكيفة نخاع وسائل الإعلام مكيفة الدماغ (الشكل 4A، يمين). وعلاوة على ذلك، تحليل RT-QPCR يوضح أن التعرض لل-231 MDA-MB خلايا سرطان الثدي الأبوية لbone- أو وسائل الإعلام مكيفة الرئة يسبب upregulation من الجينات المرتبطة الانبثاث العظام معين (CXCR4، IL-11، TGFß1) أو lung- ورم خبيث معين (VCAM1) من خلايا سرطان الثدي في الجسم الحي 11،12 (الشكل 4B). وتبين هذه النتائج صحة النظام المجراة سابقا فيما يتعلق مع الأجسام الجهاز المتوقع من خلايا سرطان الثدي في الجسم الحي، وتشير إلى أن العوامل القابلة للذوبان الموجودة في وسائل الإعلام مكيفة الجهاز يمكن أن تؤثر على النمط الظاهري خلية المنتشر بالإضافة إلى تعزيز الهجرة.
وسائل الإعلام مكيفة الجهاز يحتوي على وسطاء للذوبان المحتملة للسلوك النقيلي
تم استخدام مجموعة الماوس الأجسام المضادة تستند التسمية البيوتين لتقييم وجود وهوية من العوامل القابلة للذوبان المشتركة في وسائل الإعلام مكيفة جهاز من الأجهزة المختلفة. وتشمل هذه المجموعة الأجسام المضادة ضد 308 من proteins.This الماوس للذوبان البروتين مجموعة الأكثر شيوعا قد سبق استخدامها لتحديد العوامل القابلة للذوبان في المصالح المرتبطة مع تتالي النقيلي موجودة في نخاع مكيفة وسائل الاعلام الرئة والعظام كما هو مبين في تشو وآخرون (2014) وبيو وآخرون (2015) على التوالي 13،14. في الدراسة الحالية، وتظهر نتائج البروتين مجموعة وسائل الإعلام القاعدية (الشكل 5A) مقارنة node- الليمفاوية (الشكل 5B) وسائل الإعلام مكيفة الدماغ (الشكل 5C). أبرز بجانب كل مجموعة من العوامل القابلة للذوبان الموجودة في وسائل الإعلام التي تم العثور عليها لتكون مرتبطة مع الخطوات في سلسلة المنتشر في الأدب 19-29. هذه ذوبان القوات المسلحة الكونغوليةقد تكون الاختصاصات يستحق التحقيق وسطاء المحتملة الانبثاث الثانوية ضمن هذه المواقع الجهاز.
ويتم حصاد الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي لعملية من الجهاز عزل وتوليد وسائل الإعلام مشروطة. الأنسجة (الرئتين والدماغ وعظم الفخذ، الساق والغدد الليمفاوية) من الماوس. الرئتين، ومفروم الدماغ والغدد الليمفاوية مع مشرط. يتم حصاد نخاع العظم من تجويف النخاع من عظام عن طريق دفع برنامج تلفزيوني من خلال تجويف بإبرة 27½ G. يتم تحضين الرئة وأنسجة المخ شظايا لمدة 24 ساعة قبل تمييع مع ثلاثة مجلدات معادلة من وسائل الاعلام القاعدية الطازجة وجمع لجعل وسائل الإعلام lung- ومكيفة الدماغ. و passaged نخاع العظام والغدد خلايا العقدة انسجة 2-3 مرات من قبل تفرخ مع وسائل الإعلام القاعدية لجعل العظام والغدد وسائل الإعلام مكيفة عقدة. يمكن لوسائل الإعلام تحصد يكون صooled وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام في المقايسات المصب مثل المصفوفات البروتين، فحوصات النمو الخلوي، المقايسات الهجرة الخلوية، tumorsphere تشكيل، وRT-PCR. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الصور الفوتوغرافية التمثيلية للإجراءات عزل الجهاز وتوليد وسائل الإعلام مشروطة. وفي يوم 0، الرئتين والدماغ وعظم الفخذ، الساق والغدد الليمفاوية وتجمع من الماوس. يتم وضع العقد الرئتين والدماغ والغدد في 60 ملم 2 طبق بتري زجاجي ومفروم مع اثنين من ريش مشرط لحوالي 1 ملم 3 الحجم. يتم حصاد نخاع العظم من تجويف النخاع من عظام عن طريق دفع برنامج تلفزيوني من خلال تجويف مع 27 ½ G إبرة في أنبوب جديدمن برنامج تلفزيوني. يتم تحضين شظايا أنسجة الرئة والدماغ لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية، وCO 2 5٪ قبل تمييع مع ثلاثة مجلدات يعادل وسائل الإعلام الجديدة والتي تم جمعها لجعل وسائل الإعلام lung- ومكيفة الدماغ بعد 24 ساعة. يتم تحضين الخلايا نخاع العظام وانسجة العقدة الليمفاوية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 و passaged 2-3 مرات (~ 3 أسابيع الكلية) قبل استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام القاعدية خالية من المصل لجعل العظام والغدد وسائل الإعلام مكيفة عقدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. توصيف المعزولة خلايا العقدة الليمفاوية ونخاع العظم اللحمية. (A) مشرق الميدان صورة مجهرية تظهر مورفولوجيا الخلايا العقدة الليمفاوية اللحمية (LNSCs). (ب) تدفق الممثلتحليل الخلوي من LNSCs باستخدام فيكوإيريترين (PE) -conjugated الأجسام المضادة gp38 وثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -conjugated CD45 الأجسام المضادة (C) الحقل مشرق صورة مجهرية تظهر مورفولوجية خلايا نخاع العظام اللحمية (BMSCs). (DH) تدفق الممثل تحليل الخلوي من BMSCs باستخدام PE مترافق (ملف السوداء) الأجسام المضادة ضد (D) CD44، (E) CD106، (F) هيئة السلع التموينية، 1، (G) CD29، (H) الأجسام المضادة CD73 النسبية إلى isotype السيطرة (ملامح بيضاء). تم جمع ما لا يقل عن 10000 الأحداث قابلة للحياة في العينة. تم تعديل هذا الرقم من 13. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. أوقان المناسب أنماط الهجرة والتغييرات التعبير الجيني في الرد على وسائل الإعلام مكيفة الجهاز. (A) العظام التي تسعى 231-بوم المتغيرات (يسار والحانات مخطط) أو المتغيرات التي تسعى الرئة 231 LM2 (الحق والحانات مخطط) للنجمة داود الحمراء 231 ميغابايت الثدي البشري خط الخلايا السرطانية فضلا عن الدية MDA-MB- كانت مطلية 231 الخلايا (على حد سواء لوحات، القضبان الصلبة) على إدراج المغلفة الجيلاتين (مع 8 ميكرومتر المسام) قبل وضعها في وسائل الإعلام القاعدية (DMEM: F12 + ملحق mitogen المركزة) أو الجهاز-CM. وحضنت لوحات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 18 ساعة. تعرضت (ب) السكان الوالدين MDA-MB-231 الخلايا إما العظام-CM (يسار) أو الرئة-CM (يمين) ل48H. كان الحمض النووي الريبي معزولة وكميا باستخدام RT-QPCR. وكانت التغييرات التعبير الجيني ردا على الجهاز-CM (أشرطة سوداء) تطبيع لGAPDH وأعربت عن النسبية في التعبير الأساسي في وسائل الإعلام القاعدية (القضبان الرمادية). وتعرض البيانات كما يعني ± SEM (N = 3؛ أضعاف التغيير من السيطرة السلبية منها وسائل الإعلام القاعدية). * = تختلف اختلافا كبيرا من وسائل الإعلام القاعدية. δ = تختلف كثيرا عن خط الخلية الوالدين تعامل مع الظروف وسائل الإعلام نفسها. P <0.05، أنوفا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مكيفة الجهاز-الشكل 5. وسائل الإعلام يحتوي على وسطاء للذوبان المحتملة للسلوك النقيلي. تم استخدام مجموعة الماوس الأجسام المضادة تستند التسمية البيوتين لتحديد العوامل القابلة للذوبان الموجودة في العقدة الليمفاوية-CM والدماغ-CM. حضنت الأغشية مع عينات المعقدة البيروكسيديز من (A) وسائل الاعلام القاعدية (DMEM: F12 + ملحق mitogen المركزة)، (ب) العقدة الليمفاوية-CM أو (C) الدماغ-CM في 4 درجة CO / N وتصور باستخدام chemiluminescence. وتشير الأشكال البيضاوية الزرقاء الضوابط الإيجابية الداخلية، وصناديق مبطنة تشير ضوابط السلبية الداخلية وصناديق صلبة وتشير العوامل القابلة للذوبان من الفائدة التي يحتمل أن تشارك في سلوك النقيلي خلايا سرطان الثدي إلى العقد اللمفاوية أو الدماغ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الانبثاث هي عملية معقدة التي يتم من خلالها سلسلة من الأحداث الخلوية هي المسؤولة في النهاية عن غزو الأنسجة وورم بعيد إنشاء 4،30،31. ويمكن الاستفادة من نظام نموذجي خارج الجسم الحي المقدمة هنا لدراسة جانبين مهمين من التقدم النقيلي: سرطان الخلايا صاروخ موجه أو الهجرة إلى جهاز معين ( "للوصول إلى هناك") والنمو في هذا الجهاز ( "المتزايد هناك"). والعديد من الدراسات التي تركز سابقا على تحديد الخصائص الجزيئية الرئيسية المرتبطة الخلايا السرطانية نفسها التي تساهم في عملية ورم خبيث. على سبيل المثال، وقد حددت العمل الذي قام به فريق جوان Massagué والتوقيعات الجينات متميزة المرتبطة الرئة محددة والعظام محددة، وأنماط محددة في الدماغ من انتشار 10-12،32. في حين أن هذا العمل يوفر معلومات هامة فيما يتعلق بمساهمة الخلايا السرطانية لهذه العملية، ناهيك هو معروف عن دور العوامل جهاز معين ساهم رانه المكروية الثانوية، التي ظلت صعبة نسبيا لدراسة 13.
سبق التحقق من صحة هذا النظام النموذجي خارج الحي كما تمثيل دقيق لالمكروية الجهاز الثانوية من خلال إظهار أن خلايا سرطان الثدي خط معين الهجرة والنمو في الجهاز-CM تعكس هذه الخلايا خطوط "في نمط الجسم الحي من انتشار النقيلي. دراسة قام بها تشو وزملاؤه تستخدم أربعة خطوط الخلايا البشرية سرطان الثدي مختلفة مع اختلاف الإمكانات المنتشر في الجسم الحي، بما في ذلك MDA-MB-231 و SUM-159 (درجة عالية من النقيلي، metastasize إلى العقدة الليمفاوية والرئة والكبد والعظام والدماغ في الجسم الحي ) وهجرة SUM-149 و MDA-MB-468 (متوسطة النقيلي، metastasize إلى العقدة الليمفاوية والرئة في الجسم الحي) في كلا من SUM-159 خطوط الخلايا MDA-MB-231 وعرضها تعزيز تجاه كوسا- العظام، الليمفاوية node- والرئة-CM في حين أن خطوط الخلايا SUM-149 و MDA-MB-468 هاجر تفضيلي نحو الرئة-CM 13. توضح هذه الدراسة أن bone- وتسعى الرئة MDA-MB-231 المتغيرات على حد سواء يفضلون الهجرة إلى كوسا- العظام والرئة-CM على التوالي وأن التعرض للجهاز-CM يمكن أن تعزز التعبير عن bone- والجينات النقيلي المرتبطة الرئة التي سبق أن حددها Massagué وزملاؤه 11،12. معا، وتظهر هذه النتائج أن الجهاز-CM يوفر خارج الحي ممثل منصة من العوامل القابلة للذوبان، جهاز معين وجدت في الجسم الحي التي تؤثر على النمط الظاهري والسلوك من خلايا سرطان الثدي.
تحديد العوامل القابلة للذوبان الموجودة داخل أجهزة معينة والمستويات النسبية في التعبير يوفر نقطة انطلاق لتحديد التأثير المحتمل على سلوك الخلايا السرطانية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام تقنيات مثل immunodepletion تسمح للمستخدم لتستنزف بشكل فعال بروتين من الفائدة من الجهاز-CM لتحديد تأثيرها على السلوك في المختبر الخلوي. فمثلا، العديد من العوامل القابلة للذوبان الموجودة داخل microenvironments هيئة محددة تعمل كما chemoattractants ولديها القدرة على حمل الهجرة الخلوية والانتشار. وقد أدى العمل السابق يتم ذلك باستخدام الرئة-CM إلى التعرف على العديد من العوامل القابلة للذوبان الموجودة في الرئة-CM التي يمكن أن تكون chemoattractants للخلايا سرطان الثدي، بما في ذلك osteopontin (OPN) و L-selectin (بيع) 13. بواسطة immunodepleting هذه العوامل من الرئة-CM، كانت قادرة على إثبات انخفاض الهجرة الخلوية و / أو نمو النقيلي غاية MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي 13 تشو وزملاؤه. وتبين هذه النتائج أن وسائل الإعلام مشروطة ولدت من الأجهزة كلها توفر مصدرا قيما لدراسة آثار العوامل القابلة للذوبان محددة بشأن سلوك الخلايا السرطانية، من خلال استخدام التقنيات التقليدية في المختبر.
على الرغم من أن هذا هو نظام نموذجي اضحة إلى حد ما، هناك بعض الخطوات في بروتوكول التجريبية التي تعتبر بالغة الأهمية لناجحهجيل لتر من وسائل الإعلام مكيفة الجهاز. أولا، استخدام الفئران الذين تتراوح أعمارهم محددة من 6-12 أسابيع لحصاد أجهزة أمر مهم للسيطرة على الآثار المرتبطة بالعمر، سواء المتعلقة بالتنمية (قبل 6 أسابيع) أو المتصلة بالشيخوخة في الفئران الأكبر سنا. ثانيا، العقم هو من أهمية قصوى في جميع أنحاء البروتوكول ويمكن أن يكون أفضل ضمان من خلال استخدام تقنية العقيم صارمة والعمل في نسيج الثقافة هود العقيمة، وذلك باستخدام تعقيم المستهلكات زراعة الأنسجة والكواشف وكذلك المضادات الحيوية خفيفة في جميع وسائل الإعلام والثقافة، والمكملات الغذائية ( أي.، البنسلين / الستربتومايسين). واحدة من التحديات مع استخدام في الجسم الحي أو السابقين نظم نموذج الجسم الحي هو متأصل تقلب الحيوان إلى الحيوان. إذا لاحظت هذا، وتشمل خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها تجميع وسائل الإعلام مشروطة تم الحصول عليها من دفعات متعددة من الفئران قبل استخدامها في التجارب اللاحقة، وكذلك التأكد من أن وسائط الإعلام lung- ومكيفة الدماغ بدقة الوزن تطبيع في كل ليتجربة جمع ديا عن طريق إعادة تعليق في 4: 1 وسائل الإعلام: نسبة الأنسجة (حجم / وزن). وبالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي أن يسمح للخلايا انسجة العقدة الليمفاوية الأولية ونخاع العظم لتتجاوز 70٪ confluency في أي ممر بعينه أو أن نمت بعد 5 مجموع الممرات، وإلا فإنها سوف يفرق عضال.
يمكن تصوره تعديلات على بروتوكول المعروضة في هذه المقالة للسماح للتطبيق في مجالات مختلفة في البحث. على الرغم من أن هذا النموذج حتى الآن استخدمت حصريا لأبحاث سرطان الثدي، ويمكن أن يستخدم لدراسة دور العوامل القابلة للذوبان المستمدة من الجهاز في أنواع أخرى من السرطان، فضلا عن الدول الفسيولوجية والأمراض العادية إضافية. وبالإضافة إلى ذلك، في حين تم استخدام هذا الأسلوب هنا مع نماذج الماوس عارية المناعة، هذا الأسلوب هو من الناحية النظرية لا يقتصر على هذا النوع من الفئران وحتى يمكن استخدامها مع أنواع أخرى من النماذج الحيوانية.
في حين أن هذا النموذج يوفر importaالإقليم الشمالي فكرة عن مساهمة العوامل القابلة للذوبان محددة مستمدة من الجهاز على سلوك الخلايا السرطانية، فإنه لا يخلو من حدودها. أولا يركز هذا النموذج فقط على عنصر قابل للذوبان من microenvironments الجهاز الذي يهمل أهمية المصفوفة خارج الخلية (ECM). إدارة المحتوى في المؤسسة هو العنصر غير الخلوية موجودة في جميع أنواع الأنسجة وظائف لتوفير كل من سقالة الفيزيائية للخلايا، فضلا عن القدرة على حمل الإشارات البيوكيميائية والنشاط الحيوي الحاسمة المطلوبة لمختلف العمليات الخلوية، بما في ذلك التشكل، والتمايز الخلوي والتوازن 33 -35. الأهم من ذلك أن التكوين الجسمي والبيوكيميائية للECM غير متجانس على نطاق واسع، ويمكن أن تختلف اختلافا كبيرا بين أنواع الأنسجة. لذلك، قد يكون تكوين الأنسجة محددة من ECM أيضا تأثير على الجهاز مع الأجسام خلال الانبثاث سرطان التي يمكن التغاضي عنها مع هذا النموذج. إدارة المحتوى في المؤسسة قد تعمل أيضا على التركيز العوامل القابلة للذوبان محددة بطريقة appropriatelذ يقدم لهم بعض الخلايا، وبدون هذا صقل إدارة المحتوى في المؤسسة، وتحريض الإشارات الخلوية يمكن الانتقاص منها أو تغيير 36. على الرغم من أن النموذج المذكور في هذه الورقة يفتقر إلى عنصر ECM المناسب، يمكن تعزيز العديد من الدراسات باستخدام نهج المجاملة الاستفادة من كل نموذج المذكورة هنا جنبا إلى جنب مع مكونات ECM مناسبة. على سبيل المثال، المتاحة تجاريا الخلايا الليفية الجهاز الأولية التي توليف ECM الذاتية أو مكونات ECM المؤتلف يمكن أن تستخدم بالإضافة إلى ولدت الجهاز-CM لتحديد المدى الكامل للجهاز المكروية كاملة على السلوك الخلوي.
ومن الممكن أن المكروية الذائبة الناتجة من الجهاز-CM قد لا تحاكي بشكل مناسب ما هو من الناحية الفسيولوجية الحالية خلال عملية ورم خبيث. سرطان الخلايا البقاء والنمو والتقدم تعتمد اعتمادا كبيرا على التفاعلات سرطان الخلية المضيفة 4،30،31. جيل كامل الجهاز-CM قد يؤدي إلى صresence من العوامل القابلة للذوبان لا يعبر عنها عادة من أنواع الخلايا التي تتفاعل مع الخلايا السرطانية خلال التقدم النقيلي. وعلاوة على ذلك، وقد سبق أن ثبت أن وجود الورم الرئيسي يمكن أن تعدل المكروية من المواقع النقيلي بعيدة، وبالتالي "فتيلة" لهم لورم خبيث 37. منذ البروتوكول الحالي يستخدم أجهزة المستمدة من الفئران الحاملة للورم صحية، غير، سيكون من المفيد لمقارنة العوامل القابلة للذوبان المستمدة من الأعضاء من الفئران يحمل ورم الثدي الأساسي.
بسبب الفصل الميكانيكي للأجهزة كاملة خلال جيل من مختلف الجهاز-CM، قد يتم الافراج عن العوامل الخلايا في وسائل الإعلام المحيطة التي قد لا عادة يكون واجه من الناحية الفسيولوجية عن طريق الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك، bone- والعقدة الليمفاوية المستمدة من وسائل الإعلام مشروط تتطلب زراعة الخلايا اللحمية معزولة من هذه الأجهزة قبل تحصيلها. أنواع الخلايا الحالية خلال المجراة سابقا cultuحلقة قد لا تمثل بدقة اتساع أنواع الخلوية اجه فيزيولوجيا الخلايا السرطانية. في حين أن الخلايا اللحمية تفرز أساسا عوامل كثيرة ترتبط مع مختلف microenvironments الأعضاء، باستخدام هذه الأساليب قد لا حساب لتأثير أنواع الخلايا الأخرى الموجودة داخل الأنسجة والأعضاء 38. وأخيرا، فإننا تشتمل على ملحق mitogen في وسائل الإعلام الأساسية المستخدمة لتوليد وسائل الإعلام مكيفة الجهاز، لأننا وجدنا أن هذا كان مطلوبا للحفاظ على سلامة كل من أجهزة مثقف (الرئة والدماغ) ومعزولة BMSC وLNSC. ومع ذلك، فإننا ندرك التحذير من أن وجود هذا الملحق mitogen قد حفزت أجهزة لإنتاج مصطنع العوامل القابلة للذوبان التي قد لا تجعل عادة،
وخلاصة القول، وقد أشارت العديد من الدراسات إلى أن microenvironments الجهاز معينة يمكن أن تؤثر تأثيرا عميقا بيولوجيا الخلايا السرطانية. على الرغم من القيود التي نوقشت، والجسم الحي نموذج النظام السابق قدم هنا صepresents تقنية شاملة لدراسة تأثير المكروية القابلة للذوبان من العديد من الأجهزة الصلبة على السلوك الخلوي. في المختبر من الكتاب، وكان هذا النظام النموذجي ويستمر لاستخدامها كوسيلة لدراسة العديد من الأحداث الخلوية المرتبطة ورم خبيث، بما في ذلك الغزو، والهجرة، والانتشار، مثل وقف السلوك، والتغيرات في التعبير الجيني. يمكن للبيانات المكتسبة من هذه الدراسات بدورها بإبلاغ التطبيق السريري المحتمل لهذا النظام النموذجي لخلايا سرطان الثدي الابتدائية معزولة عن أورام المرضى من أجل تحديد استجابتها لمختلف microenvironments تمثل مواقع النقيلي المحتملة. مجتمعة، ومن المؤمل أن مزيد من الفهم للتفاعل بين الخلايا المكروية والورم أثناء عملية مع الأجسام الجهاز المنتشر سيؤدي إلى تحسين علاج السرطان في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
- Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278 (1928).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
- Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
- Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
- Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
- Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
- Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
- Zlotnik, A.
- Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
- Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
- Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805 (2014).
- Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
- Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
- Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
- Chiang, A. C., Massague, J.
- Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
- Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).
