Summary
Een hoge opbrengst Werkwijze voor eenstaps negatieve zuivering van recombinant Helicobacter pylori-neutrofiel activerend eiwit (HP-NAP) tot overexpressie gebracht in Escherichia coli door diethylaminoethyl harsen batchmodus is beschreven. HP-NAP gezuiverd met deze methode is gunstig voor de ontwikkeling van vaccins, geneesmiddelen of diagnostica voor H. pylori-geassocieerde ziekten.
Abstract
Helicobacter pylori-neutrofiel activerend eiwit (HP-NAP) is een belangrijke virulentiefactor Helicobacter pylori (H. pylori). Het speelt een cruciale rol in H. pylori geïnduceerde maagontsteking door activering van verschillende aangeboren leukocyten zoals neutrofielen, monocyten en mestcellen. De immunogeen is en immunomodulerende eigenschappen van HP-NAP maken het een potentiële diagnostische en kandidaat-vaccin voor H. pylori en een nieuw kandidaat-geneesmiddel voor de behandeling van kanker. Om grote hoeveelheden gezuiverde HP-NAP voor de klinische toepassingen te verkrijgen, een efficiënte werkwijze voor het zuiveren van dit eiwit met hoge opbrengst en zuiverheid tot stand worden gebracht.
In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor eenstaps negatieve chromatografische zuivering van recombinant HP-NAP overexpressie gebracht in Escherichia coli (E. coli) met behulp diethylaminoethyl (DEAE) ionenwisselaarharsen (bijv. Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP vormt bijna 70% van het totale eiwit in E. coli en bijna volledig hersteld in de oplosbare fractie na cellyse bij pH 9,0. Bij de optimale conditie bij pH 8,0, wordt het merendeel van HP-NAP gewonnen in de ongebonden fractie terwijl de endogene eiwitten van E. coli worden efficiënt verwijderd door de hars.
Deze zuiveringsmethode met behulp van negatieve modus batch chromatografie met DEAE ionenwisselaars levert functionele HP-NAP uit E. coli in de natieve vorm met hoge opbrengst en zuiverheid. Het gezuiverde HP-NAP kan verder worden gebruikt voor de preventie, behandeling en prognose van H. pylori-geassocieerde ziekten en kanker.
Introduction
Helicobacter pylori (H. pylori) is een belangrijke oorzaak van gastritis en maagzweren. Deze bacterie is ook geclassificeerd als een kankerverwekkende stof bij de mens door het Internationaal Agentschap voor Kankeronderzoek, onderdeel van de World Health Organization, in 1994. Er wordt geschat dat de prevalentie van H. pylori infectie 70% in de ontwikkelingslanden en 30-40% in de geïndustrialiseerde landen 1. Hoewel de infectie tarief van H. pylori afneemt in de geïndustrialiseerde landen, de infectie tarief van H. pylori in de ontwikkelingslanden een hoog 2. De standaard behandeling om H. uit te roeien pylori-infectie bestaat uit de toediening van een protonpompremmer, PPI, en twee antibiotica, claritromycine plus amoxicilline of metronidazol 3. Echter, de opkomst van de antibioticaresistentie in H. pylori gerelateerde zweren therapie dringt er bij de ontwikkeling van nieuwe strategieën ter voorkoming van or genezen van de infectie. Ontwikkeling van preventieve en / of therapeutische vaccinatie tegen H. pylori kan een alternatieve benadering H. beheersen pylori-infectie.
Helicobacter pylori-neutrofiel activerend eiwit (HP-NAP), een belangrijke virulentie factor H pylori, werd voor het eerst geïdentificeerd in water extracten van H. pylori met het vermogen om neutrofielen te activeren om zich te houden aan endotheelcellen en produceren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) 4. Neutrofiel infiltratie van het maagslijmvlies in H. pylori geïnfecteerde patiënten met actieve gastritis kan leiden tot ontsteking en weefselbeschadiging van de maag. Zo kan HP-NAP een pathologische rol spelen door het activeren van neutrofielen aan maagontsteking, die verder veroorzaakt maagzweer of H. induceren pylori-geassocieerde gastrische aandoeningen. Toch HP-NAP is een potentiële kandidaat voor klinische toepassingen 5,6. Door de immunogene en immunomodulerende progenschappen van HP-NAP, kan dit eiwit worden gebruikt om vaccins, therapeutische middelen en diagnostische instrumenten te ontwikkelen. Een klinisch onderzoek werd uitgevoerd voor het gebruik van recombinant HP-NAP als een van de bestanddelen van een eiwit vaccin tegen H. pylori. Dit vaccin bestaat uit recombinant HP-NAP, cytotoxine-geassocieerde gen A (CagA) en vacuolating A cytotoxine (VacA) proteïnen geformuleerd met aluminiumhydroxide en is verder aangetoond veilig en immunogeen bij mensen 7 te zijn. Ook HP-NAP werkt als een krachtige immunomodulator triggert T helper type 1 (Th1) -polarized immuunresponsen voor kankertherapie 8 en omlaag reguleren Th2-gemedieerde immuunresponsen opgewekt door allergische reacties en parasitaire infecties 9,10. Zoals voor diagnostiek, heeft recombinant HP-NAP-gebaseerde ELISA werd toegepast op serum antilichamen tegen HP-NAP in H. pylori geïnfecteerde patiënten 11. Een studie toonde aan dat het niveau van HP-NAP-specifieke antilichamen in sera van H. pylori geïnfecteerde patiënten met maagkanker significant hoger dan die van patiënten met chronische gastritis 12. Een andere studie toonde ook aan dat serum antilichamen tegen HP-NAP zijn geassocieerd met de aanwezigheid van niet-cardia adenocarcinoom van de maag 13. Aldus kan recombinant HP-NAP-gebaseerde ELISA toegepast om antilichamen in serum tegen HP-NAP detecteren prognose maagkanker H. pylori geïnfecteerde patiënten. Samen genomen, kon het gezuiverde HP-NAP verder worden gebruikt voor de preventie, behandeling en prognose van H. pylori-geassocieerde ziekten en kanker.
Onder de verschillende methoden voor zuivering van recombinant HP-NAP expressie gebracht in Escherichia coli (E. coli) in de natieve vorm gemeld tot nu toe, een tweede zuiveringsstap waarbij gelfiltratiechromatografie nodig om zeer zuivere HP-NAP 14-16 vinden . Hier, een methode waarbij negatieve modus batch chromatografie metdiethylaminoethyl (DEAE) ionenwisselaarharsen beschreven voor zuivering van HP-NAP overexpressie gebracht in E. coli met hoge opbrengst en een hoge zuiverheid. Deze zuiveringstechniek is gebaseerd op de binding van eiwitten van de gastheercel en / of dan HP-NAP aan de hars verontreinigingen. Bij pH 8,0, zijn bijna geen andere eiwitten, behalve HP-NAP hersteld van de ongebonden fractie. Deze zuivering benadering met behulp van DEAE ion-uitwisselingschromatografie negatief mode is eenvoudig en tijdsbesparend, doordat zuivering van recombinant HP-NAP via one-step chromatografie door middel van het verzamelen van de ongebonden fractie. Naast HP-NAP, verscheidene andere biomoleculen, zoals virussen 17, Immunoglobuline G (IgG) 18, hemoglobine 19, proteïne fosfatase 20 en virulentiefactor flagellin 21, zijn ook gerapporteerd te worden gezuiverd door ion-uitwisselingschromatografie negatief modus. De negatieve modus voorkeur ionenwisselingschromatografie als verontreinigingen de minorcomponenten aanwezig in het monster onderworpen te zuiveren 22. De toepassing van de negatieve chromatografie in zuivering van natuurlijke of recombinante biomoleculen is onlangs beoordeeld 23.
Het voorliggende rapport geeft een stap voor stap protocol voor de expressie van recombinant HP-NAP in E. coli, lysis van cellen en zuivering van HP-NAP middels negatieve modus batch chromatografie met DEAE ionenwisselaarharsen. Indien een eiwit gewenst voor zuivering geschikt voor ionenuitwisselingschromatografie als negatief, kunnen de beschreven protocol worden aangepast als uitgangspunt voor de ontwikkeling van een zuiveringswerkwijze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijk bloed werd verzameld van gezonde vrijwilligers met voorafgaande schriftelijke geïnformeerde toestemming en goedkeuring van de Institutional Review Board van de National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan.
1. Expressie van recombinant HP-NAP in E. coli
- Bereid het plasmide pET42a-NAP die de DNA sequentie van HP-NAP van H. 26.695 pylori stam als hiervoor beschreven 16. Bereid de plasmiden die de DNA-sequentie van HP-NAP de gewenste puntmutaties beschreven (zie protocol stap 8).
- Transformatie 10 ng van het bovengenoemde DNA plasmiden in E. coli BL21 (DE3) competent cells door heat shock gedurende 45 seconden bij 42 ° C, strook de cellen op lysogenie bouillon (LB) agarplaten die 50 ug / ml kanamycine, en incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 16 uur.
- Inoculeer afzonderlijke kolonies in individuele buizen met 5 ml LB-bouillon met 50 ug / ml kanamycine en groeien ze als voorkweken 37 ° C gedurende 16 uur onder schudden bij 170 rpm.
- Beënten 2 ml van de hierboven voorkweek cellen in 200 ml LB-bouillon met 50 ug / ml kanamycine in een 1 L kolf. Incubeer de geïnoculeerde kolf bij 37 ° C gedurende 2 uur onder schudden bij 170 rpm totdat de absorptie bij 600 nm ongeveer 0,4-0,5 gedetecteerd door een UV / VIS spectrofotometer bereikt.
- Voeg 80 ul van 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in de bovenstaande kweek tot een eindconcentratie van 0,4 mM om de expressie van HP-NAP induceren. Incubeer de kweek gedurende 3 uur tot de absorptie bij 600 nm ongeveer 1,6-1,7 bereikt.
- Centrifugeer de cellen bij 6000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten om het supernatant te verwijderen. Bewaar de celpellet bij -70 ° C tot de zuivering.
2. Voorbereiding van de oplosbare proteïne fractie die HP-NAP
Let op: Al de volgende stappen worden uitgevoerd bij 4 ° C uitgevoerd.
- Resuspendeer 50 ml van de cel pEllet bereid in Protocol stap 1.6 in 20 ml 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM NaCl bevattende 0,13 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 0,03 mM N-a-tosyl-L-lysinyl-chloormethylketon (TLCK) en 0,03 mM N-tosyl-L-fenylalaninyl-chloormethylketon (TPCK) bij 4 ° C zoals eerder beschreven 16.
- Breek de bacteriecellen door het passeren van de bacteriële suspensie door een hoge druk homogenisator bediend in een bereik van 15.000 tot 20.000 psi gedurende 7 keer bij 4 ° C.
- Centrifugeer het cellysaat bij 30.000 xg bij 4 ° C gedurende 1 uur om de oplosbare en onoplosbare proteïnefracties te scheiden met behulp van een ultracentrifuge. Breng de supernatant als de oplosbare eiwitfractie een bekerglas.
- Meet de eiwitconcentratie van de oplosbare eiwitfractie van de Bradford werkwijze onder toepassing van een commerciële kit met runderserumalbumine (BSA) als standaard volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg 177,6 ul van 1 N HCl in 20 ml vae oplosbare eiwitfractie verkregen uit stap 2.3 Protocol om haar pH-waarde van pH 9,0 op pH 8,0.
- Voeg 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl bovenstaande eiwitoplossing om de uiteindelijke eiwitconcentratie 0,5 mg / ml zijn.
3. Zuivering van Recombinant HP-NAP Van E. coli door Negative Mode Batch chromatografie met DEAE ionenwisselaars
- Bereid 15 ml DEAE harsen.
- Weeg 0,6 g droge poeder DEAE harsen en suspendeer in 30 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 dag.
- Centrifugeer de hars bij 10.000 x g bij 4 ° C gedurende 1 min.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof.
- Voeg 15 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl.
- Herhaal Protocol stappen 3.1.2 tot en met 3.1.4 nog vier keer.
- Sla de 15 ml vaste hars (50% slurry in 30 ml Tris-buffer) bij 4 ° C voor later gebruik.
Let op: Al de volgende staps worden uitgevoerd bij 4 ° C.
- Voeg 45 ml van de oplosbare eiwitten bereid in stap Protocol 2,6-15 ml van de hars en roer het eiwit / harsslurry met een magnetische roerder bij 4 ° C gedurende 1 uur.
- Giet het eiwit / harsslurry in een plastic of glazen kolom met een kraantje. Laat het hars om zich te vestigen in het kader van de zwaartekracht.
- Open de kraan om de eiwitoplossing om door de kolom door zwaartekracht totdat het vloeistofniveau in de kolom boven het hars. Verzamel de doorstroming als de ongebonden fractie die het gezuiverde HP-NAP bevat.
- Voeg 15 ml ijskoude 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl in de kolom.
- Open de kraan om de wasbuffer om door de kolom door zwaartekracht totdat het vloeistofniveau in de kolom boven het hars. Verzamel het doorstroomkanaal de wasfractie.
- Herhaal Protocol stappen 3,5-3,6 vier keer om de extra wasbeurt fracties te verzamelen.
- Voeg 15 ml ijskoude 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl in een kolom.
- Open de kraan om de elutiebuffer om door de kolom door zwaartekracht totdat het vloeistofniveau in de kolom boven het hars. Verzamel het doorstroomkanaal de elutiefractie.
- Herhaal stappen Protocol 3,8-3,9 vier keer de aanvullende elutiefracties verzamelen.
4. Buffer Exchange en verwijdering van endotoxine van HP-NAP Gezuiverd door Negative Mode Batch chromatografie met DEAE Resins
Opmerking: De gezuiverde HP-NAP expressie in E. coli moet worden onderworpen aan uitwisseling en verwijdering van endotoxinen vóór neutrofielen stimuleren buffer.
- Voer dialyse om de buffer van de gezuiverde HP-NAP wijzigen in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS), pH 7,2, bij 4 ° C met dialyseslang met een molecuulgewicht cut-off van 14 kDa zoals eerder beschreven 24.
- Filter de gedialyseerd HP-NAP door een syringe filter met een positief geladen, hydrofiel membraan met stroomsnelheden van 2,5 tot 4 ml / minuut bij 4 ° C om endotoxine te verwijderen bevestigd aan een 20 ml wegwerpspuit.
5. Analyse van de moleculaire eigenschappen van gezuiverd recombinant HP-NAP door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), Western Blotting, inheems-PAGE, gelfiltratiechromatografie, en Circular Dichroisme Spectroscopy
- Analyseer de gezuiverde recombinante HP-NAP door SDS-PAGE en Western blotting met hybridoma kweeksupernatanten met monoklonaal antilichaam MAb 16F4 25 zoals eerder beschreven 24.
- Analyseer de gezuiverde HP-NAP door natieve PAGE en gelfiltratie chromatografie om de oligomere toestand onderzocht zoals eerder beschreven 26.
- Analyseer het gezuiverde recombinant HP-NAP door circulair dichroïsme spectroscopie om haar secundaire structuur te onderzoeken, zoals eerder beschreven 26.
6. Evaluatie van de zuiverheid van HP-NAP door zilverkleuring van een SDS-PAGE gel
- Bereid de fixeeroplossing, sensibiliserende oplossing, zilveroplossing ontwikkeloplossing, stop oplossing en wasoplossing volgens de instructies van een zilverkleuring kit van de fabrikant.
- Voer zilverkleuring van een SDS-PAGE gel volgens de instructies van een zilverkleuring kit van de fabrikant.
- Het verwerven van de afbeelding van de gel met een beeldvormingssysteem.
7. Meting van de ROS productie uit neutrofielen geïnduceerd door HP-NAP
- Isoleer menselijke neutrofielen uit menselijk gehepariniseerd bloed door dextran sedimentatie gevolgd door dichtheidsgradiënt centrifugatie zoals eerder beschreven 24.
- Meting van de ROS productie van neutrofielen gestimuleerd met HP-NAP met behulp van een luminol-afhankelijke chemiluminescentie-test.
- Schakel een plaatlezer en de temperatuur bij 37 ° C. Plaats eenlege vlakke bodem 96-well witte plaat in de plaatlezer kamer, waardoor het opwarmen tot 37 ° C.
- Bereid de stimulus mengsels in D-PBS, pH 7,2, bevattende 0,9 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2 en 13,3 uM 5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazinedion (luminol) met als zonder van 0,67 uM-endotoxine verwijderd HP-NAP bereid uit Protocol stap 4.2.
- Dient de concentratie van humane neutrofielen bereid uit Protocol stap 7,1-2 x 10 6 cellen / ml in D-PBS, pH 7,2, bevattende 5 mM glucose.
- Voeg 50 pl neutrofiel suspensie in elk putje van de 96-well plaat terwijl.
- Voeg 150 ul van de stimulus mengsels bereid uit stap 7.2.2 Protocol in het putje met neutrofielen in een tijdsinterval van 5 seconden per putje.
- Meet de emissie chemiluminescentie gedurende 5 seconden per putje gedurende drie uur met behulp van een plaatlezer.
8.Constructie van DNA plasmiden HP-NAP Mutants door Polymerase Chain Reaction (PCR) -gebaseerde Site-direct mutagenese
Opmerking: PCR-gebaseerde site-directe mutagenese werd hoofdzakelijk realiseren zoals hiervoor 27 beschreven, behalve dat de "stille" restrictieplaatsen werden ingevoerd om de mutagenese primers door plaatsgerichte mutagenese (SDM) -assisteren software 28.
- Voer PCR Reaction.
- Voeg 10 ng plasmide pET42a-NAP, 1 uM mutagenese in Tabel 1 opgesomde primerparen, 200 uM deoxynucleosidetrifosfaten (dNTP's) en 3 eenheden van high-fidelity PCR enzymmengsel in een PCR buis met gedeïoniseerd water, waardoor een uiteindelijke volume van 25 pl.
- Start de PCR cycli bij 95 ° C gedurende 10 minuten om de matrijs-DNA te denatureren en te volgen met 12 amplificatie cycli bij 95 ° C gedurende 1 minuut, Tm geen -5 ° C gedurende 1 minuut en 72 ° C gedurende 6 min.
- Afwerking van de PCR-cycli metEen gloeistap bij Tm pp -5 o C gedurende 1 minuut en verlenging bij 72 ° C gedurende 30 minuten.
- Behandel 15 ui van het PCR product met 0,4 gl Dpn I restriction enzyme bij 37 ° C gedurende 2 uur en vervolgens analyseren 2 pi van de Dpn I-behandelde PCR-product door agarose gelelektroforese.
- Screen mutanten.
- Transformatie 2 pi van het PCR product in E. coli DH5a competente cellen door heat shock gedurende 45 seconden bij 42 ° C.
- Spreid de getransformeerde cellen op een LB plaat die 50 gg / ml kanamycine en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 16 uur.
- Isoleer het plasmide DNA van de bacteriële kolonies met een commerciële alkaline lysis kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Behandel het plasmide DNA geïsoleerd in stap 8.3.3 Protocol met Xhol restrictie-enzym voor de aanwezigheid van de gewenste stille mutaties volgens het protocol van de fabrikant verifiëren.
- Sequence deplasmide DNA gecontroleerd door Protocol stap 8.3.4 met T7 promotor primer om de correctie van de coderende sequenties van HP-NAP mutanten volgens het protocol van de fabrikant bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het schema van de experimentele procedure negatieve zuivering van recombinant HP-NAP expressie in E. coli door DEAE ionenuitwisselingsharsen in batchmodus is getoond in figuur 1. Deze zuiveringstechniek is gebaseerd op de binding van eiwitten van de gastheercel en / of dan HP-NAP aan de hars verontreinigingen. Bij pH 8,0, zijn bijna geen andere eiwitten behalve HP-NAP in zijn natieve vorm gewonnen uit de ongebonden fractie (figuur 2A en B). Het gezuiverde HP-NAP in de ongebonden fractie werd immunologisch door het antilichaam tegen HP-NAP (figuur 2C) en de zuiverheid hoger dan 97% zoals bevestigd door zilverkleuring (Figuur 2D). Bovendien, de gezuiverde recombinante HP-NAP behield zijn oligomere vorm zoals geanalyseerd door natieve PAGE (figuur 2B) en gelfiltratiechromatografie (Figuur 3A). Circulair dichroïsme spectroscopic analyse bleek dat het gezuiverde eiwit voornamelijk bestaat uit α-helices (Figuur 3B). Ook het gezuiverde HP-NTP kan stimuleren humane neutrofielen ROS (figuur 3C) te produceren. Dus de recombinant HP-NAP gezuiverd van deze benadering is in de natieve vorm met biologische activiteit. Bovendien kan deze negatieve modus batch chromatografie worden gebruikt om recombinant HP-NTP puntmutaties zuiveren één stap. Zoals getoond in figuur 4, de twee recombinante HP-NAP Y101H en HP-NAP E97GY101H mutanten die HP-NAP of H. na te bootsen pylori NCTC 11639 en NCTC 11.637 stammen, respectievelijk, werden gezuiverd door deze negatieve modus batch chromatografie met zuiverheid hoger dan 95%.
Voor het uitvoeren negatieve modus batch chromatografie met DEAE harsen HP-NAP zuiveren, moet de pH van de buffer gebruikt voor de zuivering worden ingesteld op 8,0zodat de meerderheid van HP-NAP in de ongebonden fractie. Kleinere hoeveelheid HP-NAP was aanwezig in de niet-gebonden fracties bij een pH van de buffer hoger of lager dan 8,0 (Figuur 5) was. Hoewel de zuiverheid van HP-NAP in de ongebonden fracties werd verhoogd net iets de pH verhoogd 7,0-9,0, de hoeveelheid HP-NAP in de ongebonden fracties was het hoogst wanneer de pH van de buffer pH 8,0 (Figuur 5). De hoeveelheid van de oplosbare eiwitten van cellysaten op het hars geladen is een andere belangrijke factor voor deze zuivering. Hier is de verhouding 1,5 mg eiwit per ml hars mogelijke capaciteit van de hars om de onzuiverheden uit E. absorberen coli (Figuur 6). Bovendien kan de zuiverheid en opbrengst van HP-NAP verkregen door deze negatieve modus batch chromatografie aanzienlijk worden verhoogd door de hoeveelheid van HP-NAP aanwezig in de oplosbare fractieE. coli lysaten. Recombinant HP-NAP bijna volledig hersteld in de oplosbare fractie na cellyse bij pH 9,0 (Figuur 7). Hoewel de oplosbaarheid van recombinant HP-NAP in E. coli lysaat sterk verhoogd wanneer de cellen in de buffer gelyseerd met een pH hoger dan 7,5 (Figuur 7), minder dan 90% van HP-NAP was als het oplosbare eiwit wanneer de cellen in de buffer gelyseerd met een pH lager dan 9,0.
Figuur 1:. Schematisch Overzicht van de negatieve Zuivering van HP-NAP door DEAE Resins in batch mode De zuivering begint met een batch-bindende procedure. De oplosbare eiwitfractie bevattende HP-NAP verkregen uit bacteriële lysaten toegevoegd aan de DEAE hars vooraf geëquilibreerd met Tris-buffer bij pH 8,0. De eiwitten / hars slurries worden vervolgens geïncubeerd bij 4 ° C gedurende 1 uur onder zacht mixing. Tijdens de incubatie de gastheercel eiwitten binden aan de hars. HP-NAP aanwezig in de ongebonden fractie wordt verkregen door ofwel het verzamelen van de supernatant na centrifugeren of de flow-through-fractie van een kolom die door de zwaartekracht flow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Voorbeeldige Resultaat van Zuivering van HP-NAP door Negative Mode Batch chromatografie met DEAE ionenwisselaars Het hele cellysaat (W) en oplosbare proteïne fractie (S) van E. coli BL21 (DE3) expressie HP-NAP en de ongebonden fractie (U) met HP-NAP van DEAE ion-uitwisselingschromatografie werden geanalyseerd door SDS-PAGE (A), natieve PAGE (B), en western blotting (C). De ongebonden fracwerking met de aangegeven hoeveelheid eiwitten variërend van 1 ug tot 10 ug werd geanalyseerd op een met zilver gekleurde SDS-PAGE gel (D). Moleculaire massa (M) in kDa zijn aangegeven aan de linkerkant van de gekleurde gelen en de blot. (Overgenomen uit referentie 24) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Structurele en functionele karakterisering van recombinant HP-NAP gezuiverd van E. coli door Negative modus Batch Chromatography. (A) Het UV- absorptieprofiel werd voor HP-NAP geëlueerd uit een gelfiltratiekolom. De moleculaire massa van het eiwit markers werden aangegeven op het chromatogram. (B) Het verre UV circulair dichroïsme SPECTrum van HP-NAP werd opgenomen in het golflengtegebied van 195-260 nm. (C) Menselijke neutrofielen (1 x 10 5 cellen) werden behandeld met 0,5 pM HP-NAP en D-PBS, pH 7,2, als een negatieve controle bij 37 ° C. De inhoud van ROS gevormd uit neutrofielen werd continu gemeten met een luminol-afhankelijke chemiluminescentie analyse. De gegevens werden weergegeven als het gemiddelde ± standaardafwijking van een experiment in drievoud. (Overgenomen uit referentie 24) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Zuivering van Recombinant HP-NAP mutanten uitgedrukt in E. coli door Negative Mode Batch Chromatography. De oplosbare proteïne fracties van E. coli BL21 (DE3) tot expressie brengen van twee recombinant HP-NAP Y101H en HP-NAP E97GY101H mutanten en wild-type HP-NAP werden gezuiverd door de negatieve mode chromatografie met DEAE harsen. De niet-gebonden fracties werden geanalyseerd door SDS-PAGE. Moleculaire massa (M) in kDa zijn aangegeven aan de linkerkant van de gekleurde gels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Effect van de Buffer pH op Zuivering van Recombinant HP-NAP Uitgedrukt in E. coli door Negative Mode Batch Chromatography. De oplosbare fractie van E. coli BL21 (DE3) expressie HP-NAP gelyseerd bij pH 9,0 werden op de aangegeven pH bereik 7,0-9,0 en een eiwitconcentratie van 0,3 mg / ml. deze aangepastefracties, aangeduid als lading werd daarna geladen op DEAE harsen recombinant HP-NAP door negatieve modus batch chromatografie zuivering bij 4 ° C. De ongebonden, wassen en elutie fracties werden geanalyseerd door SDS-PAGE. Moleculaire massa (M) in kDa zijn aangegeven aan de linkerkant van de gekleurde gelen. (Overgenomen uit referentie 24) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Effect van hoog eiwitten geladen op DEAE harsen Zuiveren Recombinant HP-NAP uitgedrukt in E. coli. Het oplosbare eiwitfracties E. coli BL21 (DE3) expressie HP-NAP werden op DEAE harsen volgens de aangegeven verhouding mg eiwit per milliliter harsen recombi zuiverennant HP-NAP door de negatieve modus batch chromatografie bij een pH van 8,0. De oplosbare eiwitten, aangeduid als lading (L), de niet-gebonden fractie (A), vaste fractie (B) en elutie fractie (C) werden geanalyseerd met SDS-PAGE. Moleculaire massa (M) in kDa zijn aangegeven aan de linkerkant van de gekleurde gelen. (Vanaf het referentiejaar 24) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Effect van pH op de oplosbaarheid van HP-NAP in E. Lysaten coli. (A) E. coli BL21 (DE3) expressie HP-NAP werd gesuspendeerd in ijskoude Tris-HCl buffer bij het aangegeven pH bereik 7,0-9,5. Cellen werden gelyseerd en lysaten van gehele cellen (B) werden gecentrifugeerd to scheiden oplosbare fracties (S) en onoplosbare pellets (I). De eiwitten werden geanalyseerd door SDS-PAGE. Moleculaire massa (M) in kDa zijn aangegeven aan de linkerkant van de gekleurde gelen. (B) Het percentage oplosbaarheid van recombinant HP-NAP in totaal cellysaat bij elke pH werd berekend uit de intensiteit van HP-NAP band op SDS-gels voor de oplosbare fractie (S) gedeeld door die van de hele cellysaat (W ). De gegevens werden weergegeven als het gemiddelde ± standaardafwijking van ten minste twee experimenten. (Vanaf het referentiejaar 24) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Primers gebruikt voor mutagenese. Gelieve click hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De negatieve modus batch chromatografie met DEAE anionenwisselaarharsen hier gepresenteerde is geschikt voor zuivering van recombinant HP-NAP overexpressie gebracht in E. coli. De pH van de buffers die in de stappen van cellysis en zuivering zeer kritisch om de oplosbaarheid van HP-NAP in E. waarborgen coli lysaten en efficiënte scheiding van recombinant HP-NAP van gastheercel onzuiverheden, respectievelijk. Bacteriële cellen worden gelyseerd bij pH 9,0, en de negatieve zuivering worden uitgevoerd bij pH 8,0 HP-NAP verkrijgen in hoge opbrengst en hoge zuiverheid. Typische herstel van de HP-NAP is 90%, en typische zuiverheid is 95% 24. Aangezien HP-NAP in de ongebonden fractie, slechts een minimale, maar voldoende hoeveelheid van de hars worden gebruikt om de maximale capaciteit om de verontreinigingen te absorberen bereiken. In ons geval hoogste belasting is 1,5 mg van de oplosbare eiwitten van E. coli lysaten per milliliter hars.
de proviDED protocol is ontworpen voor zuivering van recombinant HP-NAP een 50 ml E. coli cultuur. De opbrengst van de HP-NAP ligt op ongeveer 15 mg. Het zuiveringsproces kan ofwel verkleinde of opgeschaald dienovereenkomstig. Zo werden de twee recombinante HP-NAP Y101H en HP-NAP E97GY101H mutanten gezuiverd uit een 1 ml E. coli-kweek met deze negatieve modus batch chromatografie. Zowel HP-NAP mutanten met een zuiverheid hoger dan 95% verkregen door het verzamelen van de ongebonden fractie (Figuur 4). Deze negatieve modus batch chromatografie zijn ook toegepast om recombinante HP-NAP te zuiveren van een 860 ml E. coli cultuur. Het herstel van de stap met behulp van DEAE negatieve modus batch chromatografie heeft bereikt 97% met een zuiverheid van meer dan 90%.
HP-NAP expressie gebracht in Bacillus subtilis (B. subtilis) is ook met succes gezuiverd door DEAE deze negatieve modus batch chromatografiein een stap 26. In onze B. subtilis expressie systeem, de expressie niveau van HP-NAP is laag. HP-NAP nemen slechts ongeveer 5% van de totale oplosbare eiwitten van de bacteriële lysaten. Hoewel HP-NAP gericht voor zuivering aanwezig is in een kleine hoeveelheid, HP-NTP zuiverheid hoger dan 90% kan worden verkregen door vermindering van de verhouding van de hoeveelheid eiwitten van cellysaten op het hars geladen bijna alle endogene efficiënt te verwijderen eiwitten van B. 26 subtilis. Zo kan deze werkwijze ook worden toegepast om recombinante HP-NAP uitgedrukt in andere bacteriële gastheren te zuiveren.
Verscheidene werkwijzen zijn beschreven voor de zuivering van recombinant HP-NAP in zijn natieve vorm 14-16. Echter wordt een andere gelfiltratie chromatografiestap nodig om HP-NAP verkrijgen hoge zuiverheid. Deze negatieve chromatografische zuivering efficiënt kunnen opleveren functionele recombinant HP-NAP met een hoge zuiverheid in één stap. in additi, wordt de ontzilting stap niet noodzakelijk vanwege de lage zoutconcentratie in de ongebonden fractie. De batch-modus zuivering kan ook overbodig een kolom. Dus deze negatieve modus batch chromatografie met DEAE-hars biedt een eenvoudige en efficiënte methode om HP-HAP zuiveren in de natieve vorm met hoge opbrengst en zuiverheid. HP-NAP gezuiverd door deze werkwijze kan verder worden gebruikt voor de ontwikkeling van vaccins, nieuwe geneesmiddelen en diagnostica voor H. pylori gerelateerde ziekten of andere nieuwe therapeutische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
