이 원고는 생쥐의 림프절, 뼈, 폐 및 뇌에서 파생된 장기 조절 매체로 구성된 생체 외 모델 시스템을 설명합니다. 이 모델 시스템은 장기 유래 용해성 인자와 그 요인이 암세포의 장기 영양성 및 전이성 행동에 미치는 영향을 식별하고 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
유방암 전이성 행동에 장기 별 영향 유학을위한 장기 에어컨 미디어 및 응용 프로그램의 생성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
유방암은 유방암 환자에서 림프절, 뼈, 폐, 뇌 및 간으로 우선적으로 전이됩니다. 이전의 연구 노력은 관찰된 이러한 전이성 패턴(장기 친화성이라고 함)을 유발하는 유방암 세포에 내재된 요인을 확인하는 데 중점을 두었지만, 이 과정에 기여하는 특정 장기 내에 존재하는 요인에 대해서는 알려진 바가 훨씬 적습니다. 이는 부분적으로는 장기 미세환경을 정확하게 재현하는 체외 모델 시스템이 부족하기 때문입니다. 이 문제를 해결하기 위해 다양한 장기 미세환경 내에 존재하는 용해성 인자를 연구할 수 있는 체외 모델 시스템이 구축되었습니다. 이 모델은 정상적인 흉선 누드 마우스에서 분리된 장기(림프절, 뼈, 폐 및 뇌)에서 조건화된 매체를 생성하는 것으로 구성됩니다. 모델 시스템은 서로 다른 유방암 세포주가 생체 내 전이 가능성에 해당하는 장기 조절 배지에 반응하여 세포주 특이적 및 장기 특이적 악성 행동을 나타낸다는 것을 입증함으로써 검증되었습니다. 이 모델 시스템은 성장, 이동, 줄기와 같은 행동 및 유전자 발현에 대한 영향뿐만 아니라 암에 대한 잠재적인 새로운 치료 표적의 식별을 포함하여 유방 및 기타 유형의 암 세포의 전이성 행동에 역할을 할 수 있는 특정 장기 유래 용해성 요인을 식별하고 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 장기 특이적 전이성 행동을 자세히 연구하고 암 전이 과정을 주도하는 특정 장기 유래 용해 인자의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있는 최초의 생체 외 모델 시스템입니다.
서론
유방암은 여성에서 가장 흔히 진단 암 및 암 관련 사망의 제 1 원인이다. 유방암의 높은 사망률 완화 및 전이성 질환을 제거하기 위해 통상적 인 치료 실패 주로이고; 암 관련 사망의 대략 90 %가이 전이에 기인한다. 전이성 캐스케이드의 기본 분자 메커니즘을 이해하는 것은 초기와 후기 단계의 유방암 모두에 효과적인 치료제의 개발에 매우 중요합니다.
최근 연구는 유방암 전이의 다단계 특성을 규명 도왔다하고 두 암의 진행과 전이의 결과 암세포 호스트 환경 (3) 사이의 상호 작용에 따라 크게 좌우된다는 가설이다. 임상 관찰은 많은 암 즉, 장기 친 화성을 표시 있음을 나타냅니다., 경향이 우선적으로 캐스 organs.In 특정에 전이하기유방암의 예는 환자의 질병은 일반적으로 전파 나 뼈, 폐, 림프절, 간, 뇌 4-6 포함한 5 개의 주요 부위로 전이된다. 많은 이론이 과정을 설명하기 위해 개발되었지만, 몇 시간의 시험을 견뎌왔다. 1920 년대에 제안 전이 유잉의 이론은, 전이 thatthe 분포는 기계적인 요인에 엄격 때문 가정; 종양 세포가 정상 정의 생리 혈액의 흐름 패턴에 의해 몸 전체에 실시 단순히 첫 번째 모세관 침대에 체포되어 ....
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프로토콜
모든 동물 실험은 웨스턴 대학의 동물을 사용 분과위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라, 동물 관리에 캐나다위원회의 권고에 따라 실시 하였다.
1. 장기 격리 (폐, 뇌, 뼈, 림프절)
- 네 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브를 준비 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 약 30 ㎖를 함유하는 (각 오르간을 격리 함). 전자 저울을 사용하여 PBS의 각 튜브를 미리 무게.
- CO 2 흡입 6~12주 된 마우스를 안락사. 2 분 또는 마우스를 이동하고 호흡이 멈출 때까지 - 마우스는 약 1의 CO 2 챔버에 남아있을 것이다. 손가락으로 직접 확인 성공하면 안락사 더 박동의 부족에 의해 확인 될 수있다. 이 방법은 겨드랑이 림프절을 제거하는 어려움을 선도 목의 혈관을 파열 수 있으므로 자궁 전위를 피하십시오.
참고 : 이전 작업은 구체적으로 사용하고있다건강한 여성 누드 마우스, HSD : 무 흉선 Nude- Foxn1 뉴 13. - 무균 조직 배양 후드에서, 폴리스티렌 폼 패드의 뒷면에 마우스를 올려 사지를 확산 장소에 보관하는 핀을 사용합니다.
- 멸균 집게와 가위를 사....
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결과
장기 에어컨 미디어의 생성
장기 절연 및 조정 배지의 생성 방법의 개요도 / 개략도는도 2에 도시 된 절차를 나타내는 사진 영상과 함께,도 1에 나타나있다.이 프로토콜 처음 개발되었을 때, 간 포함되었음을 주목해야 분석에서 유방암 전이의 일반적인 위치이기 때문이다. 그러나, 제조 및간에 의해 분비되는 단백질 분해 효소의 대량, 이는 양질의 조정 배지를 생성하기에 충분히 오래 생존 간 유지하는 것은 매우 어렵다. 간 조정 배지 격리되면도 안정되지 않고, 같은 이유로 예상 단백질 침전물을 많이있을 쉽다. 따라서 간은 더 이상 분석에 포함되지 않았다.
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토론
전이는 세포 일련의 이벤트가 조직의 침략과 먼 종양 설립 4,30,31에 대한 궁극적 책임이있는 복잡한 과정이다. 해당 기관의 특정 기관 ( "거기에 도착")과 성장 ( "가 성장")에 암 세포 유도 또는 마이그레이션 : 여기에 제시된 생체 모델 시스템은 전이성 진행의 두 가지 중요한 측면을 연구하는데 이용 될 수있다. 많은 연구는 이전 전이 과정에 기여 암세포 자체와 연관된 주요 분자의 특성을 식별에 초점을 맞추고있다. 예를 들어, 조안 Massagué의 그룹에 의해 수행 작업은 폐 별, 뼈 별 및 확산 10-12,32의 뇌 특정 패턴과 관련된 고유 한 유전자 서명을 확인했습니다. 이 작업이 과정 암세포의 기여에 관하여 중요한 식견을 제공하지만, 훨씬 적은 t 기부 기관 특이 요소의 역할에 대해 알려진(13) 연구 상대적으로 도전 남아있다 그는 차 미세.
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 캐나다 유방암 재단-온타리오 지역, 캐나다 혁신 재단(No. 13199)의 보조금, 그리고 런던 건강 과학 재단(ALA)을 통한 John Bristol과 Donna Bristol의 기부자 지원으로 지원되었습니다. 학생 및 펠로우십 지원은 온타리오 대학원 장학금 프로그램(온타리오 주, G.M.P. 및 J.E.C.), 캐나다 대학원 장학금-석사 프로그램(M.M.P.), 캐나다 보건 연구소(CIHR)-전략 교육 프로그램(M.M.P., G.M.P 및 J.E.C.) 및 런던 지역 암 프로그램의 Pamela Greenaway-Kohlmeier 번역 유방암 연구 부서(M.M.P., G.M.P., J.E.C. 및 Y.X.). A.L.A.는 온타리오 연구 혁신부(Ministry of Research and Innovation)로부터 CIHR New Investigator Award와 Early Researcher Award의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 50 ml 원뿔형 튜브 | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | 멸균 유지 |
| 1x 인산염 완충 식염수 | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | 멸균 유지 |
| 누드 마우스 | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | 6 - 12주 령에 사용 |
| 폴리스티렌 폼 패드 | N/A | N/A | 폴리스티렌 폼 선적 컨테이너의 버려진 뚜껑 (~ 4 x 8 인치 이상)을 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다. 에탄올로 닦아 살균합니다. |
| 집게 | Fine Science Tools | 11050-10 | 멸균 |
| 가위 | 유지 Fine Science Tools | 14058-11 | 멸균 |
| 거즈 패드 | Fisher Scientific | 22-246069 | 멸균 유지 |
| 60mm2 유리 페트리 접시 | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | 멸균 |
| 메스 블레이드 | Fisher Scientific | S95937A | 멸균 상태 |
| 유지 DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | 37°C에서 따뜻하게 하십시오. 사용 전에 C 물 목욕, 멸균 상태를 유지하십시오 |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | 원고에서 "농축 미토겐 보충제"라고 합니다. 멸균 페 |
| 니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml) | 을 유지하세요Life Technologies | 15140-122 | 멸균 상태를 유지 |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | 37 °에서 따뜻하게; 사용 전에 C 물 목욕, 멸균 상태를 유지하십시오 |
| 태아 소 세럼 | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | 멸균 |
| 트립신/EDTA 용액 | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | 37°C에서 따뜻하게; 사용 전에 C 물 목욕, 멸균 상태를 유지하십시오 |
| 6웰 조직 배양 플레이트 | Thermo Scientific(Nunc) | 140675 | 멸균 유지 |
| 0.22 μ m 주사기 필터 | Sigma-Aldrich | Z359904 | 멸균 |
| T75 조직 배양 플라스크 | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | 멸균 Transwell 유지 |
| Sigma-Aldrich | CLS3464 | 멸균 유지, 마이그레이션 분석에 사용 | |
| Anti-mouse Sca-1 | R& D 체계 | 는 | 10 µ에 사용을 FAB1226P 있습니다; l/106 세포 |
| 안티 마우스 CD105 | R& D Systems | FAB1320P | 10 µ에서 사용합니다. l/106 셀 |
| 안티 마우스 CD29 | R& D Systems | FAB2405P-025 | 10 µ에서 사용; l/106 세포 |
| 안티 마우스 CD73 | R& D Systems | FAB4488P | 10 µ에서 사용합니다. l/106 세포 |
| 안티 마우스 CD44 | R& D Systems | MAB6127-SP | 는 0.25 &마이크로에서 사용합니다. g/106 세포 |
| 안티 마우스 CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | 5 µ에서 사용; l/106 세포 |
| 안티-마우스 gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | 10 µ에서 사용; L/106 세포 |
| &베타;-메르캅토에탄올 | 시그마-알드리치 | M6250 | 멸균 상태 유지 |
| 단백질 어레이 | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | 미디어 조건(네거티브 컨트롤 포함)당 1개의 어레이를 3회 사용 |
참고문헌
- Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70
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재인쇄 및 허가
