Summary
재조합 헬리코박터의 원스텝 제외 정제 고 수율 방법에 대하여 설명한다 배치 모드에서 디 에틸 아미노 에틸 수지를 이용하여 대장균에서 과발현 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP) 파이로리. 이 방법에 의해 정제 HP-NAP는 H. 백신, 약물, 또는 진단의 발전을 위해 도움이됩니다 파이로리는 질병을 -associated.
Abstract
헬리코박터 파이로리 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP)은 헬리코박터 파이로리 (H. 파이로리)의 주요 독성 요소이다. 또한 H.에 중요한 역할을 파이로리는 호중구, 단핵구 및 비만 세포를 포함한 여러 선천성 백혈구 활성화에 의해 유도 된 위장 염증. HP-NAP의 면역 원성 및 면역 속성은 H.에 대한 잠재적 인 진단 및 백신 후보 확인 유문 및 암 치료 용 신약 후보. 임상 적 용도에 사용 그래피 HP-NAP 상당량을 얻기 위해서 효율적인 방법은 높은 수율과 순도의 단백질이 확립되어야 정제한다.
이러한 프로토콜에서는, 디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) 이온 교환 수지를 이용하여 대장균 (E. 콜라이)에서 과발현 재조합 HP-NAP의 일 단계 제외 크로마토 그래피 정제 방법을 기술 하였다 (예., 세파 덱스)를 난n 개의 배치 모드. 재조합 HP-NAP는 E. 총 단백질의 약 70 %를 구성한다 대장균과 거의 완전히 pH를 9.0에서 세포 용해시의 가용성 분획에서 회수된다. pH가 8.0에서 최적의 조건에서, HP-NAP의 대부분은 언 바운드 분획에서 회수되는 반면, E.에서 내인성 단백질 대장균 효율적으로 수지에 의해 제거된다.
DEAE 이온 교환 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피를 사용하여이 정제 방법은 E.에서 기능적 HP-NAP를 얻을 높은 수율 및 순도의 기본 형태로 대장균. 정제 된 HP-NAP는 더욱 예방, 치료에 활용하고, H.의 예후 수 파일로리 질병뿐만 아니라 암 치료 -associated.
Introduction
헬리코박터 파이로리 (H. pylori의)는 위염 및 소화성 궤양의 주요 원인이다. 이 박테리아는 또한 암, 세계 보건기구 (WHO)의 일부 연구에 대한 국제기구에 의해 인간 발암 물질로 분류되어, 1994 년에 그것은 추정되었음을 H.의 보급 pylori 감염은 개발 도상국의 70 %와 선진국 (1) 30 ~ 40 %이다. 비록 H.의 감염률 파이로리는 산업화 된 국가에서 H.의 감염률을 감소 개발 도상국에서 파이로리는 여전히이 높다. 표준 치료는 H.을 근절하기 pylori 감염은 프로톤 펌프 억제제, PPI, 2 개의 항생제, 클라리스로 마이신 플러스 아목시실린 또는 메트로니다졸 (3)의 관리로 구성되어 있습니다. H. 항생제 내성 그러나, 상승 파이로리는 궤양 치료 O 방지하는 새로운 전략의 개발을 촉구 - 관련R 감염을 치료. H.에 대한 예방 및 / 또는 치료 백신 개발 H. 파이로리를 제어하는 대안적인 방법을 제공 할 수있다 pylori 감염.
헬리코박터 파일로리 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP), H 파일로리의 주요 독성 요인은 첫째 H.의 물 추출물에서 확인되었다 내피 세포 및 활성 산소 종 (ROS) (4)를 생성하기 위해 접착 호중구 활성화하는 능력 파이로리. H.에서 발견 된 위 점막의 호중구 침윤 pylori- 활성 위염에 감염 환자는 위장의 염증과 조직 손상 될 수 있습니다. 따라서, HP-NAP는 상기 궤양 H. 발생 위장 염증을 유도 호중구 활성화에 의해 병리학적인 역할을 할 수있다 파이로리는 위 질병을 -associated. 그럼에도 불구하고, HP-NAP 임상 응용 5,6에 대한 잠재적 인 후보입니다. 때문에 면역 원성 및 면역 프로에HP-NAP의 perties이 단백질은 백신, 치료제 및 진단 도구 개발하는데 사용될 수있다. 임상 실험은 H. 대 단백질 백신의 성분의 하나로서, 재조합 HP-NAP를 사용해 수행 한 파이로리. 이 백신은 수산화 알루미늄 제형 재조합 HP-NAP, 세포 독소 - 관련 유전자 A (cagA 유전자) 및 vacuolating 세포 독소의 A (바카) 단백질로 구성되며 상기 안전하고 인체 7 원성 것으로 입증되었다. 또한, HP-NAP는 암 치료 (8)에 대한 면역 반응을 -polarized 아래로 알레르기 반응 및 기생충 감염 9,10에 의해 유발 TH2 매개 면역 반응을 조절하는 (받은 Th1) T 도우미 타입 1을 트리거 강력한 면역 조절제 역할을합니다. 진단 같이, 재조합 HP-NAP 기반 ELISA는 H.에서 HP-NAP 대해 혈청 항체를 검출하기 위해 적용되어왔다 pylori 감염 환자 11 -infected. 한 연구는 보여 주었다 H.에서 혈청에서 HP-NAP 특정 항체의 수준 평로리는 위암 환자가 만성 위염 (12)을 가진 환자에서보다 유의하게 높았다 -infected. 또 다른 연구는 또한 HP-NAP에 대한 혈청 항체가 비 문부 위암 (13)의 존재와 연관된 것으로 나타났다. 따라서, 재조합 HP-NAP 기반 ELISA는 H.에서 위암의 예후에 대한 HP-NAP에 대한 혈청 항체를 검출하기 위해 적용 할 수있다 균은 환자 -infected. 함께 찍은, 정제 된 HP-NAP는 더욱 예방, 치료에 활용하고, H.의 예후 수 파일로리 질병뿐만 아니라 암 치료 -associated.
재조합 HP-NAP의 정화에 사용하는 여러 방법 중에서 네이티브 형태의 대장균 (대장균)에서 발현 두번째 정제 단계를 포함하는 겔 여과 크로마토 그래피는 고순도 HP-NAP 14-16 얻기 위해 필요한, 지금까지보고 . 여기서, 마이너스 모드 배치 크로마토 그래피를 사용하는 방법디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) 이온 교환 수지는 E. 과발현 HP-NAP 정화용 설명 고 수율 및 고순도 대장균. 이러한 정제 기술은 숙주 세포 단백질 및 / 또는 수지 HP-NAP 이외의 불순물의 결합에 기초한다. pH가 8.0에서 HP-NAP를 제외하고 거의 다른 단백질이 결합되지 않은 부분에서 발견된다. 네거티브 모드에서 DEAE 이온 교환 크로마토 그래피를 사용하여이 정제 방법은 간단하고 시간 미 결합 분획의 수집을 한 단계 크로마토 재조합 HP-NAP의 정화를 허용함으로써 절약된다. (17) 면역 글로불린 G (IgG의) 18, 헤모글로빈 19 단백질 포스파타제 (20) 및 독성 인자 편모 21 바이러스와 같은, 또한 음극에 이온 교환 크로마토 그래피에 의해 정제하는 것으로보고 된 예 HP-NAP 여러 다른 생체 분자 이외에 방법. 불순물이 미량 인 경우 음의 모드는 이온 교환 크로마토 그래피 바람직대상 시료에 존재하는 구성 요소 (22)를 정제 할 수있다. 천연 또는 재조합 생체 분자의 정제에 부정적인 크로마토 그래피의 응용 프로그램은 최근에 23을 검토하고있다.
본 보고서는 E.에서 재조합 HP-NAP의 발현을위한 단계 프로토콜에 의해 단계를 제공합니다 콜라이, DEAE 이온 교환 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피를 이용하여 HP-NAP의 세포 용해 및 정제. 정제 목적 단백질이 네거티브 모드에서 이온 교환 크로마토 그래피에 적합한 경우, 설명 된 프로토콜은 또한 정제 공정의 개발을위한 출발점으로 구성 될 수있다.
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Protocol
인간의 혈액은 국립 칭화 대학의 임상 시험 심사위원회, 신주, 대만의 사전 서면 동의 및 승인을 건강한 지원자에서 수집 하였다.
E.에서 재조합 HP-NAP의 1 식 대장균
- H.에서 HP-NAP의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 pET42a-NAP 준비 파이로리 26695 균주는 이전 16 설명했다. 설명 된 바와 같이 원하는 포인트 돌연변이 HP-NAP의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 준비 (프로토콜, 단계 8 참조).
- E.에 상기 DNA 플라스미드 10 ng의 변형 대장균 BL21 (DE3) 42 ° C 45 초 동안 열 충격에 의해 유능한 세포, 행진 50 μg의 / ㎖ 카나마이신, 그리고 16 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어 포함 판 한천 원성 국물에 세포 (LB).
- 50 μg의 / ㎖ 카나마이신과 LB 배지 5 ㎖를 포함하는 각각의 튜브에 단일 콜로니를 접종하고 3에서 precultures로 성장170 rpm으로 진탕 16 시간 동안 11 ° C를.
- 1 L 플라스크를 50㎍ / ㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 200 ㎖에 상기 예비 배양 세포를 2 ㎖를 접종한다. 대략적은 UV / VIS 분광 광도계에 의해 검출 0.4-0.5 도달 내지 600 nm에서의 흡광도까지 170 rpm으로 진탕하면서 2 시간 동안 37 ℃에서 접종 된 배양 플라스크를 인큐베이션.
- HP-NAP의 발현을 유도하기 위하여 0.4 mM의 최종 농도로 상기 배양에 1 M 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)의 80 μL를 추가한다. 약 1.6-1.7에 도달 내지 600 nm에서의 흡광도 때까지 3 시간 동안 문화를 품어.
- 원심 분리기에서 15 분 동안 4 ℃에서 6,000 XG에 세포 상층 액을 제거한다. 정화 될 때까지 -70 ℃에서 세포 펠렛을 저장합니다.
HP-NAP를 포함하는 가용성 단백질 분획 2. 제조
참고 : 다음 단계는 모두 4 ℃에서 수행된다.
- 셀 (p)의 재현 탁 50 ㎖에서 프로토콜 단계 1.6에서 제조 ellet 20 20 mM 트리스 - 염산, pH가 9.0, 50 mM의 NaCl을 함유하는 0.13 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 0.03 mM의 N 알파 토실-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) 및 0.03 ml의 4 ° C에서 mM의 N-토실-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)는 이전과 같이 16을 설명했다.
- 39 ° C에서 7 시간 15,000 20,000 PSI의 범위에서 작동되는 고압 균질화 통해 세균 현탁액을 전달하여 균체를 방해.
- 원심 1 시간 동안 4 ℃에서 30,000 × g에서 파쇄를 초 원심 분리기를 사용하여 가용성 및 불용성 단백질 분획을 분리한다. 비커에 수용성 단백질 분획으로 뜨는을 전송합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 표준으로 소 혈청 알부민 (BSA)과 상업용 키트를 사용하여 브래드 포드 (Bradford) 방법에 의해 가용성 단백질 분획의 단백질 농도를 측정한다.
- 제 20 ㎖에 1 N 염산의 177.6 μl를 추가pH를 8.0으로 pH를 9.0의 pH 값을 조정 프로토콜 단계 2.3로부터 얻어지는 전자 수용성 단백질 분획.
- 최종 단백질 농도가 0.5 ㎎ / ㎖가 될 수 있도록 상기 단백질 용액을 20 mM의 트리스 -HCl, pH가 8.0, 50 mM의 NaCl을 추가.
E.에서 재조합 HP-NAP 3. 정제 DEAE 이온 교환 수지에 부정적인 모드 배치 크로마토 그래피에 의한 대장균
- DEAE 수지 15 ml의를 준비합니다.
- DEAE 수지 중 0.6 g 건조 분말의 무게를 적어도 1 일 동안 실온에서 20 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 50 mM의 NaCl을 30 mL의에 중단.
- 10,000 X에서 수지를 원심 분리기 1 분 4 ° C에서 g.
- 제거하고 상층 액을 버린다.
- 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 50 mM의 염화나트륨의 15 ML을 추가합니다.
- 프로토콜 3.1.2 사 3.1.4에 번 단계를 반복합니다.
- 15 ml의 후속 사용을 위해 4 ℃에서 수지 (30 ㎖ 트리스 완충액 중의 50 % 슬러리)을 정착 저장한다.
주 : 다음 단계의 모두의 4 ° C에서 수행된다.
- 수지의 15 ml의 프로토콜 단계 2.6에서 제조 된 수용성 단백질의 45 ML을 추가하고 1 시간 동안 4 ° C에서 자석 교반기와 단백질 / 수지 슬러리를 교반한다.
- 스톱 콕이 장착 된 플라스틱 또는 유리 컬럼에 단백질 / 수지 슬러리를 따르십시오. 수지가 중력 정착하도록 허용합니다.
- 칼럼 내의 액체 레벨이 단지 수지 위에까지 단백질 용액이 중력 흐름에 의해 열을 실행할 수 있도록하는 콕을 열고. 플로우를 통해 정제 된 HP-NAP를 포함하는 언 바운드 분수 등을 수집합니다.
- 컬럼에 얼음처럼 차가운 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 50 mM의 NaCl을 15 ML을 추가합니다.
- 칼럼 내의 액체 레벨이 아니라 수지를 초과 할 때까지 세척 완충액이 중력 흐름에 의해 열을 통해 실행할 수 있도록 스톱 콕을 열고. 플로우 스루 세척 분획으로서 수집.
- 의정서는 추가 세척 분수를 수집하기 위해 3.5 네 3.6 번 단계를 반복합니다.
- 컬럼에 얼음처럼 차가운 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 1 M NaCl을 15 ML을 추가합니다.
- 칼럼 내의 액체 레벨이 단지 수지 위에까지 용출 완충제는 중력 유동에 의해 열을 통해 실행할 수 있도록 스톱 콕을 열고. 플로우 스루 용출 분획으로서 수집.
- 프로토콜이 추가 용출 분수를 수집하기 위해 3.8 네 3.9 번 단계를 반복합니다.
4. 버퍼 Exchange 및 DEAE 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피로 정제하여 HP-NAP의 독소 제거
참고 : 정제 된 HP-NAP는 E. 표현 대장균 교환 및 호중구를 자극하기 전 독소 제거 버퍼링 실시 할 필요가있다.
- 이전 24 바와 같이 14 kDa의 분자량 컷오프 투석 튜빙을 사용하여 4 ℃에서, 둘 베코 인산 완충 생리 식염수 (D-PBS), pH를 7.2로 정제 HP-NAP의 버퍼를 변경 투석을 수행한다.
- syring를 통해 투석 HP-NAP 필터독소를 제거하기 위해 4 ℃에서 2.5 내지 4 ㎖ / 분 범위의 유속으로 20 ㎖의 일회용 주사기에 부착 된 양으로 하전 된 친수성 막과 E 필터.
나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE), 웨스턴 블로 팅, 기본-PAGE, 젤 여과 크로마토 그래피하고, 원 편광 이색 분광학에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP의 분자 특성 5. 특성
- 마우스 단일 클론 항체 단클론 항체 16F4 (25)를 포함하는 하이 브리 도마 배양 상층 액과 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP 분석으로 이전 24 설명했다.
- 이전 26 바와 같이 올리고머의 상태를 검사하는 네이티브-PAGE 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 정제하여 HP-NAP 분석.
- 이전 26 설명 된 바와 같이 그 차 구조를 조사하기 위해 원 편광 이색 분광기에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP를 분석합니다.
SDS-PAGE 젤의 실버 염색하여 HP-NAP의 순도 6. 평가
- 실버 염색 키트 제조업체의 지시에 따라, 용액은 용액, 현상액 민감 정착 용액을 조제 액을 정지하고, 세정 용액.
- 실버 염색 키트 제조업체의 지침에 따라 SDS-PAGE 젤은 염색을 수행합니다.
- 촬상 시스템 겔의 화상을 취득.
HP-NAP에 의해 유도 된 호중구에서 ROS 생산 7. 측정
- 이전 24 바와 같은 밀도 구배 원심 분리하여 인간 덱스 트란 침강 헤파린 혈액으로부터 인간 호중구를 분리.
- 호중구에서 ROS 생성의 측정은 루미놀 의존 화학 발광 분석을 사용하여 HP-NAP 자극.
- 접시 리더의 전원을 켜고 37 ° C의 온도를 설정합니다. 배치그것은 37 ° C로 예열 할 수 있도록 플레이트 리더 챔버 내부의 빈 평평한 바닥 96 웰 흰색 접시.
- 유무와 0.9 mM의 CaCl2를 0.5 밀리미터의 MgCl 2, 13.3 μM 5- 아미노 -2,3- 디 히드로 -1,4- phthalazinedione (루미놀)를 포함하는 상기 D-PBS, pH를 7.2에서 부양 혼합물을 준비 프로토콜 단계 4.2에서 준비 0.67 μm의 독소를 제거 HP-NAP의.
- 5 mM의 포도당을 함유하는 D-PBS, pH를 7.2에서 7.1 × 106 내지 2 세포 / ㎖, 프로토콜 단계에서 제조 된 인간 호중구의 농도를 조정한다.
- 96 웰 동안 플레이트의 각 웰에 호중구 현탁액의 50 μl를 추가합니다.
- 웰 당 5 초 간격으로 웰에 호중구 함유 프로토콜 단계 7.2.2에서 제조 한 자극의 혼합물 150 μl를 추가한다.
- 플레이트 판독기를 사용하여 한 3 시간에 걸쳐 웰 당 5 초 동안 화학 발광의 발광을 측정한다.
8.중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 DNA 플라스미드 숨겨 HP-NAP 돌연변이의 건설 사이트에 직접 돌연변이 유발을 기반
참고 : "침묵"제한 부위가 부위 특이 적 변이 (SDM) -assist 소프트웨어 (28)에 의해 돌연변이 유발 프라이머에 도입 된 것을 제외하고 이전 27 설명 된대로 PCR 기반의 사이트에 직접 돌연변이는 기본적으로 생성되었습니다.
- PCR 반응을 수행합니다.
- 최종주는 플라스미드 pET42a-NAP 10ng의 표 1에 열거 된 돌연변이 유발 성 프라이머 쌍을 1 μM, 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트 (dNTPs를), 및 탈 이온수를 함유하는 PCR 튜브에 고성능 PCR 효소 믹스 3 유닛 200 μM 추가 25 μL의 볼륨.
- 95에서 PCR 사이클을 시작 10 분 동안 ° C가 주형 DNA를 변성하고, 1 분 동안 95 ° C에서 12 증폭 사이클에 따라, T는 1 분 C ° -5 더 m이없고, 6 분 72 입출력 C.
- 하여 PCR 사이클을 완료1 분의 T m PP -5 ℃로 어닐링 단계와 30 분 동안 72 ℃에서 연장 단계.
- 2 시간 동안 37 ° C에서 DPN I 제한 효소 0.4 μL와 PCR 생성물의 15 μl를 처리 한 후 아가 로스 겔 전기 영동으로 처리 DPN I-PCR 생성물의 2 μL를 분석한다.
- 화면 돌연변이.
- E.으로 PCR 생성물의 2 μL 변환 42 ° C에서 45 초 동안 열 충격에 의해 대장균 DH5α 유능한 세포.
- 를 50㎍ / ㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에 형질 전환 된 세포를 확산하고 16 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양한다.
- 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 알칼리 용해 키트를 이용한 박테리아 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리.
- 제조사의 프로토콜에 따라 원하는 침묵 돌연변이의 존재를 확인하기를 XhoI 제한 효소로 프로토콜 단계 8.3.3에서 격리 플라스미드 DNA를 처리한다.
- 시퀀스플라스미드 DNA는 제조자의 프로토콜에 따라 HP-NAP 돌연변이 체의 코딩 서열의 보정을 확인하기 위해 T7 프로모터 프라이머 프로토콜 단계 8.3.4로 확인 하였다.
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Representative Results
재조합 HP-NAP의 부정적인 정제의 실험 절차의 개략도는 E. 표현 배치 모드에서 DEAE 이온 교환 수지를 사용하여 대장균은도 1에 도시된다. 이러한 정제 기술은 숙주 세포 단백질 및 / 또는 수지 HP-NAP 이외의 불순물의 결합에 기초한다. pH가 8.0에서 네이티브 형태의 HP-NAP를 제외하고 거의 다른 단백질이 결합되지 않은 부분 (그림 2A와 B)에서 발견된다. 언 바운드 분획 정제 된 HP-NAP는 HP-NAP (그림 2C)에 대한 항체 immunodetected하고, 실버 염색 (그림 2D)에 의해 확인 된 순도 높은 97 % 이상이었다. 네이티브-PAGE (도 2B) 및 겔 여과 크로마토 그래피 (도 3a)에 의해 분석 된 바와 같이 또한, 정제 된 재조합 HP-NAP는 올리고머 형태를 유지했다. 원 편광 이색의 spectroscopIC 분석은 정제 된 단백질은 주로 α-나선 (도 3B)으로 이루어지는 것으로 나타났다. 또한, 정제 된 HP-NAP는 ROS (도 3C)를 생성하는 인간 호중구를 자극 할 수 있었다. 따라서,이 방법에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP는 생물학적 활성을 갖는 천연의 형태이다. 또한,이 네가티브 모드 배치 크로마토 그래피는 하나의 단계에서 점 돌연변이 재조합 HP-NAP를 정제하는데 사용될 수있다.도 4에 도시 된 바와 같이, 두 개의 재조합 HP-NAP Y101H 및 HP-NAP E97GY101H 돌연변이, H.의 HP-NAP을 모방하는 파일로리 NCTC 11639 및 NCTC 11637 균주를, 각각 95 %보다 높은 순도 부정적인 모드 배치 크로마토 그래피에 의해 정제 하였다.
HP-NAP를 정화 DEAE 수지를 사용하여 네거티브 모드 배치 크로마토 행하는 정제에 사용되는 완충액의 pH 값을 8.0으로 조정되어야HP-NAP의 대부분이 결합되지 않은 부분에 있는지 확인합니다. 버퍼의 pH 값이 높거나 8.0 (그림 5)보다 낮을 때 HP-NAP의 적은 양이 언 바운드 분수에 존재했다. pH가 9.0 7.0 증가로 비 결합 분획 HP-NAP 존재 순도가 조금만 증가해도, 버퍼의 pH 값은 pH가되었을 때, 미 결합 분획 HP-NAP 존재 량이 가장 높았다 8.0 (그림 5). 수지에 로딩 세포 용 해물에서 가용성 단백질의 양이 정제를위한 또 다른 중요한 인자이다. 여기서, 비는 E.로부터 불순물을 흡수하는 수지의 최대 용량을 달성하기위한 수지 밀리리터 당 1.5 밀리그램 단백질을 인 대장균 (그림 6). 또한, 순도 부정적인 모드 배치 크로마토 수득 HP-NAP의 수율은 실질적 가용성 분획 HP-NAP 존재의 양을 증가시킴으로써 증가 될 수있다E.는 해물 대장균. 재조합 HP-NAP는 거의 완전히 pH가 9.0 (그림 7)에서 세포 용해시 가용성 분획에서 회수 하였다. 비록 E.에서 재조합 HP-NAP의 용해도 세포는 9.0보다 낮은 pH로 버퍼에 용해되었을 때 세포를 7.5 (도 7)보다 높은 pH로 버퍼에 용해되었을 때 대장균 해물이 현저히 증가하고, HP-NAP의 90 % 미만의 수용성 단백질로서 존재 하였다.
그림 1 :. 배치 모드에서 DEAE 수지로 HP-NAP의 부정적인 정화의 도식 개요 정제 일괄 결합 절차를 시작합니다. 박테리아 용 해물로부터 수득 HP-NAP를 포함하는 가용성 단백질 분획은 DEAE 수지의 pH 8.0 트리스 완충액으로 미리 평형화에 첨가된다. 단백질 / 수지 슬러리는 부드러운 믹시 1 시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션NG. 배양 동안, 숙주 세포 단백질을 수지에 결합한다. 언 바운드 분수에서 HP-NAP 존재 원심 분리 또는 중력 흐름에 의해 실행 열에서 흐름을 통해 분수 후 상등액을 수집 중 하나에 의해 얻어진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. DEAE 이온 교환 수지에 부정적인 모드 배치 크로마토 그래피에 의해 HP-NAP의 정제의 실시 결과 전체 세포 용 해물 (W)와 E의 수용성 단백질 분획 (S) HP-NAP 및 DEAE 이온 교환 크로마토 그래피에서 HP-NAP를 포함하는 미 결합 분획 (U)를 발현 대장균 BL21 (DE3)을 SDS-PAGE (A), 네이티브-PAGE (B) 및 웨스턴 블 롯팅 (C)에 의해 분석 하였다. 언 바운드 FRAC1 μg의 10 μg의 범위 단백질의 표시된 양 기 실버 묻은 SDS-PAGE 겔 (D)에서 분석 하였다. kDa의 분자 질량 (M)은 염색 젤과 얼룩의 왼쪽에 표시됩니다. (참고 24에서 적응) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 구조와 E.에서 정제 된 재조합 HP-NAP의 기능 특성 네거티브 모드 배치 크로마토 대장균. (A)는 자외선 흡광 프로파일은 겔 여과 칼럼으로부터 용출 HP-NAP에 대해 기록 하였다. 단백질 마커의 분자량은 질량 크로마토 그램에 표시 하였다. (B) 원거리 UV 원형 이색 SPECTHP-NAP의 럼은 195 내지 260 나노 미터의 파장 범위에서 기록 하였다. (C) 인간 호중구 (1 × 105 세포)를 37 ℃에서 대조군으로 0.5 μM HP-NAP 및 D-PBS, pH를 7.2로 처리 하였다. 호중구에서 ROS 생성의 함유량은 루미놀 의존 화학 발광 분석을 사용하여 연속적으로 측정 하였다. 데이터는 세중의 실험의 평균 ± 표준 편차로 표현 하였다. (참고 24에서 적응) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : E.으로 표현 재조합 HP-NAP의 돌연변이의 정화 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피에 의한 대장균. E.의 가용성 단백질 분획 대장균 BL21 (DE3) 두 개의 재조합 HP-NAP Y101H 및 HP-NAP E97GY101H 돌연변이 체를 발현하는 야생형 HP-NAP는 DEAE 수지와 네거티브 모드 크로마토 그래피에 의해 정제 하였다. 언 바운드 분획을 SDS-PAGE로 분석 하였다. kDa의 분자 질량 (M)은 염색 젤의 왼쪽에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : E.으로 표현 재조합 HP-NAP의 정제에 버퍼의 pH의 영향 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피에 의한 대장균. E.의 가용성 분획 pH가 9.0에 용해 HP-NAP 발현 대장균 BL21 (DE3)를 7.0에서 9.0에 이르는 표시된 pH가 0.3 ㎎ / ㎖의 단백질 농도로 조절 하였다. 이러한 조정부하로 표시 분획 한 후 4 ℃에서 네거티브 모드 배치 크로마토 재조합 HP-NAP를 정화 DEAE 수지 상에 로딩 하였다. 언 바운드, 세척 및 용출 분획을 SDS-PAGE로 분석 하였다. kDa의 분자 질량 (M)은 염색 젤의 왼쪽에 표시됩니다. (참고 24에서 적응) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : E.으로 표현 정화 재조합 HP-NAP에 대한 DEAE 수지에로드 된 단백질의 양에 미치는 영향 대장균. E.의 가용성 단백질 분획 대장균 BL21 (DE3) 표현 HP-NAP는에 따라 DEAE 수지에로드 된 recombi 정화 수지 밀리리터 당 밀리그램 단백질 나타낸 비율NANT HP-NAP의 pH 8.0에서 부정적인 모드 배치 크로마토 그래피. 가용성 단백질은, 부하 (L)의 비 결합 분획 (A), 세척 분획 (B) 및 SDS-PAGE로 분석 하였다 용출 분획 (C)로서 나타내었다. kDa의 분자 질량 (M)은 염색 젤의 왼쪽에 표시됩니다. (참고 24에서) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : E.에서 HP-NAP의 용해도에 pH가 미치는 영향 대장균 해물. (A) E. 대장균 BL21 (DE3)의 발현 HP-NAP는 7.0에서 9.5 범위의 pH에서 표시된 빙냉 트리스 염산 완충액에 현탁시켰다. 세포를 용해시키고, 다음 전체 세포 용 해물 (W)가 t를 원심 분리오 수용성 분획 (S)과 불용성 펠렛 (I)을 분리합니다. 단백질은 SDS-PAGE로 분석 하였다. kDa의 분자 질량 (M)은 염색 젤의 왼쪽에 표시됩니다. (B) 각 pH에서 전체 세포 용 해물의 재조합 HP-NAP 용해도의 비율이 W (전체 세포 용 해물에 대한 그 나눈 가용 분획 (S)에 대한 SDS 겔에 HP-NAP 밴드의 강도를 산출 하였다 ). 데이터는 적어도 두 개의 실험의 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. (참고 24에서) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 돌연변이 유발에 사용되는 프라이머. 카스티하세요이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK.
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Discussion
여기서 제시 DEAE 음이온 교환 수지와 네가티브 모드 배치 크로마토 그래피 E 대장균 과발현 재조합 HP-NAP의 정제에 적합하다. 세포 용해 및 정제의 단계에서 사용 된 완충액의 pH 값은 E.에서 HP-NAP의 용해도를 보장하기 위해 매우 중요 대장균 해물 각각 숙주 세포 불순물 재조합 HP-NAP를 효율적으로 분리. 균체을 pH 9.0에 용해되어야하고, 음의 정제는 높은 수율 및 고순도 HP-NAP를 획득하여 pH 8.0에서 수행되어야한다. HP-NAP의 전형적인 복구 90 %이고, 통상 95 % 순도는 24이다. HP-NAP가 결합되지 않은 부분에 존재하기 때문에, 상기 수지의 최소하지만 충분한 양의 불순물을 흡수하고 그것의 최대 용량을 달성하기 위해 사용되어야한다. 우리의 경우에는, 최대 부하 용량 E.에서 가용성 단백질의 1.5 mg을 밀리리터 수지 당 대장균 해물.
있습니다 proviDED 프로토콜은 50 ml의 E.에서 재조합 HP-NAP의 정제를 위해 설계되었습니다 대장균 문화. HP-NAP의 수율은 약 15 밀리그램이다. 정제 공정은 어느 다운 스케일링 또는 스케일링해서 적절히 할 수있다. 예를 들어, 두 개의 재조합 HP-NAP Y101H 및 HP-NAP E97GY101H 돌연변이는 1 ml의 E.으로부터 정제 된 이 제외 모드 배치 크로마토 그래피를 사용하여 대장균 배양. 95 %보다 높은 순도 모두 HP-NAP 돌연변이는 결합되지 않은 부분 (도 4)를 수집함으로써 얻어졌다. 이 부정적인 모드 배치 크로마토 그래피는 또한 860 ml의 E.에서 재조합 HP-NAP을 정화하기 위해 적용되었습니다 콜라이 배양. DEAE 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피를 사용하는 단계의 회수는 90 %보다 높은 순도가 97 %에 도달했다.
HP-NAP는 (B. 서브 틸리 스)이 성공적 DEAE 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피에 의해 정제 된 바실러스 서브 틸리 표현한 단계 이십육인치 우리의 B.에서 서브 틸리 발현 시스템은 HP-NAP의 발현 수준은 낮다. HP-NAP는 세균 해물에서 총 수용성 단백질의 약 5 %를 차지한다. 정제 대상 HP-NAP 효율적 거의 모든 내생을 제거하는 소량의 90 % 이상이 수지 상에 로딩 세포 용 해물로부터 단백질의 양의 비율을 감소시킴으로써 얻어 질 수 순도 HP-NAP에 존재하더라도 B.에서 단백질 서브 틸리 스 (26). 따라서,이 방법은 또한 다른 호스트 세균에서 발현 된 재조합 HP-NAP의 정화에 적용될 수있다.
여러 가지 방법이 네이티브 형태 14-16에서 재조합 HP-NAP의 정제에보고되었다. 그러나, 추가의 겔 여과 크로마토 그래피 단계는 고순도 HP-NAP를 얻기 위해 요구된다. 이 제외 크로마토 그래피 정제를 효율적으로 한번에 고순도 기능 재조합 HP-NAP를 얻을 수있다. additi에서에, 담수 단계 인해 언 바운드 부분에서 낮은 염 농도에 필요하지 않습니다. 일괄 모드 정제는 컬럼에 대한 필요성을 미연에 방지 할 수있다. 따라서, DEAE 수지를 사용하여이 부정적인 모드 배치 크로마토 그래피 높은 수율 및 순도의 기본 형태로 HP-HAP을 정화하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이 방법에 의해 정제 HP-NAP는 더 H. 백신, 신약 및 진단의 개발에 활용 될 수있다 파이로리는 질병 또는 다른 새로운 치료 응용 프로그램을 - 관련.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
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