Summary
En hög räntemetoden för ett steg negativ rening av rekombinant Helicobacter pylori neutrofilaktiverande protein (HP-NAP) överuttryckt i Escherichia coli genom att använda dietylaminoetyl hartser i satsvis beskrivs. HP-NAP renas genom denna metod är gynnsam för utvecklingen av vacciner, läkemedel eller diagnostik för H. pylori -associated sjukdomar.
Abstract
Helicobacter pylori neutrofil-aktiverande protein (HP-NAP) är en viktig virulensfaktor av Helicobacter pylori (H. pylori). Den spelar en avgörande roll i H. pylori-inducerad gastrisk inflammation genom att aktivera flera medfödda leukocyter inklusive neutrofiler, monocyter och mastceller. De immunogena och immunmodulerande egenskaper hos HP-NAP gör det en potentiell diagnos och vaccinkandidat för H. pylori och en ny läkemedelskandidat för cancerbehandling. I syfte att erhålla väsentliga mängder av renat HP-NAP används för dess kliniska tillämpningar, till en effektiv metod att rena detta protein med högt utbyte och renhet behöver upprättas.
I detta protokoll har vi beskrivit en metod för en-stegs negativ kromatografisk rening av rekombinant HP-NAP överuttryckt i Escherichia coli (E. coli) genom användning av dietylaminoetyl (DEAE) jonbytarmassa (eg., Sephadex) in satsvis. Rekombinant HP-NAP utgör nästan 70% av det totala proteinet i E. coli och är nästan helt återhämtat sig i den lösliga fraktionen efter cellys vid pH 9,0. Med optimal kondition vid pH 8,0, är majoriteten av HP-NAP utvanns i den obundna fraktionen medan de endogena proteiner från E. coli effektivt avlägsnas genom hartset.
Denna reningsmetod med användning av negativ läge batch-kromatografi med DEAE jonbytarmassor ger funktionell HP-NAP från E. coli i dess nativa form med högt utbyte och renhet. Det renade HP-NAP skulle kunna utnyttjas ytterligare för förebyggande, behandling och prognos av H. pylori -associated sjukdomar samt cancerterapi.
Introduction
Helicobacter pylori (H. pylori) är en viktig orsak till gastrit och magsår. Denna bakterie har också klassificerats som cancerframkallande hos människor från International Agency for Research on Cancer, en del av Världshälsoorganisationen, 1994. Det har uppskattats att förekomsten av H. pylori-infektion är 70% i utvecklingsländerna och 30-40% i industriländerna 1. Även om infektionen hastigheten för H. pylori minskar i industriländerna, infektionsfrekvensen av H. pylori i utvecklingsländerna är fortfarande hög två. Standardbehandlingen för att utrota H. pylori-infektion består av administrering av en protonpumpshämmare, PPI, och två antibiotika, klaritromycin plus amoxicillin eller metronidazol 3. Men ökningen av antibiotikaresistens hos H. pylori -relaterade sår terapi uppmanar utvecklingen av nya strategier för att förebygga or bota infektionen. Utveckling av förebyggande och / eller terapeutisk vaccination mot H. pylori kan ge ett alternativt tillvägagångssätt för att styra H. pylori-infektion.
Helicobacter pylori neutrofil-aktiverande protein (HP-NAP), en viktig virulensfaktor av H pylori, identifierades först i extrakt vatten från H. pylori med förmågan att aktivera neutrofiler att vidhäfta till endotelceller och producera reaktiva syreradikaler (ROS) 4. Neutrofil infiltration av magslemhinnan hittas i H. pylori-infekterade patienter med aktiv gastrit kan resultera i inflammation och vävnadsskada i magen. Således kan HP-NAP spela en patologisk roll genom att aktivera neutrofiler att inducera gastrisk inflammation, vilket ytterligare orsakar magsår eller H. pylori -associated gastric sjukdomar. Ändå är HP-NAP en potentiell kandidat för kliniska tillämpningar 5,6. På grund av den immunogena och immunmodulerande proegenskaper till HP-NAP, kunde detta protein användas för att utveckla vacciner, terapeutiska medel och diagnostiska verktyg. En klinisk prövning har genomförts för att använda rekombinant HP-NAP som en av komponenterna i ett proteinvaccin mot H. pylori. Detta vaccin består av rekombinant HP-NAP, cellgift associerad gen A (CagA) och vakuoliserande cytotoxin A (VacA) proteiner formuleras med aluminiumhydroxid och har dessutom visat sig vara säker och immunogen i människor 7. Också fungerar HP-NAP som en potent immunmodulator för att utlösa T-hjälpar typ 1 (Th1) -polarized immunsvar för cancerterapi 8 och att nedreglera Th2-medierade immunsvar som framkallas av allergiska reaktioner och parasitinfektioner 9,10. När det gäller diagnostik, har rekombinant HP-NAP-baserade ELISA använts för att påvisa serumantikroppar mot HP-NAP i H. pylori infekterade patienter 11. En studie visade att nivån av HP-NAP-specifika antikroppar i sera från H. pylori infekterade patienter med magcancer var betydligt högre än den från patienter med kronisk gastrit 12. En annan studie visade också att serumantikroppar mot HP-NAP är associerade med närvaron av icke-kardia magcancer 13. Således kan rekombinant HP-NAP-baserade ELISA appliceras för att detektera serumantikroppar mot HP-NAP för prognos av magcancer i H. pylori-infekterade patienter. Sammantaget kan det renade HP-NAP utnyttjas ytterligare för förebyggande, behandling och prognos av H. pylori -associated sjukdomar samt cancerterapi.
Bland flera metoder som används för rening av rekombinant HP-NAP uttryckts i Escherichia coli (E. coli) i dess nativa form rapporterats hittills, behövs ett andra reningssteg inbegriper gelfiltreringskromatografi för att erhålla högren HP-NAP 14-16 . Här, en metod som använder negativ läge batch-kromatografi meddietylaminoetyl (DEAE) jonbytarhartser beskrivs för rening av HP-NAP överuttryckt i E. coli med högt utbyte och hög renhet. Denna reningsteknik baserades på den bindning av värdcellproteiner och / eller andra än HP-NAP till hartset föroreningar. Vid pH 8,0, är nästan inga andra proteiner förutom HP-NAP utvinnas från den obundna fraktionen. Detta renings tillvägagångssätt och använda DEAE jonbyteskromatografi i negativt driftläge är enkel och tidsbesparande genom att tillåta rening av rekombinant HP-NAP via ett-steg-kromatografi genom insamling av den obundna fraktionen. Förutom HP-NAP, flera andra biomolekyler, såsom virus 17 immunglobulin G (IgG) 18, hemoglobin 19, proteinfosfatas 20, och virulensfaktor flagellin 21, har också rapporterats som skall renas genom jonbyteskromatografi i negativ läge. Det negativa sättet är att föredra för jonbyteskromatografi, om föroreningar är den mindrekomponenter som är närvarande i provet utsattes för skall renas 22. Tillämpningen av negativa kromatografi i rening av naturliga eller rekombinanta biomolekyler har nyligen över 23.
Denna rapport ger en steg för steg-protokoll för uttryck av rekombinant HP-NAP i E. coli, lysering av cellerna, och rening av HP-NAP med användning av negativ läge batch-kromatografi med DEAE jonbyteshartser. Om ett protein som önskas för rening är lämplig för jonbyteskromatografi i negativ-läge, kan den beskrivna protokollet även anpassas som en utgångspunkt för utvecklingen av en reningsprocess.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant blod samlades från friska frivilliga försökspersoner med skriftligt informerat samtycke och godkännande från Institutional Review Board of National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan.
1. Expression av rekombinant HP-NAP i E. coli
- Förbereda plasmiden pET42a-NAP innehållande DNA-sekvensen för HP-NAP från H. pylori 26695 stammen som tidigare beskrivits 16. Framställa plasmider innehållande DNA-sekvensen av HP-NAP med de önskade punktmutationer såsom beskrivits (se protokollet, steg 8).
- Omvandla 10 ng av ovanstående DNA-plasmider in i E. coli BL21 (DE3) kompetenta celler genom värmechock under 45 sekunder vid 42 ° C, i rad cellerna på lysogeni-buljong (LB) agarplattor innehållande 50 | j, g / ml kanamycin, och inkubera plattorna vid 37 ° C under 16 h.
- Inokulera enstaka kolonier i individuella rör innehållande 5 ml LB-buljong med 50 mikrogram / ml kanamycin och odla dem som pre-kulturer vid 37 ° C under 16 h med skakning vid 170 rpm.
- Ympa 2 ml av ovannämnda pre-kulturceller i 200 ml LB-buljong innehållande 50 | j, g / ml kanamycin i en 1-liters kolv. Inkubera det inokulerade odlingskolv vid 37 ° C under 2 h med skakning vid 170 rpm till dess att absorbansen vid 600 nm når ca 0,4-0,5 detekteras av en UV / VIS-spektrofotometer.
- Tillsätt 80 ul av 1 M isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) i ovanstående kultur till en slutlig koncentration av 0,4 mM för att inducera uttrycket av HP-NAP. Inkubera odlingen under 3 timmar till dess att absorbansen vid 600 nm når cirka 1,6 till 1,7.
- Centrifugera cellerna vid 6000 xg vid 4 ° C under 15 min för att avlägsna supernatanten. Lagra cellpelleten vid -70 ° C fram till rening.
2. Framställning av den lösliga proteinfraktionen innehållande HP-NAP
Obs: Alla följande steg utföres vid 4 ° C.
- Resuspendera 50 ml av cell pEllet framställd i Protokollsteg 1,6 i 20 ml 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM NaCl innehållande 0,13 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 0,03 mM N-alfa-tosyl-L-lysinyl-klormetylketon (TLCK), och 0,03 mM N-tosyl-L-fenylalaninyl-klormetylketon (TPCK) vid 4 ° C såsom beskrivits tidigare 16.
- Sönderdela bakteriecellerna genom att passera den bakteriella suspensionen genom en högtryckshomogenisator som drivs vid ett intervall av 15000 till 20000 psi under 7 gånger vid 4 ° C.
- Centrifugera cellysatet vid 30.000 x g vid 4 ° C under 1 h för att separera lösliga och olösliga proteinfraktioner med användning av en ultracentrifug. Överför supernatanten som den lösliga proteinfraktionen till en bägare.
- Mäta proteinkoncentrationen av den lösliga proteinfraktionen genom Bradford-metoden med användning av ett kommersiellt kit med bovint serumalbumin (BSA) som standard i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Lägga 177,6 | il av 1 N HCl i 20 ml the lösliga proteinfraktionen som erhållits från protokoll steg 2,3 för att justera dess pH-värde från pH 9,0 till pH 8,0.
- Tillsätt 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl till ovanstående proteinlösningen för att göra den slutliga proteinkoncentrationen att vara 0,5 mg / ml.
3. Rening av rekombinant HP-NAP Från E. coli genom Negativ läge Batch Kromatografi med DEAE jonbytarmassor
- Förbered 15 ml DEAE-hartser.
- Väg in 0,6 g torrt pulver av DEAE-hartser och suspendera det i 30 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl vid rumstemperatur under åtminstone en dag.
- Centrifugera hartset vid 10.000 x g vid 4 ° C under 1 min.
- Avlägsna och kassera supernatanten.
- Tillsätt 15 ml av 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl.
- Upprepa protokoll steg 3.1.2 till 3.1.4 fyra gånger.
- Lagra 15 ml fast harts (50% uppslamning i 30 ml Tris-buffert) vid 4 ° C för efterföljande användning.
Notera: Alla följande stegs utförs vid 4 ° C.
- Tillsätt 45 ml av de lösliga proteinerna som framställts i Protokollsteg 2,6-15 ml av hartset och omrör protein / hartsuppslamningen med en magnetisk omrörare vid 4 ° C under 1 timme.
- Häll protein / harts uppslamningen i en plast- eller glaskolonn försedd med en avstängningskran. Tillåt hartset sedimentera under tyngdkraften.
- Öppna kranen för att tillåta proteinlösningen att löpa genom kolonnen genom gravitationsflöde tills vätskenivån i kolonnen är precis ovanför hartset. Samla genomströmning som den obundna fraktionen, som innehåller det renade HP-NAP.
- Tillsätt 15 ml iskall 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl in i kolonnen.
- Öppna kranen för att tillåta tvättbuffert för att gå igenom kolonnen med gravitationsflöde tills vätskenivån i kolonnen är precis ovanför hartset. Samla genomströmning som tvättfraktionen.
- Upprepa protokoll steg 3,5 till 3,6 fyra gånger för att samla in ytterligare tvättfraktionerna.
- Tillsätt 15 ml iskall 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl i en kolonn.
- Öppna kranen för att medge elueringsbufferten rinna genom kolonnen genom gravitationsflöde tills vätskenivån i kolonnen är precis ovanför hartset. Samla genomströmning som elueringsfraktionen.
- Upprepa protokoll steg 3,8 till 3,9 fyra gånger för att samla in ytterligare elueringsfraktionerna.
4. buffertbyte och Endotoxin Borttagning av HP-NAP Renad av negativ läge Batch Kromatografi med DEAE Resins
Obs: Det renade HP-NAP uttryckt i E. coli behöver utsättas för buffertbyte och endotoxin avlägsnande före stimulera neutrofiler.
- Utföra dialys för att ändra bufferten hos det renade HP-NAP till Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (D-PBS), pH 7,2, vid 4 ° C genom användning av dialysrör med molekylviktgräns av 14 kDa som tidigare beskrivits 24.
- Filtrera den dialyserade HP-NAP genom en Syringe filter med en positivt laddad, hydrofilt membran fäst till en 20 ml engångsspruta vid flödeshastigheter från 2,5 till 4 ml / minut vid 4 ° C för att avlägsna endotoxin.
5. Karakterisering av de molekylära egenskaper renat rekombinant HP-NAP genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), Western Blotting, Native-PAGE, Gelfiltreringskromatografi, och cirkulär dikroism-spektroskopi
- Analysera det renade rekombinanta HP-NAP genom SDS-PAGE och western blotting med hybridomodlingssupernatanter innehållande monoklonal musantikropp MAb 16F4 25 såsom tidigare beskrivits 24.
- Analysera det renade HP-NAP genom nativ PAGE och gelfiltreringskromatografi för att undersöka sin oligomera status som tidigare beskrivits 26.
- Analysera det renade rekombinanta HP-NAP genom cirkulär dikroism-spektroskopi för att undersöka dess sekundära struktur som tidigare beskrivits 26.
6. Utvärdering av renheten av HP-NAP genom silverfärgning av en SDS-PAGE-gel
- Förbereda fixeringslösningen, sensibiliserande lösning, silverlösning, framkallningslösning, stopplösning och tvättlösning i enlighet med tillverkarens instruktioner av en silverfärgningskit.
- Utföra silverfärgning av en SDS-PAGE-gel i enlighet med tillverkarens instruktioner av en silverfärgningskit.
- Hämta bilden av gelén med ett avbildningssystem.
7. Mätning av ROS Produktion från neutrofiler framkallad av HP-NAP
- Isolera humana neutrofiler från humant hepariniserat blod genom dextransedimentering följt av densitetsgradientcentrifugering såsom tidigare beskrivits 24.
- Mätning av ROS-produktionen från neutrofiler stimulerade med HP-NAP genom att använda en luminol beroende kemiluminiscens analys.
- Slå på en plattläsare och ställa in temperaturen vid 37 ° C. placera entom flatbottnade 96 brunnar vit platta i plattläsaren kammaren, gör det möjligt att värma till 37 ° C.
- Framställa de stimulans blandningar i D-PBS, pH 7,2, innehållande 0,9 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, och 13,3 | iM 5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazindion (luminol) med närvaro och frånvaro av 0,67 pM endotoxin-bort HP-NAP framställd från Protokollsteg steg~~POS=HEADCOMP 4,2.
- Justera koncentrationen av humana neutrofiler framställda från Protokollsteg 7,1 till 2 x 10 6 celler / ml i D-PBS, pH 7,2, innehållande 5 mM glukos.
- Tillsätt 50 pl av neutrofil suspensionen i varje brunn i 96-brunnars medan plattan.
- Tillsätt 150 | il av de stimulansblandningar framställda från protokoll steg 7.2.2 i brunnen innehållande neutrofiler med ett tidsintervall av 5 sekunder per brunn.
- Mäta emissionen av kemiluminiscens för 5 sek per brunn under en period av tre timmar med användning av en plattläsare.
8.Konstruktion av DNA-plasmider HP-NAP mutanter av Polymerase Chain Reaction (PCR) -baserade Plats direkt mutagenes
Notera: PCR-baserad webbplats-direktmutagenes genererades i princip såsom beskrivits tidigare 27 med undantag av att de "tysta" restriktionsställen infördes till de mutagenes primers genom ställesriktad mutagenes (SDM) -assist programvara 28.
- Utför PCR-reaktion.
- Lägga 10 ng plasmid pET42a-NAP, 1 ^ M av mutagenes primerpar som anges i tabell 1, 200 ^ M av deoxinukleosidtrifosfater (dNTPs), och 3 enheter av high-fidelity PCR enzymblandning i en PCR-rör innehållande avjoniserat vatten, vilket gav en slutlig volym av 25 | il.
- Initiera PCR-cykler vid 95 ° C under 10 min för att denaturera DNA-mallen, och följer med 12 amplifieringscykler vid 95 ° C under 1 minut, T m ingen -5 ° C under 1 minut och 72 ° C i 6 min.
- Avsluta PCR-cykler medett glödgningssteg vid T m pp -5 ° C under 1 minut och ett förlängningssteg vid 72 ° C under 30 min.
- Behandla 15 | il av PCR-produkten med 0,4 | il av Dpnl restriktionsenzym vid 37 ° C under 2 h och sedan analysera 2 | il av Dpnl-behandlat PCR-produkt genom agarosgelelektrofores.
- Skärm mutanter.
- Omvandla 2 | il av PCR-produkten in i E. coli DH5a-kompetenta celler genom värmechock för 45 sek vid 42 ° C.
- Sprida de transformerade cellerna på en LB-platta innehållande 50 | j, g / ml kanamycin och inkubera plattan vid 37 ° C under 16 h.
- Isolera plasmid-DNA från de bakteriekolonier med användning av en kommersiell alkalisk lys kit enligt tillverkarens protokoll.
- Behandla plasmid-DNA isolerades i protokoll steg 8.3.3 med Xhol-restriktionsenzym för att verifiera närvaron av de önskade tysta mutationer enligt tillverkarens protokoll.
- sekvensenplasmid-DNA verifieras genom protokoll steg 8.3.4 med T7 promotor-primer för att bekräfta korrigeringen av de kodande sekvenserna av HP-NAP mutanter enligt tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den schematiskt diagram över den experimentella proceduren av negativ rening av rekombinant HP-NAP uttryckt i E. coli genom att använda DEAE jonbytarmassor i batch-läge visas i figur 1. Denna reningsteknik baserad på bindning av värdcellproteiner och / eller andra än HP-NAP till hartset föroreningar. Vid pH 8,0, är nästan inga andra proteiner förutom HP-NAP i dess nativa form utvinnas från den obundna fraktionen (figur 2A och B). Det renade HP-NAP i den obundna fraktionen immunodetected genom antikroppen mot HP-NAP (figur 2C), och dess renhet var högre än 97% vilket bekräftades genom silverfärgning (figur 2D). Dessutom hålls det renade rekombinanta HP-NAP dess oligomer form enligt analys med nativ-PAGE (Figur 2B) och gelfiltreringskromatografi (figur 3A). Cirkulär dikroism spectroscopic-analys visade att det renade proteinet huvudsakligen består av a-spiraler (figur 3B). Också, det renade HP-NAP var förmåga att stimulera humana neutrofiler att producera ROS (figur 3C). Sålunda är den rekombinanta HP-NAP renas genom detta tillvägagångssätt i dess nativa form med biologisk aktivitet. Dessutom kan denna negativa sättet sats kromatografi användas för att rena rekombinant HP-NAP med punktmutationer i ett steg. Såsom visas i figur 4, de två rekombinanta HP-NAP Y101H och HP-NAP E97GY101H mutanter, vilka härmar HP-NAP av H. pylori NCTC 11639 och NCTC 11,637 stammar, respektive, renades genom detta negativa sättet sats-kromatografi med en renhet högre än 95%.
För utförande av negativa sättet sats kromatografi med användning av DEAE-hartser för att rena HP-NAP, bör pH-värdet för den buffert som används för rening justeras till 8,0för att säkerställa att majoriteten av HP-NAP är närvarande i den obundna fraktionen. Mindre mängd av HP-NAP var närvarande i de obundna fraktionerna när pH-värdet i bufferten var högre eller lägre än 8,0 (Figur 5). Även om renheten av HP-NAP närvarande i de obundna fraktionerna ökades bara lite som pH ökade från 7,0 till 9,0, mängden av HP-NAP närvarande i de obundna fraktionerna var den högsta när pH-värdet i bufferten var pH 8,0 (Figur 5). Mängden av de lösliga proteinerna från cellysaten laddades på hartset är en annan viktig faktor för denna rening. Här är förhållandet 1,5 mg proteiner per milliliter harts för att uppnå maximal kapacitet hos hartset att absorbera föroreningar från E. coli (figur 6). Dessutom kan renheten och utbytet av HP-NAP erhålles med detta negativa sättet sats kromatografi ökas väsentligt genom att öka mängden av HP-NAP närvarande i den lösliga fraktionen avE. coli-lysat. Rekombinant HP-NAP var nästan helt återhämtat sig i den lösliga fraktionen efter cellys vid pH 9,0 (figur 7). Även om lösligheten för rekombinanta HP-NAP i E. coli-lysat var markant ökad när cellerna lyserades i buffert med pH-värde högre än 7,5 (fig 7), var närvarande i form av det lösliga proteinet mindre än 90% av HP-NAP när cellerna lyserades i buffert med pH lägre än 9,0.
Figur 1:. Schematisk skiss av Negativ Rening av HP-NAP genom DEAE Resins i batch-läge Reningen börjar med en sats-bindande förfarandet. Den lösliga proteinfraktionen som innehåller HP-NAP erhållen från bakterielysat tillsättes till DEAE-harts som förekvilibrerats med tris-buffert vid pH 8,0. De proteiner / harts uppslamningar inkuberas därefter vid 4 ° C under 1 timme med varsam mixing. Under inkuberingen, de värdcellsproteiner binder till hartset. HP-NAP närvarande i den obundna fraktionen erhålles genom antingen samla supernatanten efter centrifugering eller genomflödesfraktionen från en kolonn som drivs av gravitationsflöde. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Exempel Resultat av rening av HP-NAP genom negativ läge Batch Kromatografi med DEAE jonbytarmassor Hela cellysat (W) och lösliga proteinfraktionen (S) på E. coli BL21 (DE3) som uttrycker HP-NAP och den obundna fraktionen (U) innehållande HP-NAP från DEAE jonbyteskromatografi analyserades med SDS-PAGE (A), nativ-PAGE (B), och western blotting (C). Den obundna fraction med den angivna mängden av proteiner som sträcker sig från 1 mikrogram till 10 mikrogram analyserades på en silverfärgad SDS-PAGE-gel (D). Molekylmassor (M) i kDa anges till vänster av de färgade geler och blotten. (Från 24 referens) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: strukturell och funktionell karakterisering av rekombinant HP-NAP renade från E. coli genom Negativ Läge Batch Chromatography. (A) Den UV-absorbansprofilen registrerades för HP-NAP eluerades från en gel-filtreringskolonn. De molekylära massorna av de proteinmarkörer indikerades på kromatogrammet. (B) Den bortre UV cirkulär dikroism SPECTrom HP-NAP registrerades vid våglängdsområdet 195 till 260 nm. (C) Humana neutrofiler (1 x 10 5 celler) behandlades med 0,5 | iM HP-NAP och D-PBS, pH 7,2, som negativ kontroll vid 37 ° C. Innehållet i ROS genereras från neutrofiler mättes kontinuerligt med hjälp av en luminol beroende kemiluminiscens analys. Data var representerade som medelvärde ± standardavvikelse för ett experiment i triplikat. (Från 24 referens) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Rening av rekombinanta HP-NAP mutanter uttrycktes i E. coli genom Negativ läge Batch Chromatography. De lösliga proteinfraktioner av E. coli BL21 (DE3) som uttrycker två rekombinanta HP-NAP Y101H och HP-NAP E97GY101H mutanter och vildtyp HP-NAP renades genom den negativa sättet kromatografi med DEAE-hartser. De obundna fraktionerna analyserades med SDS-PAGE. Molekylmassor (M) i kDa anges till vänster av de färgade geler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Effekt av buffert pH på Rening av rekombinant HP-NAP Uttryckt i E. coli genom Negativ läge Batch kromatografi. Den lösliga fraktionen av E. coli BL21 (DE3) som uttrycker HP-NAP lyserades vid pH 9,0 justerades till det angivna pH som sträcker sig från 7,0 till 9,0 och en proteinkoncentration av 0,3 mg / ml. dessa justeradefraktioner, indikerade som belastning, laddades sedan på DEAE-hartser för att rena rekombinant HP-NAP genom negativ läge satsvis kromatografi vid 4 ° C. De obundna, tvätta, och elueringsfraktionerna analyserades med SDS-PAGE. Molekylmassor (M) i kDa anges till vänster av de färgade geler. (Från 24 referens) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Effekt av mängden proteiner Loaded på DEAE Resins för rening av rekombinant HP-NAP Uttryckt i E. coli. De lösliga proteinfraktioner av E. coli BL21 (DE3) som uttrycker HP-NAP laddades på DEAE-hartser enligt den indikerade förhållandet av mg proteiner per milliliter av hartser för att rena recombinant HP-NAP av den negativa läget satsvis kromatografi vid pH 8,0. De lösliga proteinerna, indikeras som last (L), den obundna fraktionen (A), tvätta fraktion (B), och eluering fraktion (C) analyserades med SDS-PAGE. Molekylmassor (M) i kDa anges till vänster av de färgade geler. (Från 24 referens) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Effekt av pH på lösligheten av HP-NAP i E. coli Lysat. (A) E. coli BL21 (DE3) som uttrycker HP-NAP suspenderades i iskall Tris-HCl-buffert vid det angivna pH som sträcker sig från 7,0 till 9,5. Cellerna lyserades och sedan hela cellysat (W) centrifugerades to separera lösliga fraktioner (S) och olösliga pellets (I). Proteinerna analyserades med SDS-PAGE. Molekylmassor (M) i kDa anges till vänster av de färgade geler. (B) Den procentuella andelen av lösligheten av rekombinant HP-NAP i hela cellysat vid varje pH beräknades från intensiteten av HP-NAP-bandet på SDS-geler för den lösliga fraktionen (S) dividerat med det för hela cellysat (W ). Data var representerade som medelvärde ± standardavvikelse för minst två experiment. (Från 24 referens) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Primers som används för mutagenes. Vänligen click här för att se en större version av denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det negativa sättet sats-kromatografi med DEAE anjonbytarhartser som presenteras här är lämplig för rening av rekombinant HP-NAP överuttryckt i E. coli. PH-värdena för de buffertar som användes i stegen i cellys och rening är mycket avgörande för att säkerställa lösligheten av HP-NAP i E. coli-lysat och effektiv separation av rekombinant HP-NAP från värdcellföroreningar, respektive. Bakterieceller bör lyserades vid pH 9,0, och den negativa reningen bör utföras vid pH 8,0 för att erhålla HP-NAP i högt utbyte och hög renhet. Typiska återvinning av HP-NAP är 90%, och typiska renhet är 95% 24. Eftersom HP-NAP är närvarande i den obundna fraktionen, bör en minimal men tillräcklig mängd av hartset användas för att uppnå sin maximala förmåga att absorbera sådana föroreningar. I vårt fall är 1,5 mg av de lösliga proteinerna från E. den maximala lastkapaciteten coli-lysat per milliliter harts.
bestämded-protokollet är utformat för rening av rekombinant HP-NAP från en 50 ml E. coli kultur. Utbytet av HP-NAP är cirka 15 mg. Reningsprocessen kan antingen förminskad eller skalas upp i enlighet därmed. Till exempel har de två rekombinanta HP-NAP Y101H och HP-NAP E97GY101H mutanter renades från en 1 ml E. coli kultur genom att använda denna negativa läget parti kromatografi. Båda mutanter HP-NAP med renhet högre än 95% erhölls genom att samla den obundna fraktionen (Figur 4). Denna negativa läge batch kromatografi har också använts för att rena rekombinant HP-NAP från en 860 ml E. coli kultur. Återhämtningen i steg med hjälp av DEAE negativ läge batch-grafi har nått 97% med en renhet högre än 90%.
HP-NAP uttryckt i Bacillus subtilis (B. subtilis) har också med framgång renas genom denna DEAE negativt tillstånd satsvis kromatografii ett steg 26. I vår B. subtilis-expressionssystemet, är expressionsnivån av HP-NAP låg. HP-NAP endast står för cirka 5% av de totala lösliga proteiner från bakterielysat. Även om HP-NAP riktat för rening är närvarande i en liten mängd, HP-NAP med renhet högre än 90% kan erhållas genom att reducera förhållandet mellan mängden av proteiner från cellysat laddades på hartset för att effektivt avlägsna nästan all den endogena proteiner från B. subtilis 26. Sålunda kan denna metod också tillämpas för att rena rekombinant HP-NAP uttryckta i andra bakteriella värdar.
Flera metoder har rapporterats för rening av rekombinant HP-NAP i dess nativa form 14-16. Emellertid är en ytterligare gelfiltrering kromatografiskt steg krävs för att erhålla HP-NAP i hög renhet. Denna negativa kromatografiska rening kan effektivt ge funktionell rekombinant HP-NAP med hög renhet i ett steg. i additipå, behövs inte avsaltningssteget beroende på den låga saltkoncentrationen i den obundna fraktionen. Satsen-mode rening skulle också kunna undanröja behovet av en kolonn. Således, denna negativa läget satsvis kromatografi med användning av DEAE-harts erbjuder en enkel och effektiv metod för att rena HP-HAP i dess nativa form med högt utbyte och renhet. HP-NAP renas genom denna metod skulle kunna användas vidare för att utveckla vacciner, nya läkemedel och diagnostik för H. pylori -relaterade sjukdomar eller för andra nya terapeutiska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
