Génération des médias et applications Organ-conditionnés pour l'étude Influences spécifiques d'organes sur le cancer du sein métastatique Comportement
Summary
This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.
Abstract
Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.
Introduction
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes et la deuxième principale cause de décès liés au cancer 1. taux de mortalité élevé de cancer du sein est principalement due à l'échec de la thérapie conventionnelle pour atténuer et éliminer la maladie métastatique; environ 90% des décès liés au cancer sont dus à des métastases 2. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de la cascade métastatique est primordiale pour le développement de thérapies efficaces à la fois précoce et le cancer du sein à un stade avancé.
Des recherches antérieures ont permis d' élucider la nature multi – étapes des métastases du cancer du sein et il est émis l' hypothèse que le résultat à la fois la progression du cancer et des métastases dépend en grande partie des interactions entre les cellules cancéreuses et l'environnement hôte 3. Les observations cliniques indiquent que de nombreux cancers présentent un tropisme d'organe, ie., La tendance à métastaser préférentiellement à particulier organs.In le TASe de cancer du sein, la maladie d'un patient se propage habituellement ou des métastases à 5 sites principaux, y compris les os, les poumons, les ganglions lymphatiques, le foie et le cerveau 4-6. De nombreuses théories ont été développées pour expliquer ce processus, mais seulement quelques-uns ont résisté à l'épreuve du temps. La théorie de Ewing de métastases, proposée dans les années 1920, l'hypothèse quela distribution des métastases était strictement due à des facteurs mécaniques; dans lequel les cellules tumorales sont réalisées dans le corps par des schémas d'écoulement de sang physiologique normal défini et simplement arrêter dans le premier lit capillaire ils rencontrent 7. En revanche, 1889 "semences et le sol" hypothèse de Stephen Paget a suggéré que les interactions moléculaires supplémentaires étaient responsables de la survie et la croissance des métastases, de sorte que les cellules cancéreuses ( «graines») ne peuvent se mettre en place et microenvironnements d'organes proliferatein qui produisent des facteurs moléculaires appropriés ( «sol ») 8. Presque un siècle plus tard, Leonard Weiss sousa pris une méta-analyse des données d'autopsie publiés précédemment et confirmé la prédiction de Ewing que de nombreuses tumeurs métastatiques détectées au moment de l'autopsie ont été trouvés dans les proportions prévues qui seraient attendus si le tropisme d'organe métastatique a été déterminée par des modèles d'écoulement de sang seul. Cependant, dans manyinstances il y avait plus ou moins de métastases formées sur certains sites alors seraient attendus par des facteurs mécaniques proposées d'Ewing 9. Ces comptes et théories suggèrent que microenvironnements d'organes spécifiques jouent un rôle essentiel dans les modèles de diffusion et la croissance ultérieure et la survie de nombreux cancers, notamment le cancer du sein.
Les efforts de recherche antérieurs ont porté principalement sur les facteurs dérivés de cellules tumorales et leur contribution à l'tropisme organe observé dans les métastases du cancer du sein 10-12, facteurs mais peu de recherches ont exploré dérivées du microenvironnement organe qui peuvent fournir un créneau favorable pour la mise en placedes métastases du cancer du sein. Cela est en grande partie attribuable aux difficultés techniques de l' étude des composants du microenvironnement d'organes in vitro.
Le présent article décrit un système ex vivo du modèle global pour étudier l'influence des composants solubles du ganglion lymphatique, des os, du poumon et du cerveau sur le comportement métastatique des cellules cancéreuses du sein humain. Des études antérieures ont permis de valider ce système modèle en démontrant que les différentes lignées cellulaires de cancer du sein présentent un comportement malin spécifique organe spécifique lignée de cellules et en réponse aux moyens d'organes conditionné qui correspond à leur potentiel métastatique in vivo 13. Ce système de modèle peut être utilisé pour identifier et évaluer les facteurs solubles spécifiques organes dérivés qui peuvent jouer un rôle dans le comportement métastatique du sein et d'autres types de cellules cancéreuses, y compris les influences sur la croissance, la migration, la tige-comme le comportement, et l'expression des gènes, ainsi que l'identification dede nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le cancer. Ceci est le premier ex vivo système modèle qui peut être utilisé pour étudier le comportement métastatique spécifique d'organe en détail et d'évaluer le rôle des facteurs solubles organes dérivés dans la conduite du processus de métastase du cancer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Métastase est un processus complexe par lequel une série d'événements cellulaires sont ultimement responsables de l' invasion des tissus et de la tumeur lointaine création 4,30,31. L'ex vivo système de modèle présenté ici peut être utilisé pour étudier deux aspects importants de la progression métastatique: le cancer homing des cellules ou de migration à un organe spécifique ( "y arriver") et la croissance de cet organe ( «il y en croissance»). De nombreuses ét…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, the Canada Foundation for Innovation (No. 13199), and donor support from John and Donna Bristol through the London Health Sciences Foundation (to A.L.A.). Studentship and fellowship support were provided by the Ontario Graduate Scholarship program (Province of Ontario, to G.M.P. and J.E.C.), the Canada Graduate Scholarship-Master’s program (to M.M.P), the Canadian Institutes of Health Research (CIHR)-Strategic Training Program (to M.M.P., G.M.P and J.E.C.) and the Pamela Greenaway-Kohlmeier Translational Breast Cancer Research Unit at the London Regional Cancer Program (to M.M.P., G.M.P., J.E.C. and Y.X.). A.L.A. is supported by a CIHR New Investigator Award and an Early Researcher Award from the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1X Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6-12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1 x Mito+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
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