Summary
バッチモードでジエチルアミノ樹脂を使用して、 大腸菌中で過剰発現組換えヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質（HP-NAP）のワンステップ負精製が記載されているため、高い歩留まり方法。この方法によって精製されたHP-NAPはH.のためのワクチン、薬、または診断薬の開発のために有益ですピロリ菌は、病気を-関連しました。
Abstract
ヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質（HP-NAP）は、 ヘリコバクター・ピロリ （ ピロリ菌 ）の主要な病原性因子です。それは、Hで重要な役割を果たしていますピロリ菌は、好中球、単球、およびマスト細胞を含むいくつかの先天性白血球を活性化することによって、胃の炎症を誘発しました。 HP-NAPの免疫原性および免疫調節特性はH.のための潜在的な診断およびワクチン候補となりますピロリ菌および癌治療のための新薬候補。その臨床応用に使用される精製されたHP-NAPの実質的な量を得るために、高い収率及び純度で、このタンパク質を精製する効率的な方法を確立する必要があります。
このプロトコルでは、ジエチルアミノエチル（DEAE）イオン交換樹脂を使用して、 大腸菌 （E. coli）中で過剰発現組換えHP-NAPのワンステップネガティブクロマトグラフィー精製の ための方法を記載している（ 例えば 、セファデックス）をiがn個のバッチモード。組換えHP-NAPは、E中の全タンパク質の約70％を構成しています大腸菌とは、ほぼ完全にpHが9.0で、細胞溶解の際に可溶性画分に回収されます。 pH8.0の最適条件の下では、HP-NAPの大部分は、非結合画分に回収される一方、Eからの内因性タンパク質大腸菌を効率的に樹脂によって除去されます。
DEAEイオン交換樹脂を用いてネガティブモードバッチクロマトグラフィーを使用して、この精製方法は、Eからの機能HP-NAPを生じます高い収率および純度でその本来の形で大腸菌 。精製されたHP-NAPは、さらに予防、治療、およびHの予後のために利用することができますピロリ菌は、病気だけでなく、癌治療を-関連しました。
Introduction
ヘリコバクター・ピロリ （ ピロリ菌）は、胃炎や消化性潰瘍の主な原因です。この細菌はまた、1994年にそれはHの有病率と推定されている、世界保健機関の一部、国際がん研究機関により、ヒトでの発がん性物質として分類されていますpylori感染は発展途上国では70％と先進国1 30〜40％です。たとえH.の感染率ピロリ菌は 、先進国ではH.の感染率を減少しています発展途上国でのピロリ菌は依然として高い2です。 H.を根絶するための標準的な治療法pylori感染は、プロトンポンプ阻害薬、PPI、および2種の抗生物質、クラリスロマイシンプラスアモキシシリンまたはメトロニダゾール3の投与からなります。 H.における抗生物質耐性のが、上昇ピロリ関連の潰瘍の治療は、Oを防止するための新しい戦略の開発を促しますrの感染症を治します。 H.に対する予防および/ または治療的ワクチン接種の開発ピロリ菌は、H を制御するための別のアプローチを提供することができますピロリ感染。
ヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質（HP-NAP）、Hピロリ菌の主要な病原性因子は、最初のH.の水抽出物中で同定されました内皮細胞との反応性酸素種（ROS）4を生成するために付着する好中球を活性化する能力を有するピロリ菌 。 H.で見つかった胃粘膜の好中球の浸潤pylori-アクティブ胃炎に感染した患者は、胃の炎症および組織損傷をもたらす可能性があります。したがって、HP-NAPはさらに潰瘍またはH.を引き起こす胃の炎症を誘発するために、好中球を活性化することによって病理学的役割を果たし得ますピロリ菌は胃の病気を-関連しました。それにもかかわらず、HP-NAPは、臨床応用5,6のための潜在的な候補です。免疫原性および免疫調節プロへHP-NAPのpertiesは、このタンパク質は、ワクチン、治療薬、および診断ツールを開発するために使用することができます。臨床試験は、Hに対するタンパク質ワクチンのコンポーネントの1つとして、組換えHP-NAPを使用するために行われていますピロリ菌 。このワクチンは、水酸化アルミニウムとともに処方組換えHP-NAP、細胞毒素関連遺伝子A（CagAタンパク質）、および空胞化細胞毒A（のVacA）タンパク質で構成され、さらに安全かつ人間7において免疫原性であることが実証されています。また、HP-NAPは、Tヘルパー1型（Th1）をトリガするために、強力な免疫調節剤として作用する癌治療の8のための免疫応答を-polarizedダウンアレルギー反応や寄生虫感染9,10によって誘発されたTh2媒介性免疫応答を調節します。診断に関しては、組換えHP-NAPベースのELISAは、HでHP-NAPに対する血清抗体を検出するために適用されていますピロリ菌は、患者11に感染し。ある研究では、Hからの血清中のHP-NAP特異的抗体のレベルことを示しましたパラグアイロリは胃癌の患者は慢性胃炎12を有する患者からのものよりも有意に高かったに感染し。別の研究では、HP-NAPに対する血清抗体は、非噴門、胃腺癌13の存在と関連していることが示されました。従って、組換えHP-NAPベースのELISAは、Hで胃癌の予後のためのHP-NAPに対する血清抗体を検出するために適用することができますピロリ菌は、患者に感染し。まとめると、精製されたHP-NAPは、さらに予防、治療、およびHの予後のために利用することができますピロリ菌は、病気だけでなく、癌治療を-関連しました。
これまでに報告され、その天然の形態で（ 大腸菌 ） 大腸菌で発現された組換えHP-NAPの精製に使用されるいくつかの方法の中でも、ゲル濾過クロマトグラフィーを含む第二の精製工程は、高純度のHP-NAP 14-16を得るために必要とされます。ここでは、負モードバッチクロマトグラフィーを用いた方法ジエチルアミノエチル（DEAE）イオン交換樹脂は、Eで過剰発現HP-NAPの精製の ために記載されています高収率、高純度で大腸菌 。この精製技術は、宿主細胞のタンパク質および/または樹脂HP-NAP以外の不純物の結合に基づいていました。 pH8.0で、HP-NAPを除いてほとんどなく、他のタンパク質は、非結合画分から回収されます。ネガティブモードでDEAEイオン交換クロマトグラフィーを使用して、この精製アプローチは、非結合画分のコレクションを1段階クロマトグラフィーにより組換えHP-NAPの精製を可能にすることにより、簡単かつ時間の節約です。 図17に示すように 、免疫グロブリンG（IgG）18、ヘモグロビン19、タンパク質ホスファターゼ20、および毒性因子フラジェリン21ウイルスなどの、負にイオン交換クロマトグラフィーによって精製することが報告されているようなHP-NAP、いくつかの他の生体分子に加えてモード。不純物が軽微である場合、ネガティブモードでは、イオン交換クロマトグラフィーが好ましいです22を精製するために供される試料中に存在する成分。天然または組換え生体分子の精製における負のクロマトグラフィーの適用は、最近23を検討されています。
本レポートでは、 大腸菌における組換えHP-NAPの発現のためのステッププロトコルでステップを提供しますDEAEイオン交換樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーを用いて大腸菌細胞の溶解、およびHP-NAPの精製。精製のために、所望のタンパク質は、ネガティブモードでのイオン交換クロマトグラフィーに適している場合、記載されたプロトコルはまた、精製プロセスの開発のための出発点として適合させることができます。
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Protocol
ヒトの血液は、国立清華大学の治験審査委員会、新竹、台湾からの事前の書面によるインフォームドコンセント及び承認を得て、健康なボランティアから採取しました。
大腸菌における組換えHP-NAPの1式大腸菌
- H.からHP-NAPのDNA配列を含むプラスミドpET42a-NAPを準備ピロリ菌 26695株は、以前に16を説明しました。説明したように所望の点変異を有するHP-NAPのDNA配列を含むプラスミドを準備します（プロトコル、ステップ8を参照してください）。
- E.に上記DNAプラスミド10ngの変換42°C、50μg/ mlのカナマイシンを含有する寒天プレートストリークLB培地（LB）上の細胞を、で45秒間熱ショックにより大腸菌 BL21（DE3）コンピテント細胞および16時間、37℃でプレートをインキュベートします。
- 50μg/ mlのカナマイシンを含むLB培地の5ミリリットルを含む個々のチューブ内の単一のコロニーを接種し、3時前培養として、それらを育てます170 rpmで振とうしながら16時間7℃です。
- 1Lのフラスコ中で50μg/ mlのカナマイシンを含むLB培地200ml中に上記前培養細胞を2mlに接種。約0.4から0.5 / VIS分光光度計UVによって検出さに達した600nmの吸光度まで、170 rpmで振盪しながら37℃で2時間接種し培養フラスコをインキュベートします。
- HP-NAPの発現を誘導するために最終濃度0.4mMに上記培養物中に1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の80μLを加えます。約1.6から1.7に到達した600nmの吸光度まで3時間培養をインキュベートします。
- 遠心分離上清を除去するために15分間、4℃で6000×gで細胞。精製まで-70℃で細胞ペレットを保管してください。
HP-NAPを含有する可溶性タンパク質画分の調製
注：以下の手順は全て、4℃で行われます。
- 再懸濁細胞P 50mlのProtocolステップ1.6で調製さエレト20 20 mMトリス - 塩酸、pH9.0の、50mMのNaClを含有する0.13 mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、0.03 mMのN-αトシル-L-リジンクロロメチルケトン（TLCK）、および0.03 mlの4℃でmMのNトシル-L-フェニルアラニクロロメチルケトン（TPCK）以前16に記載されているように 。
- 4℃で7回15,000 psiの20,000の範囲で作動高圧ホモジナイザーを通して細菌懸濁液を通すことによって細菌細胞を破壊します。
- 遠心分離機は、1時間4℃で30,000×gで細胞溶解物を超遠心機を使用して、可溶性および不溶性タンパク質画分を分離します。ビーカーに可溶性タンパク質画分として上清を転送します。
- 製造業者の説明書に従って、標準としてウシ血清アルブミン（BSA）を用いて、市販のキットを用いてBradford法により、可溶性タンパク質画分のタンパク質濃度を測定します。
- 目の20ミリリットルに1 N HClを177.6μLを追加pH8.0にpHを9.0からそのpH値を調整するためにプロトコル工程2.3から得られた電子可溶性タンパク質画分。
- 最終タンパク質濃度が0.5 mg / mlとなるようにするために、上記タンパク質溶液に20mMのトリス-HCl、pH8.0の、50mMのNaClを加えます。
E.からの組換えHP-NAPの3精製DEAEイオン交換樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーによる大腸菌
- DEAE樹脂の15ミリリットルを準備します。
- DEAE樹脂0.6gの乾燥粉末を秤量し、少なくとも1日間、室温でmMのトリス-HCl、pH8.0の、50mMのNaCl 20 30ml中に懸濁します。
- 遠心分離万xにおける樹脂 1分間4℃でグラム。
- 上清を除去し、廃棄します。
- 20mMのトリス-HCl、pH8.0の、50mMのNaClを15mlを加えます。
- 繰り返し議定書は3.1.2より4 3.1.4回繰り返します。
- 15mlを、その後の使用のために4℃で樹脂（30中の50％スラリーmlのTris緩衝液）を決済格納します。
注：以下の手順のすべてをSは4℃で行われます。
- 追加プロトコルで調製した可溶性タンパク質を45 mlを2.6 mlの樹脂15のステップと1時間4℃でマグネチックスターラーを有するタンパク質/樹脂スラリーをかき混ぜます。
- 活栓を取り付けたプラスチックまたはガラスカラムにタンパク質/樹脂スラリーを注ぎます。樹脂は重力下で沈降することができます。
- カラム内の液面がちょうど樹脂を超えるまでタンパク質溶液を重力流によってカラムを介して実行できるようにコックを開きます。精製されたHP-NAPが含まれている非結合画分として、フロースルーを収集します。
- カラムに氷冷20mMのトリス-HCl、pH8.0の、50mMのNaClを15mlを加えます。
- カラム内の液面がちょうど樹脂を超えるまで、洗浄緩衝液は、重力流によってカラムを介して実行できるようにコックを開きます。洗浄画分としてフロースルーを収集します。
- 繰り返しプロトコルが追加の洗浄画分を収集するために、3.5以上の4〜3.6倍を繰り返します。
- カラムに氷冷20mMのトリス-HCl、pH8.0の、1 MのNaClを15mlを加えます。
- カラム内の液面がちょうど樹脂を超えるまで、溶出緩衝液は、重力流によってカラムを介して実行できるようにコックを開きます。溶出画分としてフロースルーを収集します。
- 繰り返しプロトコルが追加の溶出画分を収集するために、3.8以上の4〜3.9倍を繰り返します。
4.バッファー交換およびDEAE樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーで精製HP-NAPのエンドトキシン除去
注：精製されたHP-NAPは、Eで表現大腸菌は、好中球を刺激する前に交換し、エンドトキシン除去をバッファに供される必要があります。
- 以前24に記載のように14キロダルトンの分子量カットオフを有する透析チューブを用いて、4℃で、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）、pH7.2に精製されたHP-NAPのバッファを変更するために透析を行います。
- syringを通して透析HP-NAPをフィルタリングエンドトキシンを除去するために、4℃で2.5から4ミリリットル/分までの流量で20ミリリットル使い捨て注射器に取り付けられた、正に帯電し、親水性膜付きの電子フィルター。
ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、ウェスタンブロッティング、ネイティブ-PAGE、ゲルろ過クロマトグラフィー、および円偏光二色性分光法による精製された組換えHP-NAPの分子特性の5キャラクタリゼーション
- マウスモノクローナル抗体モノクローナル抗体16F4 25を含むハイブリドーマ培養上清とともにSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによって精製された組換えHP-NAPを分析し、先24が記載されています。
- 以前26に記載されているように 、そのオリゴマーの状態を調べるためにネイティブPAGEおよびゲル濾過クロマトグラフィーHP-NAPを分析します。
- 以前に26を説明したように、その二次構造を調べるために、円偏光二色性分光法によって精製された組換えHP-NAPを分析します。
SDS-PAGEゲルの銀染色により、HP-NAPの純度の6評価
- 銀染色キットを製造業者の指示に従って溶液、銀溶液、現像液、液を停止し、洗浄液を増感、定着液を調製します。
- 銀染色キットを、製造業者の説明書に従ってSDS-PAGEゲルの銀染色を行います。
- イメージング・システムでのゲルの画像を取得します。
HP-NAPにより誘導される好中球からのROS生産の7測定
- 以前に24を説明したように、密度勾配遠心分離し、デキストラン沈降により、ヒトヘパリン化血液からヒト好中球を分離します。
- 好中球からのROS産生の測定は、ルミノール依存性化学発光アッセイを使用してHP-NAPで刺激しました。
- プレートリーダーをオンにして、37℃に温度を設定。置きプレートリーダー室内の空の平底96ウェル白色プレートに、37℃に加温することを可能にします。
- 存在下および非存在下で0.9ミリモルのCaCl 2、0.5mMのMgCl 2を、13.3μM5-アミノ-2,3-ジヒドロ-1,4-フタラジンジオン（ルミノール）を含むD-PBS、pHを7.2に刺激混合物を調製しますプロトコルステップ4.2から調製0.67μMのエンドトキシン除去HP-NAPの。
- 5 mMグルコースを含む、D-PBS、pHが7.2のProtocolステップ7.1〜2×10 6細胞/ mlから調製されたヒト好中球の濃度を調整します。
- 96ウェルながら、プレートの各ウェルへの好中球懸濁液の50μlのを追加します。
- ウェル当たり5秒の時間間隔でも含む好中にプロトコルのステップ7.2.2から調製された刺激の混合物の150μLを加えます。
- プレートリーダーを用いて3時間かけてウェル当たり5秒間化学発光の発光を測定します。
8。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNAプラスミド保有するHP-NAP変異体の構築は、サイトダイレクト突然変異誘発をベース
注：「サイレント」な制限部位は、部位特異的変異誘発（SDM）-assistソフトウェア28によって突然変異誘発プライマーに導入されたことを除いて、以前に27を説明したように、PCRに基づく部位特異的変異誘発は、基本的に生成しました。
- PCR反応を行います。
- 最終的に与えて、脱イオン水を含むPCRチューブに、プラスミドpET42a-NAP 10ngの、 表1に記載の変異誘発プライマー対の1μM、デオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP類）の200μM、高忠実度PCR酵素ミックスの3ユニットを追加25μlの量。
- 95でPCRサイクルを開始します 10分間°CテンプレートDNAを変性させ、1分間95℃の12増幅サイクルで追従するように、T 1分間℃〜-5 全くmはなく 、6分間72 入出力 C。
- でPCRサイクルを終えます1分間のT m頁 -5 O Cのアニーリング工程及び30分間72℃での伸長工程。
- 2時間、37℃でのDpn I制限酵素0.4μlのPCR産物15μLを治療した後、アガロースゲル電気泳動でのDpn Iで処理したPCR産物2μlの分析。
- 画面の変異体。
- E.にPCR産物2μlのトランスフォーム42℃で45秒間熱ショックにより大腸菌 DH5αコンピテントセル。
- 50μg/ mlのカナマイシンを含むLBプレート上で形質転換細胞を広げ、37℃で16時間プレートをインキュベートします。
- 製造業者のプロトコルに従って商業アルカリ溶解キットを使用して細菌コロニーからのプラスミドDNAを単離します。
- 製造業者のプロトコルに従って、所望のサイレント変異の存在を確認するためにXhoI制限酵素でプロトコルステップ8.3.3で単離されたプラスミドDNAを扱います。
- シーケンスプラスミドDNAを、製造業者のプロトコルに従って、HP-NAP変異体のコード配列の修正を確認するために、T7プロモータープライマーを用いてプロトコルステップ8.3.4によって確認しました。
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Representative Results
組換えHP-NAPの負の浄化の実験手順の概略図は、Eで表現しましたバッチモードでDEAEイオン交換樹脂を用いて、 大腸菌は 、図1に示されている。この精製技術は、宿主細胞タンパク質および/ または樹脂HP-NAP以外の不純物の結合に基づいています。 pH8.0で、その本来の形でのHP-NAPを除いてほとんどない他のタンパク質は、非結合画分（ 図2AおよびB）から回収されます。非結合画分中の精製HP-NAPは、HP-NAP（ 図2C）に対する抗体により免疫検出し、銀染色（ 図2D）によって確認されるように、その純度は97％以上でした。ネイティブPAGE（ 図2B）およびゲル濾過クロマトグラフィー（ 図3A）によって分析した以外に、精製された組換えHP-NAPは、オリゴマー形態を保ちます。円偏光二色性spectroscopIC分析は、精製されたタンパク質は、主にαヘリックス（ 図3B）から成ることを示しました。また、精製されたHP-NAPはROS（ 図3C）を生成するために、ヒト好中球を刺激することができました。したがって、この方法によって精製された組換えHP-NAPは、生物学的活性を有するその天然の形態です。また、この負モードバッチクロマトグラフィーは、一段階での点突然変異を有する組換えHP-NAPを精製するために使用することができる。 図4に示すように、2つの組換えHP-NAP Y101HおよびHP-NAP E97GY101H変異体 H.のHP-NAPを模倣しますピロリ NCTC 11639およびNCTC 11637株を、それぞれ、95％よりも高い純度のこのネガティブモードバッチクロマトグラフィーによって精製しました。
HP-NAPを精製するためにDEAE樹脂を用いたネガティブモードバッチクロマトグラフィーを実施するため、精製のために使用されるバッファーのpHは8.0に調整されるべきですHP-NAPの大半は非結合画分に存在していることを確認します。緩衝液のpH値は、8.0（ 図5）よりも高いか低くなったときにHP-NAPのより少ない量は、非結合画分に存在しました。 pHが9.0に7.0から増加すると、非結合画分におけるHP-NAPの存在の純度が少し増加したにもかかわらず、緩衝液のpH値はpHがあったときに、未結合画分中のHP-NAPの存在量が最も高かったです8.0（ 図5）。樹脂上にロードされた細胞溶解物からの可溶性タンパク質の量は、この精製のための別の重要な因子です。ここでは、比は、Eから不純物を吸収する樹脂の最大容量を達成するためのミリリットル樹脂あたりのタンパク質の1.5 mgで大腸菌 （ 図6）。また、この負モードバッチクロマトグラフィーによって得られた純度およびHP-NAPの収率は実質的に可溶性画分にHP-NAPの存在量を増加することによって増加させることができますE.は、溶解物を大腸菌 。組換えHP-NAPは、ほぼ完全にpHが9.0（ 図7）で細胞溶解時の可溶性画分に回収されました。にもかかわらず、 大腸菌における組換えHP-NAPの溶解度細胞が9.0よりも低いpHを有する緩衝液で溶解したとき、細胞は7.5（ 図7）よりも高いpHを有する緩衝液で溶解したとき、 大腸菌溶解物が著しく増加した、HP-NAPの90％未満では、可溶性タンパク質として存在していました。
図1：バッチモードでのDEAE樹脂によるHP-NAPの負の精製の 概略概要精製は、バッチ結合手順を開始します。細菌溶解物から得られたHP-NAPを含有する可溶性タンパク質画分を、DEAE樹脂pH8.0のトリス緩衝液で予め平衡化に添加されます。タンパク質/樹脂スラリーは、その後、緩やかにmixiの1時間4℃でインキュベートされngの。インキュベーション中に、宿主細胞のタンパク質が樹脂に結合します。非結合画分中のHP-NAPの存在を集め、遠心分離後の上清または重力流によって実行カラムからのフロースルー画分のいずれかによって得られる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：DEAEイオン交換樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーによるHP-NAPの精製結果の一例 Eの全細胞溶解物（W）および可溶性タンパク質画分（S）。 HP-NAP及びDEAEイオン交換クロマトグラフィーからのHP-NAPを含有する非結合画分（U）を発現する大腸菌 BL21（DE3）をSDS-PAGE（A）、ネイティブPAGE（B）、およびウェスタンブロッティング（C）により分析しました。結合していないFRAC1μgから10μgの範囲のタンパク質の指示量にションは銀染色SDS-PAGEゲル（D）で分析しました。 kDaの中分子量（M）は、染色ゲルおよびブロットの左側に表示されています。 （参照24から適応） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：構造および E から精製された組換えHP-NAPの機能解析 ネガティブモードバッチクロマトグラフィーによって 大腸菌 （A）は、UV吸光度プロファイルは、ゲル濾過カラムから溶出したHP-NAPについて記録しました。タンパク質マーカーの分子量は、クロマトグラム上に示されました。 （B）遠紫外円二色性SPECTHP-NAPのラムは、195〜260ナノメートルの波長範囲で記録しました。 （C）ヒト好中球（1×10 5細胞）を37℃で陰性対照として、0.5μMHP-NAPとD-PBS、pHは7.2で処理しました。 ROSの含有量は、ルミノール依存性化学発光アッセイを用いて連続的に測定した好中球から生成されます。データは三連での実験の平均値±標準偏差として表しました。 （参照24から適応） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：Eに発現された組換えHP-NAPの変異体の精製 ネガティブモードバッチクロマトグラフィーによる 大腸菌 。E.の可溶性タンパク質画分大腸菌 BL21（DE3）は、2つの組換えHP-NAP Y101HおよびHP-NAP E97GY101H変異体を発現し、野生型のHP-NAPはDEAE樹脂とネガティブモードクロマトグラフィーにより精製しました。未結合画分をSDS-PAGEによって分析した。kDaの中の分子の質量（M）は染色ゲルの左側に表示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：Eに発現された組換えHP-NAPの精製に緩衝pHの影響 ネガティブモードバッチクロマトグラフィーによる 大腸菌 。E.の可溶性画分pHを9.0に溶解したHP-NAPを発現する大腸菌 BL21（DE3）は、7.0から9.0の範囲のpHを示し、および0.3 mg / mlのタンパク質濃度に調整しました。これらの調整画分を、その後4℃でネガティブモードバッチクロマトグラフィーによって、組換えHP-NAPを精製するためにDEAE樹脂上にロードし、負荷として示します。非結合、洗浄、および溶出画分をSDS-PAGEにより分析しました。 kDaの中分子量（M）は染色ゲルの左側に表示されています。 （参照24から適応） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：E.において発現ピュリ組換えHP-NAPのためにDEAE樹脂上にロードされたタンパク質の量の影響 大腸菌 。E.の可溶性タンパク質画分大腸菌 BL21（DE3）を発現するHP-NAPは、に従って、DEAE樹脂にロードしました recombiを精製する樹脂のミリリットル当たりミリグラムのタンパク質示さ比NAntのHP-NAP pH8.0のネガティブモードバッチクロマトグラフィーによる。可溶性タンパク質は、負荷（L）、非結合画分（A）、洗浄画分（B）、およびSDS-PAGEにより分析した溶出画分（C）として示します。 kDaの中分子量（M）は染色ゲルの左側に表示されています。 （参照24から） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7： 大腸菌 におけるHP-NAPの溶解度に及ぼすpHの影響 大腸菌 溶解物。（A）E. HP-NAPを発現する大腸菌 BL21（DE3）は、7.0から9.5の範囲のpHで示された氷冷Tris-HCl緩衝液に懸濁しました。細胞を溶解し、次いで、全細胞溶解物（W）は、Tを遠心分離しO可溶性画分（S）及び不溶性ペレット（I）を分離。タンパク質は、SDS-PAGEにより分析しました。 kDaの中分子量（M）は染色ゲルの左側に表示されています。 （B）各pHにおける全細胞溶解物中の組換えHP-NAPの溶解性の割合は、全細胞溶解物（Wのそれで割った可溶性画分（S）のためのSDSゲル上でHP-NAPバンドの強度から算出しました。 ）。データは、少なくとも2つの実験の平均値±標準偏差として表しました。 （参照24から） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1： 突然変異誘発のために使用されるプライマー。 CLくださいこの表の拡大版を表示するには、こちらICK。
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Discussion
ここで提示DEAE陰イオン交換樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーは、 大腸菌で過剰発現する組換えHP-NAPの精製に適しています。細胞溶解および精製の 工程において使用される緩衝液のpH値は、EでHP-NAPの溶解性を確保するために非常に重要です大腸菌溶解物およびそれぞれの宿主細胞不純物から組換えHP-NAPの効率的な分離。細菌細胞は、pH 9.0に溶解されるべきであり、負の精製は、高収率かつ高純度でHP-NAPを得るために、pH8.0で行われるべきです。 HP-NAPの典型的な回収率は90％であり、典型的な純度は95％で24です。 HP-NAPは、非結合画分中に存在するので、樹脂の最小が、十分な量の不純物を吸収するその最大容量を達成するために使用されるべきです。この例では、最大積載量は、Eからの可溶性タンパク質の1.5 mgでミリリットル樹脂あたりの大腸菌溶解物。
専らDEDプロトコルは、50ミリリットルE.から組換えHP-NAPの精製の ために設計されています大腸菌の培養。HP-NAPの収量は約15 mgです。精製プロセスは、それに応じて縮小または拡大されたいずれかであり得ます。例えば、二つの組換えHP-NAP Y101HおよびHP-NAP E97GY101H変異体を1ml 大腸菌から精製しました。このネガティブモードバッチクロマトグラフィーを用いて大腸菌培養物95％より高い純度の両方のHP-NAP変異体は、非結合画分（ 図4）を収集することによって得ました。このネガティブモードバッチクロマトグラフィーはまた、860 mlの大腸菌からの組換えHP-NAPを精製するために適用されていますcoliの培養物。DEAEネガティブモードバッチクロマトグラフィーを用いて工程の回収率は90％よりも高い純度で97％に達しています。
HP-NAPはまた、正常にこのDEAEネガティブモードバッチクロマトグラフィーによって精製された枯草菌 （ 枯草菌 ）で表さ1ステップ26インチ私たちのBの枯草菌の発現系は、HP-NAPの発現レベルが低いです。 HP-NAPは細菌溶解物からの全可溶性タンパク質の約5％を占めます。精製の対象HP-NAPは、少量で存在するにもかかわらず、90％より高い純度を有するHP-NAPを効率的にほとんどすべての内因性を除去するために、樹脂上にロードされた細胞溶解物からのタンパク質の量の割合を減少させることによって得ることができますB.からのタンパク質枯草菌 26。したがって、この方法は、他の細菌宿主中で発現された組換えHP-NAPを精製するために適用されてもよいです。
いくつかの方法がその天然型14-16における組換えHP-NAPの精製の ために報告されています。しかし、追加のゲルろ過クロマトグラフィー工程は、高純度でHP-NAPを得るために必要とされます。この負のクロマトグラフィー精製を効率よく1ステップで純度の高い機能的な組換えHP-NAPを得ることができます。 additiで脱塩工程を伴う非結合画分中の低塩濃度を必要としません。バッチモードの精製は、列の必要性をなくすことができました。このように、DEAE樹脂を使用して、このネガティブモードバッチクロマトグラフィーは、高い収率および純度でその天然型でHP-HAPを浄化するための簡単かつ効率的な方法を提供しています。この方法によって精製されたHP-NAPは、さらにワクチン、新薬、およびH.のための診断法の開発のために利用することができますピロリ菌は、疾患または他の新しい治療用途のために-関連しました。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
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