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स्तन कैंसर Metastatic व्यवहार पर अंग-विशिष्ट प्रभाव का अध्ययन कर के लिए अंग-वातानुकूलित मीडिया और आवेदनों की जनरेशन

Published: June 13, 2016 doi: 10.3791/54037
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 1,3, 1, 1,2,4,5
1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 3Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 4Department of Oncology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 5Lawson Health Research Institute
* These authors contributed equally

Introduction

स्तन कैंसर महिलाओं में सबसे अधिक बार निदान कैंसर और कैंसर से संबंधित मौतों 1 का दूसरा प्रमुख कारण है। स्तन कैंसर के उच्च मृत्यु दर मुख्य रूप से पारंपरिक चिकित्सा को कम करने और metastatic रोग को खत्म करने की विफलता के कारण होता है; कैंसर से संबंधित मौतों का लगभग 90% मेटास्टेसिस 2 के कारण हैं। मेटास्टेटिक झरना के अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझना दोनों जल्दी और देर चरण स्तन कैंसर में कारगर चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए सर्वोपरि है।

विगत अनुसंधान में मदद मिली है स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के multistep प्रकृति को स्पष्ट और यह धारणा है कि दोनों कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिस के परिणाम काफी हद तक कैंसर की कोशिकाओं और मेजबान वातावरण 3 के बीच बातचीत पर निर्भर है। नैदानिक ​​टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि कई तरह के कैंसर अंग tropism प्रदर्शित, अर्थात्।, प्रवृत्ति preferentially कैस organs.In विशिष्ट करने के लिए metastasizeस्तन कैंसर के ई, एक मरीज ​​की बीमारी आम तौर पर फैलता है या हड्डी, फेफड़े, लिम्फ नोड, जिगर और मस्तिष्क 4-6 सहित 5 मुख्य साइटों, के लिए metastasizes। कई सिद्धांतों इस प्रक्रिया को समझाने के लिए विकसित किया गया है, लेकिन केवल कुछ ही समय की कसौटी पर झेल चुके हैं। मेटास्टेसिस के Ewing के सिद्धांत, 1920 के दशक में प्रस्तावित है, धारणा मेटास्टेसिस के thatthe वितरण सख्ती से यांत्रिक कारकों की वजह से किया गया था; जिससे ट्यूमर कोशिकाओं को सामान्य परिभाषित शारीरिक रक्त प्रवाह पैटर्न से पूरे शरीर में किया जाता है और बस पहली केशिका बिस्तर में गिरफ्तार वे मुठभेड़ 7। इसके विपरीत, स्टीफन पेजेट 1889 "बीज और मिट्टी" परिकल्पना सुझाव दिया है कि अतिरिक्त आणविक बातचीत अस्तित्व और मेटास्टेसिस के विकास, जिससे कैंसर की कोशिकाओं ( "बीज") केवल खुद को स्थापित कर सकते हैं और proliferatein अंग microenvironments कि उचित आणविक कारकों का उत्पादन ( "मिट्टी के लिए जिम्मेदार थे ") 8। लगभग एक सदी बाद, लियोनार्ड वेइस के तहतपहले प्रकाशित शव परीक्षण डेटा की एक मेटा-विश्लेषण लिया और इविंग की भविष्यवाणी की पुष्टि की है कि कई मेटास्टेटिक शव परीक्षा के समय में पता चला ट्यूमर प्रत्याशित अनुपात है कि उम्मीद होगी यदि मेटास्टेटिक अंग tropism रक्त प्रवाह पैटर्न से अकेले निर्धारित किया गया था में पाए गए। हालांकि, manyinstances में वहाँ कम या अधिक मेटास्टेसिस कुछ साइटों तो इविंग के प्रस्तावित यांत्रिक कारकों 9 से उम्मीद होगी पर गठित थे। इन खातों और सिद्धांतों का सुझाव है कि विशिष्ट अंग microenvironments प्रसार पैटर्न और बाद के विकास और स्तन कैंसर सहित कई तरह के कैंसर, के अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

विगत अनुसंधान प्रयासों मुख्य रूप से ट्यूमर सेल व्युत्पन्न कारकों पर ध्यान केंद्रित किया है और अंग tropism स्तन कैंसर मेटास्टेसिस 10-12 में मनाया के लिए उनके योगदान, अंग microenvironment से निकाली गई हालांकि छोटे से अनुसंधान पता लगाया गया है कारकों स्थापना के लिए एक अनुकूल आला प्रदान कर सकता है किस्तन कैंसर मेटास्टेसिस की। यह काफी हद तक इन विट्रो में अंग microenvironment के घटकों का अध्ययन करने की तकनीकी चुनौतियों के कारण है।

वर्तमान लेख लिम्फ नोड, हड्डी, फेफड़े और मस्तिष्क मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं के व्यवहार पर मेटास्टेटिक के घुलनशील घटकों के प्रभाव के अध्ययन के लिए एक व्यापक पूर्व vivo मॉडल प्रणाली का वर्णन है। पिछले अध्ययनों से प्रदर्शित किया कि विभिन्न स्तन कैंसर कोशिका लाइनों अंग वातानुकूलित मीडिया के जवाब में सेल लाइन विशिष्ट और अंग विशेष घातक व्यवहार है कि उनके इन विवो मेटास्टेटिक संभावित 13 से मेल खाती प्रदर्शित द्वारा इस मॉडल प्रणाली पुष्टि की है। इस मॉडल प्रणाली, की पहचान करने और विशिष्ट अंग व्युत्पन्न घुलनशील कारकों है कि स्तन कैंसर की कोशिकाओं और अन्य प्रकार के विकास, प्रवास पर प्रभावों को शामिल करने की मेटास्टेटिक व्यवहार में एक भूमिका निभा सकते हैं का मूल्यांकन करने, स्टेम की तरह व्यवहार, और जीन अभिव्यक्ति इस्तेमाल किया जा सकता के रूप में अच्छी तरह से की पहचान के रूप मेंकैंसर के लिए संभावित नए चिकित्सीय लक्ष्य। यह पहला पूर्व vivo मॉडल प्रणाली है कि विस्तार से अंग विशेष मेटास्टेटिक व्यवहार का अध्ययन करने के लिए और कैंसर मेटास्टेसिस की प्रक्रिया ड्राइविंग में अंग व्युत्पन्न घुलनशील कारकों की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

सभी जानवरों के अध्ययन पश्चिमी विश्वविद्यालय पशु उपयोग उपसमिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद की सिफारिशों के अनुसार आयोजित की गई।

1. अंग अलगाव (फेफड़े, मस्तिष्क, अस्थि, लिम्फ नोड)

  1. (अलग किया जा करने के लिए एक-एक अंग के लिए) चार बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तैयार बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के लगभग 30 मिलीग्राम से युक्त। एक इलेक्ट्रॉनिक संतुलन का उपयोग पीबीएस के प्रत्येक ट्यूब पूर्व तौलना।
  2. Euthanize सीओ 2 साँस लेना द्वारा 6-12 सप्ताह पुरानी माउस। 2 मिनट या जब तक माउस चलती है और सांस लेने में बंद हो जाता है - चूहे लगभग 1 के लिए सीओ 2 कक्ष में छोड़ा जाना चाहिए। सफल इच्छामृत्यु आगे दिल की धड़कन की कमी से इसकी पुष्टि की जा सकती है, जब एक उंगली के साथ मैन्युअल की जाँच की। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से बचने के रूप में इस विधि गर्दन कक्षा लिम्फ नोड्स को हटाने के लिए अग्रणी कठिनाई की रक्त वाहिकाओं को बिगाड़ सकता।
    ध्यान दें: पिछला काम विशेष रूप से इस्तेमाल किया गया हैस्वस्थ महिला नग्न चूहों, एचएसडी: athymic Nude- Foxn1 परमाणु 13।
  3. एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में, एक polystyrene फोम पैड पर अपनी पीठ पर माउस जगह हाथ पैर फैला है और पिन का उपयोग जगह में उन्हें रखने के लिए।
  4. बाँझ संदंश और कैंची का प्रयोग, जननांग पर midline पर पेट की त्वचा में कटौती और मुँह की ओर ऊपर की तरफ काट दिया। धीरे वापस पेट की मांसपेशियों से पेट की त्वचा खींचने के लिए और polystyrene फोम पैड पर जगह में पिन।
  5. कक्षा, बाहु, और वंक्षण लिम्फ नोड्स का पता लगा।
    नोट: लिम्फ नोड्स आमतौर पर वसा ऊतकों से घिरे हैं। वंक्षण लिम्फ नोड्स के लिए सबसे आसान के रूप में वे वापस खींच लिया पेट की त्वचा पर दो रक्त वाहिकाओं के जंक्शन पर अल्पज्ञता पाए जाते हैं पता लगाने के लिए कर रहे हैं। कक्षा और बाहु लिम्फ नोड्स ऊतक के भीतर गहरे स्थित है और ऊतक के कोमल चालों की आवश्यकता होती है।
    1. तुम्हारे जाने के बाद लिम्फ नोड्स स्थित है, कैंची का उपयोग धीरे और सावधानी से लसीका कोई कटौती करने के लिएdes त्वचा, वसा और जहाजों से दूर है और उन्हें माउस से हटा दें। उचित विच्छेदन इस बात की पुष्टि करने के लिए, हटा ऊतक खत्म संदंश रोल। एक कठिन गांठ मौजूद है जब ऊतक के ऊपर संदंश रोलिंग, तो एक लिम्फ नोड संभावना सफलतापूर्वक हटा दिया गया है।
    2. बर्फ के ठंडे पीबीएस में हटा दिया लिम्फ नोड्स रखें।
  6. संदंश और कैंची का प्रयोग, सीने की ओर ऊपर एक प्रस्ताव में उजागर पेट की दीवार के माध्यम से काटने से उदर गुहा खुला। ध्यान से, उरोस्थि के माध्यम से कटौती वक्ष गुहा को उजागर।
  7. फेफड़ों के नीचे डायाफ्राम जानें और डायाफ्राम काटा। यह तनाव के कारण पसलियों की ओर खींच चाहिए।
  8. नीचे से फेफड़ों लिफ्ट और श्वासनली की दिशा में अंतर्निहित ऊतक काटा। यह फेफड़ों वक्ष गुहा से स्वतंत्र रूप से हटाया जा करने की अनुमति देता है। बर्फ के ठंडे पीबीएस में दिल और फेफड़ों के एन ब्लॉक और जगह निकालें। दिल फेफड़ों यहाँ या सिर्फ चरण 2 में वजन पहले से हटाया जा सकता है।
  9. हटाएपिन, polystyrene फोम पैड पर जगह में माउस रखे हुए हैं। पर माउस मुड़ें और पार्श्व पार्श्व करने से पीठ के निचले हिस्से भर में सभी तरह की त्वचा में कटौती।
  10. माउस की धड़ पकड़ के लिए, पैर और माउस के पैरों पर माउस के पीछे त्वचा छील धुंध के एक बाँझ टुकड़ा का उपयोग करना।
  11. बाँझ धुंध के एक ही टुकड़े का उपयोग करना, जगह में कम पैर पकड़ ध्यान से माउस पैर के टखने संयुक्त तोड़ने के लिए और संयुक्त घुटने की ओर proximally संयुक्त पर त्वचा छील।
  12. कैंची का प्रयोग, टिबिया संयुक्त घुटने और बर्फ के ठंडे पीबीएस में जगह से मुक्त हटा दें।
  13. दोहराएँ कदम 1.11) 1.12 करने के लिए) के सामने अंग के साथ।
  14. संदंश का प्रयोग, जगह में फीमर पकड़ कैंची का उपयोग मांसपेशियों के ऊतकों के आसपास के दूर कटौती और फीमर हटाने, बर्फ में रखकर ठंड पीबीएस।
  15. दोहराएँ कदम 1.14) विपरीत अंग के साथ।
  16. बाँझ धुंध का एक नया टुकड़ा का उपयोग करना, जगह में माउस के सिर पकड़। संदंश और कैंची का प्रयोग, धीरे रों बेनकाब करने के लिए त्वचा को हटानेKull। कैंची का प्रयोग, ध्यान पश्चकपाल खोपड़ी शीर्ष केंद्र से एक सीधी और नीचे लाइन में पीछे मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए काट दिया।
  17. संदंश का प्रयोग, पूर्वकाल की ओर मस्तिष्क के नीचे स्कूप और पूरे मस्तिष्क को हटा दें। बर्फ के ठंडे पीबीएस में मस्तिष्क रखें।
  18. कम से कम चार चूहों के लिए कदम 1.1) 1.17 करने के लिए) को दोहराएँ।

2. अंग वजनी

  1. अंग अलगाव के बाद, एक इलेक्ट्रॉनिक संतुलन का उपयोग फेफड़े और मस्तिष्क के ऊतकों से युक्त प्रत्येक पीबीएस ट्यूब तौलना।
  2. पूर्व अलगाव वजन (पीबीएस केवल) पीबीएस ट्यूब + अंगों (फेफड़े और मस्तिष्क) के वजन से घटा कर वजन अंतर की गणना।
  3. गणना वजन अंतर से ऊतक टुकड़े resuspend करने की जरूरत मीडिया की राशि का निर्धारण करते हैं।
    नोट: फेफड़े और मस्तिष्क के ऊतकों एक 4 में मेजबान द्वारा सामान्यीकृत वजन रहे हैं: 1 मीडिया: ऊतक अनुपात (खंड / गुम्मट)।

3. Lung- और Brain- वातानुकूलित मीडिया की पीढ़ी

  1. एक बाँझ टी मेंमुद्दा संस्कृति हुड, फेफड़ों या मस्तिष्क में तीन बार युक्त अंगों और महाप्राण पीबीएस रक्त युक्त से अवशिष्ट रक्त को दूर करने के लिए पीबीएस ट्यूबों पलटना। ताजा ठंड पीबीएस के साथ दोहराएँ जब तक समाधान रक्त का कोई सबूत के साथ स्पष्ट प्रतीत होता है।
  2. फेफड़े और दिमाग अलग 60 मिमी 2 गिलास पेट्री डिश में रखें। बार-बार आगे और पीछे टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा दो बाँझ स्केलपेल ब्लेड, कीमा फेफड़ों या दिमाग का उपयोग कर जब तक ऊतक टुकड़े आकार में लगभग ~ 1 मिमी 3 रहे हैं।
  3. Resuspend ऊतक टुकड़े उचित मात्रा में Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के (2.3 कदम में पहले से निर्धारित): F12 मीडिया 1x के साथ पूरक माइटोजन पूरक और पेनिसिलिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) ध्यान केंद्रित किया।
  4. एक 6 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से करने के लिए resuspended फेफड़ों या मस्तिष्क ऊतक टुकड़े जोड़ें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए मीडिया में ऊतक टुकड़े सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक ऊतक और च के लिए मीडिया वातानुकूलित इकट्ठाurther एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ताजा मीडिया के तीन बराबर मात्रा में जोड़कर पतला।
  6. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक अंग के लिए पतला वातानुकूलित मीडिया में 1000 XG पर अपकेंद्रित्र बड़े ऊतक मलबे को हटाने के लिए। मीडिया सतह पर तैरनेवाला लीजिए और एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर।
  7. पूल प्रत्येक अंग से वातानुकूलित मीडिया (यानी।, फेफड़े और मस्तिष्क के साथ मस्तिष्क के साथ फेफड़ों) माउस के लिए माउस परिवर्तनशीलता के लिए खाते में करने के लिए कई चूहों से। अशेष और दुकान -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक मीडिया वातानुकूलित।

4. अस्थि मज्जा वातानुकूलित मीडिया की पीढ़ी

  1. एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में, हड्डी से अतिरिक्त ऊतक ट्रिम और कैंची के साथ हड्डियों से epiphyses (अंत टुकड़े) को हटा दें।
  2. प्रत्येक हड्डी के केंद्र के माध्यम से पीबीएस के 1 मिलीलीटर धक्का द्वारा हड्डियों की एक 27 आधा जी सुई, फ्लश दिमाग़ी गुहा का उपयोग करना। यह आपको पीबीएस युक्त एक ताजा ट्यूब में अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं (BMSC) इकट्ठा करने के लिए अनुमति देगा।
  3. 1,00 पर अपकेंद्रित्र0 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए XG और पीबीएस के साथ दो बार BMSC धो लें। हड्डी stromal कोशिकाओं की वृद्धि को मीडिया के 20 मिलीलीटर में Resuspend अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं (DMEM: F12 मीडिया 1x के साथ पूरक माइटोजन पूरक, पेनिसिलिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) और 10% भ्रूण Boven सीरम (FBS) केंद्रित )।
  4. प्लेट एक T75 फ्लास्क में resuspended अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर।
    नोट: प्रत्येक T75 फ्लास्क में हर 2 चूहों से जुडा है और प्लेट कोशिकाओं; चार चूहों के लिए, दो T75 बोतल (लगभग 1 10 x 7 कोशिकाओं / कुप्पी) की जरूरत है।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए हड्डी stromal कोशिकाओं के विकास में मीडिया में अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं सेते हैं और 5% सीओ 2। ऊष्मायन के बाद, दोनों T75 बोतल से मीडिया को दूर करने और नए T75 फ्लास्क में डाल दिया है, के रूप में "फ्लोटर फ्लास्क" इस कुप्पी लेबल। पिछले 2 बोतल के लिए ताजा हड्डी stromal कोशिकाओं की वृद्धि मीडिया जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सभी 3 बोतल सेते हैं और 5% सीओ 2।
  6. 7 - कोशिकाओं लगभग 70% confluency (लगभग 5 तक पहुँचने के बाददिन) पारित होने कोशिकाओं। ऐसा करने के लिए, मध्यम हटाने और पीबीएस (3 मिलीग्राम प्रत्येक धोने) के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें। पीबीएस निकालें और trypsin / EDTA समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, कि trypsin सुनिश्चित कुप्पी की पूरी सतह को शामिल किया। बाद कोशिकाओं कुप्पी लिफ्ट बंद (~ 2 - 3 मिनट), 3 मिलीग्राम हड्डी stromal कोशिकाओं की वृद्धि मीडिया जोड़ने) द्वारा trypsinization प्रतिक्रिया बंद करो। अपकेंद्रित्र 900 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए XG, ताजा हड्डी stromal कोशिकाओं की वृद्धि को मीडिया के 10 मिलीलीटर में मीडिया, और resuspend कोशिकाओं त्यागें।
  7. सभी बोतल और मार्ग 1 से पूल कोशिकाओं: 5 तीन नए T75 बोतल में और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2। बाद कोशिकाओं को एक बार फिर से 70% तक पहुँच, 4.6 कदम और पूल और पारित होने के सभी पक्षपाती कोशिकाओं को दूसरी बार दोहराएँ। री-प्लेट चार T75 बोतल के लिए सभी कोशिकाओं और सेते 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2। अस्थि stromal कोशिकाओं की वृद्धि मीडिया सभी चरणों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  8. कोशिकाओं, संगम तक पहुँचने पीबीएस के साथ कोशिकाओं तीन बार धोने और जोड़ने की हड्डी stromal सेल संग्रह मीडिया की अनुमति दें (DMEM: F12 मीडिया + 1x केंद्रित माइटोजन सुpplement + पेनिसिलिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल); 10 मिलीग्राम / T75), यकीन है कि यह मीडिया FBS की नि: शुल्क है बना रही है। अस्थि मज्जा वातानुकूलित मीडिया लीजिए 72 घंटा बाद, -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर, पूल, विभाज्य, और दुकान के माध्यम से फिल्टर।
  9. अगर वांछित, पृथक अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं (BMSC) माउस Sca -1, CD105, CD29, और CD73, CD44 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर के रूप में पहले 13 में वर्णित तकनीकों cytometry मानक प्रवाह का उपयोग कर के phenotype की पुष्टि करें।

5. लसीका नोड वातानुकूलित मीडिया की पीढ़ी

  1. एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में, लिम्फ नोड्स तीन बार युक्त लिम्फ नोड्स और महाप्राण खूनी पीबीएस से अवशिष्ट रक्त को दूर करने के लिए पीबीएस ट्यूब पलटना। ताजा ठंड पीबीएस के साथ दोहराएँ जब तक समाधान रक्त का कोई सबूत के साथ स्पष्ट प्रतीत होता है।
  2. 60 मिमी 2 गिलास पेट्री डिश में लिम्फ नोड्स रखें। बार बार Tissu तक आगे और पीछे टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा दो बाँझ स्केलपेल ब्लेड, कीमा लिम्फ नोड्स का उपयोगई टुकड़े आकार में लगभग 1 मिमी 3 रहे हैं।
  3. एक शंक्वाकार ट्यूब में, रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान 1640 (RPMI1640) मीडिया पेनिसिलिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक / स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल), 5 एक्स 10 -5 एम बाँझ β-mercaptoethanol के 10 मिलीलीटर में resuspend ऊतक टुकड़े ( 1.75 μl / 500 मिलीलीटर मीडिया) और 10% FBS।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 900 XG पर अपकेंद्रित्र और 30 मिलीलीटर मीडिया में सभी कोशिकाओं resuspend। 5 मिलीलीटर मीडिया / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से थाली में जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिन और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
  5. 7 दिन के ऊष्मायन के बाद, मीडिया त्यागने 5 मिलीलीटर गर्म पीबीएस के साथ पक्षपाती कोशिकाओं को धोने के लिए और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 5 मिलीलीटर ताजा मीडिया जोड़ें। कोशिकाओं confluency करने के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें -, (लगभग 5 से 7 दिन), Trypsinize पूल सभी कोशिकाओं, और पारित होने कदम 4.6 में वर्णित है। पुन प्लेट 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए कोशिकाओं। इस कदम के तीन बार दोहराएँ।
  6. तीन मार्ग के बाद, कोशिकाओं confluency करने के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं, पीबीएस के साथ कुओं तीन बार धोने के लिए और जोड़ने के 2 मिलीलीटर / अच्छी तरह से DMEM: F12 + 1xकेंद्रित माइटोजन पूरक और पेनिसिलिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल), यह सुनिश्चित करना है कि इस मीडिया FBS की नि: शुल्क है। 72 घंटा, पूल, विभाज्य, और दुकान -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक लिम्फ नोड के बाद वातानुकूलित मीडिया लीजिए।
  7. अगर वांछित, पृथक लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं (LNSC) माउस CD45 और gp38 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर के रूप में पहले 13 में वर्णित तकनीकों cytometry मानक प्रवाह का उपयोग कर के phenotype की पुष्टि करें।

बहाव assays कैंसर कोशिकाओं के metastatic व्यवहार से संबंधित के लिए अंग-वातानुकूलित मीडिया का उपयोग 6.

  1. एक बार जब अंग-वातानुकूलित मीडिया चरण 1 में वर्णित के रूप में उत्पन्न किया गया है - 5, इसका इस्तेमाल आदेश कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार पर मेटास्टेटिक घुलनशील अंग व्युत्पन्न कारकों के प्रभाव का निर्धारण करने में विभिन्न डाउनस्ट्रीम सेल और आणविक जीव विज्ञान assays के बाहर ले जाने के लिए। मानक assays (साहित्य में कहीं वर्णित) के उदाहरण प्रोटीन 13, सेलुलर assays विकास शामिल <sup> 13, सेलुलर प्रवास 13 assays, tumorsphere गठन के 14, और आरटी पीसीआर 15। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए F12 मीडिया 1x के साथ पूरक माइटोजन पूरक और पेनिसिलिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल केंद्रित): मूल आधार मीडिया (अंग-वातानुकूलित मीडिया उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है यानी, असुविधाजनक DMEM। ।

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Representative Results

अंग-वातानुकूलित मीडिया की पीढ़ी

एक सिंहावलोकन चित्र / अंग अलगाव और वातानुकूलित मीडिया की पीढ़ी की प्रक्रिया के योजनाबद्ध प्रक्रिया चित्रा 2 में दिखाया गया के प्रतिनिधि फोटो छवियों के साथ, चित्रा 1 में प्रस्तुत किया है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब इस प्रोटोकॉल पहले विकास के तहत किया गया, जिगर शामिल किया गया था हमारे विश्लेषण में, क्योंकि यह स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के एक आम साइट है। हालांकि, उत्पादन और जिगर द्वारा स्रावित proteases की बड़ी राशि की वजह से, यह बहुत मुश्किल जिगर व्यवहार्य काफी लंबे समय से अच्छी गुणवत्ता के वातानुकूलित मीडिया उत्पन्न करने के लिए रखने के लिए है। लिवर वातानुकूलित मीडिया भी स्थिर नहीं एक बार अलग है, और वहाँ प्रोटीन वेग का एक बहुत ही कारण के लिए की संभावना हो जाता है। इसलिए जिगर किसी भी आगे के विश्लेषण में शामिल नहीं किया गया था।

(चित्रा 3 ए) का प्रदर्शन और BMSCs एक छोटे उपस्थिति (चित्रा 3 सी) के प्रदर्शन के साथ। प्रवाह cytometric विश्लेषण पुष्टि की है कि मोटे तौर पर LNSCs CD45 हैं - और gp38 +, साथ ~ एक CD45 रखने कोशिकाओं के 60% - gp38 + phenotype LNSCs 16 (चित्रा 3 बी) का संकेत है। , BMSCs 17,18 का संकेत - BMSCs CD44 और CD29, CD105 और SCA-1 के लिए कमजोर सकारात्मक और नकारात्मक CD73 के लिए (एच चित्रा 3 डी) के लिए सकारात्मक होना चाहिए।

स्तन कैंसर कोशिका RespOnse अंग-उचित प्रवास पैटर्न और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए

इस पूर्व vivo मॉडल प्रणाली का उपयोग करना, यह पहले से प्रदर्शन किया गया है कि विशिष्ट अंग की स्थिति की ओर आनुवंशिक पृष्ठभूमि प्रदर्शनी अंतर प्रवास और विकास पैटर्न के साथ अलग मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं। विशेष रूप से, इन नमूनों विवो 13 में इन सेल लाइनों के नाम से जाना जाता मेटास्टेटिक प्रसार पैटर्न दर्शाते हैं। वर्तमान अध्ययन में, हड्डी (231-बीओएम) - और फेफड़ों (231-LM2) एमडीए MB-231 मानव स्तन कैंसर सेल वेरिएंट की वेरिएंट -seeking (डॉ जोआन Massagué 11,12 से एक तरह का उपहार) भी कर दिया गया है एक transwell प्रवास परख में इस्तेमाल अंग-उचित प्रवास पैटर्न पुष्टि करने के लिए। परिणाम है कि हड्डी की मांग 231-बीओएम संस्करण preferentially brain- से अधिक अस्थि मज्जा वातानुकूलित मीडिया के लिए migrates और वातानुकूलित मीडिया (चित्रा -4 ए, बाएं) lung- प्रदर्शित करता है। उसी प्रकार, फेफड़ों की मांग 231-LM2 संस्करण preferentially (चित्रा -4 ए दाएं) अस्थि मज्जा वातानुकूलित मीडिया और मस्तिष्क वातानुकूलित मीडिया पर फेफड़ों के वातानुकूलित मीडिया को माइग्रेट करती है। इसके अलावा, आर टी-qPCR विश्लेषण दर्शाता है कि माता पिता का एमडीए MB-231 स्तन कैंसर की कोशिकाओं का जोखिम bone- करने के लिए या फेफड़ों के वातानुकूलित मीडिया अस्थि-विशिष्ट मेटास्टेसिस के साथ जुड़े जीन की एक अपरेगुलेशन का कारण बनता है (CXCR4, आईएल 11, TGFß1) या lung- विवो 11,12 (चित्रा 4 बी) में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के विशिष्ट मेटास्टेसिस (VCAM1)। इन परिणामों के विवो में स्तन कैंसर की कोशिकाओं की उम्मीद अंग tropism के संबंध के साथ पूर्व vivo प्रणाली की वैधता का प्रदर्शन, और इंगित करता है कि अंग-वातानुकूलित मीडिया में मौजूद घुलनशील कारकों पलायन को बढ़ावा देने के अलावा मेटास्टेटिक सेल phenotype प्रभावित कर सकते हैं।

अंग वातानुकूलित मीडिया में शामिल Metastatic व्यवहार के संभावित घुलनशील मध्यस्थों

एक बायोटिन लेबल आधारित माउस एंटीबॉडी सरणी विभिन्न अंगों से उपस्थिति और अंग-वातानुकूलित मीडिया में आम घुलनशील कारकों की पहचान का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस सरणी सबसे आम घुलनशील प्रोटीन माउस proteins.This सरणी के 308 के खिलाफ एंटीबॉडी के रूप में पहले चू एट अल में दिखाया गया फेफड़ों और अस्थि मज्जा वातानुकूलित मीडिया के भीतर मेटास्टेटिक झरना वर्तमान के साथ जुड़े हित के घुलनशील कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है शामिल है (2014) और क्रमश: 13,14 पीआईओ एट अल (2015)। वर्तमान अध्ययन में, प्रोटीन सरणी परिणाम बेसल मीडिया (चित्रा 5 ए) लसीका node- (चित्रा 5 ब) और मस्तिष्क वातानुकूलित मीडिया (चित्रा 5C) की तुलना के लिए दिखाए जाते हैं। प्रत्येक सरणी के बगल में प्रकाश डाला मीडिया में मौजूद घुलनशील कारक है कि साहित्य 19-29 में मेटास्टेटिक झरना में कदम के साथ जुड़ा होना पाया गया है। इन कारकों में घुलनशीलtors इन अंग साइटों के भीतर माध्यमिक मेटास्टेसिस के संभावित मध्यस्थों के रूप में की जांच के लायक हो सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. अवलोकन अंग अलगाव और वातानुकूलित मीडिया की पीढ़ी की प्रक्रिया के योजनाबद्ध। ऊतकों (फेफड़े, मस्तिष्क, फीमर, टिबिया और लिम्फ नोड्स) माउस से काटा जाता है। फेफड़े, मस्तिष्क और लिम्फ नोड्स एक छुरी के साथ कीमा बनाया जाता है। अस्थि मज्जा एक 27½ जी सुई के साथ गुहा के माध्यम से पीबीएस धक्का द्वारा हड्डियों की दिमाग़ी गुहा से काटा जाता है। फेफड़े और मस्तिष्क ऊतक टुकड़े ताजा बेसल मीडिया के तीन बराबर मात्रा के साथ गिराए से पहले 24 घंटे की अवधि के लिए incubated और lung- और मस्तिष्क वातानुकूलित मीडिया बनाने के लिए एकत्र कर रहे हैं। बेसल मीडिया के साथ incubating हड्डी और लिम्फ नोड वातानुकूलित मीडिया बनाने से पहले 3 बार - अस्थि मज्जा और लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं 2 passaged हैं। काटा मीडिया पी हो सकती हैooled और इस तरह के प्रोटीन, सेलुलर विकास assays, सेलुलर प्रवास assays, tumorsphere गठन, और आरटी पीसीआर के रूप में नीचे की ओर assays में इस्तेमाल के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. अंग अलगाव और वातानुकूलित मीडिया की पीढ़ी के लिए प्रक्रिया के प्रतिनिधि फोटो छवियों। दिवस 0 पर, फेफड़े, मस्तिष्क, फीमर, टिबिया और लिम्फ नोड्स माउस से एकत्र कर रहे हैं। फेफड़े, मस्तिष्क और लिम्फ नोड्स आकार में लगभग 1 मिमी से 3 एक 60 मिमी 2 गिलास पेट्री डिश में रखा गया है और दो ​​छुरी ब्लेड के साथ कीमा बनाया जाता है। अस्थि मज्जा एक ताजा ट्यूब में एक 27 आधा जी सुई के साथ गुहा के माध्यम से पीबीएस धक्का द्वारा हड्डियों की दिमाग़ी गुहा से काटा जाता हैपीबीएस की। फेफड़े और मस्तिष्क ऊतक टुकड़े ताजा मीडिया के तीन बराबर मात्रा के साथ गिराए से पहले 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 24 घंटे की अवधि के लिए incubated और 24 घंटे के बाद lung- और मस्तिष्क वातानुकूलित मीडिया बनाने के लिए एकत्र कर रहे हैं। अस्थि मज्जा और लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे हैं और 5% सीओ 2 और 2 passaged - सीरम मुक्त बेसल मीडिया के साथ मीडिया की जगह की हड्डी और लिम्फ नोड वातानुकूलित मीडिया बनाने से पहले 3 बार (~ 3 सप्ताह कुल)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. पृथक लसीका नोड और अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं की विशेषता। (ए) उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की आकृति विज्ञान (LNSCs) दिखा छवि। (बी) के प्रतिनिधि प्रवाहएक phycoerythrin (पीई) gp38 एंटीबॉडी और एक fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) का उपयोग संयुग्मित LNSCs की cytometry विश्लेषण CD45 एंटीबॉडी संयुग्मित। (सी) उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं की आकृति विज्ञान (BMSCs) दिखा छवि। (डीएच) प्रतिनिधि प्रवाह पीई संयुग्मित (काला प्रोफाइल) का उपयोग BMSCs के खिलाफ एंटीबॉडी के cytometry विश्लेषण (डी) CD44, (ई) CD106, (एफ) Sca -1, (G) CD29, (एच) CD73 एंटीबॉडी निर्धारण नियंत्रण (सफेद प्रोफाइल) के सापेक्ष। 10,000 व्यवहार्य घटनाओं की एक न्यूनतम प्रति नमूना एकत्र किए गए थे। यह आंकड़ा 13 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. यागण-उचित प्रवास पैटर्न और जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों अंग-वातानुकूलित मीडिया के जवाब में। (ए) अस्थि की मांग 231-बीओएम वेरिएंट (बाएं, धारीदार बार) या फेफड़ों की मांग 231-LM2 एमडीए MB-231 मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइन के वेरिएंट (सही, धारीदार सलाखों) के साथ ही माता पिता का एमडीए MB- या अंग-मुख्यमंत्री: 231 कोशिकाओं (दोनों पैनलों, ठोस सलाखों) जिलेटिन लेपित सम्मिलित बेसल मीडिया में नियुक्ति से पहले (8 माइक्रोन pores के साथ) (F12 + केंद्रित माइटोजन पूरक DMEM) पर चढ़ाया गया था। प्लेट्स 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated और 5% सीओ 2 के थे। (बी) पूरी आबादी पैतृक एमडीए MB-231 कोशिकाओं 48h के लिए या तो हड्डी-मुख्यमंत्री (बाएं) या फेफड़ों-मुख्यमंत्री (दाएं) से अवगत कराया गया। आरएनए पृथक किया गया और RT-qPCR का उपयोग मात्रा। अंग-मुख्यमंत्री (काली सलाखों) के जवाब में जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों GAPDH के लिए सामान्यीकृत थे और बेसल मीडिया (धूसर बार) में आधारभूत अभिव्यक्ति के सापेक्ष व्यक्त किया। डेटा SEM मतलब ± (के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैंएन = 3; गुना परिवर्तन बेसल मीडिया के संबंधित नकारात्मक नियंत्रण से)। * = बेसल मीडिया से काफी अलग; δ = एक ही मीडिया की स्थिति के साथ इलाज किया पैतृक सेल लाइन से काफी अलग; पी <0.05, एनोवा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. अंग-वातानुकूलित मीडिया Metastatic व्यवहार के संभावित घुलनशील मध्यस्थों शामिल हैं। एक बायोटिन लेबल आधारित माउस एंटीबॉडी सरणी लिम्फ नोड-मुख्यमंत्री और मस्तिष्क में मौजूद मुख्यमंत्री घुलनशील कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। 4 हे सीओ / एन पर, (बी) लिम्फ नोड-मुख्यमंत्री या (सी) मस्तिष्क मुख्यमंत्री और chemilum उपयोग करते हुए कल्पना: झिल्ली (ए) बेसल मीडिया (F12 + केंद्रित माइटोजन पूरक DMEM) के biotinylated नमूनों के साथ incubated रहे थेinescence। ब्लू अंडाकार संकेत मिलता आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण, लाइन बक्से का संकेत आंतरिक नकारात्मक नियंत्रण और ठोस बक्से हित में है कि संभावित लिम्फ नोड या मस्तिष्क को स्तन कैंसर की कोशिकाओं की मेटास्टेटिक व्यवहार में शामिल कर रहे हैं के घुलनशील कारकों से संकेत मिलता है। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें चित्रा।

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Discussion

मेटास्टेसिस एक जटिल प्रक्रिया है जिसके द्वारा सेलुलर घटनाओं की एक श्रृंखला के ऊतक आक्रमण और दूर ट्यूमर स्थापना 4,30,31 के लिए आखिर जिम्मेदार हैं। एक विशिष्ट अंग ( "वहाँ हो रही है") और वृद्धि की है कि अंग में ( "वहाँ बढ़ती") को कैंसर कोशिका घर वापस आना या प्रवास: पूर्व vivo मॉडल यहाँ प्रस्तुत प्रणाली मेटास्टेटिक प्रगति के दो महत्वपूर्ण पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। कई अध्ययनों से पहले कुंजी आणविक कैंसर कोशिकाओं को खुद कि मेटास्टेसिस की प्रक्रिया में योगदान के साथ जुड़े विशेषताओं की पहचान करने पर ध्यान केंद्रित किया है। उदाहरण के लिए, काम जोआन Massagué के समूह द्वारा किया फेफड़ों-विशिष्ट, अस्थि-विशिष्ट, और प्रसार 10-12,32 के मस्तिष्क के विशिष्ट पैटर्न के साथ जुड़े अलग जीन हस्ताक्षर की पहचान की है। इस काम के लिए इस प्रक्रिया को कैंसर कोशिकाओं के योगदान के संबंध के साथ महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, बहुत कम टी के योगदान के अंग विशेष कारकों की भूमिका के बारे में जाना जाता हैवह माध्यमिक microenvironment, जो 13 अध्ययन करने के लिए अपेक्षाकृत चुनौतीपूर्ण बनी हुई है।

इस पूर्व vivo मॉडल प्रणाली पहले से अंग-मुख्यमंत्री में है कि स्तन कैंसर कोशिका लाइन-विशिष्ट प्रवास और विकास का प्रदर्शन करके माध्यमिक अंग microenvironment का सही प्रतिनिधित्व के रूप में मान्य किया गया है इन कोशिकाओं को 'लाइनों मेटास्टेटिक प्रसार के विवो पैटर्न में दर्पण। चू और उनके सहयोगियों ने एक अध्ययन में विवो में मेटास्टेटिक संभावित बदलती, एमडीए MB-231 और योग-159 (अत्यधिक मेटास्टेटिक सहित चार अलग-अलग मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों का इस्तेमाल किया, लिम्फ नोड, फेफड़े, जिगर, हड्डी और इन विवो में मस्तिष्क के लिए metastasize ) और हड्डी marrow-, लसीका की ओर योग-149 और एमडीए MB-468 (मामूली मेटास्टेटिक, लिम्फ नोड और इन विवो में फेफड़ों) के लिए metastasize। दोनों एमडीए MB-231 और योग-159 सेल लाइनों बढ़ाया प्रदर्शित पलायन node- और फेफड़ों के मुख्यमंत्री जबकि योग-149 और एमडीए MB-468 सेल लाइनों रियायत के तौर पर फेफड़ों की ओर चले गए-CM 13। वर्तमान अध्ययन यह दर्शाता है bone- और फेफड़ों की मांग एमडीए MB-231 वेरिएंट कि दोनों क्रमश हड्डी marrow- और फेफड़ों के मुख्यमंत्री की ओर पलायन करने के लिए पसंद करते हैं और अंग-मुख्यमंत्री के लिए है कि जोखिम bone- और फेफड़ों से जुड़े मेटास्टेटिक जीनों की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के कर सकते हैं पहले से Massagué और उनके सहयोगियों 11,12 द्वारा की पहचान की। साथ में ले ली, इन परिणामों कि अंग-अंग विशेष मुख्यमंत्री घुलनशील विवो में पाया कारक है कि phenotype और स्तन कैंसर की कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित की एक पूर्व vivo मंच प्रदान करता प्रतिनिधि प्रदर्शित करता है।

विशिष्ट अंगों के भीतर मौजूद घुलनशील कारकों और अभिव्यक्ति की उनके रिश्तेदार के स्तर की पहचान कैंसर सेल व्यवहार पर उनके संभावित प्रभाव का निर्धारण करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है। इसके अलावा, इस तरह के immunodepletion के रूप में तकनीक का उपयोग कर उपयोगकर्ता को प्रभावी ढंग से अंग-मुख्यमंत्री से ब्याज की एक प्रोटीन व्यय करना इन विट्रो सेलुलर व्यवहार पर उसके प्रभाव को निर्धारित करने के लिए अनुमति दे सकते हैं। उदाहरण के लिए, कई घुलनशील विशिष्ट अंग microenvironments के भीतर मौजूद कारकों chemoattractants के रूप में कार्य और सेलुलर प्रवास और प्रसार के लिए प्रेरित करने की क्षमता है। पिछला काम फेफड़ों-मुख्यमंत्री का उपयोग किया कई घुलनशील फेफड़ों-मुख्यमंत्री में मौजूद कारक है कि osteopontin (OPN) और एल selectin (बिक्री) 13 सहित स्तन कैंसर की कोशिकाओं, के लिए chemoattractants के रूप में कार्य कर सकते हैं की पहचान करने के लिए प्रेरित किया है। फेफड़ों के मुख्यमंत्री से इन कारकों immunodepleting करके, चू और उनके सहयोगियों कम सेलुलर प्रवास और / या अत्यधिक मेटास्टेटिक एमडीए MB-231 स्तन कैंसर की कोशिकाओं के विकास को 13 प्रदर्शित करने में सक्षम थे। ये परिणाम बताते हैं कि वातानुकूलित मीडिया उत्पन्न पूरे अंगों पारंपरिक तकनीक इन विट्रो के उपयोग के माध्यम से, कैंसर सेल व्यवहार पर विशेष घुलनशील कारकों के प्रभाव के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करता है से।

हालांकि यह एक काफी सरल मॉडल प्रणाली है, वहाँ है कि सफलतापूर्वक के लिए महत्वपूर्ण हैं प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में कुछ कदम उठाए हैंअंग-वातानुकूलित मीडिया के एल पीढ़ी। सबसे पहले, अंगों की कटाई के लिए 6-12 सप्ताह की उम्र के बीच परिभाषित चूहों का उपयोग (6 पहले सप्ताह) के क्रम में उम्र से संबंधित प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है, या तो विकास से संबंधित या बड़े चूहों में उम्र बढ़ने से संबंधित है। दूसरे, बाँझपन प्रोटोकॉल भर में अत्यंत महत्व का है और सबसे अच्छा एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में कठोर सड़न रोकनेवाला तकनीक और काम के उपयोग के माध्यम से यह सुनिश्चित किया जा सकता है, सभी संस्कृति मीडिया और पूरक आहार में निष्फल टिशू कल्चर उपभोग्य और अभिकर्मकों के साथ ही हल्के एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कर ( अर्थात्।, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन)। विवो या पूर्व vivo मॉडल प्रणाली में उपयोग करने के साथ चुनौतियों में से एक निहित पशु करने वाली पशु परिवर्तनशीलता है। इस मनाया, तो समस्या निवारण चरणों बहाव के प्रयोगों में उपयोग करने से पहले चूहों के कई बैचों से प्राप्त वातानुकूलित मीडिया की पूलिंग, साथ ही यह सुनिश्चित करना भी शामिल है कि lung- और मस्तिष्क वातानुकूलित medias प्रत्येक मुझ में सही वजन सामान्यीकृत कर रहे हैं1 मीडिया: एक 4 में मेजबान द्वारा दीया संग्रह प्रयोग ऊतक अनुपात (मात्रा / वजन)। इसके अलावा, प्राथमिक लिम्फ नोड और अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं अन्यथा वे मरणासन्न अलग होगा किसी भी पारित होने पर 70% confluency पार करने के लिए या 5 कुल मार्ग से परे हो जा अनुमति नहीं दी जानी चाहिए।

इस लेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल में संशोधन अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों के लिए आवेदन की अनुमति के लिए कल्पना की जा सकती है। हालांकि इस मॉडल अब तक स्तन कैंसर अनुसंधान के लिए विशेष रूप से इस्तेमाल किया गया है, यह संभवतः कैंसर के अन्य प्रकार के रूप में अच्छी तरह के रूप में अतिरिक्त सामान्य शारीरिक और रोग राज्यों में अंग व्युत्पन्न घुलनशील कारकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, जबकि इस विधि immunocompromised नग्न माउस मॉडल के साथ यहां इस्तेमाल किया गया है, इस तकनीक सैद्धांतिक रूप से चूहों की इस प्रजाति तक सीमित नहीं है और यहां तक ​​कि संभावित पशु मॉडल के अन्य प्रकारों के साथ प्रयोग किया जा सकता है।

इस मॉडल importa प्रदान करता हैकैंसर सेल व्यवहार पर विशेष अंग व्युत्पन्न घुलनशील कारकों का योगदान करने के लिए के रूप में NT अंतर्दृष्टि, यह अपनी सीमाओं के बिना नहीं है। सबसे पहले इस मॉडल पूरी तरह अंग microenvironments के घुलनशील घटक है, जो बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के महत्व को neglects पर केंद्रित है। ईसीएम सभी प्रकार के ऊतकों और कार्यों भीतर गैर सेलुलर घटक मौजूद कोशिकाओं के लिए एक भौतिक पाड़, साथ ही morphogenesis, सेलुलर भेदभाव और homeostasis 33 सहित विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं, के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण जैव रासायनिक और biomechanical संकेतों को उत्पन्न करने की क्षमता दोनों प्रदान करने के लिए है -35। महत्वपूर्ण बात है, ईसीएम के शारीरिक और जैव रासायनिक संरचना में व्यापक रूप से विषम है और ऊतकों प्रकार के बीच भिन्न हो सकते हैं। इसलिए, ईसीएम के ऊतक विशेष रचना भी कैंसर मेटास्टेसिस कि इस मॉडल के साथ अनदेखी की जा सकती है के दौरान अंग tropism पर एक प्रभाव हो सकता है। ईसीएम भी एक तरीका है कि appropriatel में विशिष्ट घुलनशील कारकों को ध्यान केंद्रित करने के लिए कार्य कर सकते हैंY उन्हें कुछ कोशिकाओं को प्रस्तुत करता है, और ईसीएम की यह ठीक ट्यूनिंग के बिना, सेलुलर संकेत की प्रेरण कम या 36 बदला जा सकता है। हालांकि मॉडल इस पत्र में उल्लेख किया है एक उचित ईसीएम घटक का अभाव है, कई अध्ययनों से एक मानार्थ दृष्टिकोण दोनों मॉडल एक उपयुक्त ईसीएम घटक के साथ साथ यहां उल्लेख के उपयोग का उपयोग करके मजबूत किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्राथमिक अंग fibroblasts कि अंतर्जात ईसीएम या पुनः संयोजक ईसीएम घटकों synthesize उत्पन्न अंग-मुख्यमंत्री के अलावा में इस्तेमाल किया जा सकता है सेलुलर व्यवहार पर पूरे अंग microenvironment की पूर्ण सीमा निर्धारित करने के लिए।

ऐसा नहीं है कि घुलनशील अंग-मुख्यमंत्री से उत्पन्न microenvironment उचित रूप से नकल नहीं कर सकते हैं क्या मेटास्टेसिस की प्रक्रिया के दौरान उपस्थित physiologically है संभव है। कैंसर सेल अस्तित्व, विकास और प्रगति के कैंसर कोशिका मेजबान बातचीत 4,30,31 पर बहुत निर्भर कर रहे हैं। पूरे अंग-मुख्यमंत्री की पीढ़ी पी में हो सकता हैघुलनशील कारकों की resence सामान्य रूप से सेल प्रकार है कि मेटास्टेटिक प्रगति के दौरान कैंसर कोशिकाओं के साथ बातचीत के द्वारा व्यक्त नहीं। इसके अलावा, यह पहले से प्रदर्शन किया गया है कि एक प्राथमिक ट्यूमर की उपस्थिति दूर मेटास्टेटिक साइटों की microenvironment मिलाना कर सकते हैं, जिससे मेटास्टेसिस 37 के लिए "भड़काना" उन्हें। चूंकि मौजूदा प्रोटोकॉल स्वस्थ, गैर ट्यूमर असर चूहों से ली गई अंगों का उपयोग करता है, यह एक प्राथमिक स्तन ट्यूमर असर चूहों से अंगों से निकाली गई घुलनशील कारकों की तुलना करना सार्थक होगा।

विभिन्न अंग-मुख्यमंत्री की पीढ़ी के दौरान पूरे अंगों के यांत्रिक जुदाई के कारण, intracellular कारकों आसपास के मीडिया जो सामान्य रूप से कैंसर की कोशिकाओं द्वारा physiologically सामना नहीं किया जा सकता है में जारी किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, bone- और लिम्फ नोड व्युत्पन्न वातानुकूलित मीडिया इन अंगों से अपने संग्रह करने से पहले अलग-थलग stromal कोशिकाओं के संवर्धन की आवश्यकता है। सेल प्रकार पूर्व vivo cultu के दौरान उपस्थितरिंग सही कैंसर कोशिकाओं द्वारा physiologically का सामना करना पड़ा सेलुलर प्रकार की चौड़ाई का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। Stromal कोशिकाओं मुख्यतः कई कारकों छिपाना जबकि विभिन्न अंग microenvironments के साथ जुड़े, इन तरीकों का उपयोग ऊतकों और अंगों के भीतर मौजूद 38 अन्य प्रकार की कोशिकाओं के प्रभाव के लिए खाते में नहीं हो सकती है। अंत में, हम क्योंकि हमने पाया है कि यह दोनों सुसंस्कृत अंगों (फेफड़े और मस्तिष्क) और पृथक BMSC और LNSC की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए आवश्यक था, अंग-वातानुकूलित मीडिया उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया आधार मीडिया में एक माइटोजन पूरक शामिल थे। हालांकि, हम चेतावनी है कि इस माइटोजन पूरक की उपस्थिति अंगों को प्रेरित किया जा सकता था कृत्रिम रूप से घुलनशील कारकों की है कि वे सामान्य रूप से नहीं बना सकता है उत्पादन करने के लिए पहचान,

सारांश में, कई अध्ययनों से संकेत दिया है कि विशिष्ट अंग microenvironments गहराई से ट्यूमर कोशिका जीव विज्ञान को प्रभावित कर सकते हैं। पर चर्चा की सीमाओं के बावजूद, पूर्व vivo मॉडल प्रणाली यहाँ प्रस्तुत rसेलुलर व्यवहार पर कई ठोस अंगों के घुलनशील microenvironment के प्रभाव के अध्ययन के लिए एक व्यापक तकनीक epresents। लेखकों की प्रयोगशाला में, इस मॉडल प्रणाली किया गया है और, आक्रमण, प्रवास, प्रसार सहित मेटास्टेसिस के साथ जुड़े सेलुलर घटनाओं के कई अध्ययन करने का एक साधन के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है स्टेम की तरह व्यवहार, और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन किया गया है। डेटा इन अध्ययनों से प्राप्त की बारी में आदेश संभावित मेटास्टेटिक साइटों का प्रतिनिधित्व विभिन्न microenvironments के लिए उनकी प्रतिक्रिया का निर्धारण करने में प्राथमिक स्तन कैंसर के रोगी ट्यूमर से अलग कक्षों के लिए इस मॉडल प्रणाली की संभावित नैदानिक ​​आवेदन को सूचित कर सकता है। साथ में ले ली, यह आशा की जाती है कि मेटास्टेटिक अंग tropism की प्रक्रिया के दौरान microenvironment और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच बातचीत के आगे समझने भविष्य में कैंसर के इलाज के सुधार को बढ़ावा मिलेगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 ml conical tubes Thermo Scientific (Nunc) 339652 Keep sterile
1x Phosphate-buffered saline ThermoFisher Scientific 10010-023 Keep sterile
Nude mice Harlan Laboratories Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu Use at 6 - 12 weeks of age
Polystyrene foam pad N/A N/A The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol.
Forceps Fine Science Tools 11050-10 Keep sterile
Scissors Fine Science Tools 14058-11 Keep sterile
Gauze pads Fisher Scientific 22-246069 Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes Sigma-Aldrich CLS7016560 Keep sterile
Scalpel blades Fisher Scientific S95937A Keep sterile
DMEM:F12 Life Technologies 21331-020 Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile 
1x Mito + Serum Extender BD Biosciences 355006 Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Keep sterile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) Life Technologies 11875-093 Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile 
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F1051-500ML Keep sterile
Trypsin/EDTA solution ThermoFisher Scientific R-001-100 Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile 
6-well tissue culture plates Thermo Scientific (Nunc) 140675 Keep sterile
0.22 μm syringe filters Sigma-Aldrich Z359904 Keep sterile
T75 tissue culture flasks Thermo Scientific (Nunc) 178905 Keep sterile
Transwells Sigma-Aldrich CLS3464 Keep sterile, use for migration assays
Anti-mouse Sca-1 R&D Systems FAB1226P use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD105 R&D Systems FAB1320P use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD29 R&D Systems FAB2405P-025 use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD73 R&D Systems FAB4488P use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD44 R&D Systems MAB6127-SP use at 0.25 µg/106 cells
Anti-mouse CD45 eBioscience 11-0451-81 use at 5 µl/106 cells
Anti-mouse gp38 eBioscience 12-5381-80 use at 10 µl/106 cells
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250  Keep sterile
Protein arrays RayBiotech Inc. AAM-BLM-1-2 Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate

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References

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