Introduction
유방암은 여성에서 가장 흔히 진단 암 및 암 관련 사망의 제 1 원인이다. 유방암의 높은 사망률 완화 및 전이성 질환을 제거하기 위해 통상적 인 치료 실패 주로이고; 암 관련 사망의 대략 90 %가이 전이에 기인한다. 전이성 캐스케이드의 기본 분자 메커니즘을 이해하는 것은 초기와 후기 단계의 유방암 모두에 효과적인 치료제의 개발에 매우 중요합니다.
최근 연구는 유방암 전이의 다단계 특성을 규명 도왔다하고 두 암의 진행과 전이의 결과 암세포 호스트 환경 (3) 사이의 상호 작용에 따라 크게 좌우된다는 가설이다. 임상 관찰은 많은 암 즉, 장기 친 화성을 표시 있음을 나타냅니다., 경향이 우선적으로 캐스 organs.In 특정에 전이하기유방암의 예는 환자의 질병은 일반적으로 전파 나 뼈, 폐, 림프절, 간, 뇌 4-6 포함한 5 개의 주요 부위로 전이된다. 많은 이론이 과정을 설명하기 위해 개발되었지만, 몇 시간의 시험을 견뎌왔다. 1920 년대에 제안 전이 유잉의 이론은, 전이 thatthe 분포는 기계적인 요인에 엄격 때문 가정; 종양 세포가 정상 정의 생리 혈액의 흐름 패턴에 의해 몸 전체에 실시 단순히 첫 번째 모세관 침대에 체포되어 이에 그들은 7을 발생합니다. 반면에, 스티븐 파 제트 1889 "종자 및 토양"가설은 추가 분자 상호 작용이 생존과 전이의 성장, 암세포는 ( "씨") 만 자신을 설정할 수있다 적절한 분자 요소를 생산 proliferatein 기관의 미세 환경 ( "토양에 대한 책임이 제안 ") 8. 거의 한 세기 후, 레너드 와이즈에서이전에 출판 부검 데이터의 메타 분석했다 부검시에 검출 된 다수의 전이성 종양 전이 장기 향성 단독 혈류 패턴에 의해 결정된 경우 예상되는 예상 비율로 발견되었다는 유잉 예측을 확인 하였다. 그러나 manyinstances에 다음 유잉 제안 기계 요소 (9)에 의해 예상되는 특정 사이트에 형성된 적은 이상의 전이가 있었다. 이러한 계정과 이론은 특정 장기의 미세 환경이 보급 패턴과 유방암 등 많은 암의 이후의 성장과 생존에 중요한 역할을하는 것이 좋습니다.
과거의 연구 노력은 주로 종양 세포 유래 인자에 집중하고 유방암 전이 10-12에서 관찰 장기 향성 대한 기여는 장기 미세로부터 유래하지만 약간의 연구 탐구되었다 요인 설립 유리한 틈새를 제공 할 수 있다는유방암 전이. 이는 시험관 내에서의 미세 기관의 성분을 연구의 기술적 문제에 주로 기인한다.
현재 문서 인간 유방암 세포의 전이 거동에 림프절, 뼈, 폐, 뇌의 용해 성분의 영향을 연구하기위한 광범위한 생체 모델 시스템을 설명한다. 이전의 연구는 다양한 유방암 세포주가 생체 전이성 전위 (13)에 대응하는 장기 조정 배지에 응답 세포주 특정 및 기관 특이 악성 동작을 표시하는 것을 증명함으로써이 모델 시스템을 검증했다. 이 모델은 시스템 식별 및 유방암의 성장, 이동에 영향을 포함한 암 세포의 다른 유형의 전이 동작 역할을하는 특정 장기 유래 가용성 인자를 평가하고, 행동 및 유전자 발현 등을 막기 위해 사용될 수있다 도의 확인 등암에 대한 잠재적 인 새로운 치료 목표. 이를 상세히 기관 특이 전이 거동을 연구하고, 암전이 과정을 구동하기에 장기 유래 가용성 인자의 역할을 평가하기 위해 사용될 수있는 제 체외 모델 시스템이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 실험은 웨스턴 대학의 동물을 사용 분과위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라, 동물 관리에 캐나다위원회의 권고에 따라 실시 하였다.
1. 장기 격리 (폐, 뇌, 뼈, 림프절)
- 네 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브를 준비 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 약 30 ㎖를 함유하는 (각 오르간을 격리 함). 전자 저울을 사용하여 PBS의 각 튜브를 미리 무게.
- CO 2 흡입 6~12주 된 마우스를 안락사. 2 분 또는 마우스를 이동하고 호흡이 멈출 때까지 - 마우스는 약 1의 CO 2 챔버에 남아있을 것이다. 손가락으로 직접 확인 성공하면 안락사 더 박동의 부족에 의해 확인 될 수있다. 이 방법은 겨드랑이 림프절을 제거하는 어려움을 선도 목의 혈관을 파열 수 있으므로 자궁 전위를 피하십시오.
참고 : 이전 작업은 구체적으로 사용하고있다건강한 여성 누드 마우스, HSD : 무 흉선 Nude- Foxn1 뉴 13. - 무균 조직 배양 후드에서, 폴리스티렌 폼 패드의 뒷면에 마우스를 올려 사지를 확산 장소에 보관하는 핀을 사용합니다.
- 멸균 집게와 가위를 사용하여, 성기의 중간 선에서 복부 피부를 잘라 입으로 위쪽으로 잘라. 조심스럽게 복부 근육의 복부 피부를 뒤로 당겨 폴리스티렌 폼 패드의 위치에 핀.
- 겨드랑, 상완 및 서혜부 림프절을 찾습니다.
참고 : 림프 노드는 일반적으로 지방 조직에 의해 둘러싸여있다. 사타구니 림프절들은 철수 복부 피부에 두 개의 혈관의 교차점에 표면적으로 발견으로 찾을 수있는 가장 쉬운입니다. 겨드랑이와 상완 림프 노드는 조직 내에서 깊이있는 조직의 부드러운 기동을 필요로한다.- 당신이 림프절을 찾은 후, 부드럽게 조심스럽게 림프를 더 잘라 가위를 사용하지데스 멀리 피부, 지방, 혈관에서 마우스에서 제거. 적절한 절개를 확인 제거 된 조직을 통해 집게를 출시합니다. 조직 위에 나이프 압연시 하드 덩어리가 존재하는 경우, 림프절 가능성이 성공적으로 제거되었다.
- 얼음 차가운 PBS에서 제거 된 림프절을 놓습니다.
- 집게와 가위를 사용하여 가슴으로 상향 움직임에 노출 된 복부 벽을 절단하여 복강을 엽니 다. 조심스럽게 흉강을 노출, 흉골을 통해 절단.
- 폐 아래의 다이아 프램을 찾아 조리개를 잘라. 이 때문에 장력에 갈비뼈쪽으로 당겨해야합니다.
- 아래에서 폐를 들어 올리고 기관으로 기본 조직을 잘라. 이는 폐는 흉강로부터 자유롭게 제거 될 수있다. 얼음 차가운 PBS에서 블록과 장소 실내 심장과 폐를 제거합니다. 심장은 폐 여기하거나 2 단계에서 계량하기 전에 제거 될 수있다.
- 제거핀 폴리스티렌 폼 패드의 위치에 마우스를 유지. 위에 마우스를 켜고 측면이 측면에하는 맞은 편에 뒷면 하단 끝까지의 피부를 잘라.
- 거즈의 멸균 조각을 사용하여, 마우스의 몸통을 잡고 마우스의 다리와 발 위에 마우스의 뒤쪽 피부를 벗겨합니다.
- 멸균 거즈 같은 조각을 사용하여 조심스럽게 자리에 낮은 다리를 잡고 마우스 다리의 발목 관절 휴식과 무릎 관절을 향해 근위 관절을 통해 피부를 벗겨.
- 가위를 사용하여, 얼음 차가운 PBS에서 무릎 관절과 장소에서 무료로 경골를 제거합니다.
- 반복 반대 사지로) 1.12에) 1.11 단계를 반복합니다.
- 집게를 사용하여, 장소에 대퇴골을 가지고 가위를 사용하여 근육 조직을 둘러싼 절단 차가운 PBS 얼음에 배치, 대퇴골를 제거합니다.
- 반대 다리와 단계를 반복 1.14).
- 멸균 거즈의 새로운 조각을 사용하여 위치에 마우스의 머리를 잡아. 집게와 가위를 사용하여 조심스럽게들 노출 피부를 제거컬 소장. 가위를 사용하여 조심스럽게 후방 뇌를 노출 직선과 아래쪽 라인의 상단 중앙에서 후두부 두개골을 잘라.
- 집게를 사용하여 전방을 향해 뇌의 아래에 특종과 전체 뇌를 제거합니다. 얼음 차가운 PBS의 뇌를 놓습니다.
- 적어도 네 마우스에 대한 단계 1.1) 1.17에)를 반복합니다.
무게 2. 장기
- 장기 분리 후, 전자 저울을 사용하여 폐 및 뇌 조직을 포함하는 각 튜브를 PBS 무게.
- PBS를 튜브 + 기관 (폐 및 뇌)의 중량으로부터 미리 분리 체중 (PBS 만) 뺀 중량 차이를 계산한다.
- 계산 된 무게 차이로부터 조직편을 재현 탁에 필요한 용지의 양을 결정한다.
참고 : 폐와 뇌 조직은 4 재 부유에 의해 정규화 무게 : 1 미디어 : 조직 비율 (부피 / 중량).
폐 - 및 뇌 - 금연실 미디어의 3 세대
- 멸균 t에서문제 문화 후드는 혈액을 포함하는 기관 및 흡인 PBS에서 잔류 혈액을 제거하기 위해 폐 또는 뇌 세 번을 포함하는 PBS 튜브를 반전. 솔루션은 혈액의 증거와 명확한 나타날 때까지 신선한 차가운 PBS로 반복합니다.
- 별도의 60mm 2 유리 페트리 접시에 폐와 뇌를 놓습니다. 조직 절편의 크기가 약 ~ 1mm 3 때까지 반복적으로 앞뒤로 슬라이스하여 두 멸균 메스 블레이드, 말하다 폐 또는 두뇌를 사용하여.
- 재현 탁 조직 단편은 해당 볼륨에 둘 베코의 변형 이글의 중간 (DMEM)의 (단계 2.3에서 이전에 결정된) : 1 배 보충 F12 미디어 미토 겐 보충 및 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ml)에 집중.
- 6 잘 플레이트 잘 하나에 재 부유 폐 또는 뇌 조직 조각을 추가합니다.
- 37 ° C에서 24 시간 5 % CO 2 미디어에서 조직 조각을 품어. 배양 후, 각 조직과 f를 위해 미디어를 조절 수집합니다urther 한 50㎖ 원추형 튜브에 신선한 미디어 세 동등한 양을 첨가하여 희석한다.
- 15 분 동안 4 ° C에서 각 기관에 대한 희석 된 배지에서 1,000 XG에 원심 분리기는 큰 조직 파편을 제거합니다. 미디어 뜨는 수집하고 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 필터링합니다.
- 수영장은 각 기관에서 미디어를 조절 (예., 뇌와 폐, 뇌와 폐) 여러 마우스의 마우스 투 마우스 변동을 설명 할 수 있습니다. 나누어지는 및 저장은 사용할 때까지 -80 ° C에서 미디어를 조절.
골수 에어컨 미디어의 4 세대
- 무균 조직 배양 후드에서 뼈의 과도한 조직을 잘라 내고 가위로 뼈에서 이환 (끝 부분)를 제거합니다.
- 각 골의 중심을 PBS 1 ㎖ 밀어 뼈 ½ 27 G 바늘 플러시 골수 공동 사용. 이는 PBS를 함유하는 신선한 튜브 골수 간질 세포 (BMSC)를 수집 할 수 있도록한다.
- 1,00 원심 분리기0 4 ° C에서 5 분 XG와 PBS로 두 번 BMSC를 씻는다. 뼈 기질 세포 성장 배지 20ml에 재현 탁 골수 간질 세포 (DMEM은 : 1X 보충 된 F12 배지는 분열 촉진 보조제, 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ml) 및 10 % 태아 보벤 혈청 (FBS)을 농축하여 ).
- 접시 한 T75 플라스크에 재현 탁 골수 간질 세포 10 ㎖.
참고 : 각 T75 플라스크에있는 모든 2 마우스에서 결합 및 플레이트 세포; 네 마우스를 들어, 두 개의 T75 플라스크는 (약 1 × 10 7 세포 / 플라스크)이 필요하다. - 37 ° C에서 24 시간 동안 뼈 기질 세포 성장 배지에서 골수 간질 세포를 인큐베이션하고, 5 % CO 2. 배양 후, 두 T75 플라스크에서 미디어를 제거하고 새로운 T75 플라스크에 넣고, "플로터 플라스크"등이 플라스크 레이블을 붙입니다. 이전 2 플라스크에 신선한 뼈 기질 세포 성장 미디어를 추가하고 CO 2를 37 ° C에서 3 플라스크를 품어 5 %.
- 7 - 세포는 약 70 % 컨 플루 (약 5에 도달 한 후일) 통로 세포. 이 작업을 수행하려면 미디어를 제거하고 PBS (3 ㎖ 각 세척)로 두 번 세포를 씻으십시오. 그 트립신을 보장하는 플라스크의 전체 표면을 커버 PBS를 제거하고 트립신 / EDTA 용액 3 ㎖를 추가한다. 세포를 플라스크 리프트 오프 후 (~ 2-3 분)) 3 ㎖ 뼈 기질 세포 성장 배지를 첨가함으로써 트립신의 반응을 멈춘다. 원심 분리는 900 × g으로 4 ℃에서 5 분 동안 새로운 뼈 기질 세포 성장 배지 10ml에 미디어 및 재현 탁 된 세포를 버린다.
- 모든 플라스크 및 통로 1 풀 세포 : 5 세 개의 새로운 T75 플라스크에 넣고 37 ° C에서 품어 5 % CO 2. 세포가 다시 한 번 70 %에 도달 한 후, 단계 4.6 수영장과 통로 모든 부착 세포를 두 번 반복합니다. 다시 플레이트 네 개의 T75 플라스크에 세포와 37 ° C, 5 % CO 2를 품어. 뼈 기질 세포 성장 매체는 모든 단계에 사용한다.
- 세포가 뼈 기질 세포 수집 미디어를 합류에 도달 PBS로 세포를 세 번 세척하고 추가 할 수 있습니다 (DMEM : F12 미디어 + 1 배 농축 미토 겐 스와pplement + 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (/ ㎖를 50㎍); 이 매체는 FBS이 없는지 확인하고 10 ㎖ / T75). 72 시간 후 골수 에어컨 미디어를 수집, 사용할 때까지 -80 ° C에서 0.22 μm의 필터, 수영장, 나누어지는 및 저장을 통해 필터링합니다.
- 원하는 경우, 이전 13 바와 같이 기술 계측법 표준 흐름을 사용하여 마우스 무서-1, CD105, CD29 및 CD73, CD44,에 대한 항체를 사용하여 분리 된 골수 간질 세포 (BMSC)의 표현형을 확인한다.
림프절 에어컨 미디어의 5 세대
- 멸균 조직 배양 후드에서, 림프절 및 흡 묻은 PBS에서 잔여 혈액을 제거하는 림프절 세 번을 함유하는 PBS 튜브를 반전한다. 솔루션은 혈액의 증거와 명확한 나타날 때까지 신선한 차가운 PBS로 반복합니다.
- 60mm 2 유리 페트리 접시에서 림프절를 놓습니다. 반복 tissu 때까지 앞뒤로 슬라이스하여 두 멸균 메스 블레이드, 말하다 림프절을 사용하여E 단편의 크기는 대략 1 내지 3 mm이다.
- 원추형 튜브 로스웰 파크 메모리얼 연구소 1640 (RPMI1640) 페니실린 (50 μg의 / ml)로 보충 된 미디어 / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖), 5 × 10-5 M 멸균 β 머 캅토 에탄올 10ml에 재현 탁 조직 절편 ( 1.75 μL / 500 ml의 미디어) 10 % FBS.
- 4 ° C에서 5 분 900 XG에 원심 분리기 30 ml의 미디어에있는 모든 세포를 재현 탁. 5 ml의 미디어 / 잘 6 웰 플레이트에 추가하고 37 ° C에서 칠일, 5 % CO 2 품어.
- 7 일간 배양 한 후, 미디어를 버리고 5 ml의 따뜻한 PBS에 부착 된 세포를 씻어 각 웰에 5 ml의에게 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다. 단계 4.6에 설명 된대로 모든 세포를, - (7 일 약 5)를 Trypsinize 수영장 및 통로 세포가 포화 상태로 성장 할 수 있습니다. 6 웰 플레이트에 다시 플레이트 세포. 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 세 구절 후, PBS로 우물을 세 번 씻어 추가, 세포가 포화 상태로 성장 할 수 있도록 2 ㎖ / 잘 DMEM : F12 + 1 배이 매체는 FBS의 무료 보장 집중 미토 겐 보충 및 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖). 사용할 때까지 -80 ° C에서 72 시간, 수영장, 나누어지는 및 저장 후 림프절 에어컨 미디어를 수집합니다.
- 원하는 경우, 이전 13 바와 같은 기술 표준 유동 세포 계측법을 사용하여 마우스 CD45과 gp38,에 대한 항체를 사용하여 단리 림프절 간질 세포 (LNSC)의 표현형을 확인한다.
암 세포의 전이성 동작에 관련 다운 스트림 분석 실험에 대한 장기 에어컨 미디어 6.
- 5, 암세포의 전이 거동에 용해 장기 유래 인자의 영향을 결정하기 위해 다른 하류 세포 및 분자 생물학적 분석법을 수행하는 데 사용 - 장기 조정 배지되면 단계 1에 기재된 바와 같이 생성되었다. (다른 문헌에 기재되어 있음) 표준 분석법의 예로는 단백질 어레이 (13), 세포 성장 분석을 포함 <SUP> (13), 셀룰러 이동은 tumorsphere 형성 (14), (13) 분석 및 RT-PCR 15. 원래 기본 미디어 (장기 에어컨 미디어를 생성하는 데 사용 즉, 무조건 DMEM :. 1 배 보충 F12 미디어) 미토 겐 보충 및 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖를 집중 음성 대조군으로 사용한다 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
장기 에어컨 미디어의 생성
장기 절연 및 조정 배지의 생성 방법의 개요도 / 개략도는도 2에 도시 된 절차를 나타내는 사진 영상과 함께,도 1에 나타나있다.이 프로토콜 처음 개발되었을 때, 간 포함되었음을 주목해야 분석에서 유방암 전이의 일반적인 위치이기 때문이다. 그러나, 제조 및간에 의해 분비되는 단백질 분해 효소의 대량, 이는 양질의 조정 배지를 생성하기에 충분히 오래 생존 간 유지하는 것은 매우 어렵다. 간 조정 배지 격리되면도 안정되지 않고, 같은 이유로 예상 단백질 침전물을 많이있을 쉽다. 따라서 간은 더 이상 분석에 포함되지 않았다.
(그림 3A)를 시연하고 BMSCs 더 작은 모양 (그림 3C)를 시연과 함께, 문화 접착제해야한다. 유세포 분석 LNSCs 크게 CD45 것을 확인 - 그리고 gp38 +,와 ~ CD45을 가진 세포의 60 % - gp38 + LNSCs 16 (그림 3B)을 나타내는 표현형. BMSCs (17, 18)을 나타내는 - BMSCs은 CD44 및 CD29, 약 CD105 및 무서-1에 대한 긍정적 및 부정적인 CD73에 대한 (H 그림 3D)에 대한 긍정적이어야한다.
유방암 세포 RESP이주 패턴 및 유전자 발현의 변화 오르간에 적합한에 온세
이러한 생체 외 모델 시스템을 사용하여, 이전에 설명되었다 특정 기관의 조건으로 유전 적 배경을 나타낸다 차 마이그레이션 및 성장 패턴을 변화 인간 유방암 세포. 특히, 이러한 패턴은 생체 내 (13)에서 이러한 세포주의 알려진 전이성 확산 패턴을 반영한다. 현재의 연구에서, 골 (231-BOM) - 및 MDA-MB-231 인간 유방암 세포 변형의 변형을 -seeking 폐 (231-LM2) (박사 조안 Massagué 11, 12에서 일종의 선물)도 있었다 기관에 적합한 이동 패턴을 확인하기 위해 트랜스 웰 마이그레이션 분석에 사용됩니다. 결과는 뼈 추구하는 231-BOM에 변형이 우선적으로 뇌 - 이상 골수 에어컨 미디어로 마이그레이션 및 에어컨 미디어 (왼쪽 그림 4A를) 폐 - 있음을 보여줍니다. 비슷하게, 폐 추구하는 231-LM2 변형은 우선적으로 (오른쪽 그림 4A) 골수 에어컨 미디어 및 뇌 에어컨 매체를 통해 폐 에어컨 미디어로 마이그레이션합니다. 또한, RT-qPCR의 분석 부모 MDA-MB-231 유방암 세포의 노출 역시도 뼈 또는 폐 조정 배지 뼈 특정 전이 관련 유전자의 상향 조절을 일으키는 것을 증명 (CXCR4, IL-11, TGFß1) 또는 폐 - 생체 (11, 12) (도 4b)의 유방암 세포의 특정 전이 (VCAM1). 이러한 결과들은 생체 내에서 유방암 세포의 예상 장기 향성 관련하여 생체 외 시스템의 유효성을 입증하고, 장기 조정 배지에 존재하는 가용성 인자는 이동을 촉진 이외에 전이성 세포의 표현형에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
장기 에어컨 미디어는 전이성 행동의 잠재적 인 가용성 조정자를 포함합니다
바이오틴 라벨 기반 마우스 항체 어레이는 상이한 기관에서 기관 - 조정 배지의 존재하에 일반적인 가용성 요소 ID를 평가하는데 사용 하였다. 이 배열은 추 등에 도시 된 바와 같이 이전에 폐 및 골수 조정 배지 내에 전이성 캐스케이드 본과 연관된 관심 가용성 요소를 식별하는 데 사용되었다 (2014)는 가장 일반적인 마우스 가용성 proteins.This 단백질 어레이 (308)에 대한 항체를 포함 그리고 피오 등의 등 (2015)은 각각 13, 14. 현재의 연구에서 단백질 배열의 결과는 림프 노드 - (그림 5B)과 뇌 에어컨 미디어 (그림 5C)에 비해 기저 미디어 (그림 5A)에 대해 표시됩니다. 문헌 19-29에서 전이성 캐스케이드의 단계와 관련이있는 것으로 밝혀졌다 미디어에 존재하는 수용성 요소는 각 배열 옆에 강조 표시됩니다. 이러한 수용성 FACTORS이 기관 사이트 내에서 보조 전이의 가능성이 중재자로 조사 가치가있을 수 있습니다.
에어컨 미디어의 장기 분리 및 세대의 프로세스 그림 1. 개요 도식. 조직 (폐, 뇌, 대퇴골, 경골과 림프 노드) 마우스에서 수확된다. 폐, 뇌 및 림프 노드는 메스와 다진 있습니다. 골수는 27½ G 바늘로 구멍을 통해 PBS 밀어 뼈 골수 공동으로부터 수확된다. 폐와 뇌 조직 조각 신선한 기저 미디어의 세 동등한 볼륨을 희석하기 전에 24 시간 동안 배양 및 폐 - 뇌 에어컨 미디어를 만들기 위해 수집됩니다. 뼈와 림프절 에어컨 미디어를 만들기 위해 기초 매체와 배양하기 전에 3 번 - 골수와 림프 노드 기질 세포는 2 계대 있습니다. 수확 미디어는 페이지 수 있습니다ooled 및 단백질 배열, 세포 성장 분석, 세포 마이그레이션 분석, tumorsphere 형성 및 RT-PCR 등 다운 스트림 분석에 사용하기위한 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 보관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 에어컨 미디어의 장기 분리 및 생성을위한 절차 2. 대표 사진 이미지. 일 0시는 폐, 뇌, 대퇴골, 경골 및 림프절 마우스에서 수집됩니다. 폐, 뇌 및 림프 노드의 크기는 약 1mm 3 개의 메스 블레이드와 60mm 2 유리 페트리 접시에 넣고 다진된다. 골수는 새로운 튜브에 27 ½ G 바늘로 구멍을 통해 PBS 밀어 뼈 골수 공동으로부터 수확PBS의. 폐와 뇌 조직 조각 신선한 미디어의 세 동등한 볼륨을 희석하기 전에 37 ° C, 5 % CO 2에서 24 시간 동안 배양하고 24 시간 후 폐 - 뇌 에어컨 미디어를 만들기 위해 수집됩니다. 골수와 림프절 간질 세포는 37 ° C에서 배양 5 % CO 2를 2 계대된다 - 뼈와 림프절 에어컨 미디어를 만들기 위해 무 혈청 기저 매체와 매체를 교체하기 전에 3 번 (~ 삼주 총). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
격리 된 림프절과 골수 기질 세포의 그림 3. 특성. (A) 림프절 기질 세포의 형태 (LNSCs)을 나타내는 명 시야 현미경 이미지. (B) 주제 유동gp38 항체 및 형광 염료 (FITC를)를 피코 에리 트린 (PE)을 공역 사용 LNSCs 분석 계측법 CD45 항체 π 공역. (C) 골수 간질 세포의 형태 (BMSCs)을 나타내는 명 시야 현미경 이미지. (DH) 주제 유동 PE 접합 (블랙 프로파일)를 사용 BMSCs에 대한 항체의 세포 계측법 분석 (D) CD44 (E) CD106 (F) 무서-1에 이소 타입 대조군 (흰색 정보)에 대하여 (G) CD29 (H) CD73 항체. 만 가능한 이벤트의 최소 샘플 당 수집 하였다. 이 수치가 13에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 또는질화 갈륨 해당 기관이 완비 된 미디어에 대한 응답으로 이주 패턴 및 유전자 발현의 변화. (A) (231)-BOM이 뼈가 추구하는 변종 (왼쪽, 스트라이프 막대) 또는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포주의 폐 추구하는 231-LM2 변형 (오른쪽, 스트라이프 바)뿐만 아니라 부모의 MDA-MB- 또는 기관-CM : (231) 세포 (두 패널, 고체 바) 젤라틴 코팅 인서트 기저 미디어에서 이전 위치로 (8 μm의 기공) (F12 + 농축 미토 겐 보충 DMEM)에 도금했다. 플레이트는 18 시간 동안 CO (2)을 37 ° C에서 배양 5 %였다. (B) 전체 인구 부모 MDA-MB-231 세포를 48 시간 동안 어느 뼈 CM (왼쪽) 또는 폐 CM (오른쪽)에 노출시켰다. RNA를 단리하고 RT-qPCR의 정량을 사용. 기관-CM (검은 막대)에 응답하여 유전자 발현의 변화는 GAPDH에 정상화했다 및 기저 미디어 (회색 막대)의 기본 식에 대해 표현했다. 데이터는 SEM ± 평균 (으로 표시하고 있습니다N = 3; 기저 매체의 각각의 음성 대조군에서) 변화를 접습니다. * = 기저 미디어에서 유의 한 차이; δ = 같은 미디어 처리 조건 부모 세포주 크게 다르지; P <0.05, ANOVA는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 장기 에어컨 미디어는 전이성 행동의 잠재적 인 가용성 조정자를 포함합니다. 비오틴 레이블 기반 마우스 항체 배열이 림프 노드-CM과 뇌-CM에 존재하는 수용성 요소를 식별하는 데 사용되었다. 4 O CO / N에서, (B) 림프절-CM 또는 (C) 뇌 CM 및 chemilum를 사용하여 시각 : 막은 (A) 기저 매체 (F12 + 농축 미토 겐 보충 DMEM)의 비오틴 샘플 배양inescence. 블루 타원 내부 긍정적 인 컨트롤, 줄 지어 상자 내부 음성 대조군과 고체 상자가 잠재적으로 림프절이나 뇌에 유방암 세포의 전이 행동에 참여하고 관심의 수용성 요소를 나타냅니다 나타냅니다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
전이는 세포 일련의 이벤트가 조직의 침략과 먼 종양 설립 4,30,31에 대한 궁극적 책임이있는 복잡한 과정이다. 해당 기관의 특정 기관 ( "거기에 도착")과 성장 ( "가 성장")에 암 세포 유도 또는 마이그레이션 : 여기에 제시된 생체 모델 시스템은 전이성 진행의 두 가지 중요한 측면을 연구하는데 이용 될 수있다. 많은 연구는 이전 전이 과정에 기여 암세포 자체와 연관된 주요 분자의 특성을 식별에 초점을 맞추고있다. 예를 들어, 조안 Massagué의 그룹에 의해 수행 작업은 폐 별, 뼈 별 및 확산 10-12,32의 뇌 특정 패턴과 관련된 고유 한 유전자 서명을 확인했습니다. 이 작업이 과정 암세포의 기여에 관하여 중요한 식견을 제공하지만, 훨씬 적은 t 기부 기관 특이 요소의 역할에 대해 알려진(13) 연구 상대적으로 도전 남아있다 그는 차 미세.
이것은 생체 외 모델 시스템이 이전 장기 CM의 유방암 세포주 특정 이동과 성장을 보여줌으로써 보조 기관 미세의 정확한 표현으로 검증 된 것은 전이성 확산 생체 패턴 이들 세포주를 "거울. 추 연구진의 연구는 생체 내, 림프절, 폐, 간, 뼈와 뇌 전이, MDA-MB-231 및 높은 전이성 SUM-159 (포함하여 생체 내에서 전이 전위 변화 4 개의 다른 인간 유방암 세포주를 사용 ) 및 뼈 marrow-, 림프 방향으로 SUM-149 및 MDA-MB-468 (적당히 전이에있는 림프절 및 생체 내에서 폐)에 전이. 모두 MDA-MB-231 SUM-159 세포주 향상 표시된 마이그레이션 노드 - 폐-CM SUM-149 및 MDA-MB-468 세포주는 우선적으로 폐으로 마이그레이션하는 동안13-㎝. 현재의 연구 역시도 뼈와 폐 추구 MDA-MB-231 모두 각각 뼈 marrow- 폐-CM로 마이그레이션하는 것을 선호 변종 것을 증명 및 기관-CM에 그 노출 역시도 뼈와 폐 관련 전이 유전자의 발현을 촉진 할 수 이전 Massagué와 동료들 (11, 12)에 의해 식별. 종합하면, 이들 결과는 장기 CM의 표현형 및 유방암 세포의 행동에 영향을 생체 내에서 발견되는 기관 특이 가용성 인자의 생체 플랫폼 담당자 제공 보여준다.
특정 기관 내에 존재하는 가용성 인자 및 표현의 상대 레벨의 확인은 암 세포 행동에 미치는 잠재적 영향을 결정하기위한 시작점을 제공한다. 또한, 이러한 immunodepletion 같은 기술들을 사용하여 사용자가 유효하게 동작 시험 관내 세포에 미치는 영향을 결정하기 위해 장기 CM에서 목적 단백질을 소모 할 수있다. 예를 들면특정 장기 미세 환경 내 존재하는 많은 가용성 인자는 화학 유인 물질로서 기능 및 세포 이동과 증식을 유도 할 가능성이있다. 폐-CM을 사용하여 수행 이전 작업 폰틴 (OPN) 및 L- 셀렉틴 (SELL) (13)를 포함하여 유방암 세포에 대한 화학 유인 물질로서 작용할 수있다 폐에 존재하는 CM 많은 가용성 인자의 동정하게되었다. 폐-CM에서 이러한 요소를 immunodepleting으로 추와 동료들은 감소 된 세포 마이그레이션 및 / 또는 높은 전이성 MDA-MB-231 유방암 세포 (13)의 성장을 입증 할 수 있었다. 이러한 결과들은 전체 장기 전통적인 시험 관내 기법을 사용하여 암세포의 특정 동작 가용성 요소의 효과를 연구하기위한 가치있는 자원을 제공하는 조정 배지에서 생성 된 것을 보여준다.
이것은 매우 간단 모델 시스템이지만, successfu에 대한 중요한 실험 프로토콜의 몇 가지 단계가 있습니다기관 에어컨 미디어 리터 생성. 첫째, 장기 수확 6~12주의 정의 된 세 사이의 마우스의 사용은 연령과 관련된 효과를 제어하기 위해 중요한 하나 개발 관련 (6 주 전에) 이상 생쥐에서 노화와 관련이 있습니다. 둘째, 무균 프로토콜에 걸쳐 가장 중요하고 가장 (모든 배지 보충 멸균 조직 배양 용 재료 및 시약뿐만 아니라 약한 항생제를 사용하여 멸균 조직 배양 후드에서 엄격한 무균 작업 사용함으로써 확보 될 수있다 즉., 페니실린 / 스트렙토 마이신). 생체 내 또는 생체 외 모델 시스템에서 사용하는 데 어려움 중 하나는 고유 동물 간 변동성 동물이다. 이 관찰 된 경우, 문제 해결 단계는 폐 - 뇌 에어컨 매개체가 각 날에 정확하게 무게 정규화 것을 하류 실험에 사용하기 전에 마우스의 여러 일괄 처리에서 얻은 컨디셔닝 미디어의 풀링뿐만 아니라 보장을 포함1 미디어 : 4에 재 부유하여 직경 컬렉션 실험 조직 비율 (부피 / 무게). 또한, 기본 림프절 및 골수 기질 세포는 그렇지 않으면 말단 차별화, 특정 통로에서 70 % 컨 플루 언시를 초과하거나 또는 총 5 통로 이상 성장이 허용되어서는 안된다.
이 문서에서 제시 한 프로토콜에 대한 수정이 연구의 다양한 분야에 적용 할 수 있도록 구상 할 수있다. 이 모델은 현재까지 유방암 연구를 위해 독점적으로 사용되었지만, 잠재적으로 다른 암과 추가 정상적인 생리적 질병 상태의 장기 유래 가용성 인자의 역할을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 이 방법은 면역 누드 마우스 모델로 여기에 사용되었지만 또한, 이러한 기술은 이론적으로 마우스의이 종류에 한정되지 않고 잠재적으로 동물 모델의 다른 형태로 사용될 수있다.
이 모델은 importa을 제공하지만암 세포 행동의 특정 장기 유래 가용성 인자의 기여도에 관한 통찰력 NT, 그것은 한계가없는 것은 아니다. 우선이 모델은 전적으로 세포 외 기질 (ECM)의 중요성을 무시 장기 미세 환경의 수용성 성분에 초점을 맞춘다. ECM을 모든 조직 유형 및 함수 내의 비 세포 성분의 존재는 세포의 물리적 지지체뿐만 아니라 형태 형성, 세포 분화 및 항상성 (33)을 포함하는 다양한 세포 과정에 필요한 중요한 생화학 적 및 생체 역학적 신호를 유도하는 능력 모두를 제공하는 것이다 -35. 중요한 것은, ECM의 물리적, 생화학 적 조성물은 널리 이기종이며, 조직 유형에 따라 크게 다를 수 있습니다. 따라서, ECM의 조직 - 특이 적 조성물은이 모델 간과 될 수 암전 중에 장기 향성에 영향을 미칠 수있다. 전자 재료는 appropriatel 그 방법으로 특정 가용성 요인을 집중 작용할 수있다y를 특정 세포로 제시하고, ECM이 미세 조정하지 않고, 세포 신호의 유도는 감소 또는 36 변경 될 수있다. 이 문서에 언급 된 모델은 적절한 ECM 성분이 부족하지만, 많은 연구는 적절한 ECM 구성 요소와 함께 여기에 언급 된 모델을 모두 사용하는 무료 방법을 사용하여 강화 될 수있다. 예를 들어, 내인성 ECM 또는 재조합 ECM 성분을 합성 시판 차 장기 섬유 아세포 세포의 거동에 전체 미세 기관의 전체 범위를 결정하기 위해 생성 장기 CM에 더하여 사용될 수있다.
이는 장기 CM에서 생성 된 수용성 미세 적절 전이 과정에서 본 생리적 인 모방하지 않을 수있다. 암 세포 생존, 성장과 진행 암 세포 호스트 상호 작용 4,30,31에 크게 의존한다. 전체 기관-CM의 생성은 페이지가 발생할 수 있습니다가용성 인자 resence 일반적 전이성 진행 중에 암 세포와 상호 작용하는 세포 유형에 의해 발현되지. 또한, 이전 주 종양의 존재함으로써 전이 (37)을 "프라이밍"전이성 먼 위치의 미세 환경을 조절할 수 있음을 증명하고있다. 현재 프로토콜 건강한 비 종양 - 함유 마우스 유래의 장기를 사용하기 때문에, 일차 유방 종양 함유 마우스에서 장기 유래의 수용성 요인을 비교할 가치가있을 것이다.
인해 각종 장기 CM의 발생 동안 전체 기관의 기계적 분리하여 세포 내 인자는 일반적으로 암세포에 의해 생리적으로 발생되지 않을 주변 매체에 방출 될 수있다. 또한 역시도 뼈와 림프절 유래 컨디셔닝 매체는 이전에 자신의 컬렉션에 이러한 기관에서 분리 한 기질 세포의 배양이 필요합니다. 생체 cultu 중에 존재하는 세포 유형링 정확하게 암 세포에 의해 생리 학적으로 발생하는 세포 유형의 폭을 표현하지 않을 수 있습니다. 간질 세포는 주로 많은 인자를 분비하는 동안 조직 및 기관 (38) 내에 존재하는 다른 세포 유형의 영향을 고려하지 않을 수 이들 방법을 사용하여, 각종 장기와 연결된 미세 환경. 우리는 이것을 배양 기관 (폐 및 뇌)과 절연 BMSC와 LNSC 모두의 생존을 유지하기 위해 필요한 것을 알 수 있기 때문에 마지막으로, 장기 조정 배지를 생성하기 위해 사용되는 기본 배지에서 분열 촉진 보조제를 포함했다. 그러나,이 분열 촉진 보조제의 존재하에 인공적가 정상적으로하지 수 가용성 인자를 생성하기 위해 상기 장기 자극 수도 있다는 경고를 인식
결론적으로, 많은 연구 기관 특정 미세 환경 뿌리깊 종양 세포 생물학에 영향을 미칠 수 있음을 지적 하였다. 논의 된 한계에도 불구하고, 생체 모델 시스템은 여기에 제시된 r에휴대 행동에 많은 고형 장기의 수용성 미세 환경의 영향을 연구하기위한 포괄적 인 기술을 epresents. 작성자의 실험에서,이 모델 시스템 왔으며, 침윤, 이동, 증식 포함한 전이와 연관된 세포 사건의 많은 연구를위한 수단으로 사용되는 것을 계속 줄기 형 행동 및 유전자 발현 변화. 이러한 연구로부터 얻은 데이터는 다시 전위 전이성 부위를 나타내는 다양한 미세 환경에 대한 반응을 결정하기 위해 환자의 종양으로부터 분리 기본 유방암 세포에이 모델 시스템의 잠재적 임상 적용을 알릴 수있다. 이와 함께, 그 장기 향성 전이의 과정에서 미세 종양 세포 사이의 상호 작용의 이해를 더 앞으로 암 치료의 향상으로 이어질 것으로 기대한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
- Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278 (1928).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
- Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
- Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
- Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
- Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
- Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
- Zlotnik, A.
- Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
- Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
- Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805 (2014).
- Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
- Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
- Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
- Chiang, A. C., Massague, J.
- Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
- Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).
