Abstract
L'insuffisance cardiaque et des arythmies cardiaques sont les principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde entier. Cependant, le mécanisme de la pathogenèse et de dysfonctionnement du myocarde dans le cœur malade reste à être pleinement clarifié. Des preuves convaincantes récentes démontrent que les changements dans la sensibilité du myofilament Ca affectent Ca intracellulaire 2+ activités de l' homéostasie et canaux ioniques dans les myocytes cardiaques, les mécanismes essentiels responsables du potentiel d'action cardiaque et la contraction dans les cœurs sains et malades. En effet, les activités des canaux ioniques et des transporteurs sous - jacents potentiels d'action cardiaques (par exemple, Na +, Ca 2+ et K + et des canaux 2+ échangeur Na + -Ca) et le Ca2 + intracellulaire des protéines (par exemple , la manipulation., Les récepteurs de la ryanodine et Ca 2 + -ATPase dans réticulum sarcoplasmique (SERCA2a) ou phospholambane et sa phosphorylation) sont classiquement mesurée Evalumangé les mécanismes fondamentaux de cardiaque excitation-contraction (CE) de couplage. Les deux activités électriques dans la membrane et les changements Ca2 + intracellulaires sont les signaux de déclenchement de couplage CE, alors que myofilament est l'unité fonctionnelle de contraction et de relaxation, et la sensibilité de myofilament Ca est impératif dans la mise en œuvre de la performance myofibrille. Néanmoins, peu d' études intègrent la sensibilité de myofilament Ca dans l'analyse fonctionnelle du myocarde sauf si elle est l'objet de l'étude. Ici, nous décrivons un protocole qui mesure sarcomère shortening / re-allongement et le intracellulaire niveau Ca 2+ en utilisant Fura-2 AM (de détection ratiométrique) et d' évaluer les changements de la sensibilité de myofilament Ca dans les myocytes cardiaques de coeurs de rats. L'objectif principal est de souligner que la sensibilité myofilament Ca doit être pris en considération dans le couplage CE pour l' analyse mécaniste. enquête approfondie sur isur les canaux, les transporteurs d'ions Ca 2+ intracellulaire, la manipulation et la sensibilité de myofilament Ca qui sous - tendent myocytes contractilité dans les cœurs sains et malades fournira des informations précieuses pour la conception de stratégies plus efficaces de translation et de valeur thérapeutique.
Introduction
Excitation-contraction cardiaque (EC) de couplage est le schéma fondamental pour analyser les propriétés mécaniques du myocarde, à savoir la fonction contractile du cœur 1,2. Couplage C'est initiée par dépolarisation de la membrane secondaire par rapport à l'activité des canaux ioniques sarcolemmiques (par exemple le canal Na + voltage-dépendants, qui peut être mesurée par des techniques de patch-clamp). L' activation subséquente de type L voltage-dépendants canaux Ca2 + (LTCCs) et influx de Ca 2+ par LTCCs déclencher la masse de Ca 2+ libération par le biais des récepteurs de la ryanodine (les RyRs), augmentant ainsi la cytosolique concentration en Ca 2+ du nanomolaire (nM ) micromolaire (uM) niveau. Une telle augmentation de Ca 2+ cytosolique favorise la liaison à Ca2 + troponine C (CTN) en filaments fins et induit des changements conformationnels du complexe du filament pour faciliter l'interaction actine-myosine et atteint myocardial contraction 3. A l' inverse, le Ca 2+ cytosolique est re-uptaken retour dans le réticulum sarcoplasmique (SR) par le Ca2 + ATPase dans SR (SERCA2a) ou est extrudé hors de la myocytes via 2+ échangeur Na + / Ca et le plasmiques Ca 2+ ATPase 1,2. Par conséquent, la baisse de Ca cytosolique 2+ incite des changements conformationnels de minces filaments à l'état d' origine, ce qui entraîne la dissociation de l' actine-myosine et myocytes relaxation 1-3. Dans ce système, l'activité de SERCA2a est généralement considérée pour déterminer la vitesse de relaxation du myocarde , car elle représente 70-90% de Ca2 + cytosolique retrait dans la plupart des cellules cardiaques mammaliennes 1. En tant que tel, anormale Ca2 + manipulation par LTCC, RyR et SERCA2a, etc. ont été considérés comme les principaux mécanismes de troubles de la contractilité et de détente au cœur malade 1-4.
2+ qui fonctionne comme le messager dans les comptes de couplage CE pour environ 1% du total intracellulaire de Ca2 + et la majorité de Ca 2+ est lié à intracellulaires Ca2 tampons 5,6. Ceci est dû au fait que les différents tampons de Ca2 + sont abondants dans les myocytes cardiaques, par exemple, des phospholipides membranaires, l' ATP, phosphocréatine, la calmoduline, la parvalbumine, myofibril TnC, la myosine, SERCA2a et calséquestrine dans le RP. 5,6,7. Parmi eux, SERCA2a et TNC sont prédominants Ca2 + tampons 5,6,7. En outre, Ca 2+ se liant à ses tampons est un processus dynamique au cours de contraction (par exemple, 30-50% de Ca 2+ se lie à TnC et désolidarisé pendant Ca 2 + transitoires 7) et le changement de Ca 2+ cause supplémentaire de liaison "libérer" de la libre Ca 2+ dans le cytosol, les résultats dans les altérations du Ca2 * intracellulaire concntration. Par conséquent, la perturbation du niveau intracellulaire de Ca2 + induit des mouvements anormaux myofilament, qui sont les précurseurs du dysfonctionnement contractile et l' arythmie 8,9. De nombreux facteurs ( à la fois physiologiques et pathologiques) peuvent être des sources de modifications post-transcriptionnelles de protéines de myofilaments qui influencent la sensibilité de myofilaments tampon Ca2 + et Ca myofilaments 8-10. Récemment, il a été rapporté que des mutations dans les protéines myofilament augmentent le Ca 2+ affinité de liaison et intracellulaire de Ca2 + manipulation, déclenchant une pause-dépendante potentialisation de Ca 2 + transitoires, Ca 2+ libération anormale, et arythmies 8. Conformément à ce concept, nous avons également montré que myofilament Ca 2+ désensibilisation dans les cœurs de rats hypertendus secondaires à la régulation positive de la synthase neuronale de l' oxyde nitrique est associée à diastolique élevée et systolique niveaux de Ca2 +11, qui , à son tour, augmente la vulnérabilité du LTCC à l' inactivation dépendante de Ca 12. Par conséquent, la sensibilité de myofilament Ca est un régulateur "actif" de Ca2 + intracellulaire homéostasie et myocytes fonction contractile. Il est devenu nécessaire d'analyser les interactions entre myofilament et Ca2 + manipulation des protéines d' une enquête approfondie des myocytes couplage CE et la fonction cardiaque.
Ici, nous décrivons un protocole qui permet d' évaluer les changements de la sensibilité de myofilament Ca dans les myocytes cardiaques isolés. Une analyse complète des Ca2 + intracellulaire profil, la sensibilité et la contraction de myofilament Ca va déterrer de nouveaux mécanismes mécanique du myocarde sous - jacents.
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Protocol
Le protocole est en conformité avec le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publiées par les Instituts nationaux de la santé des Nations Unies (NIH Publication No. 85-23, révisée en 1996). Elle a été approuvée par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université nationale de Séoul (approbation IACUC no .: SNU-101213-1).
1. Préparation du tampon (tableau matériel et équipement)
- Préparer 300 ml de solution d'isolation fraîches le jour de l'expérience (en mM: NaCl 135; KCl, 5,4; MgCl2, 3,5; glucose 5; HEPES, 5, Na 2 HPO 4, 0,4, taurine, 20; pH 7,4 avec du NaOH).
- Préparer 100 ml d' une solution de stockage fraîches le jour de l'expérience (en mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO4 5; CaCl 2 0,2; sodium pyruvate 5; glucose 5,5; taurine 20; HEPES 10, mannitol 29; pH 7,4 avec NaOH).
- Préparer 1L de solution de perfusion (en mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MgCL 2, 1; HEPES, 10; glucose, 5,5; CaCl 2, 1,8; le mannitol, 14,5; pH 7,4 avec NaOH).
- Préparer 30 ml de solution de collagénase 1 par addition de collagénase (1 mg / ml), de la protéase (0,1 mg / ml), de l' albumine de sérum bovin (BSA, 1.67mg / ml), et le Ca2 + (0,05 mM) à 25 ml d'isolement Solution.
- Préparer 20 ml de solution de collagénase 2 par addition de collagénase (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml), et le Ca2 + (0,05 mM) à 16,7 ml de solution d'isolation.
- Préparer 40 ml de solution de BSA par addition de 0,4 g de SAB à 40 ml de solution d'isolation. Séparée 10 ml et 30 ml dans deux béchers. Ajouter Ca2 + à 30 ml de solution de SAB de sorte que la concentration finale en Ca2 + dans la solution de BSA est de 1 mM.
2. Préparation pour l'isolement du ventricule gauche (LV) myocytes
- Transfert 8-12 semaine-vieux, Sprague-Dawley (SD) des rats dans des cages de transport propres de l'installation de l'animal à la salle de préparation et d'isolement.
- Hmanger deux bains d'eau à 37 o C.
Remarque: Utilisez le bain d'une eau pour l'eau - réservoir chemisé et les tubes de perfusion du système de perfusion Langendorff. Utilisez l'autre bain d'eau pour agiter les troncs de tissus myocardiques afin de séparer les myocytes simples. - Ajouter 5 ml et 3,3 ml de solution de BSA (sans Ca2 +) à 25 ml d' une solution de collagénase 1 et 16,7 ml d'une solution de collagénase 2 pour compenser le volume à 30 ml et 20 ml, respectivement.
- Ajouter la solution d'isolation (100 ml) et une solution de collagénase 1 (30 ml) à la colonne 1 (colonne 1) et la colonne 2 (colonne 2) dans le système Langendorff de perfusion, respectivement (figure 1A).
- Oxygéner la solution d'isolation et d'une solution de collagénase 1 dans la colonne 1 et Col.2 via le tube de raccordement d'oxygène dans le système de perfusion de Langendorff (figure 1A). De même, une solution de collagénase oxygénat 2 et la solution de BSA dans le bain-marie à agitation avec 100% d' O 2 par l'intermédiaire dutube de raccordement d'oxygène.
3. Isolement de myocytes LV
- Anesthetize un rat SD par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (30 mg / kg) et de confirmer l'état d' anesthésie par orteil pincement et l' absence de retrait réflexion.
- Déplacer le rat sur un plateau de dissection. En position couchée, fixer les quatre pattes sur les côtés du corps avec du ruban adhésif.
- Appliquer thoracique incisions mi-axiales avec des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir le coffre, en veillant à ne pas endommager le cœur. Utilisez une autre paire de ciseaux propres à disséquer le cœur des vaisseaux de connexion (par exemple, cava supérieur et inférieur vena, vaisseaux pulmonaires, et de l' aorte) et de la membrane péricardique 13.
- Laisser une partie de l'aorte , d'une longueur suffisante (5-8 mm), serrer l'aorte avec une pince fine, et de monter rapidement la canule du système de perfusion de Langendorff à moins de 1 min (figure 1A). Attachez fil de suture 4/0 étroitement sur l'aorte.
- Démonter le coeur digéré en coupant l'aorte et le transférer en maintenant l'aorte avec une pince dans le flacon contenant une solution d'isolation frais (Figure 1BI). Utilisez des ciseaux fins et des pinces pour couper la majeure partie de la paroi libre LV (y compris le septum) en petits morceaux (~ 22 mm, Figure 1Bii).
- Transférer les morceaux dans un flacon contenant une solution préchauffée et oxygénée collagénase frais 2 (Figure 1Biii). Agiter pendant 10 min. Fournir de l'oxygène à maintenir la solution contenant la collagénase-2 myocytes.
- Déplacez le myocytes - suspension à un tube de 10 ml de centrifugeuse en utilisant pipettes avec une ampoule d'aspiration et ajouter Ca 2+ - contenant une solution BSA (1: 1 en volume). Centrifuger à 30 g pendant 2 minutes et jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot de myocytes dans 5 ml de solution de BSA. Centrifugeuse et jeter le surnageant.
- Disperser les pastilles de myocytes et de garder les myocytes dans 10 ml de solution de pré-oxygénée stockage à température ambiante (figure 1Biv-vi).
- Répéter les opérations (étapes 3/7 à 3/9) avec le tissu LV restant dans le ballon.
Remarque: Continuez à répéter les procédures (étapes 03.07 à 03.09) jusqu'à ce que la plupart des tissus LV disparaît pour obtenir un bon rendement de myocytes. - Maintenir les myocytes dans une solution de stockage pendant 8/6 heure à température ambiante jusqu'à la fin des expériences.
4. Les mesures simultanées de intracellulaires Ca 2+ Transitoires et myocytes Contraction
- myocytes charge BT avec l'ester acétoxyméthyle Fura-2 AM (2 uM).
Remarque: Effectuez toutes les procédures et expériences chargement avec myocytes chargés dans un tube noir (Figure 1Bvii).- Centrifuge la suspension de myocytes (1 ml) à 2 000 x g pendant 10 s. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot de myocytes dans 1 ml de solution de Tyrode avec une faible concentration de Ca 2+ (250 uM, Tableau matériel et équipement).
- Ajouter Fura-2 heures et poloxamère 407 (2 pi), disperser doucement la suspension de myocytes, et maintenir le mélange à la température ambiante (20-24 ° C) pendant 15 minutes (Figure 1Bvii).
- Centrifuger le mélange pendant 5 secondes, éliminer le surnageant et on disperse le culot de myocytes dans 1 ml de solution de perfusion contenant 500 uM de Ca 2+. Au bout de 10 min, centrifuger le mélange pendant 5 sec et jeter le surnageant.
- Ajouter une solution de perfusion frais (500 uM Ca 2+, 1 ml) et de garder le Fura-2 heures - culot myocytes chargé dans cette solution pour les enregistrements.
- Mesure de LV myocytes contraction et intracellulaire de Ca2 +
- Avant d'enregistrer, remplir le tube de perfusion qui fonctionne à travers unchemise d'eau avec la solution de Tyrode, qui est pré-chauffé à 36 ° C
- Placez quelques gouttes de la Fura 2 heures - chargé LV myocytes suspension sur la chambre d'un microscope inversé à fluorescence pour 5-8 min. perfuser lentement la solution de Tyrode (2,2 ml / min).
- Appuyez sur le bouton "start" sur le panneau avant du stimulateur numérique pour commencer la stimulation de champ (2 Hz).
Remarque: La tension de sortie (V 10, 5 msec durée) est appliquée aux myocytes dans la chambre par des fils de platine positionnés de part et d'autre de la chambre.- qui se contractent de manière stable Sélectionnez myocytes (pas ceux affichant hyper- ou hypo-contraction) pour l'enregistrement.
- Réglez le myocytes de choix dans la position horizontale du système de détection sarcomère basé sur la vidéo et ajuster la mise au point du microscope pour obtenir des images optimales de sarcomères. Placez la boîte rectangulaire pourpre sur la zone dans laquelle sarcomères claires sont clairement observés jusqu'à ce que la moyennedes longueurs de sarcomères (pic rouge) affiche un pic singulier forte (figure 2A, image inférieure).
- Notez les changements de longueur de sarcomère en réponse à une stimulation de champ (Figure 2A et B).
Remarque: Utilisez les myocytes chargés dans les 1 - 2 h. - Régler l'ouverture de la caméra de sorte que le champ dans le système de détection de sarcomères vidéo basée sur la taille de myocyte (figure 2A). Stimule la myocytes avec une excitation à 360 nm / 380 nm et émission à 510 nm (fréquence d'acquisition de 1000 Hz). Enregistrez le raccourcissement des sarcomères et le rapport Fura2 AM avec une stimulation de champ (figure 2B).
5. L' évaluation de la sensibilité de myofilament Ca
- La moyenne des longueurs de sarcomères et Ca 2 + transitoires à l' état d' équilibre (10 - 20 traces) et tracer la boucle à phase plan du rapport Fura-2 par rapport à la longueur des sarcomères du même myocytes ( à la fois avec la valeur mesurées et delta changements; Figure 2C).
- Dans chaque parcelle, définir Fura de ratio à 50% de relaxation (CE 50, figure 2C). Comparer à la fois la boucle et CE 50 de chaque intervention.
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Representative Results
myocytes LV sont isolés des coeurs de rats normaux et hypertendus. Myocytes en forme de tige avec des stries claires (représentant sarcomères) et des contractions stables en réponse à une stimulation de champ sont considérés comme les myocytes optimales et sont sélectionnés pour les enregistrements (figure 2A). Dans l'exemple représenté en F igure 2A, une Fura 2 heures LV myocytes est chargé en position horizontale et l'ouverture de la caméra est réglée de telle sorte que le myocytes occupe la majeure partie de la zone d'enregistrement et minimal zone d'arrière - plan est incluse. Dans le domaine de l'enregistrement, ajuster les dimensions de la boîte violette en cliquant et en faisant glisser cette case sur l'écran d'ordinateur (par le biais du programme d'enregistrement). Lorsque la longueur de sarcomère moyenne montre un pic rouge vif, commencer l' enregistrement (Figure 2A, image inférieure).
Tant la longueur du sarcomère et intracellulaire de Ca 2+ transie nts (Fura-2 ratios) sont enregistrées simultanément à partir des mêmes myocytes (figure 3A). Les traces moyennes de la longueur des sarcomères et de Ca les transitoires sont représentés sur la figure 3B. Individuellement, les longueurs diastolique / systolique de sarcomères, le temps de pointe (PT), et sarcomère raccourcissement sont mesurés pour enquêter sur l'amplitude et la dynamique des myocytes contractilité. Le temps de 50% de relaxation (TR 50) est analysé pour évaluer la relaxation du myocyte. De même, la pression systolique et diastolique , Fura-2 , les rapports (transitoires Ca2 +), temps au pic (PT) de phénomènes transitoires de Ca2 + et de constante de temps de décroissance de Ca2 + transitoire (tau) sont analysées pour évaluer myocytes contraction et la relaxation (Tableau 1). Dans cet exemple, les amplitudes de Ca 2 + transitoires sont modérément augmenté en myocytes LV à partir d' un rat hypertendu et la contraction est modérément réduite (figure 3B et le tableau 1).
contenu "fo: keep-together.within-page =" 1 "> En outre, les relations entre le Fura - 2 rapport et la longueur de sarcomère (indiquant la myofilament Ca 2+ sensibilité de myocytes LV) sont tracées dans les deux rats sham et hypertendus ( . la figure 3C) la Fura 2 - sarcomère longueur de trajectoire pendant la phase de relaxation du myocyte définit un quasi-équilibre du cytosol Ca 2+, myofilaments Ca 2+ de liaison et la longueur du sarcomère 14 et , par conséquent, la phase de relaxation est comparée entre les deux groupes. le déplacement vers la droite de la trajectoire dans les myocytes dans le groupe hypertendu indique une réponse réduite à myofilaments Ca2 + (figure 3C). en conséquence, la concentration de Ca2 + intracellulaire requise pour la relaxation moitié (CE 50) est augmentée (figure 3C) , se référant à myofilament Ca 2+ -desensitization dans l' hypertension.Figure 1. Procédures pour l' isolement des myocytes LV de coeur de rat. (A) Le système de perfusion de Langendorff utilisé pour perfuser la solution d'isolation dans le coeur canulée par l'aorte (encart, image agrandie du coeur monté sur le système de perfusion) (B) i - iii. Le coeur après digestion avec une solution de collagénase 1 et disséqué les tissus LV dans un plat et d'un flacon (B) iv - vi:.. myocytes suspension après addition d' une solution de collagénase 2, myocytes culot après centrifugation, et remises en suspension myocytes culot dans une solution de stockage (B) vii: incubation, incuber LV myocytes dans Fura 2 heures - solution contenant de l' isolement (2 uM Fura 2 AM, 250 uM de Ca 2+ et avec 2 pl poloxamère 407); lavage, laver myocytes LV avec une solution d'isolation avec 500 uM de Ca 2+; stockage, gardez Fura-2 AM - myocytes BT chargés danssolution d'isolation frais contenant 500 uM de Ca 2+. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Mesure de sarcomère shortening et le rapport Fura-2 (indicatif du niveau intracellulaire de Ca2 +). (A) Un diagramme de sarcomère, une image d'un LV myocytes chargé en Fura-2 et la longueur des sarcomères en moyenne (le pic rouge) sont affichées sur l'ordinateur. Dans le panneau inférieur, la ligne noire est la moyenne de chaque ligne de pixels horizontaux dans la région pourpre d'intérêt. La ligne bleue est les mêmes données ramenées à zéro à chaque extrémité. La ligne rouge est la transformée de Fourier rapide (FFT) du spectre de puissance, ce qui représente le nombre de signaux de la FFT a calculé. Un pe forteak signifie un enregistrement sarcomère propre. (B) enregistrements simultanés de longueur de sarcomère et le ratio de la Fura en réponse à une stimulation de champ (2Hz). (C) Phase-plan tracé du rapport Fura 2 fonction de la longueur des sarcomères du même LV myocytes (notez que tant la longueur réelle / Fura rapport 2 et delta modifications de ces paramètres sont analysés). CE 50 (Fura ratio 2 à 50% de relaxation, cercle indiqué par la flèche) est la comparaison qualitative de la sensibilité des myofilaments Ca entre les groupes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les résultats représentatifs de l'analyse de LV myocytes contraction imposture et les rats hypertendus. (A) des traces brutes de sarcomère shortening et Fura - 2 mesure du rapport dans les myocytes LV de simulacre et de rats hypertendus (B) traces moyennes de longueur de sarcomère et Fura -. 2 signaux. Les paramètres analysés dans les traces moyennes sont présentées dans le tableau 1. (C) parcelles Phase-planes de la Fura - 2 rapport vs longueur de sarcomère ( à la fois la longueur réelle et Fura - 2 rapport et delta modifications de ces paramètres) dans les deux groupes . La boucle de trajectoire est décalée vers la droite et la CE 50 a tendance à être plus élevé dans l' hypertension, ce qui suggère myofilament Ca 2+ désensibilisation. PT, temps au pic (s); Tau, une constante de temps de décroissance de Ca2 + transitoire (s) (obtenu en adaptant la phase de déclin de la Fura - 2 rapport avec une fonction exponentielle) .TR 50: temps de 50% de relaxation (s). 
S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandede ce chiffre.
| Paramètres | Faux | Hypertension | |
| Intracellulaires Ca 2+ | Diastolique Ca 2+ | 1.189 | 1.124 |
| Systolique Ca 2+ | 1.71 | 1.691 | |
| L'amplitude (Δ ratio) | 0,521 | 0,567 | |
| Temps de pointe (PT, s) | 0,021 | 0,031 | |
| Tau (s) | 0,079 | 0,076 | |
| Sarcomère | diastolique | 1.758 | 1,78 |
| longueur de sarcomère (pm) | |||
| Sarcomère | 0,122 | 0,115 | |
| Raccourcissement (16; longueur, mm) | |||
| Temps de pointe (PT, s) | 0,064 | 0,055 | |
| Le temps de 50% | 0,032 | 0,03 | |
| Relaxation (TR 50, s) | |||
| EC50 | [Ca 2+] i (Fura-2 ratio) pour 50% sarcomère relengthening | 0,2382 | 0,3224 |
Tableau 1. Analyse de la Fura - longueur 2 rapport (Ca2 + intracellulaire) et sarcomères mesures.
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Discussion
Ici, nous décrivons les protocoles pour évaluer les changements de la sensibilité de myofilament Ca en simple myocytes cardiaques isolés et soulignons l'importance de mesurer ce paramètre aux côtés de propriétés électrophysiologiques, intracellulaires Ca 2 + transitoires, et la dynamique des myofilaments. En effet, les enregistrements d'une ou deux des paramètres ne peuvent pas expliquer les mécanismes sous-tendant la contraction cardiaque et la relaxation. A la différence des procédés classiques qui mesurent la contraction des myocytes et de la concentration intracellulaire de Ca 2+ profil individuel 1, la présente méthode examine les deux paramètres à la fois dans les myocytes cardiaques.
Un certain nombre de méthodes sont généralement utilisées pour évaluer la sensibilité de la myofilament Ca des muscles ou des myocytes 15,16,17, par exemple, l' examen des interactions entre exogène Ca 2+ et sarcomère / longueur de la cellule / tension dans les myocytes peau(Traités avec des détergents tels que la saponine ou la β-esin pour perméabiliser la membrane). Les longueurs sont mesurées avec une photo-diode et des techniques de diffraction de faisceau laser et de la tension avec des capteurs de force ou de fibres de carbone). Ces techniques sont largement utilisées dans les études de muscle car ils permettent une évaluation quantitative de la sensibilité de myofilament Ca. Cependant, les activités des canaux ioniques endogènes dans la membrane plasmique et intracellulaire de Ca2 + manipulation, ceux sont nécessaires pour lancer la mécanique de myofilaments, sont négligés dans ces techniques. En outre, les bandes de muscle ou de myocytes à l'étude sont pré-étirés à une certaine longueur diastolique, et dans ces conditions, la longueur du sarcomère initiale peut différer de la longueur diastolique réelle des myocytes (en particulier dans des états pathologiques et à des interventions). Cela met en évidence l'avantage de la mesure actuelle où organites cellulaires restent relativement non perturbé, ce qui permet l'éva complèteation de la fonction contractile des myocytes.
Naturellement, la qualité des myocytes (Ca 2+ -tolerating) et le chargement optimal des Fura - 2AM sont deux éléments clés pour une évaluation réussie de la sensibilité de myofilament Ca. Par conséquent, plusieurs modifications sont appliquées au protocole afin d'obtenir des myocytes en forme de tige viables (60-80% des cellules totales, comme décrit précédemment 18,19,20). Tout d' abord, une faible dose de Ca 2+ est ajouté à la solution au cours du processus de digestion (par exemple, la concentration en Ca 2+ est de 50 uM dans les solutions de collagénase et de 200 uM dans la solution de stockage). En second lieu, lors du processus de digestion, de la BSA est ajouté aux solutions de collagénase pour améliorer la stabilité de la membrane. En troisième lieu, la plupart des solutions sont oxygénés lors de l'isolement, ce qui augmente le pourcentage de myocytes fonctionnels et la durée des expériences (6-8 h). Quatrièmement, les myocytes isolés sont conservés dans la solution de stockage contenant 200 uM de Ca 2+.
Pour obtenir un chargement optimal avec Fura 2 heures, deux différentes concentrations de Ca2 + (250 et 500 pm) sont utilisés et le poloxamer 407 (2 ul, 20% préparée dans du diméthylsulfoxyde) est ajouté afin d' améliorer la perméabilité de Fura-2 heures à travers la membrane , et sa stabilité dans les myocytes. Il convient de noter que tous les indicateurs de Ca colorants sont Ca 2+ tampons 21. Par conséquent, les chercheurs devraient éviter d'utiliser une concentration élevée de Fura-2 AM ou une incubation plus longue pour éviter tampon excessive et réduit la contractilité des myocytes. Il est recommandé que myocytes contraction sans Fura - 2 chargement est systématiquement vérifiée, ce qui est une étape essentielle pour estimer la qualité de myocytes et de l'état de chargement. Variabilité dans le chargement est inévitable. Par conséquent, il est important de vérifier la variabilité des myocytes contraction, en particulier, si le nombre de myocytes contracter dans la chambre est similaire avant et unprès avoir chargement. Analyse des myocytes hyper- ou hypo-traitance doit être évitée car ils ne représentent pas l'état moyen de myocytes et peuvent entraîner des résultats et des évaluations biaisées.
Il convient de noter que les changements mesurés dans le rapport Fura 2 sont des réflexions du niveau intracellulaire de Ca2 +, au lieu de la concentration chimique réelle de Ca 2+. Par conséquent, la méthode décrite ici évalue les changements qualitatifs de la sensibilité de myofilament Ca, plutôt que la sensibilité réelle des myofilaments Ca 2+. Calibration de Fura - 2 signal à la concentration intracellulaire de Ca2 + est la solution pour acquérir fiables concentrations de Ca2 + dans les myocytes individuels. La procédure d'étalonnage nécessite le chargement des myocytes avec différentes concentrations de Ca2 + Fura conjugué à - 2 heures (concentration en Ca2 + allant de 0 à 39 uM), et le Fura obtenu - 2 ratios sont calculés par ee formule suivante: [Ca 2+] i = Kd * (R - Rmin) / (Rmax - R) * F380max / F380min 21. Il est possible de calculer les valeurs moyennes mises en commun de concentrations de Ca2 + à travers une telle procédure d'étalonnage. Cependant, parce que le chargement des indicateurs de Ca est variable entre les myocytes et l' étalonnage ne soit pas effectuée dans une cellule individuelle, concentrations de Ca2 + ne peuvent pas être acquises avec précision. En outre, si F360 / F380 est mesurée plutôt que F340 / F380 (comme dans la présente étude), le rapport Fura 2 est moins précis (car F360 est la longueur d' onde isobestique de Fura-2 fluorescence 22). Néanmoins, il est encore une méthode valide pour évaluer les changements qualitatifs dans la sensibilité de myofilament Ca dans des expériences physiologiques, en particulier dans les cœurs humains malades, où myofilaments peuvent être modifiés de façon concomitante après les changements dans l'environnement intracellulaire. Il est recommandé que ce procédé est combiné avec d'autres méthodes (comme ledécrit précédemment dans la section Discussion) pour analyser précisément la vraie sensibilité de myofilaments à Ca 2+.
L'autre limitation de la méthode dans l'étude de myocytes contraction est l'état déchargé. Il peut sous - estimer ou surestimer les changements dans la sensibilité de myofilament Ca. Par conséquent, pour évaluer avec précision la sensibilité de myofilament Ca, l' analyse doit être effectuée avec des mesures alternatives pour l' évaluation à la fois qualitative et quantitative.
La technique est applicable pour l'évaluation de la fonction myocardique dans les cœurs sains et malades, y compris des échantillons cardiaques humaines, où l'environnement redox cellulaire et les modifications post-transcriptionnel sont modifiées, entraînant des modifications concomitantes dans les fonctions de myofilaments. En particulier, les canaux ioniques, homéostasie ionique intracellulaire et des protéines régulatrices dans myofilaments sont interactifs; Par conséquent, tous ces composants fonctionnent de concert pour déterminer la performance cardiaque in vivo (par exemple, telle que mesurée dans l'échocardiographie).
En conclusion, nous décrivons une méthode pour évaluer les modifications de la sensibilité de myofilament Ca et de souligner l'importance de l' analyse de ce paramètre en association avec l' électrophysiologie cardiaque, intracellulaire de Ca2 + manipulation, et myocytes contraction pour obtenir un profil complet de la fonction myocytes. La sensibilité de myofilament Ca doit être mesuré régulièrement dans les études mécanistiques en utilisant des modèles cardiaques malades, où les changements de ces paramètres, ainsi que différentes voies de signalisation intracellulaires sont interdépendants.
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Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le Programme de recherche en sciences de base par la National Research Foundation de Corée (NRF), financé par le Ministère de l'éducation, de la science et de la technologie (2013068067); par le Graduate Programme cerveau Corée 21 du ministère coréen de l'éducation, des sciences et de la technologie, hôpital universitaire national de Séoul, la Société coréenne de l'hypertension (2013), Fonds de recherche Telecom SK (. pas 3420130290) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC 31460265; NSFC 81260035).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
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