Introduction
Brystkræft er den hyppigst diagnosticerede kræft hos kvinder og den anden hyppigste årsag til kræft-dødsfald 1. Brystkræft høje dødelighed skyldes primært svigt af konventionel behandling for at mindske og eliminere metastatisk sygdom; ca. 90% af kræftrelaterede dødsfald skyldes metastaser 2. Forståelse af de underliggende molekylære mekanismer i den metastatiske kaskade er altafgørende for udviklingen af terapeutiske effektive i både tidlige og sene brystkræft.
Tidligere forskning har hjulpet belyse flertrins karakter af brystkræft metastase og det antages, at resultatet af både cancer progression og metastase er i vid udstrækning afhængig interaktioner mellem cancerceller og værtsmiljøet 3. Kliniske observationer indikerer, at mange kræftformer vise orgel tropisme, dvs.., Tendensen til fortrinsvis metastaserer til specifikke organs.In den case af brystcancer, en patients sygdom typisk spreder eller metastaserer til 5 vigtigste steder, herunder knogle, lunger, lymfeknuder, lever og hjerne 4-6. Mange teorier er blevet udviklet for at forklare denne proces, men kun få har klaret testen af tid. Ewing teori om metastaser, foreslog i 1920'erne, hypotese thatthe distribution af metastaser var strengt på grund af mekaniske faktorer; hvorved tumorceller bæres hele kroppen ved normale definerede fysiologisk blod strømningsmønstre og simpelthen standse i den første kapillære leje de støder 7. I modsætning hertil Stephen Pagets 1889 "frø og jord" hypotese foreslog, at yderligere molekylære interaktioner var ansvarlige for overlevelse og vækst af metastaser, hvorved cancerceller ( "frø") kun kan etablere sig og proliferatein orgel mikromiljøer, der producerer passende molekylære faktorer ( "jord ") 8. Næsten et århundrede senere, Leonard Weiss undertog en meta-analyse af tidligere offentliggjorte Obduktionsdata og bekræftede Ewings forudsigelse om, at mange metastatiske tumorer detekteret ved obduktion blev fundet i de forventede forhold, som kunne forventes, hvis metastatisk orgel tropisme blev bestemt ved blod strømningsmønstre alene. Men i manyinstances der var, færre eller flere metastaser dannet på bestemte steder så ville forventes af Ewing foreslåede mekaniske faktorer 9. Disse konti og teorier tyder på, at specifikke orgel mikromiljøer spiller en kritisk rolle i formidling mønstre og efterfølgende vækst og overlevelse af mange kræftformer, herunder brystkræft.
Tidligere forskningsindsats har hovedsagelig fokuseret på tumor-celle afledte faktorer og deres bidrag til orglet tropisme observeret i brystkræft metastaser 10-12, dog lidt forskning har udforsket faktorer afledt af orgel mikromiljø, der kan give en gunstig niche for etableringaf brystkræft metastaser. Dette skyldes i høj grad de tekniske udfordringer ved at studere dele af orglet mikromiljø in vitro.
Den aktuelle artikel beskriver en omfattende ex vivo modelsystem til undersøgelse af indflydelsen af opløselige bestanddele af lymfeknude, knogle, lunge og hjerne på den metastatiske adfærd af humane brystcancerceller. Tidligere undersøgelser har valideret dette modelsystem ved at demonstrere, at forskellige brystcancercellelinier vise cellelinje specifik og organspecifik malign adfærd som reaktion på organ-konditionerede medier, der svarer til deres in vivo metastatiske potentiale 13. Denne model kan anvendes til at identificere og vurdere specifikke organ-afledte opløselige faktorer, der kan spille en rolle i den metastatiske adfærd bryst- og andre typer af cancerceller, herunder påvirkninger af væksten, migration, stængel-lignende opførsel, og genekspression, samt identificering afpotentielle nye terapeutiske mål for kræft. Dette er den første ex vivo-model, der kan bruges til at studere organspecifik metastatisk adfærd i detaljer og at vurdere betydningen af organ-afledte opløselige faktorer i drive processen af cancer metastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra det canadiske Rådet om Animal Care, under protokoller godkendt af Western University Animal Brug underudvalg.
1. Organ Isolation (Lung, Brain, Bone, lymfeknuder)
- Forbered fire sterile 50 ml koniske rør (en for hvert organ, der skal isoleres) indeholdende ca. 30 ml sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Pre-veje hvert rør PBS under anvendelse af en elektronisk vægt.
- Euthanize 6-12 uger gamle mus af CO 2 inhalation. Mus bør overlades i CO 2 kammer til ca. 1 - 2 ud min eller indtil musen stopper bevæger sig og trække vejret. Vellykket eutanasi kan yderligere bekræftes ved en manglende hjerteslag når kontrolleres manuelt med en finger. Undgå cervikal dislokation, da denne metode kan sprænges blodkar i halsen, der fører til vanskeligheder fjerne armhulen lymfeknuder.
Bemærk: Tidligere arbejde har specifikt anvendesraske kvindelige nøgne mus, Hsd: athymiske Nude- Foxn1 nu 13. - I en steril vævskultur hætte, anbringe musen på ryggen på en polystyren skumpude, sprede benene og bruge stifter til at holde dem på plads.
- Brug af steril pincet og saks, klippe den abdominale hud på midterlinjen på genitalia og skær opad mod mundingen. Træk forsigtigt tilbage den abdominale hud fra mavemusklerne og pin på plads på polystyrenskum pad.
- Find armhulen, brachialis, og lyskelymfeknuder lymfeknuder.
Bemærk: Lymfeknuder er normalt omgivet af fedtvæv. De inguinale lymfeknuder er de nemmeste at finde, da de findes overfladisk ved krydset af to blodkar på trukket tilbage abdominale hud. Axillære og brachialis lymfeknuder er placeret dybere i vævet og kræver blid manøvrering af væv.- Når du har placeret lymfeknuder, bruge saksen til forsigtigt og omhyggeligt skære lymfeknuder nejdes væk fra huden, fedt og fartøjer og fjerne dem fra musen. For at bekræfte korrekt dissektion, rulle tangen over fjernede væv. Hvis en hård klump foreligger, når rullende pincet over vævet, så en lymfeknude er sandsynligvis blevet fjernet.
- Placer fjernet lymfeknuder i iskold PBS.
- Brug af pincet og saks, åbne bughulen ved at skære gennem den frilagte bugvæggen i en opadgående bevægelse mod brystet. Skær forsigtigt gennem brystbenet, udsætter brysthulen.
- Find membranen under lungerne og skære membranen. Det bør trække i retning ribbenene grundet spændinger.
- Løft lungerne fra undersiden og skære det underliggende væv mod luftrøret. Dette tillader lungerne fjernes frit fra brysthulen. Fjern hjertet og lungerne en bloc og placeres i iskold PBS. Hjertet kan fjernes fra lungerne her eller lige før vejning i trin 2.
- Fjernstifter, holde musen på plads på polystyrenskum pad. Vend musen og skære huden i lænden hele vejen på tværs fra flanken at flankere.
- Ved hjælp af en steril stykke gaze til at holde torso af mus, skræl rygskindet af musen over benene og fødderne med musen.
- Ved hjælp af samme stykke gaze, holde underbenet på plads, omhyggeligt bryde ankelleddet af musen foden og skræl huden over samlingen proksimalt mod knæleddet.
- Med en saks, fjern tibia fri knæleddet og sted i iskold PBS.
- Gentag trin 1.11) til 1,12) med modsatte ben.
- Ved hjælp af pincet, holde lårbenet på plads, skåret væk omgivende muskelvæv ved hjælp af saks og fjerne lårbenet, hvilket placerer den i iskold PBS.
- Gentag trin 1.14) med modsatte ben.
- Ved hjælp af et nyt stykke gaze, holde hovedet af musen på plads. Brug pincet og saks, forsigtigt fjerne huden til at afsløre de sKull. Ved hjælp af saks, klippe omhyggeligt occipital kraniet fra øverst i midten i en lige og nedad linje at eksponere den bageste hjerne.
- Med pincet, scoop nedenunder hjernen mod forreste og fjerne hele hjernen. Placer hjernen i iskoldt PBS.
- Gentag 1.1) til 1,17) trin i mindst fire mus.
2. Organ Vejning
- Efter organtransplantation isolation, vejer hver PBS rør indeholdende lunge- og hjernevæv under anvendelse af en elektronisk vægt.
- Beregn vægten forskel ved subtrahere pre-isolation vægt (kun PBS) fra vægten af PBS rør + organer (lunge og hjerne).
- Bestem mængden af medier, der er nødvendige for at opblande vævsfragmenter fra den beregnede vægt forskel.
Bemærk: Lunge og hjernevæv er vægt normaliseret ved resuspension i en 4: 1 media: tissue-forhold (vol / vægt).
3. Frembringelse af lunge- og hjerne- konditionerede medier
- I en steril tproblem kultur hætte, invertere PBS rør indeholdende lunge eller hjerne tre gange for at fjerne resterende blod fra organer og aspirat PBS indeholdende blod. Gentag med frisk kold PBS indtil løsning synes klart uden tegn på blod.
- Placer lunger og hjerne i separate 60 mm 2 glas petriskåle. Anvendelse af to sterile skalpelblade, hakkekød lunger eller hjerne ved gentagne gange at skære frem og tilbage, indtil vævsfragmenter er omtrent ~ 1 mm3 i størrelse.
- Resuspender vævsfragmenter i passende volumen (bestemt tidligere i trin 2.3) i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM): F12 medium suppleret med 1x koncentreret mitogen supplement og penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml).
- Tilføj resuspenderede lunge eller hjerne vævsfragmenter til en brønd af en 6-brønds plade.
- Inkuber vævsfragmenter i medier i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Efter inkubation indsamle konditionerede medier for hvert væv og fDERLIGERE fortyndes ved at tilføje tre ligeværdige mængder af frisk medier i en 50 ml konisk rør.
- Der centrifugeres ved 1.000 xg i fortyndet konditionerede medier for hvert organ ved 4 ° C i 15 minutter til fjernelse af store vævsrester. Saml medier supernatant og filtreres gennem et 0,22 um sprøjte filter.
- Pool konditionerede medier fra hvert organ (dvs.., Lunge med lunge og hjerne med hjernen) fra flere mus for at tage højde for muse-til-mus variabilitet. Alikvot og opbevares konditionerede medier ved -80 ° C indtil anvendelse.
4. generation af knoglemarv-condition Media
- I en steril vævskultur hætte, trim overskydende væv fra knoglen og fjern epifyser (endestykker) fra knoglerne med en saks.
- Ved hjælp af en 27 ½ G nål, flush medullær kavitet af knogler ved at skubbe 1 ml PBS gennem midten af hver knogle. Dette vil give dig mulighed for at indsamle knoglemarv stromale celler (BMSC) i et frisk rør indeholdende PBS.
- Centrifuge på 1,000 xg i 5 min ved 4 ° C og vask BMSC to gange med PBS. Resuspender stromale knoglemarvsceller i 20 ml bone stromal cellevækst medier (DMEM: F12-medium suppleret med 1x koncentreret mitogen supplement, penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml) og 10% føtalt boven serum (FBS) ).
- Plade 10 ml resuspenderet stromale knoglemarvsceller i en T75 kolbe.
Bemærk: Kombiner og plade celler fra hver 2 mus i hver T75 kolbe; for fire mus, er to T75 kolber nødvendigt (ca. 1 x 10 7 celler / kolbe). - Inkuber stromale knoglemarvsceller i knogle stromale cellevækstmedier i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Efter inkubation fjernes medier fra både T75 kolber og sat i nye T75 kolbe denne kolbe som "Floater Flask" mærke. Tilføj frisk knogle stromal celle vækstmedier til tidligere 2 kolber og inkuberes alle 3 kolber ved 37 ° C og 5% CO2.
- Efter cellerne når ca. 70% sammenflydning (ca. 5-7dage) passage celler. For at gøre dette, fjerne medium og vask cellerne to gange med PBS (3 ml hver vask). Fjern PBS og tilsættes 3 ml trypsin / EDTA-opløsning, der sikrer, at trypsin dækker hele overfladen af kolben. Efter cellerne løft kolben (~ 2 - 3 i min) standse trypsinisering reaktionen ved tilsætning af 3 ml bone stromal celle vækstmedium). Centrifuger 900 xg i 5 minutter ved 4 ° C, kasseres medier og resuspender cellerne i 10 ml frisk knogle stromacellelinje vækstmedier.
- Pool-celler fra alle kolber og passage 1: 5 i tre nye T75 kolber og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2. Efter cellerne igen når 70%, skal du gentage trin 4.6 og pool og passage alt vedhængende celler en anden gang. Re-plade alle celler til fire T75 kolber og inkuberes 37 ° C og 5% CO2. Knoglevækst stromacelle medier bør anvendes til alle trin.
- Tillad celler til at nå konfluens vaskes cellerne tre gange med PBS og tilsæt knogle stromal celleudtagningsmetoden medier (DMEM: F12 media + 1x koncentreret mitogen supplement + penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml); 10 ml / T75), og sørg for, at dette medie er fri for FBS. Saml knoglemarv aircondition medier 72 timer senere, filtreres gennem et 0,22 um filter, pool, portion, og opbevares ved -80 ° C indtil brug.
- Om ønsket bekræfte fænotypen af de isolerede knoglemarv stromale celler (BMSC) under anvendelse af antistoffer mod muse Sca-1, CD105, CD29, og CD73, CD44, ved anvendelse af standard flowcytometri teknikker som tidligere 13 beskrevet.
5. generation af lymfeknuder aircondition Media
- I en steril vævskultur hætte, vendes PBS rør indeholdende lymfeknuder tre gange for at fjerne overskydende blod fra lymfeknuder og aspirat blodige PBS. Gentag med frisk kold PBS indtil løsning synes klart uden tegn på blod.
- Placer lymfeknuder i 60 mm2 glas petriskåle. Brug to sterile skalpelblade, hakkekød lymfeknuder ved gentagne gange at skære frem og tilbage, indtil tissue fragmenter er ca. 1 mm 3 i størrelse.
- I et konisk rør, resuspender vævsfragmenter i 10 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) medium suppleret med penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml), 5 x 10 -5 M steril β-mercaptoethanol ( 1,75 pl / 500 ml medium) og 10% FBS.
- Centrifuger ved 900 xg i 5 min ved 4 ° C og resuspenderes alle celler i 30 ml medium. Der tilsættes 5 ml medium / brønd i en 6-brønds plade og inkuberes i 7 dage ved 37 ° C og 5% CO2.
- Efter de 7 dages inkubation, kasseres medier, vaske vedhængende celler med 5 ml varm PBS, og der tilsættes 5 ml frisk medium til hver brønd. Tillad celler til at vokse til konfluens (ca. 5 - 7 dage), Trypsinisér, pool alle celler, og passage som beskrevet i trin 4.6. Re-plade-celler til 6-brønds plade. Gentag dette trin tre gange.
- Efter tre passager, tillader cellerne at vokse til konfluens vaskes brøndene tre gange med PBS, og der tilsættes 2 ml / brønd DMEM: F12 + 1xkoncentreret mitogen supplement og penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml), der sikrer, at dette medie er fri for FBS. Saml lymfeknude-condition medier efter 72 timer, pool, portion, og opbevares ved -80 ° C indtil brug.
- Om ønsket bekræfte fænotypen af de isolerede lymfeknude stromale celler (LNSC) under anvendelse af antistoffer mod muse CD45 og gp38, ved anvendelse af standard flowcytometri teknikker som tidligere 13 beskrevet.
6. Brug af Organ-conditioned Media for Downstream Analyser Relateret til metastatisk Behavior af kræftceller
- Når orgel-condition medier er blevet genereret som beskrevet i trin 1 - 5, bruge den til at udføre forskellige nedstrøms celle og molekylærbiologiske analyser for at bestemme indflydelsen af opløselige orgel-afledte faktorer på den metastatiske adfærd af kræftceller. Eksempler på standard assays (beskrevet andetsteds i litteraturen) indbefatter proteinarrays 13, cellulære vækstassays <sup> 13, cellulære migration assays 13, tumorsphere formationen 14, og RT-PCR 15. De oprindelige basismedium anvendt til at generere orgel-konditionerede medier (dvs. ubetinget DMEM:. F12 medium suppleret med 1x koncentreret mitogen supplement og penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml) bør anvendes som en negativ kontrol .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generation af Organ-condition Media
En oversigt diagram / skematisk afbildning af processen for orgel isolation og generering af konditionerede medier er vist i figur 1, med de repræsentative fotografiske billeder af den i figur 2. Det skal bemærkes, at når denne protokol var først under udvikling, blev leveren inkluderet i vores analyse, fordi det er en fælles lokalitet af brystkræft metastase. Men på grund af den store mængde af proteaser produceres og udskilles af leveren, er det meget vanskeligt at holde leveren levedygtige længe nok til at generere gode kvalitet konditionerede medier. Lever-konditionerede medier er heller ikke stabile, når isolerede, og der har tendens til at være en masse af protein bundfald, sandsynligvis af samme grund. lever blev derfor ikke medtaget i nogen yderligere analyse.
(figur 3A) og BMSCs demonstrerer en mindre udseende (figur 3C). Flowcytometrisk analyse bekræfter, at LNSCs er stort set CD45 - og gp38 +, med ~ 60% af celler med en CD45 - gp38 + fænotype indikerer LNSCs 16 (figur 3B). De BMSCs bør være positiv for CD44 og CD29, svagt positive for CD105 og Sca-1, og negativ for CD73 (figur 3D - H), der indikerer BMSCs 17,18.
Breast Cancer Cell Response til Organ-passende migrationsmønstre og genekspression Ændringer
Brug af denne ex vivo modelsystem, er det tidligere blevet vist, at humane brystcancerceller med varierende genetiske baggrunde udviser differentieret migration og vækstmønstre til specifikke organsystemer forhold. Især disse mønstre afspejler de kendte metastatiske formidling mønstre af disse cellelinier in vivo 13. I den aktuelle undersøgelse, knogle (231-BOM) - og lunge (231-LM2) -søger varianter af MDA-MB-231 humane bryst- cancercellelinier varianter (en venlig gave fra Dr. Joan Massagué 11,12) har også været anvendes i et transwell migration assay for at bekræfte orgel-passende migrationsmønstre. Resultaterne viser, at knoglen-søger 231-BoM variant fortrinsvis migrerer til knoglemarven-konditionerede medier i hjerne- og lunge- konditionerede medier (figur 4A, venstre). Tilsvarende, Lunge-søger 231-LM2 variant fortrinsvis migrerer til lunge-condition medier end knoglemarv med aircondition medier og hjerne-condition medier (figur 4A, højre). Endvidere RT-qPCR analyse viser, at eksponering af parentale MDA-MB-231 brystcancerceller til knogle- eller lunge-konditionerede medier forårsager en opregulering af gener associeret med knogle-specifik metastase (CXCR4, IL-11, TGFß1) eller lunge- specifik metastase (VCAM1) af brystcancerceller in vivo 11,12 (figur 4B). Disse resultater viser gyldigheden af ex vivo-system med hensyn til den forventede organ tropisme af brystkræft celler in vivo, og indikerer, at opløselige faktorer til stede i organers aircondition medier kan påvirke metastatisk celle fænotype ud over at fremme migration.
Organ-condition Media Indeholder Potentielle opløselige mediatorer af metastatisk Behavior
En biotinmarkør-baserede museantistof matrix blev anvendt til at vurdere tilstedeværelsen og identiteten af fælles opløselige faktorer i orgel-konditionerede medier fra forskellige organer. Denne matrix indeholder antistoffer mod 308 af de mest almindelige opløselige muse proteins.This Proteinarray er tidligere blevet anvendt til at identificere opløselige faktorer af interesse i forbindelse med den metastatiske kaskade stede i lungen og knoglemarv konditionerede medier som vist i Chu et al (2014) og Pio et al (2015) henholdsvis 13,14. I den aktuelle undersøgelse, er Proteinarray resultater vist for basal media (figur 5A) sammenlignet med lymfeknuder lymfeknude (figur 5B) og hjerne-konditionerede medier (figur 5C). Fremhævet ved siden af hvert array er opløselige faktorer til stede i medierne, der er blevet fundet at være forbundet med trin i den metastatiske kaskade i litteraturen 19-29. Disse opløselige factorer kan være værd at undersøge som potentielle mediatorer af sekundære metastaser inden for disse orgel sites.
Figur 1. Oversigt Skematisk af fremgangsmåden ifølge Organ Isolering og Generering af konditioneret medium. Væv (lunger, hjerne, lårben, skinneben og lymfeknuder) høstes fra mus. Lunger, er hjerne og lymfeknuder hakket med en skalpel. Knoglemarv høstes fra medullære kavitet af knoglerne ved at skubbe PBS gennem hulrummet med en 27½ G nål. Lunge og hjerne væv fragmenter inkuberes i en periode på 24 timer, før fortynding med tre ligeværdige mængder af friske basale medier og opsamlet at gøre lunge- og hjerne-condition medier. Knoglemarv og lymfeknuder node stromaceller passeres 2 - 3 gange før inkubering med basale medier at gøre knogle- og lymfeknude-konditionerede medier. Høstede medier kan være pooled og opbevaret ved -80 ° C indtil den er klar til brug i efterfølgende assays, såsom protein arrays, cellulære vækst assays, cellulære migration assays, tumorsphere dannelse og RT-PCR. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative Fotografiske billeder af proceduren for Organ Isolation og Generation af konditioneret Media. På dag 0, er lungerne, hjernen, lårben, skinneben og lymfeknuder indsamlet fra musen. De lunger, hjerne og lymfeknuder anbringes i en 60 mm2 glas petriskål og hakket med to skalpelblade til ca. 1 mm3 i størrelse. Knoglemarven er høstet fra medullære kavitet af knoglerne ved at skubbe PBS gennem hulrummet med en 27 ½ G nål ind i et frisk rørPBS. Lunge og hjerne vævsfragmenter inkuberes i et tidsrum på 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 før fortynding med tre ækvivalente mængder af frisk medium og opsamlet for at gøre lunge- og hjerne-konditionerede medier efter 24 timer. Knoglemarven og lymfeknude stromale celler inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 og passeret 2 - 3 gange (~ 3 uger alt) før udskiftning medier med serum-fri basale medier til at gøre knogle og lymfeknude-konditionerede medier. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Karakterisering af isoleret lymfeknude og stromale knoglemarvsceller. (A) Bright-field mikroskopi billede, der viser morfologien af lymfeknude stromaceller (LNSCs). (B) repræsentant flowcytometri analyse af LNSCs bruger phycoerythrin (PE) -konjugeret gp38-antistof og et fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret CD45 antistof. (C) lysfeltmikroskopi billede, der viser morfologien af stromale knoglemarvsceller (BMSCs). (DH) repræsentant flow cytometri analyse af BMSCs anvendelse af PE konjugeret (sorte profiler) antistoffer mod (D) CD44, (E) CD106, (F) Sca-1, (G) CD29, (H) CD73-antistoffer i forhold til isotypekontrol (hvide profiler). Et minimum af 10.000 levedygtige hændelser blev indsamlet pr prøve. Dette tal er blevet ændret fra 13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Ellergan-passende migrationsmønstre og Gene Expression ændringer som reaktion på Organ-conditioned Medier. (A) Bone-søger 231-BoM varianter (venstre, skraverede søjler) eller lunge-søger 231-LM2-varianter (højre, skraverede søjler) af MDA-MB-231 human brystcancer cellelinje samt parental MDA-MB- 231-celler (begge paneler, faste søjler) blev udpladet på gelatineovertrukne inserter (med 8 um porer) før anbringelse i basale medier (DMEM: F12 + koncentreret mitogen supplement) eller organ-cM. Plader blev inkuberet ved 37 ° C og 5% CO2 i 18 timer. (B) hele befolkningen parentale MDA-MB-231 celler blev udsat for enten knogle-CM (venstre) eller lunge-CM (højre) i 48 timer. RNA blev isoleret og kvantificeret under anvendelse af RT-qPCR. Genekspression ændringer i respons på orgel-CM (sorte søjler) blev normaliseret til GAPDH og udtrykkes i forhold til baseline udtryk i basal medier (grå søjler). Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM (N = 3; fold-ændring fra respektive negativ kontrol af basal media). * = Væsentlig forskellig fra basal medier; δ = signifikant forskellig fra parentale cellelinje behandlet med mediet betingelser; P <0,05, ANOVA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Organ-conditioned Media Indeholder Potentielle opløselige mediatorer af metastatisk Behavior. En biotin label-baserede museantistof vifte blev anvendt til at identificere opløselige faktorer i lymfeknude-CM og hjerne-CM. Membraner blev inkuberet med biotinylerede prøver af (A) basal medium (DMEM: F12 + koncentreret mitogen supplement), (B) lymfeknude-CM eller (C) hjerne-CM ved 4 o CO / N og fremkaldes med chemiluminescence. Blå ovaler indikerer interne positive kontroller, foret felter angiver interne negative kontroller og faste felter angiver opløselige faktorer af interesse, der er potentielt involveret i metastatisk adfærd brystkræftceller til lymfeknuderne eller hjerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metastase er en kompleks proces, hvor en række cellulære begivenheder er i sidste ende ansvarlig for vævs- invasion og fjernt tumor etablering 4,30,31. Den ex vivo modelsystem præsenteres her kan bruges til at studere to vigtige aspekter af metastatisk progression: kræft celle målsøgende eller migrering til et specifikt organ ( "at komme der") og vækst i dette organ ( "vokser der"). Mange undersøgelser har tidligere fokuseret på at identificere vigtige molekylære egenskaber i tilknytning til de cancerceller selv, der bidrager til metastaser processen. For eksempel har arbejde Joan Massagué gruppe identificeret distinkte genprodukter signaturer knyttet til lunge-specifik, knogle-specifikke, og hjerne-specifikke mønstre af spredning 10-12,32. Mens dette arbejde giver en vigtig indsigt med hensyn til bidraget af cancerceller til denne proces, meget mindre vides om den rolle, organspecifikke faktorer bidrog af than sekundær mikromiljø, som har været forholdsvis udfordrende at studere 13.
Denne ex vivo modelsystem er tidligere blevet valideret som en nøjagtig gengivelse af det sekundære organ mikromiljø ved at påvise, brystcancer cellelinje-specifikke migration og vækst i orgel-CM spejle disse cellelinier "in vivo mønster af metastatisk spredning. En undersøgelse af Chu og kolleger brugte fire forskellige humane bryst- cancercellelinier med varierende metastatisk potentiale in vivo, herunder MDA-MB-231 og SUM-159 (stærkt metastatisk, metastaserer til lymfeknuderne, lunge, lever, knogler og hjerne in vivo ) og summen-149 og MDA-MB-468 (moderat metastatisk, metastaserer til lymfeknuder og lunge in vivo) i. Både MDA-MB-231 og SUM-159 cellelinjer de viste forøget migrering til knogle marrow-, lymfe lymfeknude og lunge-CM mens SUM-149 og MDA-MB-468-cellelinier fortrinsvis migreret mod lunge-CM 13. Den nuværende undersøgelse viser, at knogle- og lunge-søger MDA-MB-231-varianter både foretrækker at migrere til knogle marrow- og lunge-CM henholdsvis og at eksponering for orgel-CM kan fremme ekspressionen af knogle- og lunge-associeret metastatiske gener tidligere identificeret ved Massagué og kolleger 11,12. Taget sammen viser disse resultater, at organ-CM tilvejebringer en ex vivo platform repræsenterer organspecifikke opløselige faktorer fundet in vivo, der påvirker fænotypen og adfærd brystcancerceller.
Identifikation af opløselige faktorer til stede i specifikke organer og deres relative niveauer af ekspression giver et udgangspunkt for fastlæggelsen af deres potentielle indflydelse på kræft celle adfærd. Endvidere kan anvendelse af teknikker såsom immunodepletion tillader brugeren at effektivt nedbryder et protein af interesse fra orgel-CM for at bestemme dets virkning på in vitro cellulær adfærd. For eksempelMange opløselige faktorer til stede i specifikke organsystemer mikromiljøer fungere som kemoattraktanter og har potentialet til at inducere cellulær migration og proliferation. Tidligere arbejde gøres ved hjælp af lunge-CM har ført til identifikation af mange opløselige faktorer i lunge-CM, der kan virke som kemoattraktanter for brystkræftceller, herunder osteopontin (OPN) og L-selectin (Sælg) 13. Ved immunodepleting disse faktorer fra lunge-CM, Chu og kolleger var i stand til at demonstrere reduceret cellulær migration og / eller vækst af meget metastatiske MDA-MB-231 brystkræftceller 13. Disse resultater viser, at konditionerede medier genereret fra hele organer tilvejebringer en værdifuld kilde for undersøgelse af virkningerne af specifikke opløselige faktorer på cancercelle adfærd, ved anvendelse af traditionelle in vitro teknikker.
Selv om dette er en forholdsvis ligetil modelsystem, er der nogle trin i forsøgsprotokollen, der er kritiske for successful generation af organ-konditionerede medier. Først, brug af mus mellem de definerede alderen 6-12 uger til høst af organer er vigtigt for at kontrollere for aldersrelaterede virkninger, enten relateret til udvikling (før 6 uger) eller relateret til aldring i ældre mus. For det andet, sterilitet er af allerstørste betydning i hele protokollen og bedst kan sikres ved hjælp af streng aseptisk teknik og arbejde i en steril vævskultur hætte, hjælp steriliseret vævskultur forbrugsvarer og reagenser samt milde antibiotika i alle dyrkningsmedier og supplementer ( ie., penicillin / streptomycin). En af udfordringerne med anvendelse af in vivo eller ex vivo modelsystemer er den iboende fra dyr til dyr variabilitet. Hvis dette observeres, fejlfindingstrin omfatte fælles anvendelse af konditionerede medier opnået fra flere partier af mus før brug i efterfølgende eksperimenter, samt sikre, at lunge- og hjerne-condition medier er præcist vægtnormaliseret i hver migdia samling eksperiment ved resuspension i en 4: 1 media: tissue (volumen / vægt). Desuden bør de primære lymfeknude og stromale knoglemarvsceller ikke tillades at overstige 70% konfluens på ethvert givet passage eller være vokset ud over 5 af total passager, ellers vil de terminalt differentiere.
Ændringer af protokollen præsenteres i denne artikel kan forestillede at tillade anvendelse på forskellige forskningsområder. Selv om denne model har hidtil udelukkende været benyttet til forskning i brystkræft, kan det potentielt anvendes til at undersøge den rolle af organ-afledte opløselige faktorer i andre former for kræft samt yderligere normale fysiologiske og sygdomstilstande. Derudover, medens denne fremgangsmåde er blevet anvendt her med immunkompromitterede nøgne musemodeller, denne teknik er teoretisk ikke begrænset til denne art af mus og endda kunne potentielt anvendes med andre typer af dyremodeller.
Mens denne model giver important indsigt i bidraget fra specifikke orgel-afledte opløselige faktorer på kræft celle adfærd, er det ikke uden begrænsninger. Først denne model fokuserer udelukkende på den opløselige bestanddel af orgel mikromiljøer, der negligerer betydningen af den ekstracellulære matrix (ECM). ECM er den ikke-cellulære komponent til stede i alle vævstyper og funktioner til at afgive både fysisk stillads for celler, såvel som evnen til at inducere vigtige biokemiske og biomekaniske referencer, som kræves til forskellige cellulære processer, herunder morfogenese, cellulær differentiering og homeostase 33 -35. Vigtigt er det, den fysiske og biokemiske sammensætning af ECM er bredt heterogen og kan variere meget mellem væv typer. Derfor kan den vævsspecifikke sammensætningen af ECM også have indflydelse på orgel tropisme under cancermetastase, der kan blive overset med denne model. ECM kan også virke for at koncentrere specifikke opløselige faktorer på en måde, appropriately præsenterer dem til bestemte celler, og uden denne finjustering af ECM, kan induktion af cellulære signalering formindskes eller ændres 36. Selvom det i dette papir model mangler en passende ECM komponent, kunne mange undersøgelser styrkes ved hjælp af en gratis tilgang udnytter både den nævnes her sammen med en passende ECM komponent model. For eksempel kunne kommercielt tilgængelige primære orgel fibroblaster, der syntetiserer endogen ECM eller rekombinante ECM komponenter anvendes udover genereret organ-CM for at bestemme den fulde udstrækning af hele organet mikromiljø på cellulær adfærd.
Det er muligt, at det opløselige mikromiljø genereret fra orgel-CM ikke hensigtsmæssigt kan efterligne, hvad der er til stede fysiologisk under processen med metastase. Kræft celle overlevelse, vækst og progression er stærkt afhængig kræftcelle-vært interaktioner 4,30,31. Generering af helorgan-CM kan resultere i presence af opløselige faktorer normalt ikke udtrykkes af celletyper, der interagerer med kræftceller under metastatisk progression. Endvidere er det tidligere blevet vist, at tilstedeværelsen af en primær tumor kan modulere mikromiljøet af fjerne metastatiske steder, hvorved "priming" dem for metastase 37. Eftersom den nuværende protokol anvender organer stammer fra sunde, ikke tumor-bærende mus, ville det være værd at sammenligne de opløselige faktorer afledt af organer fra mus, der bærer en primær bryst tumor.
På grund af den mekaniske separation af hele organer under genereringen af forskellige organsystemer-CM, kan intracellulære faktorer frigives i det omgivende medium, som normalt ikke kan fysiologisk støder cancerceller. Derudover knogle- og lymfeknude-afledte konditionerede medier kræver dyrkning af stromale celler isoleret fra disse organer før deres samling. De celletyper stede under ex vivo culturing kan ikke præcist repræsentere bredden af cellulære typer fysiologisk støder kræftceller. Mens stromaceller hovedsagelig secernerer mange faktorer forbundet med forskellige organsystemer mikromiljøer, ved hjælp af disse metoder kan ikke højde for indflydelsen af andre celletyper til stede i væv og organer 38. Endelig har vi medtaget et mitogen supplement i basen medier, der anvendes til at generere orgel-konditionerede medier, fordi vi fandt, at dette var nødvendigt for at opretholde levedygtigheden af begge de dyrkede organer (lunge og hjerne) og det isolerede BMSC og LNSC. Men anerkender vi det forbehold, at tilstedeværelsen af denne mitogen supplement kunne have stimuleret organerne til kunstigt at producere opløselige faktorer, som de normalt ikke kan gøre,
Sammenfattende har mange undersøgelser vist, at specifikke orgel mikromiljøer dybt kan påvirke tumor cellebiologi. Trods de drøftede begrænsninger, ex vivo modelsystem præsenteres her represents en omfattende teknik til undersøgelse af indflydelsen af det opløselige mikromiljø mange faste organer på cellulær adfærd. I laboratoriet af forfatterne, har dette modelsystem været og fortsætter med at blive anvendt som et middel til at studere mange af de cellulære begivenheder forbundet med metastase, herunder invasion, migration, proliferation, stængel-lignende opførsel, og genekspression ændringer. Data opnået fra disse undersøgelser kunne til gengæld den potentielle kliniske anvendelse af dette modelsystem til primære brystkræftceller isoleret fra patientens tumorer, for at bestemme deres reaktion på forskellige mikromiljøer repræsenterer potentielle metastatiske sites. Tilsammen er det håbet, at en yderligere forståelse af samspillet mellem mikromiljø og tumorceller under processen med metastatisk orgel tropisme vil føre til forbedring af kræftbehandling i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
- Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278 (1928).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
- Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
- Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
- Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
- Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
- Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
- Zlotnik, A. Chemokines and cancer. Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).
- Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
- Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
- Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805 (2014).
- Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
- Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
- Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).
- Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
- Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).
