Introduction
El cáncer de mama es el cáncer más frecuentemente diagnosticado en mujeres y la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer 1. alta tasa de mortalidad de cáncer de mama se debe principalmente a la falta de la terapia convencional para mitigar y eliminar la enfermedad metastásica; aproximadamente el 90% de las muertes relacionadas con el cáncer se deben a la metástasis 2. La comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de la cascada metastásica es de suma importancia para el desarrollo de terapias eficaces tanto en temprano y el cáncer de seno en etapa tardía.
Las investigaciones anteriores han ayudado a aclarar la naturaleza de múltiples etapas de la metástasis del cáncer de mama y se plantea la hipótesis de que el resultado de la progresión de cáncer y la metástasis depende en gran medida de las interacciones entre las células cancerosas y el entorno de acogida 3. Las observaciones clínicas indican que muchos tipos de cáncer presentan tropismo de órganos, es decir., La tendencia a la metástasis preferentemente a lo específico organs.In el case de cáncer de mama, la enfermedad de un paciente típicamente se extiende o metástasis a 5 sitios principales, incluyendo el hueso, los pulmones, los ganglios linfáticos, el hígado y el cerebro 4-6. Muchas teorías se han desarrollado para explicar este proceso, pero sólo unos pocos han resistido la prueba del tiempo. La teoría de Ewing de metástasis, se propone en la década de 1920, la hipótesis de thatthe distribución de la metástasis era estrictamente debido a factores mecánicos; por el que las células tumorales se llevan a través del cuerpo por los patrones de flujo de la sangre fisiológica definidos normales y simplemente detienen en el primer lecho capilar que encuentran 7. Por el contrario, "semilla y del suelo" hipótesis de Stephen Paget 1889 sugirió que las interacciones moleculares adicionales fueron responsables de la supervivencia y el crecimiento de metástasis, en el que las células cancerosas ( "semillas") sólo pueden establecerse y microambientes de órganos proliferatein que producen factores moleculares apropiados ( "suelo ") 8. Casi un siglo más tarde, Leonard Weiss bajotomó un meta-análisis de los datos publicados anteriormente de la autopsia y se confirmó la predicción de Ewing que muchos tumores metastásicos detectados en el momento de la autopsia se encontraron en las proporciones previstas que se esperarían si metastásico tropismo órgano fue determinado por patrones de flujo sanguíneo solo. Sin embargo, en manyinstances hubo menos o más metástasis formadas en ciertos sitios a continuación, se podría esperar por factores mecánicos propuestos 9 de Ewing. Estas cuentas y teorías sugieren que los microambientes de órganos específicos desempeñan un papel fundamental en los patrones de difusión y posterior crecimiento y la supervivencia de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama.
Últimos esfuerzos de investigación se han centrado principalmente en los factores derivados de células del tumor y su contribución al tropismo de órganos observado en la metástasis del cáncer de mama 10-12, factores sin embargo pocos estudios han explorado derivados del microambiente de órganos que pueden proporcionar un nicho favorable para el establecimientode metástasis de cáncer de mama. Esto se debe en gran parte a las dificultades técnicas de estudio de los componentes del microambiente de órganos in vitro.
El presente artículo describe un sistema ex vivo integral modelo para el estudio de la influencia de los componentes solubles de los ganglios linfáticos, hueso, pulmón, cerebro y en el comportamiento metastásico de células de cáncer de mama humano. Estudios anteriores han validado este modelo de sistema mediante la demostración de que las diferentes líneas celulares de cáncer de mama muestran un comportamiento maligno de células línea específica y órgano-específica en respuesta a los medios de comunicación de órganos acondicionado que corresponde a su in vivo potencial metastásico 13. Este sistema modelo se puede utilizar para identificar y evaluar los factores solubles de órganos derivados específicos que pueden desempeñar un papel en el comportamiento metastásico de mama y otros tipos de células cancerosas, incluyendo las influencias sobre el crecimiento, la migración, el comportamiento y la expresión de genes como tallo, así como la identificación deposibles nuevas dianas terapéuticas para el cáncer. Este es el primer sistema de modelo ex vivo que se puede utilizar para estudiar el comportamiento metastásico de órganos específicos en detalle y para evaluar el papel de los factores solubles derivados de órganos en la conducción del proceso de la metástasis del cáncer.
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Protocol
Se llevaron a cabo todos los estudios con animales de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de los Animales, en virtud de los protocolos aprobados por la Universidad de Western Uso de Animales Subcomité.
1. Aislamiento de órganos (pulmón, cerebro, hueso, de ganglios linfáticos)
- Prepare cuatro estéril de 50 ml tubos cónicos (uno para cada órgano a ser aislado) que contiene aproximadamente 30 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Pre-sopesar cada tubo de PBS utilizando una balanza electrónica.
- La eutanasia de 6-12 semanas de edad ratones por inhalación de CO2. Los ratones se deben dejar en la cámara de CO 2 durante aproximadamente 1 - 2 min o hasta que el ratón deja de moverse y la respiración. la eutanasia exitosa puede confirmarse aún más por la falta de latidos del corazón cuando está marcada de forma manual con un dedo. Evitar la dislocación cervical ya que este método puede romper los vasos sanguíneos del cuello que lleva a dificultades para retirar los ganglios linfáticos axilares.
Nota: El trabajo previo ha utilizado específicamenteratones desnudos femeninos sanos, Hsd: atímicos nu Nude- Foxn1 13. - En una campana de cultivo de tejido estéril, colocar el ratón sobre su espalda en un cojín de espuma de poliestireno, difundir las extremidades y el uso de alfileres para mantenerlas en su lugar.
- El uso de pinzas y tijeras estériles, cortar la piel abdominal en la línea media en los genitales y cortar hacia arriba, hacia la boca. Tire suavemente la piel abdominal de los músculos abdominales y el pin en su lugar en la almohadilla de espuma de poliestireno.
- Busque la axilar, braquial, y los ganglios linfáticos inguinales.
Nota: Los ganglios linfáticos suelen estar rodeados de tejido graso. Los ganglios linfáticos inguinales son los más fáciles de localizar ya que se encuentran superficialmente en la unión de dos vasos sanguíneos en la piel abdominal retirado. Axilares y ganglios linfáticos braquial se encuentran más profundamente dentro del tejido y requieren maniobras suaves del tejido.- Después de haber localizado los ganglios linfáticos, usar las tijeras para cortar con mucho cuidado la linfa sindes de la piel, la grasa y los vasos y eliminarlas del ratón. Para confirmar la disección adecuada, rodar el fórceps sobre el tejido extirpado. Si existe un bulto duro al rodar el fórceps sobre el tejido, a continuación, un ganglio linfático ha probablemente ha eliminado con éxito.
- Coloque los ganglios linfáticos en PBS frío.
- Usando las pinzas y tijeras, abrir la cavidad abdominal mediante incisión en la pared abdominal expuesta en un movimiento ascendente hacia el pecho. Corte con cuidado a través del esternón, exponiendo la cavidad torácica.
- Situar la membrana debajo de los pulmones y cortar el diafragma. Se debe tirar hacia las costillas debido a la tensión.
- Levantar los pulmones desde abajo y cortar el tejido subyacente hacia la tráquea. Esto permite que los pulmones para ser removidos libremente de la cavidad torácica. Quitar el corazón y los pulmones en bloque y colocar en PBS frío. El corazón puede ser retirado de los pulmones aquí o simplemente antes de la pesada en el paso 2.
- Eliminar elpasadores, manteniendo el ratón en su lugar en la almohadilla de espuma de poliestireno. Ponga el ratón y cortar la piel de la espalda baja todo el camino al otro lado de flanco a flanco.
- Con un trozo de gasa estéril para mantener el torso del ratón, pelar la piel hacia atrás del ratón sobre las piernas y los pies del ratón.
- Utilizando el mismo trozo de gasa estéril, mantenga la pierna en su lugar, cuidadosamente romper la articulación del tobillo del pie del ratón y pelar la piel sobre la articulación proximal hacia la articulación de la rodilla.
- Con unas tijeras, retire la tibia libre de la articulación de la rodilla y colocar en PBS frío.
- Repetir los pasos 1,11) a 1,12) con el miembro opuesto.
- Con unas pinzas, mantenga el fémur en su lugar, cortar el tejido circundante muscular usando las tijeras y retire el fémur, colocándolo en PBS frío.
- Repita el paso 1.14) con el miembro opuesto.
- El uso de un nuevo trozo de gasa estéril, mantenga la cabeza del ratón en su lugar. El uso de pinzas y tijeras, retire suavemente la piel para exponer los sKull. Con unas tijeras, cortar cuidadosamente el cráneo occipital del centro de la parte superior en una línea recta y hacia abajo para exponer el cerebro posterior.
- Con unas pinzas, cuchara debajo del cerebro hacia la parte anterior y remover todo el cerebro. Coloque el cerebro en PBS enfriado en hielo.
- Repetir los pasos 1.1) a 1,17) durante al menos cuatro ratones.
2. Con un peso de órganos
- Después del aislamiento de órganos, pesar cada tubo de PBS que contiene de pulmón y tejido cerebral usando una balanza electrónica.
- Calcular la diferencia de peso restando el peso pre-aislamiento (PBS) a partir del peso del tubo de PBS + órganos (pulmón y cerebro).
- Determinar la cantidad de medios de comunicación necesarios para volver a suspender los fragmentos de tejido a partir de la diferencia de peso calculada.
Nota: pulmón y el tejido cerebral son de peso normalizado por resuspensión en una relación 4: 1 los medios de comunicación: relación de tejido (vol / peso).
3. Generación de Medios Lung-neuronas del asta posterior acondicionado
- En un t estériltema cultura capó, invertir los tubos de PBS que contiene los pulmones o el cerebro tres veces para eliminar la sangre residual de órganos y aspirado de PBS que contenía la sangre. Repita con PBS frío fresco hasta que la solución aparece clara, sin evidencia de sangre.
- Coloque los pulmones y el cerebro en separadas 60 mm 2 placas de Petri de vidrio. El uso de dos hojas de bisturí estériles, los pulmones de carne picada o cerebros por corte repetidamente hacia atrás y adelante hasta que los fragmentos de tejido son aproximadamente ~ 1 mm 3 en tamaño.
- fragmentos de tejido Resuspender en volumen apropiado (determinado previamente en el paso 2.3) de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM): medio F12 suplementado con 1x concentró suplemento mitógeno y penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml).
- Añadir pulmonares o tejido cerebral fragmentos resuspendidos a un pocillo de una placa de 6 pocillos.
- Incubar los fragmentos de tejido en medios durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Después de la incubación, recoja acondicionado medios de comunicación para cada tejido y fás diluir mediante la adición de tres volúmenes equivalentes de medio fresco en un tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar a 1000 xg en medio condicionado diluido para cada órgano a 4 ° C durante 15 min para eliminar los residuos de tejido de gran tamaño. Recoger el sobrenadante medios y filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras.
- Piscina acondicionado medios de comunicación de cada órgano (es decir., Pulmón con cáncer de pulmón y el cerebro con el cerebro) a partir de varios ratones para tener en cuenta la variabilidad-ratón-a-ratón. Alícuota y almacenar los medios condicionados a -80 ° C hasta su uso.
4. Generación de medios acondicionados de la médula ósea
- En una campana de cultivo de tejido estéril, recortar el exceso de tejido de la médula y quitar epífisis (piezas de terminación) de los huesos con unas tijeras.
- El uso de un 27 ½ G aguja, la cavidad medular de los huesos ras empujando 1 ml de PBS a través del centro de cada hueso. Esto le permitirá tomar muestras de células estromales de la médula ósea (BMSC) en un tubo nuevo que contenía PBS.
- Centrifugar a 1,000 xg durante 5 min a 4 ° C y se lava dos veces con PBS BMSC. Resuspender las células estromales de médula ósea en 20 ml de medio de crecimiento de las células estromales de la médula (DMEM: F12 suplementado con 1x concentran mitógeno suplemento, penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml) y 10% de suero Boven fetal (FBS) ).
- Placa 10 ml de células estromales de médula ósea se resuspendieron en un matraz T75.
Nota: Combinar y células de la placa de cada 2 ratones en cada matraz T75; de cuatro ratones, dos matraces T75 se necesitan (aproximadamente 1 x 10 7 células / frasco). - Se incuban las células estromales de médula ósea en los medios de crecimiento de las células estromales de la médula durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Después de la incubación, quitar el medio de los dos matraces T75 y poner en frasco nuevo T75, etiquetar este matraz como "flotador Frasco". Añadir medio de cultivo de células estromales de la médula fresca de 2 frascos anteriores e incubar los 3 matraces a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Después de células alcanzan aproximadamente el 70% de confluencia (aproximadamente 5-7días) las células pasaje. Para ello, retire medio y lavar las células dos veces con PBS (3 ml cada lavado). Retirar PBS y añadir 3 ml de solución de tripsina / EDTA, asegurando que la tripsina cubre toda la superficie del matraz. Después las células se levantan del matraz (~ 2-3 min), deje de tripsinización reacción mediante la adición de 3 estroma medio de crecimiento de células ml hueso). Centrifugar 900 xg durante 5 min a 4 ° C, tirar medios de comunicación, y volver a suspender las células en 10 ml de medio de crecimiento de células estromales de la médula fresca.
- Las células de la piscina de todos los frascos y el paso 1: 5 en tres nuevos matraces T75 y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2. Después las células lleguen de nuevo a 70%, repita el paso 4.6 y piscina y de paso todas las células adherentes por segunda vez. Re-placa de todas las células a cuatro matraces T75 e incubar 37 ° C y 5% de CO2. medios de cultivo de células estromales de médula se debe utilizar para todas las medidas.
- Permitir que las células alcanzan la confluencia, las células se lavan tres veces con PBS y se añaden estroma medio de recolección de células óseas (DMEM: F12 medios + 1x mitógeno concentrado dopplement + penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml); 10 ml / T75), asegurándose de que este medio está libre de FBS. Recoger los medios de médula ósea acondicionado 72 horas más tarde, se filtra a través de un filtro de 0,22 micras, piscina, alícuota y se almacena a -80 ° C hasta su uso.
- Si se desea, confirmar el fenotipo de las células del estroma de la médula ósea aisladas (BMSC) utilizando anticuerpos contra Sca-1 de ratón, CD105, CD29, y CD73, CD44, usando citometría de flujo estándar técnicas como se ha descrito previamente 13.
5. Generación de Medios acondicionado Linfonodular
- En una campana de cultivo de tejido estéril, invertir tubo de PBS que contenía ganglios linfáticos tres veces para eliminar sangre residual de los ganglios linfáticos y el aspirado sangrienta PBS. Repita con PBS frío fresco hasta que la solución aparece clara, sin evidencia de sangre.
- Coloque los ganglios linfáticos en placas de Petri de 60 mm 2 de vidrio. El uso de dos hojas de bisturí estériles, picadillo de ganglios linfáticos por corte repetidamente hacia atrás y adelante hasta que tissufragmentos de correos son de aproximadamente 1 mm 3 en tamaño.
- En un tubo cónico, fragmentos de tejido se resuspende en 10 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medio suplementado con penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml), 5 x 10 -5 M β-mercaptoetanol (estéril 1,75 l / 500 ml de medio) y 10% de FBS.
- Centrifugar a 900 xg durante 5 min a 4 ° C y volver a suspender todas las células en 30 ml de medio. Añadir 5 ml de medio / pocillo en una placa de 6 pocillos y se incuban durante 7 días a 37 ° C y 5% de CO2.
- Después de la incubación de 7 días, descartar los medios de comunicación, lavar las células adherentes con 5 ml de PBS caliente y añadir 5 ml de medio fresco a cada pocillo. Permitir que las células crecen hasta la confluencia (aproximadamente 5 - 7 días), trypsinize, piscina para todas las células, y el paso como se describe en el paso 4.6. células re-placa a placa de 6 pocillos. Repita este paso tres veces.
- Después de tres pasajes, permiten que las células crezcan hasta confluencia, se lavan los pocillos tres veces con PBS y añadir 2 ml / pocillo de DMEM: F12 + 1xsuplemento concentrado mitógeno y penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml), asegurándose de que este medio está libre de FBS. Recoger los medios de comunicación con ganglios linfáticos acondicionado después de 72 horas, piscina, alícuota y se almacena a -80 ° C hasta su uso.
- Si se desea, confirmar el fenotipo de las células de los ganglios linfáticos estromales aisladas (LNSC) utilizando anticuerpos contra CD45 de ratón y GP38, utilizando citometría de flujo estándar técnicas como se ha descrito previamente 13.
6. El uso de los medios de comunicación acondicionado de órganos para los ensayos intermedios relacionados con el comportamiento metastásico de células de cáncer
- Una vez que los medios de comunicación de órganos acondicionado se ha generado como se describe en los pasos 1 - 5, lo utilizan para llevar a cabo diferentes células de aguas abajo y los ensayos de biología molecular con el fin de determinar la influencia de los factores de órganos derivados solubles en el comportamiento metastásico de las células cancerosas. Ejemplos de ensayos convencionales (descritas en otra parte en la literatura) incluyen arrays de proteínas, 13 ensayos de crecimiento celular <sup> Ensayos 13, la migración celular 13, tumorsphere formación 14, y RT-PCR 15. Los medios de comunicación de base original usada para generar los medios de órgano-acondicionado (es decir, no condicionado DMEM:. Medio F12 suplementado con 1x concentró suplemento mitógeno y penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml) se debe utilizar como un control negativo .
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Representative Results
Generación de Medios de órganos acondicionado
Un diagrama general / esquemático del proceso de aislamiento de órganos y generación de medios acondicionados se presenta en la Figura 1, con las imágenes fotográficas representativas del procedimiento que se muestra en la Figura 2. Debe tenerse en cuenta que cuando este protocolo era primera fase de desarrollo, se incluyó hígado en nuestro análisis, ya que es un sitio común de metástasis del cáncer de mama. Sin embargo, debido a la gran cantidad de proteasas producidas y secretadas por el hígado, es muy difícil mantener el hígado viable el tiempo suficiente para generar medios de buena calidad condicionadas. medios de hígado acondicionado también no es estable una vez aislado, y no tiende a ser una gran cantidad de precipitado de proteína, probablemente por la misma razón. Por lo tanto, el hígado no se incluyó en ningún análisis adicional.
(Figura 3A) y BMSCs demostrando un aspecto más pequeño (Figura 3C). Análisis de citometría de flujo confirma que LNSCs son en gran parte CD45 - y GP38 +, con ~ 60% de células que poseen un CD45 - GP38 + fenotipo indicativo de LNSCs 16 (Figura 3B). Las BMSCs deben ser positivas para CD44 y CD29, débilmente positiva para CD105 y Sca-1, y negativas para CD73 (Figura 3D - H), indicativo de BMSCs 17,18.
La célula del cáncer de pecho RespOnse a patrones de migración y cambios de expresión génica de órganos apropiados
El uso de este sistema de modelo ex vivo, se ha demostrado previamente que las células de cáncer de mama humanas con diferentes antecedentes genéticos migración diferencial de exposiciones y patrones de crecimiento hacia condiciones órgano específico. En particular, estos patrones reflejan los patrones conocidos diseminación metastásica de estas líneas celulares in vivo 13. En el estudio actual, los huesos (231-BOM) - y pulmón (231-LM2) -favorecer variantes de las variantes de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (una especie de regalo del Dr. Joan Massagué 11,12) también han sido se utiliza en un ensayo de migración transwell para confirmar los patrones de migración de órganos apropiados. Los resultados demuestran que la variante 231-BOM hueso de búsqueda de migra preferentemente a los medios de comunicación ósea acondicionado hueso sobre encefálico y Lung-medio acondicionado (Figura 4A, izquierda). similar, La variante 231-LM2 de pulmón de búsqueda migra preferentemente a los medios de pulmón acondicionado más de los medios de médula ósea acondicionado y medios de comunicación cerebro-acondicionado (Figura 4A, derecha). Además, el análisis RT-qPCR demuestra que la exposición de-231 MDA-MB células de cáncer de mama de los padres para óseo o medios de pulmón acondicionado provoca una regulación positiva de genes asociados con la metástasis específica del hueso (CXCR4, IL-11, TGFß1) o Lung- metástasis específica (VCAM1) de las células de cáncer de mama in vivo 11,12 (Figura 4B). Estos resultados demuestran la validez del sistema ex vivo con respecto a la tropismo órgano esperado de células de cáncer de mama in vivo, e indica que los factores solubles presentes en los medios de órganos acondicionado pueden influir en el fenotipo celular metastásico además de promover la migración.
Medios de órganos acondicionado Contiene potenciales mediadores solubles de comportamiento metastásico
Una matriz de anticuerpo de ratón basada en la marca de biotina se utilizó para evaluar la presencia y la identidad de factores solubles comunes en los medios de órganos acondicionado a partir de diferentes órganos. Esta matriz incluye anticuerpos contra 308 de la proteins.This ratón solubles array proteína más común ha sido previamente utilizado para identificar factores solubles de interés asociada con la cascada metastásica presente dentro de los medios de comunicación de médula acondicionado de pulmón y de hueso como se muestra en Chu et al (2014) y Pio et al (2015), respectivamente 13,14. En el estudio actual, se muestran los resultados de la matriz de proteínas para los medios basales (Figura 5A) en comparación con la linfa node- (Figura 5B) y los medios de comunicación cerebro-acondicionado (Figura 5C). Destacado al lado de cada matriz son factores solubles presentes en los medios de comunicación que se han encontrado para ser asociado con pasos en la cascada metastásica en la literatura 19-29. Estos fac solublesres pueden valer la pena investigar como mediadores potenciales de metástasis secundarias dentro de estos sitios de órganos.
Figura 1. Esquema general del proceso de aislamiento de órganos y Generación de medio condicionado. Tejidos (pulmones, cerebro, fémur, tibia y ganglios linfáticos) se han cosechado en el ratón. Pulmones, ganglios linfáticos del cerebro y se trituran con un bisturí. La médula ósea se extrae de la cavidad medular de los huesos empujando PBS a través de la cavidad con una aguja 27½ G. fragmentos de pulmón y el tejido cerebral se incuban durante un período de 24 horas antes de diluir con tres volúmenes equivalentes de medios basales frescas y recogidos para hacer medios Lung-y acondicionado de cerebro. La médula ósea y las células del estroma de nodo de linfa se hacen pasar 2 - 3 veces antes de la incubación con medio basal para que los medios de comunicación con ganglios acondicionado huesos y los ganglios. los medios de comunicación pueden ser cosechadas pooled y almacenados a -80 ° C hasta que esté listo para su uso en ensayos posteriores, como arrays de proteínas, ensayos de crecimiento celular, ensayos de migración celular, la formación de tumorsphere y RT-PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes fotográficas representativo del procedimiento para el aislamiento de órganos y Generación de medio condicionado. En el día 0, los pulmones, el cerebro, el fémur, la tibia y los ganglios linfáticos se recogen desde el ratón. Los nodos pulmones, el cerebro y los ganglios se colocan en una placa de Petri de vidrio de 60 mm 2 y picado con dos hojas de bisturí a aproximadamente 1 mm 3 en tamaño. La médula ósea se extrae de la cavidad medular de los huesos empujando PBS a través de la cavidad con una aguja 27 G ½ en un tubo frescode PBS. Los fragmentos de tejido de pulmón y cerebro se incuban durante un período de 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2 antes de diluir con tres volúmenes equivalentes de medio fresco y se recogieron para hacer medios Lung-y acondicionado de cerebro después de 24 hr. Las células de la médula ósea y del estroma ganglio linfático se incuban a 37 ° C y 5% de CO2 y se pasaron 2 - 3 veces (~ 3 semanas en total) antes de sustituir los medios de comunicación con el medio basal libre de suero para la producción de hueso y la linfa medios nodo acondicionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Caracterización de las células del nodo linfático y médula estromales aisladas. Imagen de microscopía de campo brillante que muestra la morfología de las células de los ganglios linfáticos del estroma (LNSCs) (A). (B) El flujo de Representanteel análisis de citometría de LNSCs utilizando un ficoeritrina (PE) conjugado con anticuerpo GP38 y un isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpo CD45. imagen de microscopía de campo brillante que muestra la morfología de las células estromales de la médula ósea (BMSC) (C). (DH) de flujo Representante análisis de BMSCs utilizando (perfiles negros) PE conjugados anticuerpos contra citometría de (D) CD44, (E) CD106, (F) Sca-1, los anticuerpos CD73 (G) CD29, (H) con respecto al control de isotipo (perfiles en blanco). Un mínimo de 10.000 eventos viables se recogieron por muestra. Esta cifra ha sido modificado a partir de 13 años. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Ogan-apropiada patrones de migración y los cambios de expresión génica en respuesta a los medios de comunicación acondicionado de órganos. (A) por el hueso 231-BOM variantes (izquierda, barras rayadas) o variantes de pulmón de búsqueda de 231-LM2 (derecha, barras rayadas) de la 231-MDA-MB línea celular de cáncer de mama humano, así como padres MDA-MB- 231 (ambos paneles, barras sólidas) se sembraron en insertos recubiertos de gelatina (con 8 micras poros) antes de la colocación en medio basal (DMEM: F12 + suplemento concentrado mitógeno) o de órgano-CM. Las placas se incubaron a 37 ° C y 5% de CO2 durante 18 horas. (B) de la población entera de los padres células MDA-MB-231 fueron expuestas a óseo-CM (izquierda) o pulmonar-CM (derecha) durante 48 h. Se aisló el ARN y se cuantifica mediante RT-qPCR. Los cambios de expresión génica en respuesta al órgano-CM (barras negras) se normalizaron a GAPDH y expresaron en relación a la expresión basal en medio basal (barras grises). Los datos se presentan como media ± SEM (N = 3; del respectivo control negativo de medios basales)-veces el cambio. * = Significativamente diferente de medios basales; δ = significativamente diferente de la línea celular parental tratados con las mismas condiciones de los medios de comunicación; P <0,05, ANOVA. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Acondicionado órgano Figura 5. Medios Contiene potenciales mediadores solubles de comportamiento metastásico. Se utilizó una matriz de anticuerpos de ratón basado en la marca de biotina para identificar factores solubles presentes en los ganglios linfáticos y el cerebro-CM-CM. Las membranas se incubaron con muestras de biotina (A) medio basal (DMEM: F12 + suplemento concentrado mitógeno), (B) de los ganglios linfáticos-CM o (C) cerebro-CM a 4 ° CO / N y visualizaron utilizando chemiluminescence. Óvalos azules indican los controles positivos internos, cajas forradas indican controles negativos internos y cuadros sólidos indican los factores solubles de interés que están potencialmente implicados en el comportamiento metastásico de células de cáncer de mama a los ganglios linfáticos o el cerebro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La metástasis es un proceso complejo por el cual una serie de eventos celulares que son en última instancia responsable de la invasión de tejidos y tumores distantes establecimiento 4,30,31. El sistema modelo ex vivo que aquí se presenta puede ser utilizado para estudiar dos aspectos importantes de la progresión metastásica: vivienda de células de cáncer o de migración a un órgano específico ( "llegar allí") y el crecimiento en dicho órgano ( "creciendo allí"). Muchos estudios se han centrado previamente en la identificación de características moleculares clave asociados con las células de cáncer de sí mismos que contribuyen al proceso de metástasis. Por ejemplo, el trabajo realizado por el grupo de Joan Massagué ha identificado firmas de genes asociados con distintas-pulmonar específica, específica del hueso, y los patrones del cerebro específica de propagación 10-12,32. Si bien este trabajo proporciona información importante con respecto a la contribución de las células cancerosas a este proceso, y mucho menos se sabe sobre el papel de los factores específicos de órganos aportado por tque microambiente secundaria, que se ha mantenido relativamente difícil de estudiar 13.
Este sistema de modelo ex vivo ha sido previamente validado como una representación exacta del microambiente órgano secundario mediante la demostración de que las células del cáncer de mama migración de línea específico y el crecimiento en el órgano-CM refleja estas líneas de células 'en el patrón vivo de diseminación metastásica. Un estudio realizado por Chu y sus colegas utilizaron cuatro líneas celulares de cáncer de mama humano diferentes con diferentes potencial metastásico in vivo, incluyendo MDA-MB-231 y SUM-159 (altamente metastásico, metástasis a los ganglios linfáticos, pulmón, hígado, hueso y el cerebro in vivo ) y la migración SUM-149 y MDA-MB-468 (moderadamente metastática, metástasis a los ganglios linfáticos y el pulmón in vivo) en. Tanto las SUM-159 líneas celulares MDA-MB-231 y se muestran mejorado hacia marrow- ósea, la linfa node- y pulmón-CM mientras que las líneas de células SUM-149 y MDA-MB-468 preferentemente migran hacia pulmón-CM 13. El estudio actual demuestra que óseo y de pulmón de búsqueda de MDA-MB-231 variantes de ambos prefieren migrar a marrow- hueso y pulmón-CM, respectivamente, y que la exposición al órgano-CM puede promover la expresión de genes óseo y metastásicos pulmonares asociadas previamente identificados por Massagué y sus colegas 11,12. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que órgano-CM proporciona una ex vivo plataforma representativa de factores solubles específicas de órgano que se encuentran in vivo que influyen en el fenotipo y el comportamiento de las células de cáncer de mama.
Identificación de factores solubles presentes dentro de los órganos específicos y sus niveles relativos de expresión proporciona un punto de partida para determinar su potencial influencia en el comportamiento de células de cáncer. Además, usando técnicas tales como immunodepletion pueden permitir que el usuario agota eficazmente una proteína de interés a partir de órgano-CM para determinar su efecto sobre el comportamiento celular in vitro. Por ejemplo, Muchos factores solubles presentes dentro de microambientes de órganos específicos funcionar como quimioatrayentes y tienen el potencial para inducir la migración celular y la proliferación. El trabajo previo realizado utilizando pulmonar-CM ha llevado a la identificación de muchos factores solubles presentes en el pulmón-CM que pueden actuar como factores quimiotácticos para las células del cáncer de mama, incluyendo la osteopontina (OPN) y L-selectina (vender) 13. Por immunodepleting estos factores de pulmón-CM, Chu y sus colegas fueron capaces de demostrar la reducción de la migración celular y / o el crecimiento de altamente metastásicas MDA-MB-231 células de cáncer de mama 13. Estos resultados muestran que los medios condicionados generan a partir de órganos enteros proporciona un recurso valioso para el estudio de los efectos de factores solubles específicos en el comportamiento de células de cáncer, a través del uso de técnicas tradicionales in vitro.
Aunque este es un sistema modelo bastante sencillo, hay algunos pasos en el protocolo experimental que son críticos para successful generación de medios de órganos acondicionado. En primer lugar, el uso de ratones entre las edades de 6-12 semanas definidos para la recolección de los órganos es importante con el fin de controlar los efectos relacionados con la edad, ya sea relacionada con el desarrollo (antes de 6 semanas) o relacionadas con el envejecimiento en ratones más viejos. En segundo lugar, la esterilidad es de suma importancia en todo el protocolo y puede garantizarse mejor mediante el uso de la rigurosa técnica aséptica y el trabajo en una campana de cultivo de tejidos estériles, utilizando consumibles esterilizados de tejido de cultivo y reactivos, así como antibióticos leves en todos los medios de cultivo y suplementos ( es decir., penicilina / estreptomicina). Uno de los retos con el uso in vivo o ex vivo sistemas modelo es la inherente variabilidad de animal a animal. Si esto observó, pasos para solucionar problemas figuran la centralización de los medios condicionados obtenidos de varios lotes de ratones antes de su uso en experimentos posteriores, así como velar por que medios Lung-acondicionado y el cerebro son precisión normalizado para el peso en cada uno meDia colección experimento de resuspensión en una relación 4: 1 los medios de comunicación: relación de tejido (volumen / peso). Además, las células del estroma de los ganglios linfáticos y de médula ósea primaria no se debe permitir que superar el 70% de confluencia en cualquier pasaje dado o ser crecido más allá de 5 pasajes en total, de lo contrario terminal diferenciar.
Las modificaciones al protocolo presentado en este artículo podrían prever para permitir la aplicación de diferentes campos de la investigación. Aunque este modelo hasta ahora se ha utilizado exclusivamente para la investigación del cáncer de mama, que potencialmente puede ser utilizado para estudiar el papel de los factores solubles de órganos derivados de otros tipos de cáncer, así como los estados fisiológicos y enfermedades normales adicionales. Además, aunque este método se ha utilizado aquí con modelos de ratones desnudos inmunocomprometidos, esta técnica se teóricamente no se limita a esta especie de ratones e incluso podría ser utilizado con otros tipos de modelos animales.
Si bien este modelo ofrece importavisión nt en cuanto a la contribución de los factores solubles específicos de órganos derivados en el comportamiento de células de cáncer, no es sin sus limitaciones. En primer lugar este modelo se centra exclusivamente en el componente soluble de microambientes de órganos, que deja de lado la importancia de la matriz extracelular (ECM). La ECM es el componente no celular presente dentro de todos los tipos y funciones de los tejidos para proporcionar tanto un andamio física para las células, así como la capacidad de inducir señales bioquímicas y biomecánicas cruciales necesaria para los diversos procesos celulares, incluyendo la morfogénesis, la diferenciación celular y la homeostasis 33 -35. Es importante destacar que la composición física y bioquímica de la MEC es ampliamente heterogéneo y puede variar mucho entre los tipos de tejidos. Por lo tanto, la composición específica de tejido de la ECM también puede tener una influencia en el tropismo de órganos durante la metástasis del cáncer que puede ser pasado por alto con este modelo. El ECM también puede actuar para concentrar factores solubles específicas de una manera que appropriately los presenta a ciertas células, y sin este ajuste fino de la MEC, la inducción de la señalización celular puede verse disminuida o alterada 36. Aunque el modelo mencionado en este documento carece de un componente de ECM apropiada, muchos estudios podrían fortalecerse mediante el uso de un enfoque de cortesía utilizando tanto el modelo se ha mencionado aquí, junto con un componente de ECM adecuado. Por ejemplo, disponibles comercialmente fibroblastos primarios de órganos que sintetizan ECM endógeno o componentes de ECM recombinantes podrían utilizarse además de generado órgano-CM para determinar el alcance completo de todo el microambiente de órganos en el comportamiento celular.
Es posible que el microambiente soluble generado a partir de órgano-CM puede no imitan adecuadamente lo que está presente fisiológicamente durante el proceso de metástasis. Cáncer de células de supervivencia, el crecimiento y la progresión son altamente dependiente de las interacciones cáncer de células anfitrionas-4,30,31. Generación de toda órgano-CM puede resultar en la presencia de factores solubles no expresa normalmente por los tipos de células que interactúan con las células cancerosas durante la progresión metastásica. Además, previamente se ha demostrado que la presencia de un tumor primario puede modular el microambiente de sitios metastásicos distantes, por lo tanto "cebado" de ellos para la metástasis 37. Dado que el protocolo actual utiliza órganos derivados de ratones portadores de tumores sanos, no, valdría la pena comparar los factores solubles derivados de los órganos de los ratones portadores de un tumor de mama primario.
Debido a la separación mecánica de órganos enteros durante la generación de varios órgano-CM, factores intracelulares pueden ser liberados en el medio circundante que normalmente no pueden encontrar fisiológicamente por las células cancerosas. Además, óseo y de ganglios linfáticos derivado de medio condicionado requiere el cultivo de células estromales aisladas a partir de estos órganos antes de su recogida. Los tipos de células presentes durante ex vivo cultuanillo puede no representar con precisión la amplitud de tipos celulares encontrados fisiológicamente por las células cancerosas. Mientras que las células del estroma principalmente secretan muchos factores asociados con varios microambientes de órganos, usando estos métodos no puede dar cuenta de la influencia de otros tipos de células presentes dentro de los tejidos y los órganos 38. Por último, incluimos un suplemento mitógeno en los medios de base utilizados para generar medios de órganos acondicionado, porque nos dimos cuenta de que este era necesaria para mantener la viabilidad tanto de los órganos cultivados (pulmonares y cerebrales) y la aislada BMSC y LNSC. Sin embargo, somos conscientes de la advertencia de que la presencia de este suplemento mitógeno podría haber estimulado los órganos para producir artificialmente factores solubles que no pueden hacer normalmente,
En resumen, muchos estudios han indicado que los microambientes de órganos específicos pueden influir profundamente en la biología de las células tumorales. A pesar de las limitaciones mencionadas, la ex modelo in vivo del sistema que aquí se presenta represents una técnica integral para el estudio de la influencia del microentorno soluble de muchos órganos sólidos sobre el comportamiento celular. En el laboratorio de los autores, este modelo de sistema ha sido y continúa para ser utilizado como un medio de estudio de muchos de los eventos celulares asociados con la metástasis, incluyendo la invasión, la migración, la proliferación, el comportamiento de tallo similares, y los cambios de expresión génica. Los datos obtenidos de estos estudios podrían a su vez informará a la potencial aplicación clínica de este modelo de sistema de células de cáncer de mama primarios aislados de tumores de pacientes con el fin de determinar su respuesta a diferentes microambientes que representan potenciales sitios de metástasis. Tomados en conjunto, se espera que una mayor comprensión de la interacción entre las células del microambiente del tumor y durante el proceso de tropismo orgánica con metástasis conducirá a una mejora del tratamiento del cáncer en el futuro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
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