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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Une étape négative de purification chromatographique Published: June 18, 2016 doi: 10.3791/54043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Institute of Molecular and Cellular Biology, National Tsing Hua University, 2Department of Life Science, National Tsing Hua University

Summary

Procédé à rendement élevé pour une étape de purification du recombinant négatif Helicobacter pylori protéine d' activation des neutrophiles (HP-NAP) surexprimé dans Escherichia coli en utilisant des résines de diéthylaminoéthyle en mode discontinu est décrit. HP-NAP purifié par cette méthode est bénéfique pour le développement de vaccins, de médicaments ou de diagnostic pour H. pylori -Associated maladies.

Abstract

Helicobacter pylori neutrophiles-activating protein (HP-NAP) est un facteur de virulence majeur de Helicobacter pylori (H. pylori). Elle joue un rôle crucial dans H. pylori gastrique induite par l' inflammation en activant les leucocytes plusieurs innés incluant les neutrophiles, les monocytes et les mastocytes. Les propriétés immunogènes et immunomodulatrices de HP-NAP en font un candidat vaccin potentiel diagnostique et H. pylori et un nouveau candidat médicament pour le traitement du cancer. Afin d'obtenir des quantités importantes de HP-NAP purifié utilisé pour ses applications cliniques, une méthode efficace pour purifier cette protéine avec un rendement élevé et la pureté doit être établie.

Dans ce protocole, nous avons décrit un procédé en une étape négative purification chromatographique de HP-NAP recombinante surexprimée dans Escherichia coli (E. coli) en utilisant diéthylaminoéthyle (DEAE) des résines échangeuses d' ions (par ex., Sephadex®) , ile mode de traitement par lots n. HP-NAP recombinante constitue près de 70% de la protéine totale dans E. coli et est presque entièrement récupérée dans la fraction soluble après lyse cellulaire à un pH de 9,0. Sous la condition optimale à un pH de 8,0, la majorité des HP-NAP est récupéré dans la fraction non liée , tandis que les protéines endogènes de E. coli sont efficacement éliminés par la résine.

Cette méthode de purification par chromatographie négative par lots de mode avec DEAE résines échangeuses d' ions donne de HP-NAP fonctionnel à partir de E. coli sous sa forme native avec un rendement élevé et de pureté. Le HP-NAP purifiée pourrait encore être utilisé pour la prévention, le traitement et le pronostic de H. pylori -Associated maladies, ainsi que la thérapie du cancer.

Introduction

Helicobacter pylori (H. pylori) est une cause majeure de la gastrite et de l' ulcère gastro - duodénal. Cette bactérie a également été classé comme cancérogène chez l' homme par le Centre international de recherche sur le cancer, une partie de l'Organisation mondiale de la Santé, en 1994. Il a été estimé que la prévalence de H. infection pylori est de 70% dans les pays en développement et 30-40% dans les pays industrialisés 1. Même si le taux de H. infection pylori diminue dans les pays industrialisés, le taux de H. infection pylori dans les pays en développement est encore élevé 2. Le traitement standard pour l' éradication de H. pylori infection consiste en l'administration d'un inhibiteur de la pompe à protons, IPP et deux antibiotiques, la clarithromycine ou le métronidazole et amoxicilline 3. Toutefois, l'augmentation de la résistance aux antibiotiques chez H. pylori la PI thérapie de l' ulcère exhorte le développement de nouvelles stratégies pour prévenir or guérir l'infection. Développement de la vaccination prophylactique et / ou thérapeutique contre H. pylori pourrait fournir une approche alternative pour contrôler H. infection pylori.

Helicobacter pylori protéine d' activation des neutrophiles (HP-NAP), un facteur de virulence majeur de H pylori, a été identifié dans les extraits d'eau de H. pylori avec la possibilité d'activer les neutrophiles adhérer aux cellules endothéliales et produire des espèces réactives de l' oxygène (ROS) 4. L' infiltration des neutrophiles de la muqueuse gastrique trouvée dans H. pylori patients infectés par gastrite active peuvent provoquer une inflammation et des dommages aux tissus de l'estomac. Ainsi, HP-NAP peut jouer un rôle pathologique par l' activation des neutrophiles pour induire une inflammation de l' estomac, ce qui provoque en outre l' ulcère ou H. pylori -Associated maladies gastriques. Néanmoins, HP-NAP est un candidat potentiel pour des applications cliniques 5,6. En raison de la pro immunogène et immunomodulateurspriétés de HP-NAP, cette protéine pourrait être utilisée pour développer des vaccins, des agents thérapeutiques et des outils de diagnostic. Un essai clinique a été mené à l' aide de HP-NAP recombinante comme l' un des composants d'un vaccin contre la protéine H. pylori. Ce vaccin se compose de HP-NAP recombinant associé à la cytotoxine gène A (CagA), et des protéines Une cytotoxine vacuolisante (VacA) formulé avec de l' hydroxyde d'aluminium et il a en outre été démontrée comme étant sans danger et immunogène chez l'être humain 7. En outre, HP-NAP agit comme un immunomodulateur puissant pour déclencher T auxiliaires de type 1 (Th1) multipolarisé réponses immunitaires pour le traitement du cancer et de 8 à réguler à la baisse des réponses immunitaires médiées par Th2 induites par des réactions allergiques et d' infections parasitaires 9,10. En ce qui concerne le diagnostic recombinant ELISA basé sur HP-NAP a été appliqué pour détecter des anticorps sériques contre la HP-NAP de H. pylori patients infectés par le 11. Une étude a montré que le niveau d'anticorps spécifiques HP-NAP dans le sérum de H. pylori patients infectés par le cancer gastrique était significativement plus élevé que chez les patients souffrant de gastrite chronique 12. Une autre étude a également montré que les anticorps sériques dirigés contre HP-NAP sont associées à la présence de non-cardia 13 adénocarcinomes gastriques. Ainsi, recombinant ELISA à base de HP-NAP peut être appliqué pour détecter les anticorps sériques dirigés contre HP-NAP pour le pronostic du cancer gastrique chez H. pylori patients infectés par l . Pris ensemble, le HP-NAP purifiée pourrait encore être utilisé pour la prévention, le traitement et le pronostic de H. pylori -Associated maladies, ainsi que la thérapie du cancer.

Parmi les différentes méthodes utilisées pour la purification de recombinant HP-NAP exprimé dans Escherichia coli (E. coli) sous sa forme native rapporté jusqu'à présent, une chromatographie sur gel de filtration deuxième étape de purification impliquant est nécessaire pour obtenir de haute pureté HP-NAP 14-16 . Ici, une méthode utilisant la chromatographie négative mode batch avecdiéthylaminoéthyle (DEAE) résines échangeuses d' ions est décrit pour la purification de HP-NAP surexprimé dans E. coli avec un rendement élevé et une grande pureté. Cette technique de purification a été basée sur la liaison des protéines et / ou des impuretés autres que HP-NAP à la résine cellule hôte. A pH 8,0, presque pas d'autres protéines à l'exception de HP-NAP sont récupérés à partir de la fraction non liée. Cette approche de purification utilisant la chromatographie par échange d'ions DEAE en mode négatif est simple et économiser en permettant la purification de HP-NAP recombinante par Chromatographie en une seule étape par la collecte de la fraction non liée du temps. En plus de HP-NAP, plusieurs autres biomolécules, tels que les virus 17, immunoglobuline G (IgG) 18, l' hémoglobine 19, la protéine phosphatase 20, et le facteur de virulence flagelline 21, ont également été rapportés d'être purifiée par chromatographie échangeuse d' ions en négatif mode. Le mode négatif est préféré pour la chromatographie échangeuse d'ions, si des impuretés sont mineuresles composants présents dans l'échantillon soumis à purifier 22. L'application de la chromatographie négative dans la purification de biomolécules naturelles ou recombinantes a été récemment examiné 23.

Le présent rapport fournit une étape par le protocole d'étape pour l' expression de HP-NAP recombinante dans E. coli, la lyse des cellules et la purification de HP-NAP utilisant une Chromatographie en discontinu en mode négatif par DEAE résines échangeuses d' ions. Si une protéine souhaitée pour la purification est adaptée à la chromatographie d'échange d'ions en mode négatif, le protocole décrit pourrait également être adapté comme point de départ pour le développement d'un procédé de purification.

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Protocol

Le sang humain a été recueilli chez des volontaires sains avec le consentement écrit préalable éclairé et l'approbation du Conseil institutionnel d'examen de la National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan.

1. Expression du recombinant HP-NAP dans E. coli

  1. Préparer le plasmide pET42a-PNA contenant la séquence d'ADN de la HP-NAP de H. pylori 26695 souche comme décrit précédemment 16. Préparer les plasmides contenant la séquence d'ADN de la HP-NAP avec les mutations ponctuelles souhaitées telles que décrites (voir protocole, étape 8).
  2. Transformer 10 ng des plasmides d'ADN ci - dessus dans E. coli BL21 (DE3) des cellules compétentes par choc thermique pendant 45 secondes à 42 ° C, strie les cellules sur le bouillon de lysogénie (LB) des plaques de gélose contenant 50 pg / ml de kanamycine, et incuber les plaques à 37 ° C pendant 16 heures.
  3. Inoculer des colonies isolées dans des tubes individuels contenant 5 ml de bouillon LB avec 50 ug / ml de kanamycine et de croître comme des précultures à 37 ° C pendant 16 heures avec agitation à 170 tours par minute.
  4. Inoculer 2 ml des cellules pré-culture ci-dessus dans 200 ml de bouillon LB contenant 50 pg / ml de kanamycine dans un flacon de 1 litre. Incuber le flacon de culture inoculé à 37 ° C pendant 2 heures sous agitation à 170 tours par minute jusqu'à ce que l'absorbance à 600 nm atteint environ 0,4 à 0,5 détectée par un spectrophotomètre UV / VIS.
  5. Ajouter 80 ul de 1 M isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG) à la culture ci-dessus à une concentration finale de 0,4 mM pour induire l'expression de la HP-NAP. Incuber la culture pendant 3 heures jusqu'à ce que l'absorbance à 600 nm atteint environ 1/6 à 1/7.
  6. Centrifuger les cellules à 6000 x g à 4 ° C pendant 15 min pour éliminer le surnageant. Stocker le culot cellulaire à -70 ° C jusqu'à la purification.

2. Préparation de la protéine de la fraction soluble contenant de HP-NAP

Remarque: Toutes les étapes suivantes sont effectuées à 4 ° C.

  1. Remettre en suspension 50 ml de la cellule pEllet préparé dans le protocole étape 1.6 dans 20 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 9,0, NaCl 50 mM contenant 0,13 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 0,03 mM de N-alpha-tosyl-L-lysinyle-chlorométhylcétone (TLCK) et 0,03 mM de N-tosyl-L-phénylalaninyle-chlorométhylcétone (TPCK) à 4 ° C comme décrit précédemment 16.
  2. Rompre les cellules bactériennes en faisant passer la suspension bactérienne à travers un homogénéiseur à haute pression fonctionnant à une gamme de 15 000 à 20 000 psi pendant 7 heures à 4 ° C.
  3. Centrifuger le lysat cellulaire à 30 000 x g à 4 ° C pendant 1 heure pour séparer les fractions de protéines solubles et insolubles à l'aide d'une ultracentrifugeuse. Transférer le surnageant comme la fraction protéique soluble dans un bêcher.
  4. Mesurer la concentration en protéine de la fraction de protéine soluble par la méthode de Bradford en utilisant un kit commercial avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) comme étalon, selon les instructions du fabricant.
  5. Ajouter 177,6 ul de HCl 1 N dans 20 ml d'ee soluble dans la fraction protéique obtenue à partir de l'étape 2.3 Protocole pour ajuster sa valeur de pH allant de pH 9,0 à pH 8,0.
  6. Ajouter 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl à la solution de protéine ci-dessus pour obtenir une concentration finale en protéine soit 0,5 mg / ml.

3. La purification du recombinant HP-NAP à partir de E. coli par Chromatographie négative mode batch avec DEAE résines échangeuses d' ions

  1. Préparer 15 ml de résines DEAE.
    1. Peser 0,6 g de poudre sèche de résine DEAE et de le suspendre dans 30 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl à la température ambiante pendant au moins 1 jour.
    2. Centrifuger la résine à 10.000 x g à 4 ° C pendant 1 min.
    3. Retirer et jeter le surnageant.
    4. Ajouter 15 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM.
    5. Répéter les étapes 3.1.2 Protocole à 3.1.4 quatre fois plus.
    6. Stocker les 15 ml réglées résine (50% suspension dans 30 ml de tampon Tris) à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
      Note: Toutes les étapes suivantess sont effectuées à 4 ° C.
  2. Ajouter 45 ml de protéines solubles préparés dans l'étape Protocole de 2,6 à 15 ml de la résine et on agite la suspension de protéine / résine avec un agitateur magnétique à 4 ° C pendant 1 h.
  3. Verser la suspension de protéines / résine dans une colonne en matière plastique ou en verre muni d'un robinet d'arrêt. Laisser la résine régler par gravité.
  4. Ouvrir le robinet d'arrêt pour permettre à la solution de protéine à courir à travers la colonne par écoulement par gravité jusqu'à ce que le niveau de liquide dans la colonne juste au-dessus de la résine. Recueillir l'écoulement de la fraction non liée, qui contient le HP-NAP purifiée.
  5. Ajouter 15 ml d'glacé 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM dans la colonne.
  6. Ouvrir le robinet d'arrêt pour permettre au tampon de lavage pour fonctionner à travers la colonne par écoulement par gravité jusqu'à ce que le niveau de liquide dans la colonne juste au-dessus de la résine. Recueillir l'écoulement comme la fraction de lavage.
  7. Répéter les étapes Protocole 3.5 à 3.6 quatre fois plus pour recueillir les fractions de lavage supplémentaires.
  8. Ajouter 15 ml d'glacé 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1 M de NaCl dans une colonne.
  9. Ouvrir le robinet d'arrêt pour permettre au tampon d'élution à courir à travers la colonne par écoulement par gravité jusqu'à ce que le niveau de liquide dans la colonne juste au-dessus de la résine. Recueillir l'écoulement de la fraction d'élution.
  10. Répéter les étapes protocole de 3,8 à 3,9 quatre fois plus pour recueillir les fractions d'élution supplémentaires.

4. Buffer Exchange et endotoxines Suppression de HP-NAP Purifié par Chromatographie négative mode batch avec DEAE Résines

Remarque: Le HP-NAP purifiée exprimé dans E. coli doit être soumis à un échange de tampon et l' élimination d'endotoxine avant de stimuler neutrophiles.

  1. Effectuer une dialyse pour changer le tampon du HP-NAP purifiée pour tamponnée au phosphate salin de Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, à 4 ° C en utilisant un tube de dialyse à coupure de poids moléculaire de 14 kDa tel que décrit précédemment 24.
  2. Filtrer le HP-NAP dialysée à travers une seringueFiltre électronique avec une charge positive, d'une membrane hydrophile fixée à une seringue jetable de 20 ml à des débits allant de 2,5 à 4 ml / minute à 4 ° C pour éliminer l'endotoxine.

5. Caractérisation des propriétés moléculaires de la recombinante purifiée HP-NAP par dodécylsulfate de sodium-gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), Western blot, Native-PAGE, Gel Filtration Chromatographie et dichroïsme circulaire Spectroscopy

  1. Analyser le HP-NAP recombinante purifiée par SDS-PAGE et transfert de Western avec des surnageants de culture d'hybridomes contenant un anticorps monoclonal de souris MAb 25 16F4 24 comme décrit précédemment.
  2. Analyser le HP-NAP a été purifié par PAGE natif et la Chromatographie par filtration sur gel pour examiner son état ​​oligomère tel que décrit précédemment 26.
  3. Analyser le HP-NAP recombinante purifiée par spectroscopie de dichroïsme circulaire pour examiner sa structure secondaire comme décrit précédemment 26.

6. Evaluation de la pureté de la HP-NAP par coloration à l'argent d'un gel SDS-PAGE

  1. Préparer la solution de fixation, solution, solution d'argent, solution de développement sensibilisation, la solution d'arrêt, et une solution de lavage selon les instructions d'un kit de coloration à l'argent du fabricant.
  2. Effectuer coloration à l'argent d'un gel SDS-PAGE selon les instructions d'un kit de coloration à l'argent du fabricant.
  3. Acquérir l'image du gel avec un système d'imagerie.

7. Mesure de la production d'ERO induite par les neutrophiles par HP-NAP

  1. Isoler neutrophiles humains à partir de sang hépariné humain par sédimentation dextran suivi par gradient de densité centrifugation comme décrit précédemment 24.
  2. Mesure de la production de radicaux libres à partir de neutrophiles stimulés avec HP-NAP à l'aide d'un dosage de chimioluminescence luminol-dépendante.
    1. Tourner sur un lecteur de plaque et régler la température à 37 ° C. Placer unevide fond plat plaque de 96 puits blanche à l'intérieur de la chambre de lecteur de plaque, ce qui lui permet de se réchauffer à 37 ° C.
    2. Préparer les mélanges de stimulation dans le D-PBS, pH 7,2, contenant 0,9 mM de CaCl2, 0,5 mM de MgCl2 et 13,3 pM de 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phtalazinedione (luminol) avec la présence et l' absence de 0,67 uM endotoxine retirée HP-NAP préparé à partir de l'étape 4.2 Protocole.
    3. Ajuster la concentration en neutrophiles humains préparés à partir de protocole étape 7.1 à 2 x 10 6 cellules / ml dans du D-PBS, pH 7,2, contenant 5 mM de glucose.
    4. Ajouter 50 pl de neutrophiles suspension dans chaque puits de la plaque de 96 puits tout.
    5. Ajouter 150 pi des mélanges de relance préparés à partir de protocole étape 7.2.2 dans les neutrophiles et contenant à un intervalle de temps de 5 secondes par puits.
    6. Mesurer l'émission de la chimioluminescence pendant 5 secondes par puits sur une période de trois heures en utilisant un lecteur de plaque.

8.Construction d'ADN Plasmides hébergeant HP-NAP Mutants par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à base de mutagenèse directe

Remarque: la mutagénèse site direct à base de PCR a été généré essentiellement 27 comme décrit précédemment , sauf que les sites de restriction "silencieuses" ont été introduits dans les amorces de mutagenèse par une mutagenèse dirigée (SDM) logiciel -aider 28.

  1. Effectuer la réaction PCR.
    1. Ajouter 10 ng du plasmide pET42a-PNA, 1 uM de mutagénèse paires d'amorces énumérées dans le tableau 1, 200 uM de désoxynucléosides triphosphates (dNTP), et 3 unités de haute fidélité par PCR mélange d' enzymes dans un tube PCR contenant de l' eau déminéralisée, ce qui donne une finale volume de 25 ul.
    2. Initier les cycles de PCR à 95 ° C pendant 10 minutes pour dénaturer l'ADN matrice, et suivre avec 12 cycles d'amplification à 95 ° C pendant 1 minute, T m pas -5 ° C pendant 1 minute, et 72 ° C pendant 6 min.
    3. Terminer les cycles de PCR avecune étape de recuit à T m p -5 ° C pendant 1 minute et une étape d'extension à 72 ° C pendant 30 min.
  2. Traiter 15 ul du produit de PCR avec 0,4 ul d'Dpn I enzyme de restriction à 37 ° C pendant 2 heures, puis on analyse 2 ul du produit de PCR Dpn I traité par électrophorèse sur gel d'agarose.
  3. mutants d'écran.
    1. Transformer 2 ul du produit de PCR dans E. coli DH5a cellules compétentes par choc thermique pendant 45 sec à 42 ° C.
    2. Répartir les cellules transformées sur une plaque LB contenant 50 pg / ml de kanamycine et incuber la plaque à 37 ° C pendant 16 heures.
    3. Isoler l'ADN de plasmide à partir des colonies bactériennes en utilisant un kit commercial de la lyse alcaline selon le protocole du fabricant.
    4. Traiter l'ADN de plasmide isolé dans l'étape 8.3.3 Protocole avec l'enzyme de restriction Xhol pour vérifier la présence des mutations silencieuses souhaitées selon le protocole du fabricant.
    5. séquence dul'ADN plasmidique a vérifié par l'étape 8.3.4 Protocole avec l'amorce promoteur T7 pour confirmer la correction des séquences codantes des mutants HP-NAP selon le protocole du fabricant.

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Representative Results

Le schéma de principe du mode opératoire de purification négative de HP-NAP recombinante exprimée dans E. coli en utilisant DEAE résines échangeuses d' ions en mode discontinu est représenté sur la figure 1. Cette technique de purification est basée sur la liaison des protéines et / ou des impuretés autres que HP-NAP à la résine cellule hôte. A pH 8,0, presque pas d' autres protéines à l' exception de HP-NAP sous sa forme native sont récupérés à partir de la fraction non liée (Figure 2A et B). HP-NAP purifiée dans la fraction non liée a été immunodétecté par l'anticorps dirigé contre HP-NAP (figure 2C), et sa pureté est supérieure à 97% comme confirmé par coloration à l' argent (figure 2D). En outre, le HP-NAP recombinante purifiée a conservé sa forme oligomérique analysé par PAGE natif (figure 2B) et la Chromatographie par filtration sur gel (Figure 3A). Dichroïsme circulaire spectroscopIC analyse a montré que la protéine purifiée était principalement composé d'hélices a (figure 3B). En outre, le HP-NAP purifiée était capable de stimuler des cellules neutrophiles humaines pour produire des ROS (figure 3C). Ainsi, le HP-NAP recombinant purifié par cette approche est sous sa forme native avec une activité biologique. En outre, cette chromatographie en mode batch négatif peut être utilisé pour purifier HP-NAP recombinante avec des mutations ponctuelles en une seule étape. Comme le montre la figure 4, les deux mutants HP-NAP Y101H et HP-NAP E97GY101H recombinant, qui imitent HP-NAP de H. pylori NCTC 11639 NCTC et 11,637 souches, respectivement, ont été purifiés par Chromatographie sur ce lot mode négatif avec une pureté supérieure à 95%.

Pour mettre en oeuvre une Chromatographie en mode discontinu négatif en utilisant des résines de DEAE pour purifier HP-NAP, la valeur du pH du tampon utilisé pour la purification doit être ajusté à 8,0faire en sorte que la majorité des HP-NAP est présent dans la fraction non liée. Quantité moindre de HP-NAP était présent dans les fractions non liées lorsque la valeur du pH du tampon est supérieure ou inférieure à 8,0 (Figure 5). Même si la pureté de HP-NAP présent dans les fractions non liées a été augmentée juste un peu plus que le pH a augmenté de 7,0 à 9,0, la quantité de HP-NAP présent dans les fractions non liées était la plus élevée lorsque la valeur du pH du tampon a un pH 8,0 (figure 5). La quantité des protéines solubles à partir de lysats de cellules chargées sur la résine est un autre facteur important pour cette purification. Ici, le rapport est de 1,5 mg de protéines par millilitre de résine pour obtenir une capacité maximale de la résine pour absorber les impuretés provenant de E. coli (figure 6). En outre, la pureté et le rendement de la HP-NAP obtenu par Chromatographie sur ce mode batch négatif peut être sensiblement augmentée en augmentant la quantité de HP-NAP présente dans la fraction soluble deE. coli lysats. HP-NAP recombinante a été presque complètement récupéré dans la fraction soluble après lyse cellulaire à un pH de 9,0 (figure 7). Même si la solubilité du HP-NAP recombinante dans E. coli lysats est nettement augmentée lorsque les cellules ont été lysées dans le tampon avec un pH supérieur à 7,5 (figure 7), moins de 90% de HP-NAP est présent sous forme de protéine soluble , lorsque les cellules ont été lysées dans le tampon avec un pH inférieur à 9,0.

Figure 1
Figure 1:. Outline Schéma de la Purification négative de HP-NAP par DEAE Résines en mode batch La purification commence par une procédure batch contraignant. La fraction de protéine soluble contenant HP-NAP obtenu à partir de lysats bactériens est ajouté à la résine DEAE pré-équilibrée avec du tampon Tris à pH 8,0. Les protéines / bouillies de résine sont ensuite incubés à 4 ° C pendant 1 heure avec mixi douceng. Pendant l'incubation, les protéines de la cellule hôte se lient à la résine. HP-NAP présent dans la fraction non liée est obtenue soit par la collecte du surnageant après centrifugation ou la fraction d'écoulement d'une colonne dirigée par écoulement gravitaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Résultat Des exemples de purification de HP-NAP négative par Chromatographie en mode discontinu avec DEAE résines échangeuses d' ions L'ensemble du lysat de cellules (W) et la fraction de protéines solubles (S) de E. coli BL21 (DE3) exprimant HP-NAP et la fraction non liée (U) contenant HP-NAP de chromatographie échangeuse d' ions de DEAE ont été analysés par SDS-PAGE (A), PAGE natif (B) et buvardage de Western (C). Le frac non liéetion avec la quantité de protéines allant de 1 ug à 10 ug indiqué a été analysé sur un gel SDS-PAGE coloré à l' argent (D). Les masses moléculaires (M) sont indiqués en kDa sur la gauche des gels colorés et la tache. (Adapté de la référence 24) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Structural et caractérisation fonctionnelle du Recombinant HP-NAP Purifié De E. coli par Chromatographie négative en mode batch (A) . Le profil d'absorbance UV a été enregistré pour HP-NAP élue à partir d' une colonne de filtration sur gel. Les masses moléculaires des marqueurs protéiques ont été indiqués sur le chromatogramme. (B) Le UV lointain dichroïsme circulaire spectrhum de HP-NAP a été enregistré à la plage de longueur d'onde de 195 à 260 nm. (C) Les neutrophiles humains (1 x 10 5 cellules) ont été traitées avec 0,5 uM de HP-NAP et D-PBS, pH 7,2, en tant que témoin négatif à 37 ° C. Le contenu des ERO générées à partir des neutrophiles a été mesurée en continu en utilisant un essai de chimioluminescence luminol-dépendante. Les données ont été représentées comme la moyenne ± écart type d'une expérience en triple. (Adapté de la référence 24) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Purification de recombinantes Mutants HP-NAP Exprimé en E. coli par Chromatographie négative mode par lots. Les fractions de protéines solubles de E. coli BL21 (DE3) exprimant deux mutants de E97GY101H recombinantes HP-NAP Y101H et HP-NAP et de type sauvage HP-NAP ont été purifié par Chromatographie en mode négatif avec des résines DEAE. Les fractions non liées ont été analysées par SDS-PAGE. Les masses moléculaires (M) en kDa sont indiquées sur la gauche des gels colorés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Effet du tampon de pH sur Purification de Recombinant HP-NAP Exprimé en E. coli par Chromatographie négative en mode batch. La fraction soluble de E. coli BL21 (DE3) exprimant HP-NAP lysées à un pH de 9,0 a été ajusté au pH indiqué , allant de 7,0 à 9,0 et une concentration en protéine de 0,3 mg / ml. Ces ajustéfractions, indiquées comme charge, ont ensuite été chargés sur des résines DEAE pour purifier HP-NAP recombinante par Chromatographie mode batch négative à 4 ° C. Les non liés, lavage, et les fractions d'élution ont été analysées par SDS-PAGE. Les masses moléculaires (M) sont indiqués en kDa sur la gauche des gels colorés. (Adapté de la référence 24) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Effet de la quantité de protéines chargées sur DEAE Résines pour Purifiant Recombinant HP-NAP Exprimé en E. coli. Les fractions de protéines solubles de E. coli BL21 (DE3) exprimant HP-NAP ont été chargés sur des résines DEAE selon la le rapport indiqué de mg de protéines par ml de résines pour purifier recombiHP-NAP nant par la chromatographie en mode batch négatif à pH 8,0. Les protéines solubles ont indiqué que la charge (L), la fraction non liée (A), la fraction de lavage (B), et la fraction d'élution (C) ont été analysés par SDS-PAGE. Les masses moléculaires (M) sont indiqués en kDa sur la gauche des gels colorés. (De référence 24) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Effet du pH sur la solubilité de HP-NAP dans E. coli lysats. (A) E. coli BL21 (DE3) exprimant HP-NAP a été mis en suspension dans du tampon Tris-HCl glacé à pH indiqué , allant de 7,0 à 9,5. Les cellules ont été lysées et les lysats de cellules entières puis (W) ont été centrifugés to séparer les fractions solubles (S) et de granulés insolubles (I). Les protéines ont été analysées par SDS-PAGE. Les masses moléculaires (M) sont indiqués en kDa sur la gauche des gels colorés. (B) Le pourcentage de solubilité de HP-NAP recombinante dans l'ensemble du lysat de cellules à chaque pH a été calculée à partir de l'intensité de la bande HP-NAP sur des gels SDS pour la fraction soluble (S) divisée par celle du lysat de cellules entières (W ). Les données ont été représentées comme la moyenne ± écart-type d'au moins deux expériences. (De référence 24) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1: Amorces utilisées pour la mutagenèse. S'il vous plaît clbeurk ici pour voir une version plus grande de cette table.

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Discussion

La Chromatographie discontinue en mode négatif par DEAE résines échangeuses d' anions présenté ici est approprié pour la purification de HP-NAP recombinante surexprimée dans E. coli. Les valeurs de pH des tampons utilisés dans les étapes de lyse des cellules et la purification sont très critiques pour assurer la solubilité du HP-NAP dans E. Les lysats coli et une séparation efficace de HP-NAP recombinante à partir d' impuretés de cellules hôtes, respectivement. Les cellules bactériennes doivent être lysées à pH 9,0, et la purification négative doit être effectuée à un pH de 8,0 pour obtenir HP-NAP avec un rendement élevé et une grande pureté. Récupération typique de HP-NAP est de 90% et une pureté typique est de 95% 24. Etant donné que HP-NAP est présent dans la fraction non liée, une quantité minime, mais suffisante de la résine doit être utilisée pour atteindre sa capacité maximale pour absorber les impuretés. Dans notre cas, la capacité de charge maximale est de 1,5 mg de protéines solubles de E. coli par lysats résine ml.

Le proviprotocole ded est conçu pour la purification de HP-NAP recombinante à partir d' un ml E. 50 culture coli. Le rendement de HP-NAP est d' environ 15 mg. Le procédé de purification peut être soit mise à l'échelle vers le bas ou à échelle en conséquence. Par exemple, les deux mutants de E97GY101H recombinants HP-NAP Y101H et HP-NAP ont été purifiés à partir d' un 1 ml E. coli en utilisant la culture de cette Chromatographie en mode batch négatif. Les deux mutants HP-NAP avec une pureté supérieure à 95% ont été obtenus en collectant la fraction non liée (figure 4). Cette chromatographie mode batch négatif ont également été appliqué pour purifier HP-NAP recombinante à partir d' un 860 ml E. la culture coli. La récupération de l'étape en utilisant une Chromatographie en mode discontinu sur DEAE négatif a atteint 97% avec une pureté supérieure à 90%.

HP-NAP exprimé dans Bacillus subtilis (B. subtilis) a également été purifié avec succès par cette Chromatographie par lots de mode négatif DEAEen une seule étape 26. Dans notre B. subtilis système d'expression, le niveau de HP-NAP expression est faible. HP-NAP ne représente qu'environ 5% des protéines totales solubles dans des lysats bactériens. Même si HP-NAP ciblé pour la purification est présent en une petite quantité, HP-NAP avec une pureté supérieure à 90% peut être obtenu en réduisant le rapport de la quantité de protéines à partir de lysats de cellules chargées sur la résine pour éliminer efficacement la quasi-totalité endogène les protéines de B. subtilis 26. Ainsi, ce procédé peut également être appliqué pour purifier HP-NAP recombinante exprimée dans d'autres hôtes bactériens.

Plusieurs méthodes ont été rapportées pour la purification de HP-NAP recombinante sous sa forme native 14-16. Cependant, une étape de chromatographie de filtration sur gel supplémentaire est nécessaire pour obtenir HP-NAP avec une pureté élevée. Cette purification chromatographique négative peut efficacement produire HP-NAP recombinante fonctionnelle avec une grande pureté en une seule étape. En additià l'étape de dessalement est pas nécessaire en raison de la faible concentration de sel dans la fraction non liée. La purification en mode batch peut également éviter la nécessité d'une colonne. Ainsi, cette Chromatographie mode batch négatif en utilisant une résine DEAE offre une méthode simple et efficace pour purifier HP-PAH sous sa forme native avec un rendement élevé et de pureté. HP-NAP purifiée par ce procédé pourrait encore être utilisé pour le développement de vaccins, de nouveaux médicaments et des diagnostics pour H. pylori ou pour les personnes handicapées : maladies autres nouvelles applications thérapeutiques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
pET42a-NAP  N/A N/A prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3) Thermo Fisher Scientific Inc C6000-03 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
Kanamycin Amresco 25389-94-0 http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) MD Biomedical Inc 101-367-93-1 http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
=IPTG%20
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich 10837091001 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) Sigma-Aldrich T7254 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) Sigma-Aldrich T4376 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Protein standard (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich P5619  a standard protein for Bio-Rad Protein Assay
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW
DEAE–Sephadex  A-25 chloride form Sigma-Aldrich A25120 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubing Spectrum Laboratories 132720 with molecular weight cutoff of 14 kDa
http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® units with Mustang® E membrane Pall MSTG25E3 for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mouse monoclonal antibody MAb 16F4 N/A N/A raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;  A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare Life Sciences 28989335 for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit, protein GE Healthcare Life Sciences 17-1150-01 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17-1440-02 for density gradient centrifugation to purify human neutrophils
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
Flat bottom 96-well white plate Thermo Fisher Scientific Inc 236108 http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol Sigma-Aldrich A8511 protected from light
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand  long template PCR system Sigma-Aldrich 11681834001 source of High Fidelity PCR enzyme mix
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn I New England Biolabs R0176S https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I New England Biolabs R0146S https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5α Thermo Fisher Scientific Inc 18265-017 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
Name Company Product Number Comments
Equipment
 
U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer Hitachi  N/A out of market and upgraded to a new model
http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer Avestin Inc C315320 http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge Hitachi Koki Co 90106401 for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
ÄKTA FPLC GE Healthcare Life Sciences 18-1900-26 for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD spectrophotometer Aviv Biomedical N/A out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php
LAS-3000 imaging system Fujifilm N/A discontinued and replaced
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter Perkin-Elmer 1420-018 for chemiluminescence detection
http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018

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References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
  3. Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
  4. Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
  5. Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
  6. de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
  7. Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
  8. Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
  9. Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
  10. Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
  11. Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
  12. Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
  13. Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
  14. Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
  15. Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
  16. Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
  17. Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
  18. Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
  19. Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
  20. Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
  21. Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
  22. Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
  23. Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
  24. Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
  25. Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
  26. Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
  27. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
  28. Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).

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Immunologie numéro 112 HP-NAP, DEAE chromatographie négative fraction non liée la chromatographie par lots,
Une étape négative de purification chromatographique<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Activation des neutrophiles protéine surexprimée dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En mode batch
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Kuo, T. Y., Hong, Z. W., Tsai, C.… More

Kuo, T. Y., Hong, Z. W., Tsai, C. C., Yang, Y. C., Fu, H. W. One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode. J. Vis. Exp. (112), e54043, doi:10.3791/54043 (2016).

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