Introduction
Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebs bei Frauen und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle 1. Brustkrebs hohe Mortalitätsrate ist vor allem auf das Scheitern der konventionellen Therapie zu lindern und Metastasen zu beseitigen; etwa 90% der durch Krebs verursachten Todesfälle sind auf Metastasen 2. die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der metastatischen Kaskade zu verstehen, ist sowohl von größter Bedeutung für die Entwicklung von Therapeutika in wirksamen frühen und späten Stadium von Brustkrebs.
Frühere Forschung hat die vielstufige Natur der Metastasierung von Brustkrebs geholfen aufzuklären und es wird vermutet , dass das Ergebnis sowohl der Tumorprogression und Metastasierung auf Wechselwirkungen zwischen Krebszellen weitgehend abhängig ist und der Host - Umgebung 3. Klinische Beobachtungen zeigen , dass viele Krebsarten Organtropismus anzuzeigen, dh., Die Neigung vorzugsweise an spezifischen metastasieren organs.In der case von Brustkrebs breitet sich ein Patient die Krankheit in der Regel oder metastasiert bis 5 wichtigsten Sehenswürdigkeiten, wie der Knochen, Lunge, Lymphknoten, Leber und Gehirn 4-6. Viele Theorien wurden entwickelt, um diesen Prozess zu erklären, aber nur wenige haben den Test der Zeit überstanden. Ewing Theorie der Metastasierung, in den 1920er Jahren vorgeschlagen, die Hypothese aufgestellt dassdie Verteilung der Metastasierung auf mechanische Faktoren streng zurückzuführen war; wodurch Tumorzellen im ganzen Körper durch normale definierten physiologischen Blutflussmuster und einfach verhaften in der ersten kapillaren Bett getragen werden , stoßen sie auf 7. Im Gegensatz dazu 1889 Stephen Paget "Saatgut und Boden", schlug Hypothese, dass zusätzliche molekulare Wechselwirkungen für das Überleben und das Wachstum von Metastasen verantwortlich waren, wobei Krebszellen ( "Samen") sich nur etablieren können und proliferatein Organ Mikroumgebungen, die entsprechenden molekularen Faktoren ( "Boden erzeugen 8 "). Fast ein Jahrhundert später, Leonard Weiss unternahm eine Meta-Analyse von zuvor Autopsie Daten veröffentlicht und bestätigt Ewing-Vorhersage, dass viele Metastasen zum Zeitpunkt der Autopsie festgestellt wurden in den zu erwartenden Verhältnissen gefunden, dass, wenn metastasierendem Organtropismus wurde durch Blutflussmuster allein bestimmt zu erwarten wäre. Doch in manyinstances gab es weniger oder mehr Metastasen an bestimmten Stellen gebildet , dann würde durch Ewing vorgeschlagene mechanische Faktoren 9 zu erwarten. Diese Konten und Theorien besagen, dass bestimmte Organ Mikroumgebungen spielen eine entscheidende Rolle bei der Verbreitung Muster und das anschließende Wachstum und das Überleben von vielen Krebsarten, einschließlich Brustkrebs.
Frühere Forschungsanstrengungen haben sich hauptsächlich auf Tumorzellen abgeleitet Faktoren konzentriert und ihren Beitrag zur Organtropismus bei Brustkrebs Metastasen beobachtet 10-12, jedoch wenig Forschung erforscht Faktoren aus dem Organ Mikro abgeleitet , die eine günstige Nische für die Einrichtung zur Verfügung stellen kannvon Brustkrebs Metastasen. Dies ist im Wesentlichen auf die technischen Herausforderungen der Komponenten des Organs Mikroumgebung in vitro zu studieren.
Der aktuelle Artikel beschreibt ein umfassendes ex vivo Modellsystem zur Untersuchung des Einflusses von löslichen Bestandteilen des Lymphknotens studieren, Knochen, Lunge und Gehirn auf dem metastatischen Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen. Frühere Studien haben dieses Modellsystem validiert durch den Nachweis , dass verschiedene Brustkrebszelllinien Zelllinie spezifische und organspezifische bösartige Verhalten als Reaktion auf organ konditionierten Medien angezeigt werden , die auf ihre in vivo Metastasepotential 13 entspricht. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um lösliche Faktoren zu identifizieren und zu bewerten spezifischen organ abgeleitet, die eine Rolle bei der metastatischen Verhaltens von Brustkrebs und anderen Arten von Krebszellen, einschließlich Einflüsse auf das Wachstum, der Migration spielen kann, stielartigen Verhalten und Genexpression, sowie die Identifizierung vonmögliche neue therapeutische Ziele für Krebs. Dies ist das erste ex vivo Modellsystem , das verwendet werden kann , organspezifische metastatischen Verhalten im Detail zu untersuchen und die Rolle der organ abgeleiteten löslichen Faktoren in den Antrieb der Prozess der Krebsmetastasen zu bewerten.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Canadian Council on Animal Care durchgeführt, unter Protokolle, die von der Western University Tiergebrauch Subcommittee genehmigt.
1. Organ Isolation (Lunge, Gehirn, Knochen, Lymphknoten)
- Bereiten vier sterile 50 ml konische Röhrchen (eine für jedes Organ isoliert werden), die etwa 30 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Pre-wiegen jedes Röhrchen PBS eine elektronische Waage.
- Euthanize 6-12 Wochen alten Maus durch CO 2 Inhalation. 2 min , oder bis die Maus nicht mehr bewegt und die Atmung - Mäuse sollte etwa 1 in der CO 2 Kammer gelassen werden. Erfolgreiche Euthanasie kann durch einen Mangel an Herzschlag bestätigt werden, wenn von Hand mit einem Finger überprüft. Vermeiden Sie Zervikaldislokation da diese Methode der Blutgefäße des Halses führt zu Schwierigkeiten entfernen axillären Lymphknoten können bersten.
Hinweis: Frühere Arbeiten haben speziell verwendetgesunde weibliche Nacktmäuse HSD: Athymischen NUDE Foxn1 nu 13. - In einer sterilen Kultur Haube Gewebe, legen Sie die Maus auf dem Rücken auf einer Polystyrol-Schaumpolster, verteilt die Glieder und verwenden Stifte sie an ihrem Platz zu halten.
- Mit einer sterilen Pinzette und Schere, schneiden Sie die Bauchhaut an der Mittellinie an den Genitalien und nach oben in Richtung auf den Mund geschnitten. Ziehen Sie die Bauchhaut aus den Bauchmuskeln zurück und an Ort und Stelle auf dem Polystyrolschaumstoffpolster Pin.
- Suchen Sie den axillären, brachial und Leistenlymphknoten.
Anmerkung: Die Lymphknoten werden normalerweise von Fettgewebe umgeben ist. Die Leistenlymphknoten sind am einfachsten zu finden, wie sie oberflächlich an der Kreuzung von zwei Blutgefäße auf der nach hinten gezogen Bauchhaut zu finden sind. Axillary und brachial Lymphknoten befinden sich tiefer in das Gewebe und erfordern sanfte Rangieren von Gewebe.- Nachdem Sie die Lymphknoten gefunden haben, verwenden Sie die Schere sanft und vorsichtig die Lymphe schneiden nichtdes von der Haut, Fett und Behälter und aus der Maus zu entfernen. Um zu bestätigen, richtige Präparation, rollen die Zange über das entfernte Gewebe. Wenn ein harter Klumpen besteht, wenn die Zange über das Gewebe rollt, dann hat ein Lymphknoten wahrscheinlich erfolgreich entfernt wurde.
- Legen entfernt Lymphknoten in eiskaltem PBS.
- Mit Hilfe der Pinzette und Schere, öffnen Sie die Bauchhöhle durch in einer Aufwärtsbewegung in Richtung der Brust durch die freiliegenden Bauchwand zu schneiden. Vorsichtig durch das Brustbein geschnitten, die Brusthöhle ausgesetzt wird.
- Suchen Sie die Blende unterhalb der Lunge und die Membran geschnitten. Es sollte sich an den Rippen aufgrund der Spannung ziehen.
- Heben Sie die Lungen von unten und schneiden Sie das darunter liegende Gewebe in Richtung der Luftröhre. Dies ermöglicht die Lunge frei aus der Brusthöhle entfernt werden. Entfernen Sie das Herz und die Lunge en bloc und in eiskaltem PBS. Das Herz kann aus den Lungen hier oder nur entfernt werden, bevor in Schritt 2 wiegen.
- Entferne dasStifte, auf dem Polystyrolschaumstoffpolster mit der Maus an Ort und Stelle zu halten. Drehen Sie die Maus über und schneiden Sie die Haut des unteren Rückens den ganzen Weg über von Flanke zu flankieren.
- ein steriles Stück Gaze Mit dem Torso der Maus, ziehen Sie die Rückenhaut der Maus über die Beine und Füße der Maus zu halten.
- Mit dem gleichen Stück steriler Gaze, halten Sie die Unterschenkel an Ort und Stelle, sorgfältig das Sprunggelenk des Maus-Fuß brechen und schälen die Haut über dem Gelenk proximal zu dem Kniegelenk.
- Mit einer Schere, entfernen Sie die Tibia frei aus dem Kniegelenk und in eiskaltem PBS.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.11) bis 1,12) mit entgegengesetzten Glied.
- Mit einer Pinzette, halten Sie die Oberschenkel an Ort und Stelle, wegschneiden die Schere umgebenden Muskelgewebe verwenden und den Oberschenkelknochen zu entfernen, es in eiskaltem PBS platzieren.
- Wiederholen Sie Schritt 1.14) mit entgegengesetzten Extremität.
- Mit einem neuen Stück steriler Gaze, halten Sie den Kopf der Maus an Ort und Stelle. Mit einer Pinzette und Schere, entfernen Sie die Haut sanft die s aussetzenKull. Mit einer Schere schneiden Sie vorsichtig die Hinterhaupts Schädel von oben in der Mitte in einer geraden und nach unten Linie die hintere Gehirn aufzudecken.
- Mit einer Pinzette, eine Schaufel unter dem Gehirn in Richtung der vorderen und entfernen Sie das gesamte Gehirn. Legen Sie das Gehirn in eiskaltem PBS.
- Wiederholen der Schritte 1.1) bis 1,17) für mindestens vier Mäusen.
2. Organ Wiegen
- Nach Organ Isolation, wiegen jedes PBS Rohr Lungen- und Hirngewebe enthält eine elektronische Waage.
- Berechnen Sie die Gewichtsdifferenz durch die Pre-Isolierung Gewicht subtrahiert (PBS nur) aus dem Gewicht des PBS Rohr + Organe (Lunge und Gehirn).
- Bestimmung der Menge an Medien benötigt Gewebefragmenten aus dem berechneten Gewichtsunterschied zu resuspendieren.
Hinweis: Lungen- und Hirngewebe sind Gewicht normalisiert durch Aufwirbelung in einem 4: 1 Medien: Gewebe-Verhältnis (vol / wt).
3. Erzeugung von Lungen- und Brain- Anlage Medien
- In einem sterilen tAusgabe Kultur Kapuze, invertieren Röhrchen PBS, die Lunge oder Gehirn dreimal aus Organen und absaugen PBS Blut enthält Restblut zu entfernen. Wiederholen Sie mit frischem, kaltem PBS, bis eine Lösung ohne Anzeichen von Blut klar erscheint.
- Platzieren Sie Lungen und Gehirn in getrennten 60 mm 2 Petrischalen aus Glas. Mit Hilfe von zwei sterile Skalpellklingen, zerkleinern Lunge oder Gehirn durch hin und her immer wieder schneiden , bis die Gewebefragmente etwa ~ 1 mm 3 groß sind.
- F12-Medien mit 1x konzentriert mitogen Ergänzung und Penicillin (50 & mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml) ergänzt: Resuspendieren Gewebefragmente in geeigneten Volumen an Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (zuvor im Schritt 2.3 bestimmt).
- In resuspendierten Lunge oder Gehirn Gewebefragmente zu einer Vertiefung einer 6-Well-Platte.
- Gewebefragmente in Medien Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Nach der Inkubation collect konditionierten Medien für jedes Gewebe und feitere verdünnt durch Zugabe von drei äquivalenten Volumina von frischem Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen.
- Zentrifuge bei 1.000 xg in verdünnten konditionierten Medien für jedes Organ bei 4 ° C für 15 min große Gewebetrümmer zu entfernen. Sammeln Medienüberstand und filtriert durch einen 0,22 & mgr; m Spritzenfilter.
- Pool konditionierten Medien von jedem Organ (dh., Der Lunge mit Lunge und Gehirn mit Gehirn) von mehreren Mäusen zu berücksichtigen Maus-zu-Maus - Variabilität. Aliquotieren und Speichern von Medien bei -80 ° C bis zur Verwendung konditioniert.
4. Erzeugung von Knochenmark-konditionierten Medien
- In einer sterilen Kultur Kapuze Gewebe, schneiden überschüssige Gewebe aus dem Knochen und entfernen Epiphyse (Endstücke) aus den Knochen mit einer Schere.
- Mit einem 27 ½ G-Nadel, bündig Markhöhle der Knochen durch Drücken 1 ml PBS durch das Zentrum eines jeden Knochen. Dies ermöglicht es Ihnen Stromazellen des Knochenmarks (BMSC) in ein frisches Röhrchen mit PBS zu sammeln.
- Zentrifuge bei 1,000 × g für 5 min bei 4 ° C und waschen BMSC zweimal mit PBS. Resuspendieren Stromazellen des Knochenmarks in 20 ml Knochen Stroma-Zellwachstumsmedium (DMEM: F12-Medium mit 1x ergänzt konzentriert mitogen zu ergänzen, Penicillin (50 & mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml) und 10% fötalem Boven Serum (FBS) ).
- Platte 10 ml resuspendiert Stromazellen des Knochenmarks in einem T75-Kolben.
Hinweis: Kombinieren und Plattenzellen aus jeweils 2 Mäusen in jeder T75-Flasche; für vier Mäusen werden zwei T75 - Flaschen benötigt wird (etwa 1 x 10 7 Zellen / Kolben). - Inkubieren für 24 Zellwachstumsmedien bone stromal h bei 37 ° C und 5% CO 2 Stromazellen des Knochenmarks in. Nach der Inkubation entfernen Medien aus beiden T75-Flaschen und in neue T75-Flasche, beschriften Sie diese Flasche als "Floater Flask". In frischen Knochen Stromazellen Wachstumsmedien zur vorherigen 2 - Kolben und Inkubation alle 3 - Kolben bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Nachdem die Zellen erreichen etwa 70% Konfluenz (ca. 5 bis 7Tage) Passage Zellen. Um dies zu tun, entfernen Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS (3 ml jeder Wäsche). Entfernen PBS und 3 ml Trypsin / EDTA-Lösung, dass Trypsin zu gewährleisten, die gesamte Oberfläche des Kolbens abdeckt. Nachdem die Zellen die Kolben abheben (~ 2 - 3 min), stoppen Trypsinierung Reaktion durch Zugabe von 3 ml Knochen Stromazellen Wachstumsmedien). Zentrifuge 900 xg für 5 min bei 4 ° C, verwerfen Medien und resuspendieren Zellen in 10 ml frischem Zellwachstum Medien Knochen Stroma.
- Pool - Zellen aus allen Flaschen und Passage 1: 5 in drei neue T75 - Kolben und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2. Nachdem die Zellen wieder einmal 70% erreichen, wiederholen Sie die Schritte 4.6 und Pool und Passage alle anhaftenden Zellen ein zweites Mal. Re-Platte alle Zellen zu vier T75 - Kolben und Inkubation 37 ° C und 5% CO 2. Knochen Stroma-Zellwachstumsmedien sollten für alle Schritte verwendet werden.
- Lassen Zellen Konfluenz erreichen, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und fügen Knochen Stromazellen Sammlung Medien (DMEM: F12-Medium + 1x konzentriert Mitogen supplement + Penicillin (50 & mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml); 10 ml / T75) und sicherstellen, dass diese Medien frei von FBS ist. Sammeln Knochenmark-konditionierten Medien 72 Stunden später, filtriert durch ein 0,22-um-Filter, Pool, aliquoten und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
- Falls gewünscht, bestätigen Antikörper gegen Maus - Sca-1, CD105, CD29 und CD73, CD44, unter Verwendung von Standardtechniken Durchflusszytometrie den Phänotyp der isolierten Stromazellen des Knochenmarks (BMSC) unter Verwendung von 13 , wie zuvor beschrieben.
5. Generation von Lymph Node-konditionierten Medien
- zu entfernen Restblut aus Lymphknoten und absaugen blutigen PBS in einer sterilen Kultur Haube Gewebe, invertieren PBS Rohr Lymphknoten dreimal enthält. Wiederholen Sie mit frischem, kaltem PBS, bis eine Lösung ohne Anzeichen von Blut klar erscheint.
- Legen Lymphknoten in 60 mm 2 Petrischalen aus Glas. Mit Hilfe von zwei sterile Skalpellklingen, zerkleinern Lymphknoten wiederholt hin und her, bis das Schneiden tissue Fragmente sind etwa 1 mm 3 in der Größe.
- In einem konischen Rohr, resuspendieren Gewebefragmente in 10 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) Medium mit Penicillin (50 & mgr; g / ml) supplementiert / Streptomycin (50 ug / ml), 5 x 10 -5 M β-Mercaptoethanol sterile ( 1,75 & mgr; l / 500 ml Medium) und 10% FBS.
- Zentrifuge bei 900 × g für 5 min bei 4 ° C und Resuspendierung alle Zellen in 30 ml Medium. 5 ml Medium / Vertiefung in einer 6-Well - Platte und Inkubation für 7 Tage bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Nach der 7-tägigen Inkubation verwerfen Medien, waschen anhaftenden Zellen mit 5 ml warmem PBS und 5 ml frisches Medium zu jeder Vertiefung. Lassen Zellen bis zur Konfluenz wachsen (ca. 5-7 Tage), trypsinize, bündeln alle Zellen, und der Durchgang, wie in Schritt 4.6 beschrieben. Re-Platte Zellen bis 6-Well-Platte. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Nach drei Passagen erlauben Zellen bis zur Konfluenz, waschen Vertiefungen dreimal mit PBS und 2 ml / Vertiefung DMEM wachsen: F12 + 1xkonzentrierte mitogen Ergänzung und Penicillin (50 & mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml), um sicherzustellen, dass dieses Medium frei von FBS ist. Sammeln Lymphknoten-konditionierten Medien nach 72 h, Pool, aliquoten und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
- Falls gewünscht, kann bestätigen , Antikörper gegen Maus CD45 und gp38, unter Verwendung von Standard - Durchflusszytometrie Techniken , um den Phänotyp der isolierten Lymphknoten Stromazellen (LNSC) unter Verwendung von wie zuvor 13 beschrieben.
6. Verwendung von Organ-konditionierten Medien für Downstream-Assays mit Bezug zu Metastasiertem Verhalten von Krebszellen
- Sobald die organ konditionierten Medien wurde wie beschrieben erzeugt in den Schritten 1 bis 5, verwenden sie verschiedene Downstream Zell- und Molekularbiologie Assays durchzuführen, um den Einfluss der löslichen organ abgeleiteten Faktoren auf das metastatische Verhalten von Krebszellen zu bestimmen. Beispiele von Standardassays ( an anderer Stelle in der Literatur beschrieben) umfassen Protein - Arrays 13, das Zellwachstum Assays <sup> 13, Zellmigration Assays 13, tumorsphere Bildung 14 und RT-PCR 15. Die ursprüngliche Basismedium verwendet , um die organ konditionierte Medien zu erzeugen (dh unconditioned DMEM. F12 Medium mit 1x Ergänzung konzentriert Mitogen ergänzt und Penicillin (50 & mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml) als Negativkontrolle verwendet werden , .
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Representative Results
Die Erzeugung von Orgelanlage Medien
Ein Übersichtsdiagramm / schematische Darstellung des Prozesses der organ Isolierung und Erzeugung von konditionierten Medien ist in Abbildung 1, mit repräsentativen photographischen Bildern des Verfahrens in Figur 2 gezeigt dargestellt. Es ist zu beachten , dass , wenn dieses Protokoll zunächst in der Entwicklung war, Leber aufgenommen wurde in unserer Analyse, weil es eine gemeinsame Stelle der Metastasierung von Brustkrebs. Jedoch wegen der großen Menge an Proteasen durch die Leber produziert und sezerniert, ist es sehr schwierig, die Leber tragfähige lange genug zu halten, um gute Qualität konditionierten Medien erzeugen. Leber-konditionierten Medien ist ebenfalls nicht stabil einmal isoliert, und es neigt dazu, eine Menge von Protein-Niederschlag, vermutlich aus dem gleichen Grund zu sein. Daher Leber wurde in keiner weiteren Analyse einbezogen.
(3A) zeigt und BMSCs demonstriert eine kleinere Bild (3C). Durchflusszytometrie - Analyse bestätigt , dass LNSCs weitgehend CD45 - und gp38 +, mit ~ 60% der Zellen besitzen eine CD45 - gp38 + Phänotyp anzeigt LNSCs 16 (3B). Indikativ für BMSCs 17,18 - Die BMSCs sollte für CD44 und CD29, schwach positiv für CD105 und Sca-1, und negativ für CD73 (H 3D) positiv sein.
Breast Cancer Cell Response zu organ geeignete Migrationsmuster und Veränderungen der Genexpression
Mit Hilfe dieses ex vivo Modellsystem wurde zuvor gezeigt, dass menschliche Brustkrebszellen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen zeigen differentielle Migration und Wachstumsmuster auf spezifische Organ Bedingungen. Bemerkenswert ist , reflektieren diese Muster die bekannten metastatischen Verbreitung Muster dieser Zelllinien in vivo 13. In der aktuellen Studie, Knochen (231-BOM) - und Lunge (231-LM2) -sucht Varianten der MDA-MB-231 menschliche Brustkrebs - Zellvarianten (ein freundliches Geschenk von Dr. Joan Massagué 11,12) haben auch gewesen in einem Transwell-Migrationstest verwendet, um organ geeigneten Migrationsmuster bestätigen. Die Ergebnisse zeigen , dass das knochensuch 231-BOM Variante wandert bevorzugt an das Knochenmark konditioniertem Medium über Gehirn- und Lungen- konditionierten Medien (4A, links). ÄhnlichDie Lungenkrebs-seeking 231-LM2 Variante wandert bevorzugt an Lungen-konditionierten Medien über bone marrow-konditionierten Medien und Gehirn-konditionierten Medien (4A, rechts). Darüber hinaus zeigt RT-qPCR-Analyse, dass die Exposition der elterlichen MDA-MB-231 Brustkrebszellen Knochen- oder assoziierten Lungen-konditionierten Medien bewirkt eine Hochregulation von Genen, die mit knochenspezifische Metastasierung (CXCR4, IL-11, TGFß1) oder Lungen- spezifische Metastasierung (VCAM1) von Brustkrebszellen in vivo 11,12 (4B). Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit des ex vivo - System in Bezug auf die erwartete Organtropismus von Brustkrebszellen in vivo, und zeigt an, daß lösliche Faktoren , die in organ konditionierten Medien metastatischen Zellphänotyps neben der Förderung der Migration beeinflussen können.
Orgel-konditionierten Medien Enthält Potential Lösliche Mediators des metastasierten Verhalten
Ein Biotinmarker-basierte Maus-Antikörper-Array wurde verwendet, um die Anwesenheit und Identität der gemeinsamen löslichen Faktoren in organ konditionierten Medien aus verschiedenen Organen zu beurteilen. Dieses Array enthält Antikörper gegen 308 der häufigsten Array löslichen Maus proteins.This Proteins ist zuvor verwendet worden , lösliche Faktoren von Interesse mit der metastatischen Kaskade vorhanden in der Lunge und Knochenmark konditioniertem Medium assoziiert zu identifizieren , wie in Chu et al (2014) gezeigt , und Pio et al (2015) bzw. 13,14. In der vorliegenden Studie Proteinarray Ergebnisse sind für Grundmedien (5A) gezeigt , im Vergleich zu Lymphe node- (5B) und Gehirn-konditionierten Medien (Figur 5C). Hervorgehoben neben jedem Array sind lösliche Faktoren , die in den Medien , die gefunden wurden , mit den Schritten in der metastatischen Kaskade in der Literatur 19-29 zugeordnet werden. Diese löslichen factoren können als potentielle Vermittler von sekundären Metastasen in diesen Organ Standorte zu untersuchen wert sein.
Abbildung 1 Schematische Übersicht des Prozesses der Organ Isolation und die Erzeugung von konditionierten Medien. Tissues (Lunge, Gehirn, Femur, Tibia und Lymphknoten) aus der Maus geerntet. Lunge, Gehirn und Lymphknoten werden mit einem Skalpell zerkleinert. Knochenmark wird aus dem Markraum des Knochens durch PBS geerntet durch den Hohlraum mit einer 27½ G Nadel drückt. Lungen- und Gehirngewebefragmente werden für einen Zeitraum von 24 Stunden inkubiert, bevor sie mit drei äquivalente Mengen von frischem Basalmedien Verdünnung und gesammelt Lungen- und Gehirn-konditionierten Medien zu machen. 3-mal, bevor sie mit Basalmedium Inkubation Knochen und Lymphknoten-konditionierten Medien zu machen - Knochenmark und Lymphknoten Stromazellen 2 agiert. Die geernteten Medien p seinooled und bei -80 ° C bis bereit gespeichert zur Verwendung in nachgelagerten Assays wie Protein - Arrays, Zellwachstumsassays, Zellmigration Assays, tumorsphere Bildung und RT-PCR. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Fotobilder des Verfahrens für Orgel Isolierung und Erzeugung von konditionierten Medien. Am Tag 0, die Lunge, Gehirn, Femur, Tibia und Lymphknoten werden aus der Maus gesammelt. Die Lunge, dem Gehirn und den Lymphknoten werden in einem 60 mm 2 Glaspetrischale fein zerkleinert und mit zwei Skalpellklingen auf etwa 1 mm 3 in der Größe angeordnet. Das Knochenmark wird aus dem Markraum des Knochens durch Drücken PBS durch den Hohlraum mit einer 27 ½ G Nadel in ein frisches Röhrchen geerntetPBS. Der Lunge und Gehirngewebefragmente werden für einen Zeitraum von 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2 vor dem Verdünnen mit drei äquivalenten Volumina von frischem Medium inkubiert und gesammelt Lungen- und Gehirn-konditionierten Medien nach 24 Stunden zu machen. Knochenmark und Lymphknoten stromalen Zellen werden bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubiert und agierten 2 - 3 mal (~ 3 Wochen total) vor dem Medium mit serumfreien Basalmedium zu machen Knochen und Lymphknoten-konditionierten Medien zu ersetzen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Charakterisierung der isolierten Lymphknoten und Knochenmark - Stroma - Zellen. (A) Hellfeld - Mikroskopie - Bild zeigt die Morphologie von Lymphknoten Stromazellen (LNSCs). (B) Repräsentative FlussZytometrie Analyse von LNSCs ein Phycoerythrin (PE) -konjugierte gp38 - Antikörper und ein Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Antikörper konjugiertem CD45 verwendet wird . (C) Mikroskopiebild Hellfeld die Morphologie von Stromazellen des Knochenmarks (BMSCs). (DH) Repräsentative Fluss zeigt Zytometrie Analyse BMSCs Verwendung PE konjugiert (black Profile) Antikörper gegen (D) CD44, (E) CD106, (F) Sca-1, (G) CD29, (H) CD73 - Antikörpern relativ zu dem Isotypkontrolle (white - Profile). Ein Minimum von 10.000 tragfähige Ereignisse wurden pro Probe gesammelt. Diese Zahl hat sich von 13 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Organ-geeignete Migrationsmuster und Veränderungen der Genexpression in Reaktion auf Organ-konditionierten Medien. (A) Knochensuch 231-BOM - Varianten (links, gestreifte Balken) oder Lungensuch 231-LM2 Varianten (rechts, gestreifte Balken) der MDA-MB-231 Brustkrebszelllinie sowie die elterliche MDA-MB- 231 - Zellen (beide Platten, Vollstäbe) wurden auf mit Gelatine beschichtete Einsätze plattiert (mit 8 um Poren) vor der Platzierung in Grundmedium (DMEM: F12 + konzentrierte Mitogen Zuschlag) oder Organ-CM. Platten bei 37 ° C und 5% CO 2 für 18 Stunden inkubiert wurden. (B) insgesamt Population parentalen MDA-MB-231 - Zellen wurden entweder Knochen-CM (links) oder Lunge-CM (rechts) für 48 Stunden ausgesetzt. RNA wurde isoliert und quantifiziert RT-qPCR verwendet wird. Veränderungen der Genexpression als Antwort auf Orgel-CM (schwarze Balken) wurden normalisiert auf GAPDH und ausgedrückt im Verhältnis zum Ausgangswert Ausdruck in Basalmedium (graue Balken). Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt (N = 3; fach-Wechsel von jeweils negative Kontrolle der basalen Medien). * = Von Grundmedien signifikant verschieden; δ = signifikant verschieden von der Eltern-Zelllinie mit den gleichen Medienbedingungen behandelt; P <0,05, ANOVA. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Orgelanlage Medien Enthält Potential Lösliche Mediators des metastasierten Verhalten. Ein Biotin - Label-basierte Maus - Antikörper - Array verwendet wurde lösliche Faktoren in Lymphe vorhanden zu identifizieren Knoten-CM und Gehirn-CM. , (B) Lymphknoten-CM oder (C) Gehirn-CM bei 4 o CO / N und visualisiert Chemilum Verwendung: Membranen wurden mit biotinylierten Proben von (A) Grundmedium (F12 + konzentriertem mitogen Ergänzungs DMEM) inkubiert ,inescence. Blaue Ellipsen zeigen interne positive Kontrollen, gefütterte Boxen zeigen interne negative Kontrollen und feste Kästen zeigen lösliche Faktoren von Interesse , die möglicherweise in den metastatischen Verhalten von Brustkrebszellen in die Lymphknoten oder des Gehirns beteiligt sind. Bitte hier klicken um eine größere Version davon zu sehen Zahl.
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Discussion
Metastasierung ist ein komplexer Prozess , bei dem eine Reihe von zellulären Ereignissen letztlich für Gewebe verantwortlich sind , Invasion und entfernten Tumor Einrichtung 4,30,31. Die ex vivo Modellsystem hier präsentiert werden können genutzt zu studieren zwei wichtige Aspekte des metastasierten Progression: Krebszelle Homing oder Migration auf ein bestimmtes Organ ( "getting there") und das Wachstum in diesem Organ ( "dort wachsen"). Viele Studien haben sich auf die Ermittlung der wichtigsten molekularen Eigenschaften mit den Krebszellen selbst assoziiert zuvor konzentriert, die auf die Metastasierung Prozess beitragen. Zum Beispiel wurde von Joan Massagué Gruppe geleistete Arbeit verschiedene Gen - Signaturen im Zusammenhang mit Lungenspezifische, knochenspezifische und gehirnspezifische Muster der Ausbreitung 10-12,32 identifiziert. Während diese Arbeit wichtige Erkenntnisse in Bezug auf den Beitrag von Krebszellen zu diesem Verfahren bietet, viel weniger ist über die Rolle der organspezifischen Faktoren bekannt t beigetragener sekundäre Mikro, die relativ schwierig zu studieren 13 geblieben ist.
Diese ex vivo Modellsystem wurde zuvor als eine genaue Darstellung des sekundären Organmikro validiert durch , dass die Brustkrebs-Zelllinie spezifische Migration und das Wachstum in der Organ-CM demonstriert spiegelt diese Zellen Linien 'in vivo Muster der Metastasierung. Eine Studie von Chu und Kollegen verwendet vier verschiedene humane Brustkrebszelllinien in vivo Metastasierungspotential unterschiedlichen, einschließlich MDA-MB-231 und SUM-159 (stark metastatischen, metastasieren zu den Lymphknoten, Lunge, Leber, Knochen und Gehirn in vivo ) und die SUM-149 und MDA-MB-468 (moderat metastatischen, zu den Lymphknoten und Lunge metastasieren in vivo) in. Sowohl die MDA-MB-231 und SUM-159 - Zelllinien angezeigt verstärkte Migration in Richtung aus Knochenmark, Lymphe Knoten- und Lunge-CM, während die SUM-149 und MDA-MB-468 Zelllinien bevorzugt in Richtung Lunge gewandert-CM 13. Die aktuelle Studie zeigt, dass Knochen- und Lungensuch MDA-MB-231-Varianten sowohl Knochen zu migrieren bevorzugen marrow- und Lungen-CM jeweils und dass die Exposition gegen Organ-CM kann die Expression von Knochen- und Lungen-assoziierten metastasierendem Gene fördern zuvor von Massagué identifiziert und Kollegen 11,12. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse , dass organ CM stellt eine ex vivo - Plattform repräsentativ für organspezifische löslichen Faktoren in vivo gefunden, die den Phänotyp und das Verhalten von Brustkrebszellen beeinflussen.
Identifizierung von löslichen Faktoren, die innerhalb bestimmter Organe und ihre relativen Expressionsniveaus bietet einen Ausgangspunkt für ihre potenziellen Einfluss auf das Krebszellverhalten zu bestimmen. Weiterhin kann unter Verwendung von Techniken wie Immunodepletion ermöglichen es dem Benutzer , um effektiv ein Protein von Interesse aus organ CM abzureichern seine Wirkung auf in vitro Zellverhalten zu bestimmen. Beispielsweiseviele lösliche Faktoren, die innerhalb bestimmten Organ Mikroumgebungen, fungieren als Lockstoffe und haben das Potenzial, Zellmigration und Proliferation zu induzieren. Frühere Arbeiten Lungen-CM getan Verwendung hat zur Identifizierung von vielen löslichen Faktoren in Lungen-CM geführt , die als chemische Lockstoffe für Brustkrebszellen, einschließlich Osteopontin (OPN) und L-Selectin (verkaufen) 13 wirken. Durch immunodepleting diese Faktoren aus Lungen-CM, Chu und Mitarbeiter konnten reduzierten Zellmigration und / oder das Wachstum von hoch metastatischen MDA-MB-231 - Brustkrebszellen 13 zu demonstrieren. Diese Ergebnisse zeigen , dass konditioniertes Medium generiert von ganzen Organen für die Untersuchung der Wirkungen von bestimmten löslichen Faktoren auf Krebszellverhalten, durch die Verwendung von herkömmlichen Techniken in vitro eine wertvolle Ressource bereitstellt.
Obwohl dies eine ziemlich einfache Modellsystem ist, gibt es einige Schritte in dem experimentellen Protokoll, das für successfu kritischl Generation von organ konditionierten Medien. Erstens ist die Verwendung von Mäusen zwischen den definierten Alter von 6-12 Wochen zum Ernten von Organen wichtig, um altersbedingte Effekte zu steuern, entweder im Zusammenhang mit der Entwicklung (vor Ablauf von 6 Wochen) oder in Verbindung mit in älteren Mäusen Alterung. Zweitens ist die Sterilität von größter Bedeutung in der gesamten Protokoll und kann am besten durch die Verwendung von strengen aseptischen Technik und Arbeit in einer sterilen Gewebekulturhaube sichergestellt werden, sterilisierte Gewebekultur Verbrauchsmaterialien und Reagenzien sowie milde Antibiotika in allen Kulturmedien und Ergänzungen ( dh., Penicillin / Streptomycin). Eine der Herausforderungen , mit in - vivo - Verwendung oder ex vivo Modellsystemen ist die inhärente Tier zu Tier Variabilität. Wenn dies beobachtet, sind Schritte zur Fehlerbehebung Bündelung von konditionierten Medien aus mehreren Chargen von Mäusen vor der Verwendung in nachgelagerten Experimenten erhalten, sowie sicherzustellen, dass Lungen- und Gehirnanlage Medien in jeder mir genau gewichts normalisiert werdendia Sammlung Experiment durch Aufwirbelung in einem 4: 1 Medien: Gewebe-Verhältnis (Volumen / Gewicht). Darüber hinaus sollten die primären Lymphknoten und Knochenmark-Stromazellen nicht zu jedem gegebenen Passage zu über 70% Konfluenz erlaubt sein oder darüber hinaus 5 Gesamt Passagen gezüchtet werden, sonst werden sie terminal differenzieren.
Änderungen am Protokoll in diesem Artikel vorgestellten könnte in Betracht gezogen werden Anwendung auf verschiedenen Gebieten der Forschung zu ermöglichen. Obwohl dieses Modell ausschließlich für Brustkrebsforschung bisher hat, kann es potenziell die Rolle von organ abgeleiteten löslichen Faktoren in anderen Krebsarten sowie zusätzliche normalen physiologischen und Krankheitszustände zu untersuchen verwendet werden. Darüber hinaus, während dieses Verfahren hier mit geschwächtem Immunsystem Nacktmausmodelle verwendet wurde, wird diese Technik theoretisch nicht auf diese Arten von Mäusen beschränkt und sogar potenziell mit anderen Arten von Tiermodellen verwendet werden könnten.
Während dieses Modell bietet important Einblick, den Beitrag der spezifischen Organ abgeleiteten löslichen Faktoren auf das Krebszellverhalten, ist es nicht ohne seine Grenzen. Erstens ist dieses Modell konzentriert sich ausschließlich auf die löslichen Bestandteile der Organmikroumgebungen, die die Bedeutung der extrazellulären Matrix (ECM) vernachlässigt. Das ECM ist die nicht-zelluläre Komponente vorhanden in allen Gewebetypen und Funktionen sowohl eine physikalische Gerüst für Zellen zur Verfügung zu stellen, sowie die Fähigkeit , wichtige biochemische und biomechanische Cues für verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich der Morphogenese, die zelluläre Differenzierung und Homöostase 33 erforderlich zu induzieren -35. Wichtig ist, dass die physikalische und biochemische Zusammensetzung des ECM weitgehend heterogen und stark zwischen Geweben Typen variieren kann. Daher ist die gewebespezifische Zusammensetzung des ECM kann auch einen Einfluss auf Organtropismus während Krebsmetastasen, die mit diesem Modell übersehen werden kann. Das ECM kann wirken, um auch spezifische lösliche Faktoren in einer Weise zu konzentrieren, dass appropriately stellt sie bestimmte Zellen, und ohne diese Feinabstimmung des ECM, die Induktion von zellulärer Signal vermindert oder 36 verändert werden kann. Obwohl die in diesem Dokument erwähnt Modell eine entsprechende ECM-Komponente fehlt, könnten viele Studien unter Verwendung eines kostenlosen Ansatz sowohl das Modell hier zusammen mit einem geeigneten ECM-Komponente erwähnt Verwendung gestärkt werden. handelsüblichen primären organ Fibroblasten beispielsweise die endogene ECM oder rekombinante ECM Komponenten synthetisieren könnte zusätzlich zu erzeugte organ CM verwendet werden, um den vollen Umfang des ganzen Organs Mikroumgebung auf Zellverhalten zu bestimmen.
Es ist möglich, dass das lösliche Mikro erzeugt von Organ-CM kann nicht in geeigneter Weise zu imitieren, was während des Prozesses der Metastasierung vorhanden physiologisch ist. Überleben von Krebszellen, das Wachstum und die Progression sind stark abhängig von Krebszellen Wirt - Interaktionen 4,30,31. Die Erzeugung von ganzen Organ-CM kann in der p führenräsenz löslicher Faktoren normalerweise nicht von Zelltypen exprimiert, die mit Krebszellen während der metastatischen Progression interagieren. Weiterhin wurde zuvor gezeigt, dass die Gegenwart eines primären Tumors kann der Mikroumgebung entfernten Metastasen modulieren, wodurch "Priming" , um sie für die Metastasierung 37. Da die aktuelle Protokoll Organe von gesunden, nicht tumortragenden Mäusen abgeleitete verwendet, wäre es sinnvoll sein, um die löslichen Faktoren, die von Organen von Mäusen abgeleitet zu vergleichen, um eine primäre Brusttumor trägt.
Durch die mechanische Trennung von ganzen Organen während der Erzeugung von verschiedenen Organ-CM kann die intrazelluläre Faktoren in die umgebenden Medien freigesetzt werden, die normalerweise nicht physiologisch durch Krebszellen auftreten können. Zusätzlich erfordert Knochen- und Lymphknoten stamm konditioniertem Medium die Kultivierung von Stromazellen aus diesen Organen vor ihrer Sammlung isolierten Zellen. Die vorhandenen Zelltypen während der ex vivo cultuRing kann nicht genau die Breite der Zelltypen repräsentieren physiologisch durch Krebszellen auftreten. Während Stromazellen hauptsächlich viele Faktoren , die mit verschiedenen Organmikroumgebungen sezernieren, unter Verwendung dieser Verfahren nicht vorhanden 38 innerhalb von Geweben und Organen , um den Einfluss von anderen Zelltypen entfallen. Schließlich enthalten wir eine Mitogen Ergänzung in den Basismedien organ konditionierten Medien zu erzeugen, weil wir, dass diese gefunden wurde, erforderlich, um die Lebensfähigkeit der beiden kultivierten Organe (Lunge und Gehirn) und der isolierten BMSC und LNSC zu halten. Allerdings erkennen wir den Vorbehalt, dass das Vorhandensein dieses Mitogen ergänzen die Organe haben angeregt könnten künstlich lösliche Faktoren produzieren, die sie möglicherweise nicht mehr normal machen,
Zusammenfassend wurden viele Studien darauf hin, dass spezifische Organ Mikroumgebungen tief Tumor Zellbiologie beeinflussen können. Trotz der diskutierten Einschränkungen hat die ex vivo Modellsystem hier represents eine umfassende Technik, um den Einfluss der löslichen Mikro vieler solider Organe auf zelluläre Verhalten studiert. Im Labor der Autoren wurde dieses Modellsystem war und ist weiterhin als ein Mittel verwendet werden, viele der zellulären Ereignisse im Zusammenhang mit der Metastasierung zu studieren, einschließlich der Invasion, Migration, Proliferation, Stamm-ähnliches Verhalten und Veränderungen der Genexpression. Die Daten aus diesen Studien gewonnenen wiederum könnte die mögliche klinische Anwendung dieses Modellsystem zur primären Brustkrebszellen isoliert von Patienten Tumoren informieren, um ihre Reaktion auf verschiedene Mikroumgebungen, um zu bestimmen, die den möglichen Metastasen. Zusammengenommen ist zu hoffen, dass ein weiteres Verständnis der Wechselwirkung zwischen den Mikro und Tumorzellen während des Prozesses des metastasierten Organtropismus zu einer Verbesserung der Krebsbehandlung in der Zukunft führen wird.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
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