Abstract
فشل القلب وعدم انتظام ضربات القلب هي الأسباب الرئيسية للأمراض والوفيات في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك، لا تزال الآلية المرضية وعطل عضلة القلب في القلب المريضة إلى توضيح كامل. يوضح أدلة دامغة مؤخرا أن التغيرات في حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ تؤثر على الكالسيوم داخل الخلايا 2+ الأنشطة التوازن والقناة الايونية في myocytes القلب، والآليات الأساسية المسؤولة عن إمكانات العمل القلب وانقباض في قلوب سليمة والمريضة. في الواقع، أنشطة القنوات الأيونية والنقل الكامنة إمكانات العمل القلب (على سبيل المثال، الصوديوم، الكالسيوم 2+ و K + القنوات ونا + -CA 2+ مبادل) والكالسيوم 2+ التعامل مع البروتينات داخل الخلايا (على سبيل المثال، ryanodine المستقبلات والكالسيوم يتم قياس 2+ -ATPase في شبكية الهيولى العضلية (SERCA2a) أو فسفولامبان والفسفرة به) تقليديا إلى evaluيأكل من الآليات الأساسية للالقلب اقتران الإثارة، تقلص (EC). كل من الأنشطة الكهربائية في الغشاء والتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا 2+ هي إشارات الزناد من اقتران EC، في حين خيط عضلي هو وحدة وظيفية من التقلص والاسترخاء، وحساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ أمر لا بد منه في تنفيذ الأداء ييفة عضلية. ومع ذلك، عدد قليل من الدراسات تتضمن حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ في التحليل الوظيفي لعضلة القلب إلا إذا كان التركيز في الدراسة. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يقيس قسيم عضلي تقصير / إعادة إطالة والخلايا مستوى الكالسيوم 2+ باستخدام Fura 02:00 (كشف ratiometric) وتقييم التغييرات من حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ في myocytes القلب من قلوب الفئران. والهدف الرئيسي هو التأكيد على أنه خيط عضلي ينبغي أن تؤخذ حساسية الكالسيوم 2+ بعين الاعتبار في اقتران EC للتحليل الآلية. تحقيق شامل طعلى قنوات، نقل أيون، داخل الخلايا معالجة الكالسيوم 2+، وحساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ التي تكمن وراء انقباض العضلية في قلوب سليمة والمريضة سوف توفر معلومات قيمة عن تصميم استراتيجيات أكثر فعالية من متعدية وقيمة علاجية.
Introduction
القلب الإثارة، تقلص (EC) اقتران هو مخطط أساسي لتحليل الخواص الميكانيكية للعضلة القلب، أي وظيفة مقلص من القلب 1،2. يبدأ اقتران المفوضية الأوروبية من خلال الاستقطاب غشاء الثانوي لأنشطة القنوات الأيونية sarcolemmal (على سبيل المثال، نا + قناة بوابات الجهد، والتي يمكن قياسها عبر تقنيات التصحيح، المشبك). تفعيل لاحق من الجهد بوابات L من نوع كا 2+ قنوات (LTCCs) والكالسيوم 2+ تدفق عبر LTCCs تؤدي الجزء الأكبر من الكالسيوم 2+ الإفراج خلال ryanodine المستقبلات (RyRs)، وزيادة عصاري خلوي تركيز الكالسيوم 2+ من nanomolar (نانومتر ) إلى مكرومولي مستوى (ميكرومتر). هذه الزيادة في كاليفورنيا عصاري خلوي 2+ يعزز الكالسيوم 2+ ملزمة لتروبونين C (المجلس الوطني الانتقالي) في خيوط رقيقة ويثير التغيرات متعلق بتكوين مجمع خيوط لتسهيل التفاعل بين الأكتين الميوسين ومن بلوغ myocardi انكماش ال 3. على العكس، فإن الكالسيوم عصاري خلوي 2+ وإعادة المستحوذ ظهر في شبكية الهيولى العضلية (SR) من خلال كا 2+ -ATPase في ريال (SERCA2a) أو مقذوف من العضلية عن طريق نا + / كا 2+ المبادلات والبلازمي كاليفورنيا 2+ أتباز 1،2. ونتيجة لذلك، وانخفاض في الكالسيوم عصاري خلوي 2+ يحرض التغييرات متعلق بتكوين خيوط رقيقة العودة إلى حالته الأصلية، مما أدى إلى تفكك الأكتين، الميوسين والعضلية الاسترخاء 1-3. في هذا المخطط، ويعتبر هذا النشاط من SERCA2a عموما لتحديد سرعة الاسترخاء عضلة القلب لأنه يشكل 70 - 90٪ من عصاري خلوي إزالة الكالسيوم 2+ في معظم خلايا القلب الثدييات 1. على هذا النحو، والشاذ الكالسيوم 2+ معالجة من قبل LTCC، RYR وSERCA2a، وما إلى ذلك اعتبرت الآليات الرئيسية لانقباض ضعف واسترخاء في قلب المريضة 1-4.
> في الواقع، مجانا عصاري خلوي كا 2+ أن وظائف كما قال رسول في حسابات اقتران EC لحوالي 1٪ من مجموع الكالسيوم داخل الخلايا 2+ والغالبية من الكالسيوم 2+ لا بد أن الكالسيوم داخل الخلايا 2+ مخازن 5،6. هذا ويرجع ذلك إلى حقيقة أن العديد من الكالسيوم 2+ مخازن وفيرة في myocytes القلب، على سبيل المثال، الفوسفورية غشاء، ATP، فسفوكرياتين، كالمودولين، parvalbumin، ييفة عضلية الشركات عبر الوطنية، الميوسين، SERCA2a، وكالسيكويسترين في ريال 5،6،7. من بينها، SERCA2a والشركات عبر الوطنية هي السائدة الكالسيوم 2+ مخازن 5،6،7. وعلاوة على ذلك، الكالسيوم 2+ ملزمة لالمخازن المؤقتة الخاصة به هو عملية ديناميكية خلال نشل (على سبيل المثال، 30-50٪ من الكالسيوم 2+ بربط الشركات عبر الوطنية وتنفصل منه خلال كا 2+ العابرين 7) والتغيير في كا 2+ سبب إضافي ملزم "الافراج" حرية الكالسيوم 2+ إلى العصارة الخلوية، والنتائج في التعديلات من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ اضربentration. ونتيجة لذلك، الاضطراب داخل الخلايا مستوى الكالسيوم 2+ يدفع الحركات خيط عضلي غير طبيعي، والتي هي السلائف من ضعف مقلص وعدم انتظام ضربات القلب 8،9. عوامل كثيرة (كلا الفسيولوجية والمرضية) يمكن أن تكون مصادر تعديلات ما بعد النسخي من البروتينات خيط عضلي، التي تؤثر على خيط عضلي الكالسيوم 2+ التخزين المؤقت وخيط عضلي الكالسيوم 2+ حساسية 8-10. في الآونة الأخيرة، أفيد أن الطفرات في البروتينات خيط عضلي زيادة الكالسيوم 2+ تقارب ملزمة والخلايا معالجة الكالسيوم 2+، مما اثار التقوية التي تعتمد على وقفة من الكالسيوم 2+ العابرين، والشاذ الكالسيوم 2+ الإفراج عنهم، وعدم انتظام ضربات القلب 8. وتماشيا مع هذا المفهوم، لقد أظهرنا أيضا أن خيط عضلي الكالسيوم 2+ الحساسية في قلوب الفئران ارتفاع ضغط الدم الثانوي ليصل تنظيم الخلايا العصبية سينسيز أكسيد النيتريك يرتبط ضغط الدم الانبساطي مرتفعة والانقباضي الكالسيوم 2+ المستويات11، والذي بدوره يزيد من ضعف LTCC إلى الكالسيوم 2+ تثبيط معتمد على 12. وبالتالي، حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ هو منظم "نشطا" من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التوازن والعضلية وظيفة مقلص. أصبح من الضروري لتحليل التفاعلات بين خيط عضلي والكالسيوم 2+ التعامل مع البروتينات لتحقيق شامل في العضلية اقتران EC وظيفة القلب.
هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يقيم التغييرات من حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ في myocytes القلب المعزولة. تحليل شامل للالكالسيوم داخل الخلايا 2+ الشخصي، وخيط عضلي الكالسيوم 2+ حساسية والانكماش كشف آليات جديدة الميكانيكا عضلة القلب الكامنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكول هو وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرتها المعاهد الوطنية للأمم المتحدة للصحة (NIH المنشور رقم 85-23، منقحة 1996). تم الموافقة عليها من قبل اللجنة الحيوان الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من جامعة سيول الوطنية (موافقة IACUC أي: جامعة سول الوطنية-101213-1).
1. إعداد العازلة (مواد الجدول والمعدات)
- إعداد 300 مل من محلول عزلة جديدة على يوم من التجربة (في ملي: كلوريد الصوديوم، 135، بوكل، 5.4، MgCl 2، 3.5، الجلوكوز، 5؛ HEPES، 5؛ نا 2 هبو 4، 0.4، التورين، 20؛ الرقم الهيدروجيني 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم).
- إعداد 100 مل من محلول تخزين جديدة على يوم من التجربة (في ملي: كلوريد الصوديوم 120، بوكل 5.4، MgSO 4 5؛ CaCl 2 0.2، الصوديوم البيروفات 5؛ الجلوكوز 5.5، التورين 20؛ HEPES 10؛ مانيتول 29؛ ودرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم).
- تحضير 1L من حل نضح (في ملي: كلوريد الصوديوم، 141.4، بوكل، 4؛ ناه 2 ص 4، 0.33، MGCل 2، 1؛ HEPES، 10؛ الجلوكوز، 5.5، CaCl 2، 1.8، مانيتول، 14.5، 7.4 درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم).
- إعداد 30 مل من محلول كولاجيناز 1 بإضافة كولاجيناز (1 ملغ / مل)، البروتيني (0.1 ملغ / مل)، ألبومين المصل البقري (BSA، 1.67mg / مل)، والكالسيوم 2+ (0.05 ملم) إلى 25 مل من العزلة حل.
- إعداد 20 مل من محلول كولاجيناز 2 بإضافة كولاجيناز (1 ملغ / مل)، BSA (1.67 ملغ / مل)، والكالسيوم 2+ (0.05 ملم) إلى 16.7 مل من محلول العزلة.
- إعداد 40 مل من محلول BSA بإضافة 0.4 غرام من BSA إلى 40 مل من محلول العزلة. فصل 10 مل و 30 مل إلى قسمين الأكواب. إضافة الكالسيوم 2+ إلى 30 مل من محلول BSA بحيث النهائي الكالسيوم 2+ التركيز في حل جيش صرب البوسنة هو 1 ملم.
2. إعداد لعزل البطين الأيسر (LV) Myocytes
- نقل 8-12، ذكور فئران قبل أسبوع سبراغ داولي (SD) في أقفاص النقل النظيفة من منشأة الحيوان إلى غرفة التحضير والعزلة.
- Hأكل اثنين من حمامات المياه إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدام حمام مائي واحد للمياه - خزان تغلف وأنابيب نضح من نظام الارواء Langendorff. استخدام حمام مائي آخرين للتحريض جذوع أنسجة عضلة القلب وذلك لفصل myocytes واحدة. - إضافة 5 مل و 3.3 مل من محلول BSA (بدون الكالسيوم 2+) إلى 25 مل من محلول كولاجيناز 1 و 16.7 مل كولاجيناز الحل 2 لتعويض حجم 30 مل و 20 مل، على التوالي.
- إضافة حل العزلة (100 مل)، وحل كولاجيناز 1 (30 مل) إلى العمود 1 (العقيد 1) والعمود 2 (العقيد 2) في نظام Langendorff نضح، على التوالي (الشكل 1A).
- الأوكسجين في حل العزلة وحل كولاجيناز 1 في العقيد 1 وCol.2 عبر أنبوب توصيل الأكسجين في النظام نضح Langendorff (الشكل 1A). وبالمثل، الأوكسجين حل كولاجيناز 2 وحل جيش صرب البوسنة في حمام مائي تهتز مع 100٪ O 2 عن طريقأنبوب توصيل الأكسجين.
3. عزل LV Myocytes
- تخدير الفئران SD عن طريق الحقن داخل الصفاق من الصوديوم بنتوباربيتال (30 ملغ / كلغ) وتأكد من حالة التخدير التي كتبها اصبع القدم معسر وعدم وجود انعكاس الانسحاب.
- نقل الفئران إلى علبة تشريح. في موقف ضعيف، وتأمين أربع أرجل على الجانبين من الجسم مع الشريط.
- تطبيق الصدري شقوق منتصف محوري مع مقص جراحي لفتح الصدر، وضمان عدم تلف القلب. استخدام زوج آخر من مقص نظيفة لتشريح القلب من الأوعية التي تربط (على سبيل المثال، متفوقة والوريد الأجوف السفلي، الأوعية الرئوية، والشريان الأورطي) وغشاء التامور 13.
- ترك جزء من الشريان الأورطي لمدة كافية (5-8 ملم)، المشبك الأبهر مع ملقط غرامة، وجبل بسرعة قنية من نظام الارواء Langendorff حدود 1 دقيقة (الشكل 1A). ربط خيوط الجروح 4/0 بإحكام على الشريان الأورطي.
- ترجل قلب هضمها من قبل قطع الشريان الأورطي ونقلها من خلال عقد الشريان الأورطي مع ملقط في قارورة تحتوي على حل العزلة الطازجة (الشكل 1Bi). استخدام مقص الجميلة وملقط لقطع معظم الجدار الحر LV (بما في ذلك الحاجز) إلى أجزاء أصغر (~ 22 ملم، الشكل 1Bii).
- نقل القطع في قارورة تحتوي على قبل تحسنت والاوكسيجين كولاجيناز جديدة الحل 2 (الشكل 1Biii). يهز لمدة 10 دقيقة. استمرار في تقديم الأكسجين إلى التي تحتوي على العضلية كولاجيناز حل 2.
- نقل العضلية - تعليق لأنبوب 10 مل الطرد المركزي باستخدام القطارات مع لمبة الشفط وإضافة الكالسيوم 2+ - تحتوي على حل جيش صرب البوسنة (1: 1 في الحجم). أجهزة الطرد المركزي في 30 جرام لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. إعادة تعليق بيليه العضلية في 5 مل من محلول BSA. الطرد المركزي وتجاهل طاف.
- تفريق الكريات العضلية والحفاظ على myocytes في 10 مل من محلول التخزين المؤكسج قبل في RT (الشكل 1Biv الى السادس).
- كرر الإجراءات (الخطوات 3،7-3،9) مع النسيج LV المتبقية في القارورة.
ملاحظة: الحفاظ على تكرار الإجراءات (الخطوات 3،7-3،9) مرة أخرى حتى معظم الأنسجة LV يختفي في الحصول على عائد جيد من myocytes. - الحفاظ على myocytes في حلول التخزين لمدة 6-8 ساعة على RT حتى نهاية التجارب.
4. القياسات في وقت واحد من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ العابرون والعضلية تقلص
- myocytes تحميل LV مع acetoxymethyl استر FURA-02:00 (2 ميكرومتر).
ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات التحميل والتجارب مع myocytes محملة في أنبوب الظلام (الشكل 1Bvii).- الطرد المركزيifuge تعليق العضلية (1 مل) في 2000 x ج لمدة 10 ثانية. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه العضلية في 1 مل من محلول تايرود مع انخفاض الكالسيوم 2+ تركيز (250 ميكرومتر، مواد الجدول والمعدات).
- إضافة FURA-02:00 وبولوكسامير 407 (2 ميكرولتر)، تفريق بلطف تعليق العضلية، والحفاظ على الخليط في RT (20-24 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة (الشكل 1Bvii).
- الطرد المركزي الخليط لمدة 5 ثوان، تجاهل طاف وتفريق بيليه العضلية في 1 مل من محلول الارواء تحتوي على 500 ميكرومتر الكالسيوم 2+. بعد 10 دقيقة، الطرد المركزي الخليط لمدة 5 ثانية وتجاهل طاف.
- إضافة محلول الارواء الطازجة (500 ميكرومتر الكالسيوم 2+، 1 مل) والحفاظ على FURA-02:00 - بيليه العضلية التي تم تحميلها في هذا الحل للتسجيلات.
- قياس انكماش LV العضلية والكالسيوم داخل الخلايا 2+
- قبل التسجيل، وملء الأنبوب نضح أن يمر عبرسترة المياه مع حل تايرود، وهو قبل تحسنت إلى 36 درجة مئوية.
- ضع بضع قطرات من FURA 02:00 - تحميل LV تعليق العضلية على غرفة المجهر مضان مقلوب لمدة 5 - 8 دقائق. ببطء يروي الحل تايرود (2.2 مل / دقيقة).
- اضغط على زر "البدء" على اللوحة الأمامية للمحفز إصبعي لبدء التحفيز الميدان (2 هرتز).
ملاحظة: انتاج التيار الكهربائي (10 فولت، 5 ميللي ثانية مدتها) وتطبيقها على myocytes في الغرفة من خلال أسلاك البلاتين المتمركزة على جانبي الغرفة.- اختر myocytes أن العقد ثابت (لا تلك التي تعرض فرط أو قصور انكماش) للتسجيل.
- ضبط العضلية من خيار في الوضع الأفقي للنظام الكشف قسيم عضلي القائم على الفيديو وضبط بؤرة المجهر للحصول على صور أفضل من ساركومير. ضع مربع مستطيل الأرجواني على المنطقة التي لوحظت ساركومير واضحة بوضوح حتى المتوسطمن أطوال قسيم عضلي (الذروة الحمراء) يعرض ذروة فريدة حادة (الشكل 2A، الصورة السفلى).
- تسجيل التغيرات في طول قسيم عضلي في الاستجابة لتحفيز الميدان (الشكل 2A وباء).
ملاحظة: استخدم myocytes تحميل ضمن 1-2 ساعة. - ضبط فتحة الكاميرا بحيث الحقل في نظام الكشف قسيم عضلي القائم على الفيديو هو حجم العضلية (الشكل 2A). تحفيز العضلية مع الإثارة في 360 نانومتر / 380 نانومتر، والانبعاثات في 510 نانومتر (تردد اقتناء 1000 هرتز). سجل تقصير قسيم عضلي ونسبة Fura2 AM مع التحفيز الميدان (الشكل 2B).
5. تقييم حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+
- متوسط أطوال قسيم عضلي والكالسيوم 2+ العابرين في حالة استقرار (10-20 آثار) ورسم حلقة مرحلة الطائرة من نسبة FURA-2 مقابل طول قسيم عضلي من نفس العضلية (على حد سواء مع القيمة المقاسةالصورة ودلتا التغييرات، الشكل 2C).
- في كل قطعة، وتحديد نسبة FURA -2 في 50٪ الاسترخاء (EC 50، الشكل 2C). مقارنة كل حلقة وEC 50 من كل تدخل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عزل myocytes LV من قلوب الفئران العادية وارتفاع ضغط الدم. تعتبر myocytes على شكل قضيب مع التصدعات واضحة (تمثل ساركومير) وتقلصات مستقرة وردا على التحفيز المجال ليكون myocytes الأمثل ويتم اختيارها للتسجيلات (الشكل 2A). في المثال الموضح في F igure 2A، وهو FURA 02:00 -loaded يتم وضع LV العضلية أفقيا ويتم ضبط فتحة الكاميرا بحيث تحتل العضلية أكثر من مجال تسجيل والمنطقة الخلفية الحد الأدنى من مدرج. في مجال تسجيل وضبط أبعاد مربع الأرجواني عن طريق النقر والسحب هذا الإطار على شاشة الكمبيوتر (من خلال برنامج تسجيل). عندما يظهر متوسط طول قسيم عضلي واحد ذروة حمراء حادة، بدء التسجيل (الشكل 2A، الصورة السفلى).
كلا طول قسيم عضلي والكالسيوم داخل الخلايا 2+ transie وتسجل اليلة (FURA-2 النسب) في وقت واحد من نفس myocytes (الشكل 3A). وتظهر متوسط آثار طول قسيم عضلي والعابرين الكالسيوم 2+ في الشكل 3B. بشكل فردي، أطوال الانبساطي / الانقباضي قسيم عضلي، والوقت ليصل إلى ذروته (PT)، وتقاس تقصير قسيم عضلي للتحقيق في السعة وديناميات انقباض العضلية. ويتم تحليل الوقت إلى 50٪ الاسترخاء (TR 50) لتقييم التخفيف من العضلية. وبالمثل، فإن ضغط الدم الانبساطي والانقباضي FURA-2 نسب (كاليفورنيا 2+ العابرين)، والوقت ليصل إلى ذروته (PT) من الكالسيوم 2+ العابرين والوقت ثابت من الكالسيوم 2+ تسوس عابرة (تاو) ويتم تحليل لتقييم انكماش العضلية والاسترخاء (الجدول 1). في هذا المثال، يتم زيادة سعة من الكالسيوم 2+ العابرين معتدلة في myocytes LV من الفئران ارتفاع ضغط الدم والانكماش هو انخفاض معتدل (الشكل 3B والجدول 1).
محتوى "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> وعلاوة على ذلك، فإن العلاقات بين FURA - يتم رسم 2 ونسبة طول قسيم عضلي (مما يدل على خيط عضلي الكالسيوم 2+ حساسية myocytes LV) في كل من الشام وارتفاع ضغط الدم الفئران ( . الشكل 3C) وFURA 2 - قسيم عضلي طول مسار خلال مرحلة الاسترخاء من العضلية تعرف على شبه التوازن من العصارة الخلوية الكالسيوم 2+، خيط عضلي الكالسيوم 2+ ملزمة، وطول قسيم عضلي 14، وبالتالي، تتم مقارنة مرحلة الاسترخاء بين البلدين المجموعات. إن التحول نحو اليمين من مسار في myocytes من مجموعة ارتفاع ضغط الدم يشير إلى وجود استجابة خيط عضلي خفضت إلى الكالسيوم 2+ (الشكل 3C). وعليه، فإن الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التركيز المطلوب للنصف الاسترخاء (EC 50) وزيادة (الشكل 3C) في اشارة الى خيط عضلي الكالسيوم 2+ -desensitization في ارتفاع ضغط الدم."1"> 
الشكل 1. إجراءات لعزل myocytes LV من قلب فأر. (أ) نظام نضح Langendorff تستخدم ليروي حل العزلة في قلب مقنى عبر الشريان الأبهر (الشكل، صورة مكبرة للقلب التي شنت على نظام الارواء) (ب) ط - ثالثا: إن القلب بعد الهضم مع حل كولاجيناز 1 وتشريح الأنسجة LV في طبق وقارورة (ب) رابعا - سادسا:. العضلية تعليق بعد إضافة كولاجيناز حل 2، العضلية بيليه بعد الطرد المركزي، وإعادة علقت بيليه العضلية في حلول التخزين (ب) سابعا: الحضانة، واحتضان LV myocytes في FURA 02:00 - محلول يحتوي على العزلة (2 ميكرومتر FURA 02:00، 250 ميكرومتر الكالسيوم 2+ و 2 ميكرولتر بولوكسامير 407)؛ تبييض، وغسل myocytes LV مع حل العزلة مع 500 ميكرومتر الكالسيوم 2+. التخزين، والحفاظ على FURA-02:00 - myocytes LV تحميلها فيحل العزلة الطازجة التي تحتوي على 500 ميكرومتر الكالسيوم 2+. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. قياس تقصير قسيم عضلي ونسبة FURA-2 (الإرشادية داخل الخلايا مستوى الكالسيوم 2+). (A) رسم تخطيطي لقسيم عضلي، صورة لFURA-2 -loaded LV العضلية وطول قسيم عضلي متوسط (ذروة الحمراء) هي ظاهرة على شاشات الكمبيوتر. في اللوحة السفلى، والخط الأسود هو متوسط كل خط بكسل أفقي داخل المنطقة الأرجواني من الفائدة. الخط الأزرق هو نفس البيانات ركزت في كل نهاية. الخط الأحمر هو تحويل فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس) طيف الطاقة، والذي يمثل عدد من الإشارات وقد حسبت الاتحاد الفرنسي للتنس. البولي ايثيلين واحد حادحزب العدالة والتنمية يعني تسجيل قسيم عضلي نظيفة. (ب) التسجيلات في وقت واحد من طول قسيم عضلي والنسبة FURA -2 ردا على التحفيز الميدان (2HZ). مؤامرة (C) المرحلة الطائرة من نسبة FURA 2 مقابل طول قسيم عضلي من نفس LV العضلية (لاحظ أن يتم تحليل كل من الطول الفعلي / FURA نسبة 2 ودلتا التغييرات التي تجري هذه المعلمات). EC 50 (FURA نسبة 2 في 50٪ الاسترخاء، دائرة أشار السهم) هو المقارنة النوعية من الحساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ بين المجموعتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. ممثل نتائج تحليل LV انكماش العضلية في الشام والجرذان ارتفاع ضغط الدم. (أ) آثار الخام من قسيم عضلي الصورةhortening وFURA - 2 نسبة القياس في myocytes LV من الشام والجرذان ارتفاع ضغط الدم (B) متوسط آثار طول قسيم عضلي وFURA - 2 الإشارات. وتظهر المعلمات التي تم تحليلها في آثار المتوسط في الجدول رقم 1. (C) المؤامرات المرحلة الطائرة من FURA - 2 نسبة مقابل طول قسيم عضلي (كل من الطول الفعلي وFURA - 2 نسبة ودلتا التغييرات التي تجري هذه المعلمات) في المجموعتين . يتم إزاحة حلقة مسار إلى اليمين وEC 50 يميل إلى أن يكون أعلى في ارتفاع ضغط الدم، مما يشير إلى خيط عضلي الكالسيوم 2+ الحساسية. PT، والوقت ليصل إلى ذروته (ثانية)؛ تاو، وقت ثابت من الكالسيوم 2+ تسوس عابر (ثانية) (الحصول عليها عن طريق تركيب مرحلة تراجع FURA - نسبة 2 مع الدالة الأسية) .TR 50: حان الوقت ل50٪ الاسترخاء (ثانية). 
الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبرمن هذا الرقم.
| المعلمات | الشام | ارتفاع ضغط الدم | |
| الكالسيوم داخل الخلايا 2+ | الانبساطي الكالسيوم 2+ | 1،189 | 1.124 |
| الانقباضي الكالسيوم 2+ | 1.71 | 1.691 | |
| السعة (Δ نسبة) | 0.521 | 0.567 | |
| الوقت لقمة (PT، ق) | 0.021 | 0.031 | |
| تاو (ق) | 0.079 | 0.076 | |
| قسيم عضلي | الانبساطي | 1،758 | 1.78 |
| طول قسيم عضلي (ميكرون) | |||
| قسيم عضلي | 0.122 | 0.115 | |
| تقصير (16؛ طول، مم) | |||
| الوقت لقمة (PT، ق) | 0.064 | 0.055 | |
| الوقت إلى 50٪ | 0.032 | 0.03 | |
| الاسترخاء (TR 50، ق) | |||
| EC50 | [كا 2+] ط (FURA-2 نسبة) 50٪ قسيم عضلي relengthening | 0.2382 | 0.3224 |
الجدول 1. تحليل FURA - 2 نسبة (الكالسيوم داخل الخلايا 2+) وقسيم عضلي قياسات الطول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن تصف بروتوكولات لتقييم التغيرات من حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ في واحدة العضلية القلبية معزولة والتأكيد على أهمية قياس هذه المعلمة إلى جانب الخصائص الكهربية، الكالسيوم داخل الخلايا 2+ العابرين، وديناميات خيط عضلي. وذلك لأن التسجيلات واحدة أو اثنتين من المعلمات قد لا فسر الآليات الكامنة وراء تقلص القلب والاسترخاء. على عكس الطرق التقليدية لقياس انكماش العضلية والكالسيوم داخل الخلايا 2+ الشخصي بشكل فردي 1، يدرس المنهج الحالي كلا المعلمات في وقت واحد في نفس myocytes القلب.
ويستخدم عدد من الطرق عموما لتقييم خيط عضلي الكالسيوم 2+ حساسية العضلات أو myocytes 15،16،17، على سبيل المثال، دراسة التفاعلات بين دخيلة الكالسيوم 2+ وقسيم عضلي / طول خلية / التوتر في myocytes البشرة(تعامل مع المنظفات مثل سابونين أو β-ESIN إلى permeabilize الغشاء). يتم قياس أطوال مع الصور الصمام الثنائي وتقنيات حيود أشعة الليزر، والتوتر مع محولات القوة أو ألياف الكربون). وتستخدم هذه التقنيات على نطاق واسع في الدراسات العضلات لأنها تمكن التقديرات الكمية للحساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+. ومع ذلك، أنشطة القناة الايونية الذاتية في غشاء البلازما والخلايا معالجة الكالسيوم 2+ مطلوبة، وتلك لبدء آليات خيط عضلي، تهمل في هذه التقنيات. وبالإضافة إلى ذلك، شرائط العضلات أو myocytes تحت الدراسة لبعض طول الانبساطي امتدت مسبقا، وتحت هذه الظروف، يمكن أن طول قسيم عضلي الأولي تختلف من طول الانبساطي الفعلي للmyocytes (وخاصة في الحالات المرضية ومع التدخلات). هذا يسلط الضوء على الاستفادة من القياس الحالي حيث لا تزال العضيات الخلوية رابط الجأش نسبيا، وبالتالي، تمكين evalu شاملأوجه من وظيفة العضلية مقلص.
ومن المفهوم، ونوعية myocytes (كاليفورنيا 2+ -tolerating) والتحميل الأمثل للFURA - 02:00 هما العناصر الرئيسية لتقييم ناجح لحساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+. وفقا لذلك، يتم تطبيق عدة تعديلات على البروتوكول من أجل الحصول على myocytes على شكل قضيب قابلة للحياة (60-80٪ من مجموع الخلايا، كما هو موضح سابقا 18،19،20). أولا، يتم إضافة جرعة منخفضة من الكالسيوم 2+ إلى حلول خلال عمليات الهضم (مثل تركيز الكالسيوم 2+ 50 ميكرومتر في الحلول كولاجيناز و 200 ميكرومتر في حلول التخزين). ثانيا، يتم إضافة BSA خلال عملية الهضم إلى حلول كولاجيناز لتعزيز الاستقرار الغشاء. ثالثا، المؤكسج معظم الحلول خلال العزلة، التي تعزز من نسبة myocytes الوظيفية ومدة التجارب (6-8 ساعة). رابعا، يتم الاحتفاظ myocytes معزولة في تخزين حل جontaining 200 ميكرومتر الكالسيوم 2+.
للحصول على التحميل الأمثل مع FURA 02:00، يتم استخدام نوعين مختلفين من الكالسيوم 2+ تركيزات (250 و 500 ميكرومتر) وبولوكسامير 407 (2 ميكرولتر، 20٪ أعدت في سلفوكسيد ثنائي ميثيل) يضاف إلى تعزيز نفاذية FURA-2:00 من خلال الغشاء و استقرارها في myocytes. وتجدر الإشارة إلى أن جميع الكالسيوم 2+ الأصباغ مؤشر هي الكالسيوم 2+ مخازن 21. ولذلك، يجب على الباحثين تجنب استخدام تركيزات عالية من FURA-02:00 أو حضانة أطول لتجنب التخزين المؤقت المفرط وانخفاض انقباض العضلية. فمن المستحسن أن تقلص العضلية دون FURA - 2 تحميل يتم فحص روتيني، وهي خطوة ضرورية لتقدير نوعية العضلية وحالة التحميل. التباين في تحميل أمر لا مفر منه. وبالتالي، فمن المهم للتحقق من تنوع انكماش العضلية، تحديدا، ما إذا كان عدد من التعاقد myocytes في غرفة مشابه قبل وfter التحميل. وينبغي تجنب تحليل myocytes فرط أو التعاقد فراش لا تسبب لأنهم لا يمثلون وضع متوسط من myocytes وقد تسبب نتائج وتقييمات متحيزة.
وتجدر الإشارة إلى أن التغييرات التي تم قياسها في نسبة FURA 2 هي انعكاسات داخل الخلايا مستوى الكالسيوم 2+، بدلا من التركيز الكيميائي الفعلي من الكالسيوم 2+. ولذلك، فإن الطريقة الموصوفة هنا تقييم التغييرات النوعية من الحساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+، بدلا من الحساسية الفعلية لل myofilaments إلى الكالسيوم 2+. معايرة FURA - 2 إشارة إلى الخلايا تركيز الكالسيوم 2+ هو الحل للحصول على موثوقة الكالسيوم 2+ التركيزات في myocytes الفردية. إجراء المعايرة يتطلب myocytes تحميل مع تركيزات مختلفة من الكالسيوم 2+ -conjugated FURA - 02:00 (كاليفورنيا 2+ تركيز تتراوح 0-39 ميكرون)، وFURA التي تم الحصول عليها - يتم احتساب 2 نسب مع اله الصيغة التالية: [كا 2+] ط = دينار كويتي * (R - RMIN) / (Rmax - R) * F380max / F380min 21. فمن الممكن لحساب متوسط القيم المجمعة من الكالسيوم 2+ تركيزات من خلال هذا الإجراء المعايرة. ومع ذلك، لأن تحميل مؤشرات الكالسيوم 2+ هو متغير بين myocytes والمعايرة لم يتم تنفيذ في زنزانة فردية، لا يجوز الحصول الكالسيوم 2+ تركيزات بدقة. وعلاوة على ذلك، إذا تم قياس F360 / F380 بدلا من F340 / F380 (كما هو الحال في هذه الدراسة)، ونسبة FURA 2 هي أقل دقة (لأن F360 هو الطول الموجي تساوي الامتصاصية من FURA-2 مضان 22). ومع ذلك، فإنه لا يزال هناك طريقة صحيحة لتقييم التغيرات النوعية في حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ في التجارب الفسيولوجية، وخاصة في قلوب البشر المريضة، حيث لل myofilaments يمكن تغييرها بصورة متزامنة بعد التغيرات في البيئة داخل الخلايا. فمن المستحسن أن هذا الأسلوب هو الجمع بين وسائل بديلة (مثل ديمكتوب من قبل في القسم مناقشة) لتحليل أدق حساسية الحقيقية لل myofilaments إلى الكالسيوم 2+.
الحد الآخر من طريقة في دراسة انكماش العضلية هو الشرط المفرغة. قد نقلل أو المبالغة في تقدير التغيرات في حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+. لذلك، لتقييم بدقة حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+، يجب إجراء التحليل مع قياسات بديلة لتقييم كلا نوعي وكمي.
هذه التقنية قابلة للتطبيق لتقييم وظيفة عضلة القلب في قلوب سليمة والمريضة، بما في ذلك عينات القلب الإنسان، حيث يتم تغيير بيئة الأكسدة الخلوية وتعديلات ما بعد النسخي، مما أدى إلى تغيرات مصاحبة في وظائف خيط عضلي. على وجه الخصوص، القنوات الأيونية، داخل الخلايا التوازن الأيوني والبروتينات التنظيمية في لل myofilaments تفاعلية. لذلك، تعمل جميع هذه المكونات في حفلهر لتحديد أداء القلب في الجسم الحي (على سبيل المثال، إذا ما قيست في ضربات القلب).
في الختام، نحن تصف طريقة لتقييم التغيرات في حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ والتأكيد على أهمية تحليل هذه المعلمة بالتزامن مع الكهربية القلب، الخلايا معالجة الكالسيوم 2+، والانكماش العضلية للحصول على لمحة كاملة من وظيفة العضلية. ينبغي قياس حساسية خيط عضلي الكالسيوم 2+ بشكل روتيني في الدراسات الميكانيكية باستخدام نماذج مريضة القلب، حيث التغييرات في هذه المعايير وكذلك مختلف مسارات الإشارات بين الخلايا مترابطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل برنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث كوريا (جبهة الخلاص الوطني) بتمويل من وزارة التربية والتعليم والعلوم والتكنولوجيا (2013068067). بواسطة برنامج الدراسات العليا في الدماغ كوريا 21 من وزارة الكورية التعليم والعلوم والتكنولوجيا ومستشفى جامعة سيول الوطنية، والجمعية الكورية لارتفاع ضغط الدم (2013)، وصندوق البحوث للاتصالات SK (رقم 3420130290) ومن المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC 31460265، 81260035 NSFC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
References
- Bers, D. M., et al.
- Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
- Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
- Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
- Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
- Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
- Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
- Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
- Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
- Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336 (2013).
- Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
- Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
- Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
- Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
- Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
- Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
- Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
- Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
- Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
