Summary
وهناك طريقة العائد المرتفع على خطوة واحدة تنقية السلبية المؤتلف هيليكوباكتر بيلوري-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP) overexpressed في القولونية باستخدام راتنجات diethylaminoethyl في دفعة واسطة يوصف. HP-NAP تنقيته بواسطة هذه الطريقة هو مفيد لتطوير اللقاحات والعقاقير، أو تشخيص له. بيلوري -associated الأمراض.
Abstract
هيليكوباكتر بيلوري-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP) هو عامل الفوعة الرئيسي للهيليكوباكتر بيلوري (ه. بيلوري). انها تلعب دورا حاسما في ه. -induced بيلوري التهاب المعدة عن طريق تنشيط الكريات البيض عدة الفطرية بما فيها العدلات، وحيدات، والخلايا البدينة. الخصائص المناعية والمناعية من HP-NAP تجعل منه مرشحا محتملا التشخيص واللقاحات له. بيلوري ومرشح دواء جديد لعلاج السرطان. من أجل الحصول على كميات كبيرة من تنقية HP-NAP المستخدمة في التطبيقات السريرية لها، وسيلة فعالة لتنقية هذا البروتين مع ارتفاع العائد ونقاء يحتاج إلى أن تنشأ.
في هذا البروتوكول، ونحن قد وصفت طريقة لخطوة واحدة تنقية الكروماتوغرافي السلبية المؤتلف HP-NAP overexpressed في القولونية (إي كولاي) باستخدام diethylaminoethyl (DEAE) راتنجات التبادل الأيوني (على سبيل المثال، باستخدام Sephadex) طدفعة واسطة ن. يشكل المؤتلف HP-NAP ما يقرب من 70٪ من البروتين الكلي في E. يتم استرداد القولونية وبشكل كامل تقريبا في جزء قابل للذوبان على تحلل الخلايا في درجة الحموضة 9.0. تحت الظروف المثلى في الرقم الهيدروجيني 8.0، يتم استرداد معظم HP-NAP في جزء غير منضم في حين أن البروتينات الذاتية من E. تتم إزالة القولونية بكفاءة من الراتنج.
هذه طريقة تنقية باستخدام السلبي دفعة واسطة اللوني مع DEAE راتنجات التبادل الأيوني غلة وظيفية HP-NAP من E. القولونية في شكل الأصلي مع ارتفاع العائد والنقاء. المطهرون HP-NAP يمكن زيادة تستخدم للوقاية والعلاج، والتشخيص من H. بيلوري -associated الأمراض وكذلك علاج السرطان.
Introduction
هيليكوباكتر بيلوري (ه. بيلوري) هو أحد الأسباب الرئيسية لالتهاب المعدة والقرحة الهضمية. كما تم تصنيفها هذه البكتيريا كمادة مسرطنة في البشر من قبل الوكالة الدولية لبحوث السرطان، وهي جزء من منظمة الصحة العالمية، في عام 1994. وتشير التقديرات إلى أن معدل انتشار ه. العدوى بيلوري 70٪ في البلدان النامية، و30-40٪ في البلدان الصناعية 1. على الرغم من أن معدل إصابة ه. بيلوري يتناقص في البلدان الصناعية، فإن معدل إصابة ه. بيلوري في البلدان النامية لا يزال مرتفعا 2. العلاج القياسي للقضاء على ه. يتكون العدوى بيلوري من إدارة مضخة البروتون مثبط، مؤشر أسعار المنتجين، واثنين من المضادات الحيوية، كلاريثروميسين بالإضافة إلى أموكسيسيلين أو ميترونيدازول 3. ومع ذلك، وصعود المقاومة للمضادات الحيوية في H. ذات الصلة ب بيلوري العلاج قرحة يحث على وضع استراتيجيات جديدة لمنع سص علاج العدوى. تطوير لقاح وقائي و / أو العلاجية ضد ه. بيلوري يمكن أن توفر نهجا بديلا للسيطرة على ه. العدوى بيلوري.
هيليكوباكتر بيلوري تم تحديد-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP)، وهو عامل الفوعة كبير من H بيلوري، للمرة الأولى في المستخلصات المائية من H. بيلوري مع القدرة على تفعيل العدلات على الانضمام إلى الخلايا البطانية وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 4. تسلل العدلة من الغشاء المخاطي في المعدة وجدت في H. pylori- المرضى المصابين مع التهاب المعدة قد تسهم في التهاب وتلف الأنسجة المعدة. وبالتالي، قد HP-NAP تلعب دورا المرضية من خلال تفعيل العدلات للحث على التهاب المعدة، مما يسبب المزيد من قرحة أو H. بيلوري -associated الأمراض المعدية. ومع ذلك، HP-NAP هو مرشح محتمل للتطبيقات السريرية 5،6. نظرا للمحترفين مناعة والمناعيةperties من HP-NAP، هذا البروتين يمكن أن تستخدم لتطوير لقاحات، وكلاء العلاجية، وأدوات التشخيص. وقد أجريت تجربة سريرية لاستخدام المؤتلف HP-NAP واحدة من مكونات لقاح بروتين ضد ه. بيلوري. يتكون هذا اللقاح المؤتلف HP-NAP، المرتبط سامة للخلية جين ألف (CagA)، والبروتينات المفجي سامة للخلية ألف (فاكا) وضعت مع هيدروكسيد الألومنيوم، وكذلك ثبت أن تكون آمنة ومناعة لدى البشر (7). أيضا، HP-NAP بمثابة مناعي قوي لتحريك T نوع المساعد 1 (TH1) -polarized الاستجابات المناعية لعلاج السرطان 8 وأسفل تنظيم الاستجابات المناعية بوساطة TH2-التي تسببها الحساسية والالتهابات الطفيلية 9،10. أما بالنسبة للتشخيص، وقد تم تطبيق المؤتلف ELISA أساس HP-NAP للكشف عن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP في H. -infected بيلوري المرضى 11. وأظهرت إحدى الدراسات أن مستوى الأجسام المضادة HP-NAP الخاصة في الأمصال من H. السنة التحضيرية-infected وري المرضى الذين يعانون من سرطان المعدة وكان أعلى بكثير من تلك التي من المرضى الذين يعانون من التهاب المعدة المزمن 12. وأظهرت دراسة أخرى أيضا أن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP ترتبط مع وجود غير الفؤاد-المعدة غدية 13. وهكذا، يمكن تطبيقها المؤتلف ELISA أساس HP-NAP للكشف عن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP لتشخيص سرطان المعدة في H. -infected بيلوري المرضى. مجتمعة، المطهرون HP-NAP يمكن زيادة تستخدم للوقاية والعلاج، والتشخيص من H. بيلوري -associated الأمراض وكذلك علاج السرطان.
من بين العديد من الطرق المستخدمة لتنقية المؤتلف HP-NAP أعرب في القولونية (إي كولاي) في شكله الأصلي ذكرت حتى الآن، هناك حاجة إلى الثانية خطوة تنقية تنطوي اللوني هلام الترشيح للحصول نقية للغاية HP-NAP 14-16 . هنا، وطريقة استخدام سلبي اللوني دفعة واسطة معيوصف diethylaminoethyl (DEAE) راتنجات التبادل الأيوني لتنقية HP-NAP overexpressed في E. القولونية مع ارتفاع العائد ودرجة نقاوة عالية. واستندت هذه التقنية تنقية على الربط للبروتينات الخلية المضيفة و / أو غيرها من الشوائب من HP-NAP إلى الراتنج. في الرقم الهيدروجيني 8.0، يتم استرداد أي ما يقرب من البروتينات الأخرى باستثناء HP-NAP من الكسر غير منضم. هذا النهج تنقية باستخدام DEAE التبادل الأيوني اللوني في وضع سلبي بسيط وتوفير الوقت من خلال السماح تنقية المؤتلف HP-NAP عبر خطوة واحدة اللوني من خلال مجموعة من الكسر غير منضم. بالإضافة إلى HP-NAP، والعديد من الجزيئات الحيوية الأخرى، مثل الفيروسات 17، المناعي G (مفتش) 18، الهيموجلوبين 19، بروتين الفوسفاتيز 20، وعامل الفوعة فلاجيلين 21، كما تم الإبلاغ عن أن يطهر التبادل الأيوني اللوني في سلبية واسطة. ويفضل وضع سلبي للالتبادل الأيوني اللوني إذا الشوائب هي قاصرالمكونات الموجودة في العينة تعرضوا ليتم تنقيته 22. وقد استعرضت تطبيق اللوني سلبي في تنقية الجزيئات الحيوية الطبيعية أو المؤتلف مؤخرا 23.
ويقدم هذا التقرير خطوة بروتوكول خطوة للتعبير عن المؤتلف HP-NAP في E. القولونية، تحلل الخلايا، وتنقية HP-NAP باستخدام السلبي دفعة واسطة اللوني مع DEAE راتنجات التبادل الأيوني. إذا كان البروتين المطلوب لتنقية مناسبة للالتبادل الأيوني اللوني في وضع سلبي، ويمكن أيضا أن تتكيف بروتوكول صفها كنقطة انطلاق لتطوير عملية تنقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم جمع الدم البشري من المتطوعين الأصحاء للموافقة المسبقة عن خطية مسبقة وموافقة من مجلس المؤسسي استعراض جامعة تسينغ هوا الوطنية، هسينشو، تايوان.
1. التعبير عن المؤتلف HP-NAP في E. القولونية
- إعداد البلازميد pET42a-NAP التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي من HP-NAP من H. بيلوري 26695 سلالة كما هو موضح سابقا (16). إعداد البلازميدات التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي من HP-NAP مع الطفرات نقطة المطلوبة كما هو موضح (انظر البروتوكول، خطوة 8).
- تحويل 10 نانوغرام من البلازميدات الحمض النووي أعلاه إلى E. القولونية BL21 (DE3) الخلايا المختصة عن طريق الصدمة الحرارية لمدة 45 ثانية في 42 درجة مئوية، خط الخلايا على مرق استذابة (LB) أجار لوحات تحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
- تطعيم المستعمرات واحد في أنابيب الفردية التي تحتوي على 5 مل من مرق LB مع 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين وزراعتها كما precultures في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع اهتزاز عند 170 دورة في الدقيقة.
- تطعيم 2 مل من الخلايا ما قبل ثقافة أعلاه إلى 200 مل من مرق LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين في قارورة 1 لتر. احتضان القارورة ثقافة تلقيح عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع اهتزاز عند 170 دورة في الدقيقة حتى الامتصاصية في 600 نانومتر تصل إلى حوالي 0،4-0،5 الكشف عن طريق الأشعة فوق البنفسجية / VIS معمل.
- إضافة 80 ميكرولتر من 1 M الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) في الثقافة أعلاه لتركيز النهائي من 0.4 ملم للحث على التعبير عن HP-NAP. احتضان الثقافة لمدة 3 ساعة حتى الامتصاصية في 600 نانومتر تصل إلى حوالي 1،6-1،7.
- الطرد المركزي الخلايا في 6000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة طاف. تخزين بيليه خلية في -70 درجة مئوية حتى تنقية.
2. إعداد جزء البروتين القابلة للذوبان التي تحتوي على HP-NAP
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية للخروج في 4 درجات مئوية.
- و resuspend 50 مل من خلية صellet أعد بروتوكول خطوة 1.6 في 20 مل من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم التي تحتوي على 0.13 ملي phenylmethylsulfonyl فلوريد (PMSF)، 0.03 مم N-ألفا-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)، و 0.03 ملي N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) في 4 درجات مئوية كما سبق وصفها 16.
- تعطيل خلايا البكتيريا عن طريق تمرير تعليق البكتيرية من خلال الخالط ارتفاع ضغط تعمل على مجموعة من 15،000 إلى 20،000 رطل لمدة 7 مرات في 4 درجات مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي في الخلايا المحللة في 30000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لفصل أجزاء البروتين القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان باستخدام نابذة. نقل طاف باعتبارها جزء من البروتين القابلة للذوبان في كوب.
- قياس تركيز البروتين في جزء البروتين القابلة للذوبان باستخدام طريقة برادفورد باستخدام طقم التجارية مع زلال المصل البقري (BSA) كمعيار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إضافة 177.6 ميكرولتر من 1 N حمض الهيدروكلوريك إلى 20 مل من الالبريد ذوبان جزء من البروتين الحصول عليها من بروتوكول خطوة 2.3 إلى ضبط قيمة الرقم الهيدروجيني من درجة الحموضة 9.0 إلى 8.0 درجة الحموضة.
- إضافة 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم إلى محلول البروتين المذكور أعلاه لجعل تركيز البروتين النهائي ليكون 0.5 ملغ / مل.
3. تنقية المؤتلف HP-NAP من E. القولونية التي كتبها Negative اللوني دفعة واسطة مع DEAE الراتنجات التبادل الأيوني
- إعداد 15 مل من راتنجات DEAE.
- تزن من 0.6 غرام من مسحوق جاف من راتنجات DEAE وتعليقه في 30 مل من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 في اليوم على الاقل.
- أجهزة الطرد المركزي الراتنج في 10000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- إزالة والتخلص من طاف.
- إضافة 15 مل من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم.
- كرر بروتوكول الخطوات 3.1.2 إلى 3.1.4 أربع مرات أكثر.
- تخزين 15 مل استقر الراتنج (50٪ الطين في 30 مل العازلة تريس) في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.
ملاحظة: كل من الخطوة التاليةتتم الصورة من عند 4 درجات مئوية.
- إضافة 45 مل من البروتينات القابلة للذوبان التي أعدت في بروتوكول خطوة 2،6 حتي 15 مل من الراتنج وتحريك الطين بروتين / الراتنج مع محرك مغناطيسي في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- صب الطين بروتين / الراتنج في عمود من البلاستيك أو الزجاج مزودة محبس. تسمح الراتنج ليستقر تحت الجاذبية.
- فتح محبس للسماح الحل البروتين لتشغيل من خلال العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى مستوى السائل في العمود أعلاه هو مجرد الراتنج. جمع التدفق من خلال مثل جزء غير منضم، الذي يحتوي على تنقية HP-NAP.
- إضافة 15 مل من الجليد الباردة 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم في العمود.
- فتح محبس للسماح للغسل العازلة لتشغيل من خلال العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى مستوى السائل في العمود أعلاه هو مجرد الراتنج. جمع التدفق من خلال مثل جزء غسل.
- كرر بروتوكول الخطوات 3،5-3،6 أربع مرات أكثر لجمع الكسور غسل إضافية.
- إضافة 15 مل من الجليد الباردة 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 M كلوريد الصوديوم في عمود.
- فتح محبس للسماح للشطف العازلة لتشغيل من خلال العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى مستوى السائل في العمود أعلاه هو مجرد الراتنج. جمع من خلال تدفق كما الكسر شطف.
- كرر بروتوكول الخطوات 3،8-3،9 أربع مرات أكثر لجمع الكسور شطف إضافية.
4. تبادل العازلة وإزالة الذيفان الداخلي من HP-NAP تنقية كتبها Negative اللوني دفعة واسطة مع DEAE الراتنجات
ملاحظة: أعرب النقي HP-NAP في E. يحتاج القولونية يتعرضون للتخفيف الصرف وإزالة الذيفان الداخلي السابقة لتحفيز العدلات.
- أداء غسيل الكلى لتغيير المخزن المؤقت للتنقية HP-NAP إلى Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (D-PBS)، ودرجة الحموضة 7.2، في 4 درجات مئوية باستخدام أنابيب غسيل الكلى مع الوزن الجزيئي قطع من 14 كيلو دالتون كما هو موضح سابقا (24).
- تصفية مدال HP-NAP من خلال سيرينجالبريد فلتر مع موجبة الشحنة، غشاء ماء تعلق على 20 الحقنة مل في معدلات تدفق تتراوح 2،5-4 مل / دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الذيفان الداخلي.
5. توصيف خصائص الجزيئية لتنقية المؤتلف HP-NAP من الصوديوم دوديسيل كبريتات-إس دي إس بايج (SDS-PAGE)، ويسترن التنشيف، الأم-PAGE، جل الترشيح اللوني، والتعميم ازدواج اللون الطيفي
- تحليل المنقى المؤتلف HP-NAP بواسطة SDS-PAGE والغربية النشاف مع supernatants ثقافة هجين يحتوي الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة ماب 16F4 25 كما سبق وصفه (24).
- تحليل المطهرون HP-NAP التي كتبها الأم-PAGE وهلام الترشيح اللوني لدراسة وضعها بلازميدة قليلة القسيمات كما هو موضح سابقا (26).
- تحليل المنقى المؤتلف HP-NAP من ازدواج اللون الطيفي دائري لدراسة هيكلها الثانوي كما هو موضح سابقا (26).
6. تقييم الطهارة من HP-NAP من الفضة تلطيخ من هلام SDS-PAGE
- إعداد الحل وتحديد وتوعية حل، حل الفضة، ووضع حل، والتوقف عن الحل، والحل غسل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة للمجموعة الفضية تلطيخ.
- أداء تلطيخ الفضة من هلام SDS-PAGE وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لعدة تلطيخ الفضة.
- الحصول على صورة من هلام مع نظام التصوير.
7. قياس ROS الإنتاج من العدلات المستحث بواسطة HP-NAP
- عزل العدلات الإنسان من الدم heparinized البشري عن طريق الترسيب ديكستران تليها الطرد المركزي كثافة التدرج كما هو موضح سابقا (24).
- قياس الإنتاج ROS من العدلات حفز مع HP-NAP باستخدام التوهج الفحص تعتمد على مينول.
- تشغيل قارئ لوحة وضبط درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. وضعفارغة مسطحة القاع لوحة 96-جيدا بيضاء داخل الغرفة لوحة القارئ، والسماح لها الدافئة إلى 37 درجة مئوية.
- تحضير مخاليط التحفيز في مد برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2، التي تحتوي على 0.9 ملي CaCl 2، 0.5 ملي MgCl 2، و 13.3 ميكرومتر 5-أمينو-2،3-ثنائي هيدرو-1،4-phthalazinedione (مينول) مع وجود وغياب 0.67 ميكرومتر-إزالة الذيفان الداخلي HP-NAP أعدت من بروتوكول خطوة 4.2.
- ضبط تركيز العدلات الإنسان أعدت من الخطوة بروتوكول 7،1-2 × 10 6 خلية / مل في مد برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2، تحتوي على 5 ملي الجلوكوز.
- إضافة 50 ميكرولتر من تعليق العدلة في كل بئر من 96-بشكل جيد في حين طبق من ذهب.
- إضافة 150 ميكرولتر من خليط من الحوافز التي أعدت من بروتوكول خطوة 7.2.2 في العدلات تحتوي جيدا في فترة زمنية من 5 ثوان لكل بئر.
- قياس الانبعاثات من التوهج لمدة 5 ثوان لكل بئر على مدى ثلاث ساعات باستخدام قارئ لوحة.
8.بناء الحمض النووي البلازميدات ايواء HP-NAP المسوخ التي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) القائم على الطفرات الموقع المباشرة
ملاحظة: تم إنشاء PCR القائم الطفرات المباشر الموقع في الأساس كما هو موضح سابقا 27 إلا أن أدخلت المواقع قيود "الصامتة" لالاشعال الطفرات التي كتبها الطفرات موقع الموجه (SDM) برنامج -assist 28.
- أداء PCR رد الفعل.
- إضافة 10 نانوغرام البلازميد pET42a-NAP، 1 ميكرومتر من أزواج التمهيدي الطفرات المدرجة في الجدول 1، 200 ميكرومتر من triphosphates deoxynucleoside (dNTPs)، و 3 وحدات من مزيج انزيم عالية الدقة PCR في أنبوب PCR يحتوي على ماء منزوع الأيونات، وإعطاء النهائي حجم 25 ميكرولتر.
- بدء دورات PCR في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتفسد الحمض النووي القالب، وتابع مع 12 دورات التضخيم في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، T م لم -5 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 72 درجة مئوية لمدة 6 دقائق.
- الانتهاء من دورات PCR معخطوة الصلب في T م ص -5 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وخطوة التمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- علاج 15 ميكرولتر من الناتج PCR مع 0.4 ميكرولتر من DPN أنا انزيم التقييد عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة وبعد ذلك تحليل 2 ميكرولتر من الناتج PCR تعامل I-DPN من قبل الكهربائي للهلام الاغاروز.
- المسوخ الشاشة.
- تحويل 2 ميكرولتر من الناتج PCR إلى E. القولونية DH5α الخلايا المختصة عن طريق الصدمة الحرارية لمدة 45 ثانية في 42 درجة مئوية.
- نشر الخلايا تحولت على لوحة LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
- عزل DNA البلازميد من المستعمرات البكتيرية باستخدام عدة تحلل القلوية التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- علاج DNA البلازميد معزولة في بروتوكول خطوة 8.3.3 مع انزيم التقييد XhoI للتحقق من وجود الطفرات الصامتة المطلوبة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تسلسلDNA البلازميد التحقق من قبل بروتوكول خطوة 8.3.4 مع التمهيدي T7 المروج لتأكيد تصحيح تسلسل الترميز من المسوخ HP-NAP وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أعرب الرسم التخطيطي للإجراء التجريبي لتنقية السلبية المؤتلف HP-NAP في E. ويرد القولونية باستخدام DEAE راتنجات التبادل الأيوني في دفعة واسطة في الشكل 1. وتقوم هذه التقنية تنقية على الربط للبروتينات الخلية المضيفة و / أو غيرها من الشوائب من HP-NAP إلى الراتنج. في الرقم الهيدروجيني 8.0، يتم استرداد أي ما يقرب من البروتينات الأخرى باستثناء HP-NAP في شكله الأصلي من الكسر غير منضم (الشكل 2A وباء). وقد immunodetected وتنقيته HP-NAP في جزء غير منضم من الأجسام المضادة ضد HP-NAP (الشكل 2C)، وكان نقاوتها أعلى من 97٪ وهو ما أكدته تلطيخ الفضة (الشكل 2D). وبالإضافة إلى ذلك، أبقى المنقى المؤتلف HP-NAP شكله بلازميدة قليلة القسيمات كما تحليلها من قبل الأم-PAGE (الشكل 2B) واللوني هلام الترشيح (الشكل 3A). التعميم spectroscop ازدواج اللونوأظهر تحليل جيم أن البروتين المنقى وتتكون أساسا من α-اللوالب (الشكل 3B). أيضا، كان تنقيته HP-NAP قادرة على تحفيز العدلات الإنسان لإنتاج ROS (الشكل 3C). وهكذا، فإن المؤتلف HP-NAP تنقيته من هذا النهج هو في شكل الأصلي مع النشاط البيولوجي. وعلاوة على ذلك، وهذا سلبي اللوني دفعة واسطة يمكن استخدامها لتنقية المؤتلف HP-NAP مع الطفرات نقطة في خطوة واحدة. وكما هو مبين في الشكل (4)، وهما المؤتلف HP-NAP Y101H وHP-NAP E97GY101H المسوخ، التي تحاكي HP-NAP من H. بيلوري NCTC 11639 وNCTC 11637 سلالات، على التوالي، وتنقيته من هذا الوضع دفعة اللوني السلبي مع نقاء أعلى من 95٪.
لأداء سلبي اللوني دفعة واسطة باستخدام راتنجات DEAE لتنقية HP-NAP، ينبغي تعديل قيمة الرقم الهيدروجيني للالعازلة المستخدمة لتنقية إلى 8.0للتأكد من أن الغالبية العظمى من HP-NAP موجودة في جزء غير منضم. وكان مبلغ اقل من HP-NAP موجودة في الكسور غير منضم عندما كانت قيمة الرقم الهيدروجيني للعازلة أعلى أو أقل من 8.0 (الشكل 5). على الرغم من أن نقاء HP-NAP موجودة في الكسور غير منضم وزادت قليلا عن زيادة درجة الحموضة 7،0-9،0، كان المبلغ من HP-NAP موجودة في الكسور غير منضم أعلى عندما كانت قيمة الرقم الهيدروجيني للدرجة الحموضة عازلة 8.0 (الشكل 5). كمية من البروتينات القابلة للذوبان من الخلية لست] تحميلها على الراتنج هو عامل مهم آخر لهذا التطهير. هنا، وهذه النسبة 1.5 ملغ من البروتينات في الراتنج الملليمتر الواحد لتحقيق القدرة القصوى من الراتنج لاستيعاب الشوائب من E. القولونية (الشكل 6). وبالإضافة إلى ذلك، ونقاء والعائد من HP-NAP التي حصلت عليها هذه اللوني دفعة واسطة سلبي يمكن زيادة بشكل كبير عن طريق زيادة كمية HP-NAP موجودة في جزء قابل للذوبان منكولاي لست]. تم العثور المؤتلف HP-NAP بشكل كامل تقريبا في جزء قابل للذوبان على تحلل الخلايا في درجة الحموضة 9.0 (الشكل 7). على الرغم من أن ذوبان المؤتلف HP-NAP في E. وزادت القولونية لست] بشكل ملحوظ عندما هي lysed الخلايا في المنطقة العازلة مع الرقم الهيدروجيني أعلى من 7.5 (الشكل 7)، وكانت أقل من 90٪ من HP-NAP الحالية مثل البروتين القابلة للذوبان عندما كانت هي lysed الخلايا في المنطقة العازلة مع الرقم الهيدروجيني أقل من 9.0.
الشكل 1: ملخص تخطيطي لتنقية السلبية للHP-NAP التي كتبها DEAE الراتنجات في دفعة واسطة تبدأ تنقية مع إجراء ملزم دفعة واحدة. يضاف جزء من البروتين القابلة للذوبان التي تحتوي على HP-NAP تم الحصول عليها من لست] البكتيرية إلى الراتنج DEAE قبل معايرتها مع تريس العازلة في درجة الحموضة 8.0. ثم يتم تحضين البروتينات / عجائن الراتنج في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع انترنت لطيفنانوغرام. أثناء الحضانة، والبروتينات الخلية المضيفة ربط الراتنج. يتم الحصول HP-NAP موجودة في جزء غير منضم إما عن طريق جمع طاف بعد الطرد المركزي أو جزء التدفق من خلال من عمود تديرها تدفق الجاذبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتيجة المثالية لتنقية HP-NAP التي كتبها Negative اللوني دفعة واسطة مع الراتنجات DEAE التبادل الأيوني والمحللة خلية كاملة (W) وجزء من البروتين القابلة للذوبان (S) من E. وقد تم تحليل القولونية BL21 (DE3) معربا عن HP-NAP وجزء غير منضم (U) التي تحتوي على HP-NAP من DEAE التبادل الأيوني اللوني بواسطة SDS-PAGE (A)، وأصلي-PAGE (B)، والغربية النشاف (C). وفارك غير منضمتم تحليل نشوئها مع المبلغ المشار إليه من البروتينات تتراوح من 1 ميكروغرام إلى 10 ميكروغرام على هلام SDS-PAGE الملطخة الفضة (D). يشار إلى الجماهير الجزيئية (M) في كيلو دالتون على الجهة اليسرى من المواد الهلامية الملون وصمة عار. (مقتبس من مرجع 24) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): الهيكلي وتوصيف وظيفي المؤتلف HP-NAP تنقيته من E. القولونية التي كتبها Negative اللوني دفعة واسطة. (A) وسجلت الشخصي للأشعة فوق البنفسجية الامتصاصية ل HP-NAP مزال من عمود هلام الترشيح. وأشار الجماهير الجزيئية للعلامات البروتين على اللوني. (ب) والأشعة فوق البنفسجية بكثير ازدواج اللون دائرية SPECTوسجلت الروم من HP-NAP في نطاق الطول الموجي من 195-260 نانومتر. وعولج (C) العدلات البشرية (1 × 10 5 خلايا) مع 0.5 ميكرومتر HP-NAP ومد برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2، كعنصر تحكم السلبية عند 37 درجة مئوية. وقد تم قياس محتوى ROS المتولدة من العدلات باستمرار باستخدام التوهج الفحص تعتمد على مينول. مثلت البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري للتجربة في ثلاث نسخ. (مقتبس من مرجع 24) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تنقية المؤتلف المسوخ HP-NAP أعرب في E. القولونية التي كتبها Negative اللوني دفعة واسطة. كسور البروتين القابلة للذوبان من E. القولونية BL21 (DE3) التعبير عن اثنين المؤتلف HP-NAP Y101H وHP-NAP المسوخ E97GY101H وتم تنقيته من النوع البري HP-NAP قبل وضع اللوني السلبي مع راتنجات DEAE. وقد تم تحليل الكسور غير منضم بواسطة SDS-PAGE. يشار إلى الجماهير الجزيئية (M) في كيلو دالتون على الجهة اليسرى من المواد الهلامية الملون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: تأثير من العازلة درجة الحموضة في تنقية المؤتلف HP-NAP أعرب في E. القولونية التي كتبها Negative اللوني دفعة واسطة، وجزء للذوبان من E. القولونية BL21 (DE3) معربا عن HP-NAP هي lysed في درجة الحموضة 9.0 تم تعديلها لدرجة الحموضة أشار تتراوح 7،0-9،0 وتركيز البروتين من 0.3 ملغ / مل. هذه تعديلهاثم تم تحميل كسور، مشار إليه الحمل، على راتنجات DEAE لتنقية المؤتلف HP-NAP التي كتبها سلبي اللوني دفعة واسطة عند 4 درجات مئوية. وقد تم تحليل غير منضم، وغسل، وكسور شطف بواسطة SDS-PAGE. يشار إلى الجماهير الجزيئية (M) في كيلو دالتون على الجهة اليسرى من المواد الهلامية الملون. (مقتبس من مرجع 24) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تأثير كمية البروتينات المحملة على DEAE الراتنجات لتنقية المؤتلف HP-NAP أعرب في E. القولونية. كسور البروتين القابلة للذوبان من E. تم تحميل القولونية BL21 (DE3) معربا عن HP-NAP على راتنجات DEAE وفقا ل نسبة أشار البروتينات ملغ في كل ملليلتر من راتنجات لتنقية recombiنانت HP-NAP التي كتبها السلبية اللوني دفعة واسطة في درجة الحموضة 8.0. البروتينات القابلة للذوبان، وأشار أثناء تحميل (L)، وجزء غير منضم (A)، جزء غسل (B)، وتم تحليلها بواسطة SDS-PAGE جزء شطف (C). يشار إلى الجماهير الجزيئية (M) في كيلو دالتون على الجهة اليسرى من المواد الهلامية الملون. (من إشارة 24) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7: تأثير درجة الحموضة على ذوبانية HP-NAP في E. القولونية لست]. (A) E. القولونية BL21 (DE3) علقت معربا عن HP-NAP العازلة في تريس، حمض الهيدروكلوريك الجليد الباردة في درجة الحموضة أشار تتراوح 7،0-9،5. كانت هي lysed الخلايا وتم طرد الخلية لست] ثم بأكملها (W) رس فصل الأجزاء القابلة للذوبان (S) وكريات غير قابلة للذوبان (I). وقد تم تحليل البروتينات بواسطة SDS-PAGE. يشار إلى الجماهير الجزيئية (M) في كيلو دالتون على الجهة اليسرى من المواد الهلامية الملون. تم احتساب (ب) النسبة المئوية للذوبان المؤتلف HP-NAP في المحللة خلية كاملة في كل درجة الحموضة من شدة الفرقة HP-NAP على المواد الهلامية SDS لجزء قابل للذوبان (S) مقسوما على لالمحللة خلية كاملة (W ). مثلت البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري اثنين على الاقل من التجارب. (من إشارة 24) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: الاشعال المستخدمة لالطفرات. الرجاء CLإك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وضع دفعة اللوني السلبي مع DEAE راتنجات أنيون الصرف المقدمة هنا هي مناسبة لتنقية المؤتلف HP-NAP overexpressed في القولونية E. قيم الرقم الهيدروجيني للمخازن المستخدمة في خطوات تحلل الخلايا وتنقية هي حيوية للغاية لضمان ذوبان HP-NAP في E. لست] القولونية والفصل الفعال للالمؤتلف HP-NAP من الشوائب الخلية المضيفة، على التوالي. يجب هي lysed الخلايا البكتيرية في الرقم الهيدروجيني 9.0، ويجب أن يتم تنفيذ تنقية السلبية في درجة الحموضة 8.0 للحصول على HP-NAP في ارتفاع العائد ودرجة نقاوة عالية. انتعاش نموذجية من HP-NAP هو 90٪، ونقاء النموذجي هو 95٪ 24. منذ HP-NAP موجود في جزء غير منضم، وكمية الحد الأدنى ولكن يكفي من الراتنج وينبغي أن تستخدم لتحقيق القدرة القصوى على امتصاص الشوائب. في حالتنا، فإن أقصى قدرة التحميل 1.5 ملغ من البروتينات القابلة للذوبان من E. لست] القولونية في الراتنج ملليلتر.
و. نحن نتعاملتم تصميم بروتوكول دائرة التنمية الاقتصادية لتنقية المؤتلف HP-NAP من 50 مل E. ثقافة القولونية. العائد من HP-NAP حوالي 15 ملغ. عملية تنقية يمكن إما تحجيم أو توسيع نطاقها وفقا لذلك. على سبيل المثال، وتنقيته اثنين المؤتلف HP-NAP Y101H وHP-NAP المسوخ E97GY101H من 1 مل E. وقد تم الحصول على ثقافة القولونية باستخدام هذا سلبي اللوني دفعة واسطة. كل المسوخ HP-NAP مع نقاء أعلى من 95٪ عن طريق جمع جزء غير منضم (الشكل 4). كما تم تطبيق هذا سلبي اللوني دفعة واسطة لتنقية المؤتلف HP-NAP من 860 مل E. ثقافة القولونية. انتعاش الخطوة باستخدام DEAE سلبي اللوني دفعة واسطة وصلت 97٪ مع نقاء أعلى من 90٪.
وأعرب HP-NAP في العصوية الرقيقة (B. الرقيقة) كما تم تنقيته بنجاح هذا DEAE وضع سلبي دفعة اللونيفي خطوة واحدة 26. في منطقتنا B. الرقيقة نظام التعبير، ومستوى التعبير من HP-NAP منخفض. HP-NAP تمثل سوى حوالي 5٪ من إجمالي البروتينات القابلة للذوبان من لست] البكتيرية. على الرغم من HP-NAP المستهدفة لتنقية موجود في كمية صغيرة، HP-NAP مع نقاء يمكن الحصول على أعلى من 90٪ عن طريق خفض نسبة كمية من البروتينات من الخلية لست] تحميلها على الراتنج لإزالة بكفاءة تقريبا كل الذاتية البروتينات من B. الرقيقة (26). وهكذا، يمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة لتنقية المؤتلف HP-NAP أعرب في المضيفين البكتيرية الأخرى.
وقد تم الإبلاغ عن عدة طرق لتنقية المؤتلف HP-NAP في شكل الأصلي الخاص به 14-16. ومع ذلك، مطلوب خطوة إضافية الكروماتوغرافي هلام الترشيح للحصول على HP-NAP في نقاء عالية. هذه تنقية الكروماتوغرافي السلبية يمكن أن تسفر عن كفاءة وظيفية المؤتلف HP-NAP مع نقاء عالية في خطوة واحدة. في additiعلى، ليست هناك حاجة الخطوة تحلية المياه نظرا لانخفاض تركيز الأملاح في جزء غير منضم. يمكن تنقية دفعة واسطة أيضا تغني عن الحاجة إلى عمود. وهكذا، وهذا سلبي دفعة واسطة اللوني باستخدام راتنج DEAE يقدم طريقة بسيطة وفعالة لتنقية HP-HAP في شكل الأصلي مع ارتفاع العائد والنقاء. HP-NAP تنقيته بواسطة هذه الطريقة يمكن زيادة الاستفادة لتطوير اللقاحات والعقاقير الجديدة، والتشخيص له. بيلوري ذات الصلة ب الأمراض أو لتطبيقات علاجية جديدة أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
