Summary
I denne artikel beskrives en protokol til visualisering amyloid Ap plaques i Alzheimers sygdom-musemodeller ved anvendelse methoxy-x 04, som krydser blod-hjerne-barrieren og selektivt binder til p-plisserede ark findes i tæt kerne Ap plaques. Det tillader præ-screening af plaque-holdige vævssnit før immunfarvning og forarbejdning til elektronmikroskopi.
Abstract
En detaljeret protokol er anført her for at identificere amyloid Ap plaques i hjernen sektioner af Alzheimers sygdom musemodeller før præ-embedding immunfarvning (specifikt for ioniseret calcium-bindende adaptormolekyle 1 (IBA1), et calcium-bindende protein udtrykt af mikroglia) og vævsbehandling for elektronmikroskopi (EM). Methoxy-x 04 er et fluorescerende farvestof, der krydser blod-hjerne-barrieren og selektivt binder til p-foldet ark findes i tæt kerne Ap plaques. Injektion af dyrene med methoxy-x 04 før aflivning og hjerne fiksering tillader pre-screening og udvælgelse af plaque-holdige hjerne sektioner for yderligere behandling med tidskrævende manipulationer. Dette er især nyttigt, når studerer tidlig AD patologi inden for specifikke områder af hjernen eller lag, der kan indeholde meget få plaques, der er til stede i kun en lille brøkdel af sektionerne. behandling af vævssnit med Congo Rød, Thioflavin S, og Thiofl Post-mortemavin T (eller endda med methoxy-x 04) kan mærke p-plisseret ark, men kræver omfattende rydning med ethanol for at fjerne overskydende farvestof og disse procedurer er uforenelige med ultrastrukturelle konservering. Det ville også være effektivt at udføre mærkning af Ap (og andre cellulære markører, såsom IBA1) på alle hjernesnit fra regioner af interesse, kun for at give en lille fraktion indeholdende Ap plaques på det rigtige sted. Vigtigere er det, Ap plaques er stadig synlige efter vævsbehandling for EM, der giver mulighed for en præcis identifikation af de områder (generelt ned til nogle få kvadratmillimeter) med elektronmikroskop til at undersøge.
Introduction
Amyloid Ap plakdannelse er det vigtigste neuropatologiske kendetegnende for Alzheimers sygdom (AD). Men stigende tyder vigtige roller i immunsystemet i sygdomsprogression 1,2. Især nye data fra prækliniske og kliniske studier etableret immun dysfunktion som en vigtigste drivkraft og bidragyder til AD patologi. Med disse resultater, har centrale og perifere immunceller dukket op som lovende terapeutiske mål for AD 3. Den følgende protokol kombinerer lys og elektronmikroskopi (EM) til at generere nye indsigter i forholdet mellem Ap plaque deposition og microgliale fænotypiske ændringer i AD. Denne protokol tillader mærkning af Ap plaques i musemodeller for AD under anvendelse af in vivo injektion af det fluorescerende farvestof methoxy-x 04. Methoxy-x 04 er en Congo Red-derivat, der let kan krydse blod-hjerne-barrieren til at indtaste hjerneparenkymet og binde β-plisserede ark med højffinity. Eftersom farvestoffet er fluorescerende, kan den anvendes til in vivo detektion af Ap plaque deposition med to-foton mikroskopi 4. Når bundet til Ap, betyder methoxy-x 04 ikke tager afstand eller videredistribuere væk fra plaques, og det bevarer sin fluorescens over tid. Det er generelt indgives perifert at muliggøre ikke-invasiv billeddannelse af hjernen dynamik 5. Fluorescensen forbliver også efter aldehyd fiksering, der giver mulighed for korrelativ post mortem-analyser, herunder undersøgelse af neuronal død i nærheden af Ap-plaques 6.
Denne protokol udnytter egenskaberne af methoxy-x 04 for at vælge hjerne sektioner fra APP SWE / PS1A 246e mus (APP-PS1, co-udtrykke en dobbelt mutation på APP genet Lys670Asn / Met671Leu, og human presenilin PS1-A264E variant) 7, der udviser Ap plaques i specifikke områder af interesse (hippocampus CA1, strata radiatum og lacunosum-moleculare) Før pre-embedding immunfarvning mod mikroglial markør ioniseret calcium-bindende adapter molekyle 1 (IBA1) at visualisere microgliale celle organer og processer med EM. Musene gives intraperitoneal injektion af methoxy-x 04-opløsning, 24 timer før hjernen fiksering gennem transcardial perfusion. Koronale hjernesnit opnås ved anvendelse af et vibratom. Sektioner indeholdende hippocampus CA1 screenes under et fluorescerende mikroskop for tilstedeværelse af Ap plaques i strata radiatum og lacunosum-moleculare. Immunfarvning for IBA1, er osmiumtetroxid post-fiksering, og plast harpiks indlejring derefter udført på de udvalgte hjernesektioner. Ved slutningen af denne protokol, kan sektionerne arkiveres uden yderligere ultrastrukturelle nedbrydning, klar til ultratynde sektionering og ultrastrukturelle undersøgelse. Vigtigere er de plaques stadig fluorescerende efter immunfarvning med forskellige antistoffer, f.eks IBA1 som i den foreliggende protokol. De bliver mørkere tHan deres omgivende neuropil efter osmiumtetroxid post-fiksering, uafhængigt af methoxy-x 04 farvning, som hjælper med at præcist at identificere de områder af interesse, generelt ned til nogle få kvadratmillimeter, der skal undersøges med transmissions elektron mikroskop.
Denne korrelative tilgang giver en effektiv måde at identificere specifikke hjerne sektioner for at undersøge på ultrastrukturelle niveau. Dette er især nyttigt, når studerer tidlig AD patologi, inden specifikke hjerneregioner eller lag, som kun indeholder nogle få Ap plaques, der er til stede i kun en lille brøkdel af vævssnit. I disse tider især, ville det være effektivt at anvende immunfarvning for Ap (og dobbelt mærkning for andre cellulære markører, såsom IBA1) på flere hjernesnit blot for at give en lille fraktion indeholdende Ap plaques på det rigtige sted. Desuden injektion af levende mus med methoxy-x 04 før aflivning og væv behandlingen ikke compromise den ultrastrukturelle konservering. Alternative metoder såsom farvning post mortem med Congo Rød, Thioflavin S, thioflavin T eller methoxy-x 04 på faste sektioner væv kræver farvning differentiering i ethanol, 8-11, som forårsager osmotiske stress og forstyrrer ultrastruktur. Congo Red er også kræftfremkaldende for mennesker 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Alle forsøg blev godkendt og udført i henhold til retningslinjerne i den institutionelle dyreetik udvalg, i overensstemmelse med den canadiske Rådet om Animal Care retningslinjer som administreres af Animal Care udvalg Université Laval. APP-PS1 hanmus mellem 4 og 21 måneder gamle, blev anvendt. Disse dyr blev huset under en 12 h lys-mørke-cyklus ved 22 - 25 ° C med fri adgang til foder og vand.
1. Methoxy-x 04 Fremstilling af opløsning
- Der fremstilles en 5 mg / ml opløsning af methoxy-x 04 9 ved at opløse methoxy-x 04 i en opløsning indeholdende 10% dimethylsulfoxid (DMSO), 45% propylenglycol og 45% natrium- phosphatpufret saltvand (0,9% NaCl i 100 mM phosphatbuffer , pH 7,4).
- Ved hjælp af en mikrovægt, vejer 5 mg af methoxy-x 04 forbindelse. Under en emhætte, opløse methoxy-x 04 i DMSO og omrøres, indtil der opnås en klar grønlig opløsning. Successivt tilsættes propylenglycol og pHosphate buffer saltvand under omrøring med hver tilsætning.
- Omrør opløsningen ved 4 ° C på en rotator O / N. Opnå en gullig grøn emulsion. Opløsningen kan opbevares ved 4 ° C i op til to måneder uden nedbrydning.
2. Methoxy-x 04 Solution Injection
- 24 timer før perfusion, vejes musene og give hver mus en intraperitoneal injektion af methoxy-x 04 i en dosis på 10 mg / kg legemsvægt ved anvendelse af en 27 ½ G nål.
3. Transcardial perfusion af injicerede mus
- På dagen før perfusionen, udarbejde passende volumener af phosphatpufret saltvand (PBS), 3,5% acrolein, og 4% paraformaldehyd (PFA) løsninger 13 og opbevare dem ved 4 ° CO / N.
Bemærk: Disse opløsninger vil blive brugt til både perfusion og pre-embedding immunhistokemi. Vær særlig forsigtig, når du arbejder med acrolein, da det er ætsende og giftige for bådeforskere og miljø. Eftersom acrolein er ætsende for plast, altid bruge egnet glasvarer til at forberede acrolein løsninger. - På dagen for perfusion, foretage PFA og acrolein ved hjælp grovfiltrerpapiret på 25 um partikelretentionskammeret.
- Under perfusion, brug en peristaltisk pumpe til at levere 15 ml PBS, 75 ml acrolein, og 150 ml PFA successivt i musen omsætning, ved en strømningshastighed på 25 ml / min.
Vær forsigtig. Udfør perfusion strengt inde i en emhætte for at undgå skadelige dampe af PFA og acrolein.- For at opsætte pumpen, indsætte den ene ende i PBS løsning, fylde slangen (holder ca. 15 ml) med PBS, og fastsætte en 25 G vinget blodtapning nål til den anden ende. På alle tidspunkter, sørge for, at slangen er helt fri for luftbobler.
- Glasset anbringes direkte i acrolein flasken efter indstilling af perfusion pumpe med slangen fyldt med PBS.
- enaesthetize en mus ad gangen med en 90 mg / kg kropsvægt dosis natriumpentobarbital injiceret intraperitonealt under anvendelse af en 27 ½ G nål. Vurdere reaktioner på hale / tå trykker. Fortsæt kun hvis musen ikke reagerer på sådanne afskrækningsmiddel, smertefulde stimuli.
- Fastgør musen i liggende stilling (liggende på ryggen med ansigtet opad) ved at tape forpoterne og bagpoter med arbejdsfladen og omhyggeligt udsætte hjertet uden at forårsage skade på andre organer. Vær sikker på at arbejde hurtigt efter punktering mellemgulvet.
- Udfør en incision gennem huden med kirurgiske sakse langs thorax midterlinjen begynder kaudalt for brystkassen og fortsætte rostralt for kravebenet.
- Gøre yderligere to laterale indsnit langs bunden af den ventrale brystkassen. Bevæg og pin de to flapper af hud, og sørg for at eksponere hele brysthulen.
- Hold formet som et sværd proces med stumpe pincet til at eksponere brysthulen og støt den spidse sakss. Skær igennem mellemgulvet og brystkassen, være omhyggelig med at undgå at punktere lungerne, og fortsætte snittet rostralt til kraveben. Vær sikker på at arbejde hurtigt efter punktering mellemgulvet.
- rive forsigtigt hjertesaek med stumpe pincet. Hold hjertet stabilt med stumpe pincet, skære det højre atrium, og start infusion af PBS. Læg straks blodtapning nålen ind i venstre ventrikel.
- Perfundere musen med PBS (i slangen) efterfulgt af acrolein i 3 minutter (svarende til 75 ml) og derefter skifte til PFA i 6 minutter (svarende til 150 ml). Sørg for at holde pause pumpens flow før du skifter løsning for at forhindre bobler i at trænge ind i røret.
- Halshugge musen og udtrække den faste hjerne og placere den direkte i et hætteglas indeholdende 4% PFA i mindst 2 timer ved 4 ° C.
- For at ekstrahere hjernen, en saks og pincet til at skære gennem huden for at blotlægge kraniet. bryde forsigtigt kraniet opOr i mellem øjnene, og chip off små stykker af det at eksponere den underliggende hjerne.
- Fjern forsigtigt den udsatte hjerne og post fix det med 4% PFA i yderligere 2 timer, før du fortsætter til vibratome sektionering.
4. Brain Sektionsinddeling Brug af en Vibratome
- Vask den faste hjernen 3 gange med afkølet PBS. Ved hjælp af en skarp barberblad, fjern lugtekolben (medmindre denne region er under undersøgelse) og sender hjernen tværs i 2 - 3 stykker af omtrent ens højde, som alle kan sektioneret samtidig for at fremskynde proceduren.
- Lim stykker af hjernevæv lodret ned på prøven plade sikret i bakken. Sørg for, at den glatte snitfladen stikker fast til modellen pladen og ikke bliver fortrængt under sektionering procedure. Tilsæt så PBS løsning i bakken, indtil hele hjernen overfladen er helt neddykket. Det er vigtigt at holde the hjerne stykker og efterfølgende afsnit helt nedsænket i PBS i hele dette trin.
- Placer bakken i vibratome, justere skærehastighed til 0,5 mm / sek, af skære- frekvens til 90 Hz, og foderet tykkelse til 50 pm for at give 50 um tykke sektioner. Derefter overføre sektioner i 20 ml hætteglas med kryobeskyttende opløsning (40% PBS, 30% ethylenglycol og 30% glycerol) ved anvendelse af en fin malerpensel. Opbevares glassene ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse. Alternativt holde sektionerne i PBS i umiddelbar screening som beskrevet i de følgende trin.
5. Afsnit Screening for tilstedeværelsen af methoxy-x 04-farvede Plaques
- Ved hjælp af en stereotaktisk musehjerne atlas 14 vælge hjernesnit indeholdende regionen af interesse, for eksempel, hippocampus CA1 som anvendt i det foreliggende eksempel. Placer hver sektion i en brønd i en 24-brønds kulturplade indeholdende nok kryobeskyttende opløsningsåledes at forhindre afsnittene tørrer ud.
- Undersøge hver sektion successivt, for at undgå udtørring sektionerne, ved anvendelse af følgende procedure:
- Tilføj en dråbe PBS til et objektglas med et engangs pipette, og placer afsnittet om dråben.
- Undersøg afsnit under et fluorescerende mikroskop for at identificere regioner, der indeholder methoxy-x 04 mærkede Ap plaques.
Bemærk: methoxy-x 04 let kan visualiseres under anvendelse af en fluorescens ultraviolet (UV) filter (excitation 340 - 380 nm).
- Tage billeder af områder af interesse (ROI) i lyse område samt i fluorescens tilstand uden at bevæge objektbordet, idet hvert billede skal vise den samme region i begge felter for at korrelere tilstedeværelsen af plaques direkte til den strukturelle region af væv afsnittet.
- Gem og navngive billeder taget efter dyrets nummer. optage Også brønden nummer i pladen og feltet af billederne taken. For eksempel, Ex: 9978A1B; Animal nummer: 9978; Nå nummer: A1; Field: Bright. Placér afsnittet tilbage i sin udpegede godt, når billedbehandling er afsluttet.
Bemærk: I sidste ende, for hvert afsnit undersøges, opnås to billeder, et i lyse felt og en anden i UV området. - Åbn de to billeder af samme ROI (en i lyse felt og andre UV felt) i Billede J, og ved hjælp af MosaicJ plugin, justere kanterne af de to billeder og gemmer det justeret og kombinerede billede i overensstemmelse med godt nummer det kom fra.
- Gemme billedet i en separat mappe med nummeret på den bestemt dyr. Kombiner billederne til at identificere og lokalisere de plaques i vævssnittet, og har en fuld udsigt over hele afsnittet i de to forskellige felter (lyse og UV).
- Efter visningen er fuldført, opbevare de undersøgte sektioner ved -20 ° C i en 24-brønds kultur plade indeholdende kryoprotektant indtil immunfarvning eller yderligere behandling er carried ud.
6. Pre-embedding Immunfarvning for IBA1
Bemærk: Udfør immunfarvning for IBA1 på udvalgte frit-flydende sektioner ved at placere pladen på en langsomt bevæger rocker ved stuetemperatur.
- Vask grundigt afsnittene 3 gange med ca. 1 ml PBS, hver vask varede i 10 min.
- Quench endogene peroxidaser med 0,3% hydrogenperoxid i PBS-opløsning i 10 minutter. Dette trin forhindrer uspecifik peroxidaseaktivitet, hvilket er vigtigt for at undgå baggrundsfarvning.
- Vask vævet i PBS 3 gange i 10 minutter hver.
- Inkuber de afsnit på 0,1% natriumborhydrid i PBS-opløsning i 30 minutter. Dette trin er vigtigt at reducere eventuelle resterende aldehyder fra fikseringstrinnet, og er især vigtigt, hvis acrolein anvendes i væv fiksering.
- Vask vævet i PBS 3 gange i 10 min hver gang og sørg for at fjerne alle boblerne.
- Blokere sektionerne i 1 time.Forskellige antistoffer kan kræve forskellige blokerende tider og løsninger. For IBA1, forberede blokeringspuffer indeholdende 10% føtalt bovint serum, 3% bovint serumalbumin og 0,01% Triton X-100 i 50 mM Tris-bufret saltvand (TBS; pH 7,4).
Bemærk: Det blokerende trin er at forhindre ikke-specifik binding af det primære antistof. Den lave koncentration af Triton X-100 tillader svag permeabilisering af membraner til bedre farvning, og er lav nok til at bevare de fleste ultrastrukturelle træk af væv under EM. - Fjern blokerende buffer fra vævet, og inkuber i primære antistofopløsning (kanin-anti-IBA1, fortyndet [1: 1000] i blokeringspuffer) ved 4 ° CO / N.
- Vask i TBS 3 gange i 10 minutter hver gang.
- Inkuber i sekundært antistof (gede-anti-kanin konjugeret til biotin) [1: 200] i 0,05 M TBS i 90 min.
- Vask i TBS 5 gange i 5 min hver gang.
- Inkuber i Avidin-Biotin-kompleks opløsning (Avidin [1: 100], biotin [1: 100]) i TBSopløsning i 1 time.
- Vask i TBS 5 gange i 5 min hver gang.
- Klarlæg IBA1 farvning med 0,05% diaminobenzidin (DAB) og 0,015% hydrogenperoxid i TBS i 8 min.
Bemærk: Timingen for DAB udvikling kan variere fra protokol til protokol og bør bestemmes ved hurtigt at undersøge de farvede snit under et lysmikroskop.
Bemærk: IBA1, bør man være i stand til klart at visualisere celle organer og processer i IBA1-farvede mikroglia på 20X (se figur 2 for repræsentativt eksempel). Være forsigtig ved anvendelse DAB, da det er et kendt carcinogen. - Undgå over-udvikling ved omhyggelig overvågning afsnittene (som beskrevet ovenfor) under dette trin. Reaktionen standses ved vaskning sektionerne i afkølet PB 5 gange i 5 min hver gang.
7. Behandling for Electron Microscopy
- Forberede 1% osmiumtetroxid opløsning i PBS i et hætteglas. Osmiumtetroxid er lysfølsom; dække glass hætteglas med aluminiumfolie for at beskytte opløsningen mod lys.
Være forsigtig ved anvendelse osmiumtetroxid, da det er en meget farlig kemisk. Udfør denne og de følgende trin inde i en emhætte. - Fjern PBS fra afsnittene og sprede dem flade med en fin pensel. Udfør dette trin én godt på en tid til at holde sektionerne tørrer ud. Vær sikker på at flade afsnittene umiddelbart før du tilføjer osmiumtetroxid, da eventuelle folder i afsnittene bliver permanent og forsøger at flade væv indlæg osmium fiksering vil kun bryde sektionerne.
- Fordybe afsnittene i osmiumtetroxid i 30 minutter ved stuetemperatur, tilsætte en dråbe osmiumtetroxid ad gangen med en overførsel pipette, for at forhindre afsnittene i at folde. Dæk godt med aluminiumfolie for at beskytte sektionerne mod lys.
Bemærk: Dette trin løser lipider inden sektionerne. Vævet vises meget mørke efter osmium post-fiksering. - Mens sektioner er i osmium Tetrohydroxid, forberede plast harpiks i et engangsbægerglas ved blanding 20 g komponent A, 20 g komponent B, 0,6 g komponent C, og 0,4 g komponent D. Kombiner komponenterne sammen i den ovennævnte rækkefølge og bland dem godt under anvendelse af en 10 ml serologisk pipette indtil der opnås en ensartet farve.
- Overfør den fremstillede blanding til aluminium vejning retter. De vil modtage vævssnit når de er blevet dehydreret.
- Dehydrer sektionerne i stigende koncentrationer af ethanol i 2 min i følgende rækkefølge: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
- For at fjerne resterende ethanol, fordybe afsnittene i propylenoxid 3 gange i 2 minutter hver gang. Fjern de dehydrerede-sektioner fra 24-brønds kulturplade i 20 ml hætteglas. Brug altid hætteglas ved arbejde med propylenoxid, som det opløser plastik, og udvise forsigtighed, da det er farligt.
- Brug en bøjet glas pipettespids eller en fin pensel til at overføre afsnittene fra propylenoxid solutipå i harpiksen og efterlader O / N for infiltration ved stuetemperatur. Pas på ikke at udvande harpiksen med propylenoxid.
- Indlejre afsnittet med harpiksen på poly-chlor-tri-fluor-ethylen (PCTFE) filmsheets:
- Placer aluminium vejer retter, der indeholder prøverne i en 50 - 60 ° C ovn i 10 - 15 minutter før indlejring afsnittene om PCTFE- filmsheets.
- Når indlejring sektioner, arbejde med en aluminium vejer ret ad gangen. Ved hjælp af en fin malerpensel, male et tyndt lag af harpiks på én PCTFE film ark.
- Flytte en del af vævet ad gangen fra den aluminium vejning skålen til PCTFE film ark. Fjern overskydende harpiks fra hele væv, sørg for ikke at forstyrre den.
- Efter flytning alle afsnittene fra den ene vejer fad til PCTFE film ark, placere en anden PCTFE ark over det første, at skabe en sandwich af væv og harpiks i mellem 2 ark.
- Polymerisere harpiksen i en inkubator i 3 dage ved 55 - 60 ° C.
- Materialet er nu klar til ultratynde sektionering og ultrastrukturelle undersøgelse, specialiserede teknikker som ofte udføres af EM core faciliteter. Opbevar prøverne mellem PCTFE film ark sikkert ved RT uden ultrastrukturelle nedbrydning.
Bemærk: De efterfølgende trin for ultratynde sektionering og transmission elektronmikroskopi undersøgelse er forklaret i en separat protokol 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit viser de resultater, der kan opnås ved forskellige kritiske trin i protokollen. Især resultaterne viser eksempler på hjernen sektioner indeholder methoxy-x 04 farvede plaques i bestemt region og lag af interesse: hippocampus CA1, strata radiatum og lacunosum-moleculare. De plaques og regionale / lamellar organisering af hippocampus successivt visualiseres ved hjælp af en kombination af UV og lyse felt filtre (Figur 1). De valgte hjernesnit efterfølgende immunfarvet og bearbejdet til EM samtidig holde styr på deres Ap plaques, i betragtning af, at de stadig fluorescerende efter immunfarvning, og bliver mørkere end det omgivende neuropil efter behandling med osmiumtetroxid og indlejring (figur 1). Dette gør det muligt at identificere de områder (generelt et par millimeter kvadreret) undersøge med elektronmikroskop baseret på location af plaques. Endvidere er en forbedret protokol for pre-indlejring immunfarvning af mikroglia med IBA1 beskrevet her. Denne protokol giver en enestående visualisering af microgliale cellelegemer, store og små processer (figur 2) samt indtrængning af antistofferne i hjernen sektioner. Det letter således identifikation af microgliale celle organer og processer på ultrastrukturelle niveau, og studiet af deres samspil med Ap plaques (figur 3 og 4).
Figur 1. Visualisering af Ap plaques i 21-måneder gamle APP-PS1 Mus Brug Light Microscopy, Efter systemisk injektion af det fluorescerende farvestof methoxy-x 04. AB) Dobbelt billeddannelse af en hippocampus sektion ved hjælp af lyse felt og fluorescens tilstande. Regionerne og lag af interesse visualiseres under lyse felt(A), og Ap plaques successivt lokaliseret under anvendelse af et UV-filter på en afstand på 340 - 380 nm (B). CD) Dobbelt billeddannelse af en anden hippocampale afsnit før (C) og efter (D) præ-embedding immunfarvning for IBA1, efterfulgt af post-fiksering i osmiumtetroxid, dehydrering i ethanol, og indlejring i en plastharpiks som krævet for transmissionselektronmikroskopi. Det skal bemærkes, plakken (omkranset af en stiplet linje) er stadig synlig ved vævsbehandling til elektronmikroskopi. Visualisere plaques ved beskæring af væv blokke giver mulighed for en præcis udvælgelse af de områder, billedet ved høj rumlig opløsning. Scale barer = 300 um for A og B, 150 um for C og D. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Vi sualization af mikroglial Cell Krop og fine processer i 21-måneder gamle APP-PS1 mus ved IBA1 Farvning på Light Mikroskopisk niveau. AB) Eksempler på IBA1-farvet mikroglia viser en grupperet fordeling, når de forbinder med Ap plaques (identificeret ved korrelative fluorescensafbildning af methoxy-x 04; omkranset af en stiplet linje) som observeret før osmiumtetroxid post-fiksering og plast harpiks indlejring. CD) Eksempler på IBA1-farvet microglia forbundet med Ap plaques efter osmiumtetroxid post-fiksering og plast harpiks indlejring. Bemærk, at plaques bliver mørkere end deres omgivende neuropil efter osmium post-fiksering, således at sporing af deres placering. Scale bar = 250 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
060 / 54060fig3.jpg "/>
Figur 3. Dual Visualisering af Ap plaques og IBA1-immunfarvning i 6 måneder gamle APP-PS1 mus på Ultrastrukturel niveau. A) Eksempel på tæt kerne Ap plaque anerkendt af dens kompakte fibrillært struktur (se indsat) og association med dystrofe neuritter med ultrastrukturelle træk af autofagi. B) Eksempel på IBA1-farvet mikroglial fremgangsmåde (m, farvet i violet) fundet i nærheden Ap plaque, der indeholder amyloidaflejringer. Mitokondrielle forandringer (vist med asterisker) kan også ses i mikroglial proces. Det skal bemærkes, var dette billede erhverves til vævs-harpiks grænsen (hvid, til højre på billedet), hvor indtrængning af antistoffer og farvningsintensitet er maksimal. Scale barer = 2 um for A, 1 um for B. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Yderligere eksempler på IBA1-immunfarvet Mikroglia i 6 måneder gamle APP-PS1 Mus som observeret med Transmission Electron Microscopy. AD) Eksempler på IBA1-farvet mikroglial celle krop og processer (m) erhvervet længere væk fra vævet-harpiks grænsen , viser en fremragende penetration af antistofferne og farvningsintensitet dybere i den sektion ved hjælp af denne protokol. bv = blodkar, d = dendritceller, i = inklusion, s = dendritiske rygsøjlen, t = Axon terminalen. De pilespidser viser synaptiske kløfter. Scale barer = 1 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskrives en korrelative tilgang til målretning tæt kerne Ap plaques med EM. Methoxy-x 04 in vivo injektion muliggør hurtig udvælgelse af hjernen sektioner, der indeholder Ap plaques inden for bestemte regioner og lag af interesse, for eksempel hippocampus CA1, strata radiatum, og lacunosum-moleculare. I det foreliggende eksempel blev methoxy-x 04 pre-screening kombineret med præ-indlejring immunfarvning for IBA1 at studere, hvordan forskellige microgliale fænotyper interagere med synapser på ultrastrukturelle niveau i nærvær af tæt kerne Ap plaques.
Mikroglia er utroligt lydhøre over for deres omgivelser og deres inflammatoriske aktivitet har været længe undersøgt i forbindelse med at underminere normal hjernefunktion og forbedre udviklingen af AD. Især blev disse celler impliceret i neurodegenerative processer på grund af deres omfattende aktivering og frigivelse af pro-inflammatoriske cytokiner, der fører til chrONIC neuroinflammation, og forstyrrelse af normal hjerne homøostase 15. I de senere år er disse residente immunceller blev også vist til aktivt remodel neuronale kredsløb i sund hjerne, hvilket fører til identifikation af nye patogene mekanismer 16,17. Deres fysiologiske roller på synapser kan blive dysreguleret under neuroinflammation i AD, hvilket resulterer i forværret synaptisk tab, i øjeblikket den bedste patologiske korrelat for kognitiv tilbagegang på tværs af forskellige neurodegenerative tilstande 18,19.
De til den foregående pre-embedding IBA1 farvningsfremgangsmåde 13 modifikationer tillader nu bedre indtrængning af antistoffer tværs af hjernesektioner, samt visualisering af microgliale cellelegemer og fine processer på ultrastrukturelle niveau. Samlet set skal udføres omhyggeligt fra muse perfusion indtil plastharpiks indlejring af vævssnittene, i betragtning af at ultrastrukturelle nedbrydning protokollenforekommer på et i-mellem trin kan kompromittere integriteten af cellemembraner, organeller, cytoskeletale elementer osv.
Denne protokol kunne udføres uden nogen immunfarvning (ved udeladelse afsnit 6) til udelukkende visualisere tæt kerne Ap plaques, men det giver også et effektivt værktøj til at studere de komplekse mekanismer AD patogenese med relation til Ap deposition, da forskellige antistoffer kan anvendes til fokuserer på forskellige celletyper, herunder perifert-afledte makrofager, endogene mikroglia, astrocytter, oligodendrocytter og deres stamceller, såvel som mange neuronale undertyper.
I betragtning af den in vivo injektion af methoxy-x 04, kan denne protokol ikke udføres på faste hjernesnit, som udelukker dens anvendelse med post mortem human hjerneprøver. Også Modsat til immunfarvning mod Ap hvilke etiketter opløselige og uopløselige former af Ap, anvendelsen af farvestoffer binding til p-plisserede sHEET proteinstrukturer, såsom methoxy-x 04 kun tillader visualisering af tæt kerne plaques, hvilket udgør en anden begrænsning.
Ikke desto mindre kunne vigtige anvendelser omfatter studere roller mikroglia og andre forskellige celletyper, som overlapper og forøge deres aktiviteter, og kan have direkte virkning på plak homeostase og neuronal funktion i løbet af AD patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), Academic Press. New York. (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. è Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
