Summary
Un metodo ad alto rendimento per un solo passaggio di purificazione negativo ricombinante Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine (HP-NAP) sovraespresso in Escherichia coli utilizzando resine dietilamminoetil in modalità batch è descritta. HP-NAP purificata da questo metodo è utile per lo sviluppo di vaccini, farmaci, o diagnostica per H. pylori -associated malattie.
Abstract
Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine (HP-NAP) è un importante fattore di virulenza di Helicobacter pylori (H. pylori). Essa svolge un ruolo fondamentale in H. pylori indotta infiammazione gastrica attivando diversi leucociti innate tra neutrofili, monociti e mastociti. Le proprietà immunogeniche e immunomodulanti di HP-NAP lo rendono un candidato potenziale diagnostico e vaccino per H. pylori e un nuovo candidato farmaco per la terapia del cancro. Per ottenere quantità sostanziali di purificato HP-NAP utilizzato per le sue applicazioni cliniche, un metodo efficace per purificare questa proteina con alta resa e purezza deve essere stabilito.
In questo protocollo, abbiamo descritto un metodo per un passo negativo purificazione cromatografica ricombinante HP-NAP sovraespresso in Escherichia coli (E. coli) utilizzando dietilamminoetil (DEAE) resine a scambio ionico (per es., Sephadex) imodalità batch n. Ricombinante HP-NAP costituisce quasi il 70% delle proteine totali in E. coli ed è quasi completamente recuperato nella frazione solubile upon lisi cellulare a pH 9,0. A condizione ottimale a pH 8,0, la maggioranza di HP-NAP viene recuperato nella frazione non legata mentre le proteine endogene da E. coli sono efficacemente rimossi dalla resina.
Questo metodo di purificazione mediante cromatografia modalità negativa batch con resine a scambio ionico DEAE produce funzionale HP-NAP da E. coli nella sua forma nativa con alta resa e purezza. L'HP-NAP purificata potrebbe essere ulteriormente utilizzato per la prevenzione, il trattamento e la prognosi di H. pylori -associated malattie e terapia del cancro.
Introduction
Helicobacter pylori (H. pylori) è una delle principali cause di gastrite e ulcera peptica. Questo batterio è stato classificato come sostanza cancerogena per l'uomo dall'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro, che fa parte dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, nel 1994. E 'stato stimato che la prevalenza di H. pylori è del 70% nei paesi in via di sviluppo e il 30-40% nei paesi industrializzati 1. Anche se il tasso di infezione di H. pylori è in calo nei paesi industrializzati, il tasso di infezione di H. pylori nei paesi in via di sviluppo è ancora alto 2. Il trattamento standard per sradicare H. pylori consiste nella somministrazione di un inibitore della pompa protonica, PPI, e due antibiotici, claritromicina più amoxicillina o metronidazolo 3. Tuttavia, l'aumento della resistenza agli antibiotici in H. pylori -related terapia dell'ulcera sollecita lo sviluppo di nuove strategie per prevenire or curare l'infezione. Sviluppo di vaccinazione preventiva e / o terapeutico contro H. pylori potrebbe fornire un approccio alternativo per controllare H. pylori.
Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine (HP-NAP), un importante fattore di virulenza di H. pylori, è stato identificato in estratti di acqua di H. pylori con la possibilità di attivare neutrofili di aderire alle cellule endoteliali e produrre specie reattive dell'ossigeno (ROS) 4. Infiltrazione dei neutrofili della mucosa gastrica si trovano in H. pylori pazienti infettati con gastrite attiva possono provocare infiammazione e danni ai tessuti dello stomaco. Così, HP-NAP può giocare un ruolo patologico attivando neutrofili per indurre infiammazione gastrica, che provoca ulteriore ulcera o H. pylori -associated malattie gastriche. Tuttavia, HP-NAP è un potenziale candidato per le applicazioni cliniche 5,6. A causa della pro immunogenica e immunomodulanteprietà di HP-NAP, questa proteina potrebbero essere utilizzati per sviluppare vaccini, agenti terapeutici, e strumenti diagnostici. Uno studio clinico è stato condotto per l'utilizzo ricombinante HP-NAP come uno dei componenti di un vaccino contro H. proteine pylori. Questo vaccino è costituito da ricombinante HP-NAP, cytotoxin associata gene A (CagA), e le proteine vacuolizzante citotossina A (VacA) formulato con idrossido di alluminio ed è stato ulteriormente dimostrato di essere sicuro ed immunogenico negli esseri umani 7. Inoltre, HP-NAP agisce come un potente immunomodulatore per innescare T helper di tipo 1 (Th1) -polarized risposte immunitarie per la terapia del cancro 8 e per regolare le risposte immunitarie Th2-mediate indotte da reazioni allergiche e infezioni parassitarie 9,10. Per quanto riguarda la diagnostica, ricombinante ELISA HP-NAP-based è stata applicata per rilevare gli anticorpi sierici contro HP-NAP in H. pylori -infected pazienti 11. Uno studio ha mostrato che il livello di anticorpi specifici per HP-NAP nei sieri di H. pylori -infected pazienti con cancro gastrico è risultata significativamente più alta di quella di pazienti con gastrite cronica 12. Un altro studio ha anche dimostrato che gli anticorpi sierici contro HP-NAP sono associati con la presenza di non-cardias adenocarcinoma gastrico 13. Così, ricombinante ELISA HP-NAP-based può essere applicata per rilevare anticorpi contro HP-NAP per la prognosi del cancro gastrico in H. pylori -infected pazienti. Nel loro insieme, la HP-NAP purificata potrebbe essere ulteriormente utilizzato per la prevenzione, il trattamento e la prognosi di H. pylori -associated malattie e terapia del cancro.
Tra i vari metodi utilizzati per la purificazione di ricombinante HP-NAP espresso in Escherichia coli (E. coli), nella sua forma nativa, presentate finora, una cromatografia di gel-filtrazione seconda fase di purificazione che coinvolge è necessario per ottenere elevata purezza HP-NAP 14-16 . Qui, un metodo che utilizza negativo cromatografia modalità batch condietilamminoetil (DEAE) resine a scambio ionico è descritto per la purificazione di HP-NAP sovraespresso in E. coli con alto rendimento e di elevata purezza. Questa tecnica di purificazione è stata basata sul legame di proteine della cellula ospite e / o impurezze diverse HP-NAP alla resina. A pH 8,0, quasi senza altre proteine tranne HP-NAP vengono recuperati dalla frazione non legata. Questo approccio purificazione mediante DEAE cromatografia a scambio ionico in modalità negativa è semplice e risparmio consentendo purificazione ricombinante HP-NAP tramite one-step cromatografia attraverso la raccolta della frazione libera tempo. Oltre ad HP-NAP, diverse altre biomolecole, come virus 17, Immunoglobulina G (IgG) 18, emoglobina 19, proteina fosfatasi 20, e fattore di virulenza flagellin 21, sono stati segnalati anche ad essere purificata dalla cromatografia a scambio ionico in negativo modalità. La modalità negativa è preferito per cromatografia a scambio ionico se impurità sono il minorecomponenti presenti nel campione sottoposto da depurare 22. L'applicazione della cromatografia negativo purificazione di biomolecole naturali o ricombinanti è stato recentemente rivisto 23.
Il presente rapporto fornisce un passo per passo il protocollo per l'espressione ricombinante HP-NAP in E. coli, la lisi delle cellule, e purificazione di HP-NAP utilizzando modalità negativa cromatografia batch con resine a scambio ionico DEAE. Se una proteina desiderata per purificazione è adatto per cromatografia a scambio ionico in modo negativo, il protocollo descritto potrebbe anche essere adattato come punto di partenza per lo sviluppo di un processo di purificazione.
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Protocol
Il sangue umano è stato raccolto da volontari sani con il previo consenso informato scritto e approvazione da parte del Institutional Review Board della National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan.
1. Espressione ricombinante HP-NAP in E. coli
- Preparare il plasmide pET42a-NAP che contiene la sequenza di DNA di HP-NAP da H. pylori 26695 ceppo come descritto in precedenza 16. Preparare i plasmidi contenenti la sequenza di DNA di HP-NAP con le mutazioni puntiformi desiderati come descritto (vedi protocollo, punto 8).
- Trasformare 10 ng dei plasmidi di DNA sopra in E. coli BL21 (DE3) cellule competenti di shock termico per 45 secondi a 42 ° C, striscia le celle brodo lisogenia (LB) piastre di agar contenenti 50 mg / ml kanamicina, e incubare le piastre a 37 ° C per 16 ore.
- Seminare singole colonie in tubi singoli contenenti 5 ml di brodo LB con 50 ug / ml kanamicina e crescere come precultures a 37 ° C per 16 ore con agitazione a 170 giri al minuto.
- Seminare 2 ml di cellule pre-coltura sopra in 200 ml di brodo LB contenente 50 ug / ml kanamicina in un pallone da 1 L. Incubare la pallone di coltura inoculato a 37 ° C per 2 ore con agitazione a 170 rpm fino l'assorbanza a 600 nm raggiunge circa 0,4-0,5 rilevati mediante UV / VIS.
- Aggiungere 80 ml di 1 M isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) nella cultura sopra ad una concentrazione finale di 0,4 mM di indurre l'espressione di HP-NAP. Incubare la coltura per 3 ore finché l'assorbanza a 600 nm raggiunge circa 1,6-1,7.
- Centrifugare le cellule a 6000 xga 4 ° C per 15 minuti per rimuovere il surnatante. Conservare il pellet cellulare a -70 ° C fino purificazione.
2. Preparazione della frazione proteica solubile contenenti HP-NAP
Nota: Tutti i seguenti passaggi vengono effettuati a 4 ° C.
- Risospendere 50 ml della cellula pEllet preparata nel protocollo punto 1.6 in 20 ml di 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM NaCl contenente 0.13 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), 0,03 mM N-alpha-tosil-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK), e 0,03 mM N-tosil-L-fenilalaninil-chloromethylketone (TPCK) a 4 ° C come descritto in precedenza 16.
- Frantumare le cellule dei batteri facendo passare la sospensione batterica attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione azionata ad una gamma di 15.000 a 20.000 psi per 7 volte a 4 ° C.
- Centrifugare il lisato cellulare a 30.000 xg a 4 ° C per 1 ora per separare le frazioni proteiche solubili e insolubili utilizzando un'ultracentrifuga. Trasferire il surnatante come frazione proteica solubile in un becher.
- Misurare la concentrazione di proteine della frazione proteina solubile con il metodo di Bradford utilizzando un kit commerciale con siero albumina bovina (BSA) come standard secondo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere 177,6 ml di HCl 1 N in 20 ml di thfrazione proteica solubile e ottenuto dal protocollo punto 2.3 per regolarne il valore di pH da pH 9,0 a pH 8,0.
- Aggiungere 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl alla soluzione proteica sopra per effettuare la concentrazione proteica finale sia 0,5 mg / ml.
3. Purificazione di ricombinante HP-NAP Da E. coli da Negativo cromatografia modalità batch con resine a scambio ionico DEAE
- Preparare 15 ml di resine DEAE.
- Pesare 0,6 g di polvere secca di resine DEAE e sospensione in 30 ml di 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl a temperatura ambiente per almeno 1 giorno.
- Centrifugare la resina a 10.000 x ga 4 ° C per 1 min.
- Rimuovere e scartare il surnatante.
- Aggiungere 15 ml di 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl.
- Ripetere i passaggi protocollo 3.1.2 a 3.1.4 quattro volte di più.
- Conservare i 15 ml di resina regolate (50% slurry in 30 ml di tampone Tris) a 4 ° C per un uso successivo.
Nota: Tutti i seguenti steps è condotta a 4 ° C.
- Aggiungere 45 ml di proteine solubili preparati nel protocollo punto 2.6 a 15 ml della resina e mescolare la poltiglia proteine / resina con un agitatore magnetico a 4 ° C per 1 ora.
- Versare la poltiglia proteine / resina in una colonna plastica o vetro, dotata di rubinetto. Lasciare che la resina di stabilirsi per gravità.
- Aprire il rubinetto per consentire alla soluzione proteica per eseguire attraverso la colonna flusso per gravità fino a che il livello del liquido nella colonna è appena sopra la resina. Raccogliere il flusso attraverso la frazione non legata, che contiene il purificato HP-NAP.
- Aggiungere 15 ml di ghiaccio freddo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl nella colonna.
- Aprire il rubinetto per consentire al tampone di lavaggio per eseguire attraverso la colonna flusso per gravità fino a che il livello del liquido nella colonna è appena sopra la resina. Raccogliere il flusso attraverso la frazione di lavaggio.
- Ripetere i passaggi protocollo 3.5 a 3.6 quattro volte di più per raccogliere le frazioni di lavaggio aggiuntivi.
- Aggiungere 15 ml di ghiaccio freddo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl in una colonna.
- Aprire il rubinetto per consentire al tampone di eluizione a correre attraverso la colonna flusso per gravità fino a che il livello del liquido nella colonna è appena sopra la resina. Raccogliere il flusso attraverso la frazione di eluizione.
- Ripetere i passaggi protocollo 3.8 a 3.9 quattro volte di più per raccogliere le frazioni di eluizione aggiuntivi.
4. Scambio Buffer e rimozione di endotossina HP-NAP Purificato da Negative cromatografia modalità batch con DEAE Resine
Nota: Il purificato HP-NAP espresso in E. coli deve essere sottoposto al buffer di scambio e la rimozione di endotossina prima stimolare neutrofili.
- Eseguire dialisi per modificare il buffer del purificato HP-NAP di tampone fosfato salino di Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, a 4 ° C utilizzando tubo di dialisi con molecolare cutoff peso di 14 kDa come descritto in precedenza 24.
- Filtrare il HP-NAP dializzata attraverso un SyringFiltro e con una carica positiva, la membrana idrofila attaccato ad una siringa monouso da 20 ml a portate da 2,5 a 4 ml / minuto a 4 ° C per rimuovere endotossine.
5. caratterizzazione delle proprietà molecolari del purificata ricombinante HP-NAP di dodecil solfato di sodio-SDS-PAGE (SDS-PAGE), Western Blotting, nativo-PAGE, gel filtrazione Cromatografia e Circular Dicroismo Spettroscopia
- Analizzare il purificato ricombinante HP-NAP mediante SDS-PAGE e western blotting con sovranatanti di coltura di ibridomi contenenti anticorpo monoclonale murino Mab 16F4 25 come descritto in precedenza 24.
- Analizzare la purificato HP-NAP da nativo-PAGE e cromatografia su gel di filtrazione per esaminare lo stato oligomerico come descritto in precedenza 26.
- Analizzare il purificato ricombinante HP-NAP mediante spettroscopia di dicroismo circolare per esaminare la sua struttura secondaria come descritto in precedenza 26.
6. Valutazione della purezza di HP-NAP da Silver colorazione di un gel SDS-PAGE
- Preparare la soluzione di fissaggio, sensibilizzazione soluzione, soluzione d'argento, soluzione di sviluppo, stop soluzione, e la soluzione di lavaggio secondo le istruzioni di un kit d'argento colorazione del produttore.
- Eseguire colorazione d'argento di un gel SDS-PAGE secondo le istruzioni di un kit di colorazione d'argento del produttore.
- Acquisire l'immagine del gel con un sistema di imaging.
7. Misura del ROS di produzione dai neutrofili indotta da HP-NAP
- Isolare neutrofili umani da sangue eparinizzato umano mediante sedimentazione destrano seguita da centrifugazione in gradiente di densità come descritto in precedenza 24.
- Misura della produzione di ROS da neutrofili stimolati con HP-NAP utilizzando un saggio di chemiluminescenza luminol-dipendente.
- Attivare un lettore di piastre e impostare la temperatura a 37 ° C. Inserire unfondo piatto vuoto piatto a 96 pozzetti bianca all'interno della camera di lettore di piastre, permettendo così di riscaldare a 37 ° C.
- Preparare le miscele di stimolo in D-PBS, pH 7,2, contenente 0,9 mM CaCl 2, 0.5 mM MgCl 2 e 13,3 pM 5-ammino-2,3-diidro-1,4-phthalazinedione (luminol) con la presenza e assenza di 0,67 micron endotossine-rimosso HP-NAP preparata dal protocollo passo 4.2.
- Regolare la concentrazione di neutrofili umani preparati protocollo punto 7.1 a 2 x 10 6 cellule / ml in D-PBS, pH 7,2, contenente 5 mM di glucosio.
- Aggiungere 50 ml di sospensione di neutrofili in ciascun pozzetto della 96-bene mentre plate.
- Aggiungere 150 microlitri della miscela stimolo preparati con protocollo punto 7.2.2 nei neutrofili e contenenti un intervallo di tempo di 5 secondi per pozzetto.
- Misurare le emissioni di chemiluminescenza per 5 sec per oltre un periodo di tre ore utilizzando un lettore di piastre.
8.La costruzione del DNA plasmidi ospitare HP-NAP Mutants da Polymerase Chain Reaction (PCR) a base di mutagenesi sito-diretta
Nota: mutagenesi sito-diretta PCR-based è stato generato essenzialmente come descritto in precedenza 27, tranne che i siti di restrizione "silenziose" sono state introdotte per i primer di mutagenesi sito-diretta dal mutagenesi (SDM) software -Assistere 28.
- Eseguire la PCR reazione.
- Aggiungere 10 ng di plasmide pET42a-NAP, 1 mM di mutagenesi coppie di primer elencati nella tabella 1, 200 micron di trifosfati deossinucleosidici (dNTP), e 3 unità di alta fedeltà mix enzima PCR in una provetta PCR contenenti acqua deionizzata, dando una finale volume di 25 microlitri.
- Avviare i cicli di PCR a 95 ° C per 10 minuti per denaturare il DNA stampo, e seguire con 12 cicli di amplificazione a 95 ° C per 1 minuto, T M No -5 ° C per 1 minuto, e 72 ° C per 6 min.
- Finire i cicli di PCR conuna fase di ricottura a T m pp -5 ° C per 1 minuto ed una fase di estensione a 72 ° C per 30 min.
- Trattare 15 ml di prodotto di PCR con 0,4 ml di Dpn I restriction enzyme a 37 ° C per 2 ore e quindi analizzare 2 microlitri del prodotto PCR Dpn I trattati mediante elettroforesi su gel di agarosio.
- mutanti schermo.
- Trasforma 2 ml di prodotto di PCR in E. coli DH5α cellule competenti di shock termico per 45 sec a 42 ° C.
- Distribuire le cellule trasformate su una piastra di LB contenente 50 ug / ml kanamicina e incubare la piastra a 37 ° C per 16 ore.
- Isolare il DNA plasmidico dalle colonie batteriche utilizzando un kit commerciale lisi alcalina secondo il protocollo del produttore.
- Trattare il DNA plasmide isolato nel protocollo passo 8.3.3 con XhoI enzima di restrizione per verificare la presenza delle mutazioni silenti desiderati secondo il protocollo del produttore.
- sequenza ilplasmide DNA verificato da protocollo passo 8.3.4 con T7 promotore primer per confermare la correzione delle sequenze codificanti di mutanti HP-NAP secondo il protocollo del produttore.
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Representative Results
Lo schema della procedura sperimentale di purificazione negativo ricombinante HP-NAP espressa in E. coli mediante resine a scambio ionico DEAE in modalità batch è mostrato in Figura 1. Questa tecnica di purificazione è basato sul legame di proteine della cellula ospite e / o impurezze diverse HP-NAP alla resina. A pH 8,0, quasi senza altre proteine tranne HP-NAP nella sua forma nativa vengono recuperati dalla frazione libera (Figura 2A e B). Il purificato HP-NAP della frazione non legata è stata immunodetected dagli anticorpi contro HP-NAP (Figura 2C), e la sua purezza era superiore al 97% come confermato mediante colorazione argento (Figura 2D). Inoltre, il purificato ricombinante HP-NAP mantenuto sua forma oligomerica come analizzato da nativo-PAGE (Figura 2B) e la cromatografia per gel filtrazione (Figura 3A). Circolare spectroscop dicroismoanalisi ic ha mostrato che la proteina purificata è composto principalmente da alfa-eliche (Figura 3B). Inoltre, il purificato HP-NAP era in grado di stimolare neutrofili umani per produrre ROS (Figura 3C). Così, il ricombinante HP-NAP purificato mediante questo approccio è nella sua forma nativa con attività biologica. Inoltre, questo negativo cromatografia modalità batch può essere usata per purificare ricombinante HP-NAP con mutazioni puntiformi in un unico passaggio. Come mostrato in figura 4, le due ricombinanti mutanti HP-NAP Y101H e HP-NAP E97GY101H, che imitano HP-NAP di H. pylori NCTC 11639 e NCTC 11.637 casi ceppi rispettivamente, sono stati purificati da questa modalità negativa cromatografia batch con purezza superiore al 95%.
Per eseguire negativo cromatografia modalità batch utilizzando resine DEAE per purificare HP-NAP, il valore pH del tampone utilizzato per la purificazione deve essere regolata a 8.0per assicurare che la maggior parte di HP-NAP è presente nella frazione non legata. Minore quantità di HP-NAP era presente nelle frazioni non associati quando il valore pH del tampone è superiore o inferiore a 8,0 (Figura 5). Anche se la purezza di HP-NAP presente nelle frazioni non legato è stata aumentata solo un po 'come pH aumentato da 7.0 al 9.0, la quantità di HP-NAP presente nelle frazioni non legato era il più alto quando il valore pH del tampone era pH 8,0 (Figura 5). La quantità di proteine solubili da lisati cellulari caricati sulla resina è un altro fattore importante per questa purificazione. Qui, il rapporto è di 1,5 mg di proteine alla resina millilitro per conseguire la massima capacità della resina di assorbire le impurità da E. coli (Figura 6). Inoltre, la purezza e resa di HP-NAP ottenuto da questo negativo cromatografia modalità batch possono essere notevolmente aumentata aumentando la quantità di HP-NAP presente nella frazione solubileE. coli lisati. Ricombinante HP-NAP fu quasi completamente recuperato nella frazione solubile upon lisi cellulare a pH 9,0 (Figura 7). Anche se la solubilità ricombinante HP-NAP in E. coli lisati era marcatamente aumentata quando le cellule sono state lisate in tampone con pH superiore a 7,5 (figura 7), meno del 90% di HP-NAP era presente come proteina solubile quando le cellule sono state lisate in tampone con pH inferiore a 9,0.
Figura 1:. Schema Schema della Purificazione negativa di HP-NAP dalla DEAE Resine in modalità batch La purificazione inizia con una procedura batch vincolante. La frazione proteica solubile contenente HP-NAP ottenuto da lisati batterici viene aggiunto alla resina DEAE pre-equilibrata con Tris-tampone a pH 8,0. Le proteine / fanghi resina vengono poi incubate a 4 ° C per 1 ora con dolce mixing. Durante l'incubazione, le proteine della cellula ospite legano alla resina. HP-NAP presente nella frazione non legata è ottenuto da una raccolta del surnatante dopo la centrifugazione o dalla frazione flusso continuo da una colonna gestito da flusso di gravità. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Risultato Esempi di Purificazione di HP-NAP di Negative Cromatografia modalità batch con resine a scambio ionico DEAE L'intero lisato cellulare (W) e frazione proteina solubile (S) di E. coli BL21 (DE3) che esprime HP-NAP e la frazione non legata (U) contenente HP-NAP da DEAE cromatografia a scambio ionico sono stati analizzati mediante SDS-PAGE (A), nativo-PAGE (B), e Western blotting (C). Il frac non legatozione con la quantità indicata di proteine che vanno da 1 mg a 10 mg è stato analizzato su un gel SDS-PAGE silver-tinto (D). masse molecolari (M) in kDa sono indicati sulla sinistra dei gel colorati e la macchia. (Adattato da riferimento 24) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: strutturale e caratterizzazione funzionale di ricombinante HP-NAP purificata da E. coli di Negative cromatografia modalità batch. (A) Il profilo assorbanza UV è stato registrato per HP-NAP eluito dalla colonna di gel-filtrazione. Le masse molecolari delle proteine marker sono stati indicati sul cromatogramma. (B) L'lontano UV dicroismo circolare SPECTrum di HP-NAP è stato registrato presso la gamma di lunghezze d'onda di 195 a 260 nm. (C) neutrofili umani (1 x 10 5 cellule) sono stati trattati con 0,5 mM HP-NAP e D-PBS, pH 7,2, come controllo negativo a 37 ° C. Il contenuto di ROS generati dai neutrofili è stata misurata in continuo mediante un saggio di chemiluminescenza luminolo-dipendente. I dati sono stati rappresentati come media ± deviazione standard di un esperimento in triplicato. (Adattato da riferimento 24) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Purificazione di ricombinanti Mutanti HP-NAP Espresso in E. coli da Negativo cromatografia modalità batch. Le frazioni proteiche solubili di E. coli BL21 (DE3) che esprime due ricombinanti HP-NAP Y101H e HP-NAP mutanti E97GY101H e wild-type HP-NAP sono stati purificati dal cromatografia modalità negativa con resine DEAE. Le frazioni non legate sono stati analizzati mediante SDS-PAGE. Masse molecolari (M) in kDa sono indicati sul lato sinistro dei gel colorati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Effetto del pH tampone sulla Purificazione di ricombinante HP-NAP Espresso in E. coli di Negative cromatografia modalità batch. La frazione solubile di E. coli BL21 (DE3) che esprime HP-NAP lisate a pH 9,0 sono stati adeguati al pH indicato vanno da 7.0 a 9.0 e una concentrazione proteica di 0,3 mg / ml. questi regolatafrazioni, indicate come carico, sono stati poi caricati su resine DEAE per purificare ricombinante HP-NAP da negativo cromatografia modalità batch a 4 ° C. Il coniugato, lavaggio, e le frazioni di eluizione sono stati analizzati mediante SDS-PAGE. masse molecolari (M) in kDa sono indicati sulla sinistra del gel macchiati. (Adattato da riferimento 24) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Effetto della quantità di proteine caricato su DEAE Resine per purificare ricombinante HP-NAP Espresso in E. coli. Le frazioni proteiche solubili di E. coli BL21 (DE3) che esprime HP-NAP sono stati caricati su resine DEAE in base alla il rapporto indicato di proteine mg per millilitro di resine per purificare recombinant HP-NAP dal negativo cromatografia modalità batch a pH 8,0. Le proteine solubili, indicati come carico (L), la frazione non legata (A), frazione di lavaggio (B), e la frazione di eluizione (C) sono stati analizzati mediante SDS-PAGE. masse molecolari (M) in kDa sono indicati sulla sinistra del gel macchiati. (Da riferimento 24) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Effetto del pH sulla solubilità di HP-NAP in E. coli lisati. (A) E. coli BL21 (DE3) che esprime HP-NAP è stata sospesa in tampone Tris-HCl ghiacciata al pH indicato vanno da 7.0 e 9,5. Le cellule sono state lisate e lisati cellulari poi interi (W) sono stati centrifugati to separare le frazioni solubili (S) e pellets insolubili (I). Le proteine sono stati analizzati mediante SDS-PAGE. masse molecolari (M) in kDa sono indicati sulla sinistra del gel macchiati. (B) La percentuale di solubilità ricombinante HP-NAP in tutta lisato cellulare ad ogni pH è stato calcolato dalla intensità della banda di HP-NAP su gel SDS per la frazione solubile (S) diviso che per il lisato cellula intera (W ). I dati sono stati rappresentati come media ± deviazione standard di almeno due esperimenti. (Da riferimento 24) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: primer utilizzati per la mutagenesi. Si prega di click qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
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Discussion
La modalità di cromatografia lotto negativo con resine a scambio anionico DEAE qui presentata è adatto per la purificazione di ricombinante HP-NAP sovraespresso in E. coli. I valori di pH dei tamponi usati nelle fasi di lisi cellulare e purificazione sono molto critici per assicurare la solubilità di HP-NAP in E. lisati coli e efficiente separazione dei ricombinante HP-NAP dalle impurità cellula ospite, rispettivamente. Le cellule batteriche devono essere lisati a pH 9,0, e la purificazione negativo devono essere eseguite a pH 8.0 per ottenere HP-NAP in alto rendimento e di elevata purezza. Il recupero di HP-NAP è del 90%, e la tipica purezza è 95% 24. Poiché HP-NAP è presente nella frazione non legata, una quantità minima ma sufficiente della resina deve essere utilizzato per ottenere la capacità massima di assorbire le impurità. Nel nostro caso, il carico massimo è di 1,5 mg di proteine solubili da E. lisati coli per resina millilitro.
il Proviprotocollo ded è stato progettato per la purificazione di ricombinante HP-NAP da un ml E. 50 cultura coli. La resa di HP-NAP è di circa 15 mg. Il processo di purificazione può essere sia in scala ridotta o in scala-up di conseguenza. Ad esempio, i due ricombinanti HP-NAP Y101H e HP-NAP mutanti E97GY101H sono stati purificati da un ml E. 1 cultura coli utilizzando questo negativo cromatografia modalità batch. Entrambi i mutanti HP-NAP con purezza superiore al 95% sono stati ottenuti raccogliendo la frazione libera (Figura 4). Questa negativo cromatografia modalità batch sono stata applicata anche per purificare ricombinante HP-NAP da un ml E. 860 cultura coli. Il recupero del gradino utilizzando DEAE negativo cromatografia modalità batch ha raggiunto il 97% di purezza superiore al 90%.
HP-NAP espresso in Bacillus subtilis (B. subtilis), è stato anche purificato con successo da questo DEAE modalità negativa cromatografia lottiin un solo passaggio 26. Nel nostro B. sistema di espressione subtilis, il livello di espressione di HP-NAP è basso. HP-NAP rappresenta solo circa il 5% delle proteine solubili totali da lisati batterici. Anche se HP-NAP mirato per purificazione è presente in piccola quantità, HP-NAP con purezza superiore al 90% può essere ottenuto riducendo il rapporto tra la quantità di proteine da lisati cellulari caricati sulla resina per rimuovere efficacemente quasi tutto il endogena proteine da B. subtilis 26. Così, questo metodo può essere applicato anche per purificare ricombinante HP-NAP espressa in altri ospiti batterici.
Diversi metodi sono stati riportati per la purificazione di ricombinante HP-NAP nella sua forma nativa 14-16. Tuttavia, un passo ulteriore cromatografia gel filtrazione è necessaria per ottenere HP-NAP a elevata purezza. Questa purificazione cromatografica negativo può produrre in modo efficiente funzionale ricombinante HP-NAP con elevata purezza in un unico passaggio. in additiil passo di desalinizzazione non è necessario a causa della bassa concentrazione di sale nella frazione non legata. La purificazione modalità batch potrebbe ovviare alla necessità di una colonna. Così, questo negativo cromatografia modalità batch utilizzando resina DEAE offre un metodo semplice ed efficace per purificare HP-HAP, nella sua forma nativa con alta resa e purezza. HP-NAP purificato mediante questo metodo potrebbe essere ulteriormente utilizzato per lo sviluppo di vaccini, nuovi farmaci e diagnostica per H. pylori -related malattie o per altre nuove applicazioni terapeutiche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
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