Summary
Den här artikeln beskriver ett protokoll för att visualisera amyloida Ap plack i Alzheimers sjukdomsmodeller mus med hjälp av metoxi-X04, som passerar blod-hjärnbarriären och selektivt binder till p-veckade ark som finns i tät kärna Ap plack. Den tillåter pre-screening av plack innehållande vävnadssnitt före immunfärgning och bearbetning för elektronmikroskopi.
Abstract
En detaljerad protokoll finns här för att identifiera amyloid Ap plack i hjärnan sektioner från Alzheimers sjukdomsmodeller mus innan pre-inbäddning immunfärgning (speciellt för joniserad kalciumbindande adaptermolekyl en (IBA1), en kalciumbindande protein som uttrycks av mikroglia) och vävnadsbehandling för elektronmikroskopi (EM). Metoxi-X04 är en fluorescerande färg som passerar blod-hjärnbarriären och binder selektivt till p-veckade ark som finns i tät kärna Ap-plack. Injektion av djuren med metoxi-X04 före avlivning och hjärnan fixering tillåter pre-screening och val av plack innehållande hjärnan sektioner för vidare bearbetning med tidskrävande manipulationer. Detta är särskilt användbart när man studerar tidig AD patologi inom specifika områden i hjärnan eller skikt som kan innehålla mycket få plack, som förekommer i endast en liten del av sektionerna. Obduktion behandling av vävnadssnitt med kongorött, Thioflavin S, och Thioflavin T (eller ens med metoxi-X04) kan märka p-veckade ark, men kräver omfattande röjning med etanol för att avlägsna överskott av färgämne och dessa förfaranden är oförenliga med ultra bevarande. Det skulle också vara ineffektivt för att utföra märkning av aP (och andra cellulära markörer såsom IBA1) på samtliga hjärnsektioner från regionerna av intresse, bara för att ge en liten fraktion som innehåller Ap-plack på rätt plats. Viktigt, Ap plack är fortfarande synliga efter vävnadsbehandling för EM, vilket möjliggör en exakt identifiering av de områden (i allmänhet ner till några kvadratmillimeter) att undersöka med elektronmikroskop.
Introduction
Amyloid Ap plackbildning är den huvudsakliga neuropatologiska kännetecken för Alzheimers sjukdom (AD). Men allt fler bevis tyder viktiga roller i immunsystemet i sjukdomsförloppet 1,2. I synnerhet, nya data från prekliniska och kliniska studier etablerade immundysfunktion som de främsta pådrivarna och bidrar till AD patologi. Med dessa resultat har centrala och perifera immunceller framträtt som lovande terapeutiska mål för AD 3. Följande protokoll kombinerar ljus och elektronmikroskopi (EM) för att generera nya insikter i förhållandet mellan Ap plack nedfall och microglial fenotypiska förändringar i AD. Detta protokoll möjliggör märkning av Ap plack i musmodeller av AD med hjälp av in vivo injektion av fluorescerande färgämne metoxi-X04. Metoxi-X04 är en kongorött-derivat som lätt kan passera blod-hjärnbarriären för att komma in i hjärnparenkymet och binda β-veckade ark med högffinity. Eftersom färgämnet är fluorescent, kan den användas för in vivo detektion av Ap plack nedfall med två-foton-mikroskopi 4. Efter bindning till AP, inte metoxi-X04 inte dissociera eller omfördela bort från plack, och det behåller sin fluorescens över tiden. Det är allmänt administreras perifert för att möjliggöra för icke-invasiv avbildning av hjärnan dynamik 5. Fluorescensen är också fortfarande efter aldehyd fixering, vilket möjliggör korrelat obduktion analyser, inklusive undersökning av neuronal död i närheten av A-beta plack 6.
Detta protokoll drar fördel av egenskaperna hos metoxi-X04 för att välja hjärnsektioner från APP SWE / PS1A 246E möss (APP-PS1, samuttrycker en dubbel mutation vid APP-genen Lys670Asn / Met671Leu och human presenilin PS1-A264E variant) 7 som uppvisar Ap plack i specifika regioner av intresse (hippocampus CA1, skikt radiatum och lacunosum-moleculare) Före pre-inbäddning immunfärgning mot microglial markör joniserat kalciumbindande adaptermolekyl en (IBA1) att visualisera microglial cellkroppar och processer med EM. Mössen ges intraperitoneal injektion av metoxi-X04 lösning, 24 timmar före hjärnan fixering genom transcardial perfusion. Koronala hjärnan sektioner erhålls med hjälp av en vibratome. Sektioner som innehåller hippocampus CA1 screenas under ett fluorescensmikroskop för närvaron av Ap-plack i strata radiatum och lacunosum-moleculare. Immunfärgning för IBA1, är osmiumtetroxid efter fixering, och plast harts inbäddning sedan på de valda hjärnsektioner. I slutet av detta protokoll, kan sektionerna arkiveras utan ytterligare ultra nedbrytning, redo för ultratunn sektionering och ultra undersökning. Viktigt är placken fortfarande fluorescerande efter immunfärgning med olika antikroppar, till exempel IBA1 som i det nuvarande protokollet. De blir mörkare tHan deras omgivande neuropil efter osmiumtetroxid efter fixering, oberoende av metoxi-X04 färgning, vilket bidrar till att exakt identifiera de områden av intresse, i allmänhet ner till några kvadratmillimeter, som skall undersökas med transmissionselektronmikroskop.
Detta korrelat metod ger ett effektivt sätt att identifiera specifika hjärnsektioner att undersöka på ultra nivå. Detta är särskilt användbart när man studerar tidig AD patologi, inom specifika områden i hjärnan eller skikt som bara kan innehålla några Ap plack, som förekommer i endast en liten del av vävnadssnitt. Under dessa tider särskilt, skulle det vara ineffektivt att använda immunfärgning för AP (och dubbel märkning för andra cellulära markörer som IBA1) på flera hjärnsektioner helt enkelt för att ge en liten fraktion som innehåller Ap plack på rätt plats. Dessutom injektion av levande möss med metoxi-X04 före avlivning och vävnadsbehandling inte compromise den ultra bevarande. Alternativa metoder såsom obduktion färgning med kongorött, Thioflavin S, Thioflavin T eller metoxi-X04 på sektioner fixerade vävnads kräver färgning differentiering i etanol, 8-11 som orsakar osmotisk stress och stör ultra. Congo Red är också en känd mänsklig carcinogen 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Alla experiment har godkänts och utförts enligt riktlinjerna för Institutional Animal etikkommitté, i enlighet med den kanadensiska rådet om Animal Care riktlinjer som administreras av Animal Care kommittén Université Laval. APP-PS1 hanmöss mellan 4 och 21 månaders ålder användes. Dessa djur inhystes under en 12 timmar ljus-mörker-cykel vid 22-25 ° C med fri tillgång till mat och vatten.
1. metoxi-X04 lösningsberedning
- Bered en 5 mg / ml lösning av metoxi-X04 9 genom upplösning metoxi-X04 i en lösning innehållande 10% dimetylsulfoxid (DMSO), 45% propylenglykol och 45% natriumfosfat-buffrad saltlösning (0,9% NaCl i 100 mM fosfatbuffert , pH 7,4).
- Med hjälp av en mikrovåg, väger 5 mg metoxi-X04 förening. Under en huv, upplösa metoxi-X04 i DMSO och rör om tills en klar grönaktig lösning erhålles. Successivt till propylenglykol och phosphate buffert saltlösning under omrörning med varje tillsats.
- Rör om lösningen vid 4 ° C på en rotator O / N. Skaffa en gulgrön emulsion. Lösningen kan förvaras vid 4 ° C i upp till två månader utan nedbrytning.
2. metoxi-X04 lösning Injection
- 24 h före perfusion, väga mössen och ge varje mus en intraperitoneal injektion av metoxi-X04 vid en dos av 10 mg / kg kroppsvikt med hjälp av en 27 ½ G-nål.
3. transcardial Perfusion av det injicerade möss
- På dagen före perfusion, förbereda lämpliga volymer av fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 3,5% akrolein, och 4% paraformaldehyd (PFA) lösningar 13 och förvara dem vid 4 ° CO / N.
Obs: Dessa lösningar kommer att användas för både perfusion och pre-inbäddning immunohistokemi. Var särskilt försiktig när du arbetar med akrolein, eftersom det är frätande och giftigt för bådeforskare och miljö. Dessutom, eftersom akrolein är frätande på plast, använd alltid lämplig glas att förbereda akrolein lösningar. - På dagen för perfusion, filtrera PFA och akrolein med grovfilterpapper av retention 25 nm partikel.
- Under perfusionen, använda en peristaltisk pump för att leverera 15 ml PBS, 75 ml akrolein och 150 ml PFA successivt i musen cirkulationen, vid en flödeshastighet av 25 ml / min.
Var försiktig. Utför perfusion strikt i ett dragskåp för att undvika skadliga ångor av PFA och akrolein.- För att ställa in pumpen, stick in ena änden i PBS-lösning, fylla röret (håller ca 15 ml) med PBS och fixa en 25 G bevingad bloduppsamlingsnålen till den andra änden. I alla tider, se till att slangen är fritt från luftbubblor.
- Placera röret direkt i akrolein flaskan efter att perfusionen pumpen med slangen fylld med PBS.
- Enaesthetize en mus i taget med en 90 mg / kg kroppsvikt dos av natriumpentobarbital injicerades intraperitonealt med användning av en 27 ½ G-nål. Utvärdera svar på svansen / tå nypor. Fortsätt bara om musen inte svarar på sådana aversiva, smärtsamma stimuli.
- Fäst musen i ryggläge (liggande på rygg med ansiktet uppåt) genom att tejpa framtassarna och baktassar till arbetsytan och noggrant exponera hjärtat utan att orsaka skador på andra organ. Var noga med att arbeta snabbt efter punktering av membranet.
- Utföra ett snitt genom huden med kirurgisk sax längs bröstkorg mittlinjen börjar kaudalt om bröstkorgen och fortsätt rostralt om nyckelbenet.
- Gör ytterligare två sido snitt längs basen av den ventrala bröstkorg. Rör försiktigt och stift de två flikar av hud, och se till att exponera hela brösthålan.
- Håll xiphoid processen med trubbiga pincett för att exponera brösthålan och stadig spetsiga saxs. Skär genom membranet och bröstkorgen, vara noga med att undvika att punktera lungorna, och fortsätta snittet rostralt till nyckelbenen. Var noga med att arbeta snabbt efter punktering av membranet.
- riva försiktigt hjärtsäcken med trubbiga pincett. Håll hjärtat stadigt med trubbig pincett, skära höger förmak, och starta infusionen PBS. Omedelbart sätta bloduppsamlingsnålen i vänster kammare.
- BEGJUTA musen med PBS (i slangen) följt av akrolein under 3 min (motsvarande 75 ml) sedan växla till PFA under 6 min (motsvarande 150 ml). Var noga med att pausa pumpflödet innan du byter lösning för att förhindra bubblor från att komma in i röret.
- Decapitate musen och extrahera den fasta hjärnan och placera den direkt in i en glasampuU, som innehöll 4% PFA under minst 2 h vid 4 ° C.
- Att extrahera hjärnan, använda sax och pincett för att skära genom huden för att exponera skallen. Försiktigt bryta skallen open mellan ögonen, och chip bort små bitar av att exponera den underliggande hjärnan.
- Försiktigt bort den exponerade hjärnan och efter korrigering den med 4% PFA under ytterligare två timmar innan du fortsätter för vibratome sektionering.
4. Brain Sektione Använda en Vibratome
- Tvätta fasta hjärnan 3 gånger med kyld PBS. Med hjälp av en vass rakblad bort luktloben (om denna region är under utredning) och skär hjärnan på tvären i 2 - 3 stycken ungefär samma höjd, som alla kan sektione samtidigt för att påskynda förfarandet.
- Limma bitar av hjärnvävnad vertikalt på provet plattan säkras i facket. Se till att den släta snittytan håller fast provplattan och inte får rubbas under snittförfarandet. Tillsätt tillräckligt PBS-lösning i facket tills hela hjärnans yta är helt nedsänkt. Det är viktigt att hålla the hjärn bitar och efterföljande avsnitten helt nedsänkt i PBS under det här steget.
- Placera brickan i vibratome, justera snitthastigheten till 0,5 mm / sek, snittfrekvensen till 90 Hz och matningstjockleken till 50 um för att ge 50 um tjocka sektioner. överför sedan sektioner i 20 ml glasampuller innehållande kryoskyddande lösning (40% PBS, 30% etylenglykol och 30% glycerol) med användning av en fin pensel. Förvara rören vid -20 ° C tills vidare användning. Alternativt hålla sektionerna i PBS för omedelbar screening såsom beskrivs i de följande stegen.
5. Avsnitt screening av förekomsten av metoxi-X04-färgade plattor
- Med hjälp av en stereotaktisk mushjärna atlas 14 väljer hjärnan sektioner innehållande regionen av intresse, till exempel, hippocampus CA1 som användes i föreliggande exempel. Placera varje sektion i en brunn i en 24-brunnars odlingsplatta innehållande tillräckligt kryoskyddande lösningför att förhindra delarna från att torka ut.
- Undersöka varje sektion successivt, för att undvika uttorkning sektionerna, med användning av följande förfarande:
- Lägga till en liten droppe av PBS till ett mikroskopobjektglas med en disponibel pipett, och placera avsnittet om droppen.
- Undersök avsnittet under ett fluorescerande mikroskop för att identifiera områden som innehåller metoxi-X04 märkta Ap plack.
Notera: metoxi-X04 kan enkelt visualiseras med användning av en fluorescens ultraviolett (UV) filter (excitation 340-380 nm).
- Ta bilder av regioner av intresse (ROI) i ljusa fält samt i fluorescens läge utan att flytta mikroskop scenen, eftersom varje bild måste visa samma region i båda fälten för att korrelera förekomsten av plack direkt till den strukturella regionen vävnadssnittet.
- Spara och namnge bilder tagna i enlighet med djurnummer. Också spela väl numret i plattan och området bilderna taken. Till exempel, Ex: 9978A1B; Djur nummer: 9978; Väl Nummer: A1; Fält: Bright. Placera sektionen tillbaka i dess utsedda väl när avbildning är klar.
Obs: I slutändan, för varje avsnitt granskas, är två bilder erhålls en i ljusa fält och en annan i UV området. - Öppna två bilder av samma ROI (en i ljusa fält och det andra i UV-området) i Image J, och använda MosaicJ plugin, justera kanterna på de två bilderna och spara linje och kombinerade bilden enligt brunnen nummer det kom från.
- Spara bilden i en separat mapp med numret på den speciella djuret. Kombinera bilderna för att identifiera och lokalisera de plack i vävnadssnittet, och har en fullständig bild av hela sträckan i de två olika områden (ljusa och UV).
- Efter screening processen är klar, lagrar de undersökta sektionerna vid -20 ° C i en 24-brunnars odlingsplatta innehållande frysskyddsmedel tills immunfärgning eller vidare behandling är carried ut.
6. Pre-inbäddning immunfärgning för IBA1
Obs: Utför immunfärgning för IBA1 på utvalda fritt flytande sektioner genom att placera plattan på en långsam vippa vid RT.
- Tvätta delarna 3 gånger med ca 1 ml PBS, varje tvätt varar i 10 minuter.
- Släcka endogena peroxidaser med 0,3% väteperoxid i PBS-lösning under 10 min. Detta steg förhindrar icke-specifik peroxidasaktivitet, vilket är viktigt för att undvika bakgrundsfärgning.
- Tvätta vävnaden i PBS 3 gånger under 10 min vardera.
- Inkubera sektioner i 0,1% natriumborhydrid i PBS-lösning under 30 minuter. Detta steg är viktigt för att reducera eventuella återstående aldehyder från fixeringssteget, och är särskilt viktigt om akrolein används i vävnadsfixering.
- Tvätta vävnaden i PBS 3 gånger 10 minuter varje gång och se till att ta bort alla bubblor.
- Blockera sektionerna under 1 timme.Olika antikroppar kan kräva olika blockeringstider och lösningar. För IBA1, förbereda blockeringsbuffert innehållande 10% fetalt bovint serum, 3% bovint serumalbumin och 0,01% Triton X-100 i 50 mM Tris-buffrad saltlösning (TBS; pH 7,4).
Obs: Den blockerande steget är för att förhindra ospecifik bindning av den primära antikroppen. Den låga koncentrationen av Triton X-100 kan lätt permeabilization av membran för bättre färgning, och är tillräckligt låg för att bevara de flesta ultra funktioner i vävnaden under EM. - Avlägsna blockerande buffert från vävnaden, och inkubera vid primär antikroppslösning (kanin-anti-IBA1, späddes [1: 1000] i blockeringsbuffert) vid 4 ° CO / N.
- Tvätta i TBS 3 gånger under 10 min varje gång.
- Inkubera i en sekundär antikropp (get-anti-kanin konjugerad till biotin) [1: 200] i 0,05 M TBS under 90 min.
- Tvätta i TBS 5 gånger under 5 minuter varje gång.
- Inkubera i Avidin-Biotin komplex lösning (Avidin [1: 100], biotin [1: 100]) i TBSlösning under 1 timme.
- Tvätta i TBS 5 gånger under 5 minuter varje gång.
- Avslöja IBA1 färgning med 0,05% diaminobensidin (DAB) och 0,015% väteperoxid i TBS under 8 min.
Notera: Tidpunkten för DAB-utveckling kan variera från protokoll till protokoll och bör bestämmas genom att snabbt undersöka de färgade snitt under ett ljusmikroskop.
Obs! IBA1, bör man tydligt kunna visualisera cellkroppar och processer IBA1 fläckade mikroglia vid 20X (se figur 2 för representativt exempel). Var försiktig med DAB, eftersom det är ett känt cancerframkallande. - Undvik över utvecklas genom att noggrant övervaka sektionerna (som beskrivits ovan) under detta steg. Stoppa reaktionen genom att tvätta de avsnitt i kyld PB 5 gånger under 5 min varje gång.
7. Behandling för elektronmikroskopi
- Förbereda en% osmiumtetroxid-lösning i PBS i en glasflaska. Osmiumtetroxid är ljuskänslig; täcka glass injektionsflaska med aluminiumfolie för att skydda lösningen mot ljus.
Var försiktig med användning av osmiumtetroxid, eftersom det är en mycket farlig kemikalie. Utför detta och följande steg inuti ett dragskåp. - Ta bort PBS från sektionerna och sprida dem platt med en fin pensel. Utför detta steg en brunn i taget för att hålla sektionerna från att torka ut. Var noga med att platta sektionerna omedelbart före tillsats osmiumtetroxid, som alla veck i avsnitten blir permanent och försöker platta vävnad efter osmium fixering kommer bara att bryta avsnitten.
- Doppa sektioner i osmiumtetroxid under 30 min vid RT, tillsätta en droppe av osmiumtetroxid i taget med en överföringspipett, för att förhindra de avsnitt från vikning. Täck väl med aluminiumfolie för att skydda de avsnitt från ljus.
Obs: Detta steg fastställs lipider inom sektionerna. Vävnaden visas mycket mörk efter osmium efter fixering. - Medan avsnitt är i osmium TetroXide, förbereda plastharts i en engångsbägare genom att blanda 20 g av komponent A, 20 g komponent B, 0,6 g komponent C, och 0,4 g komponent D. Kombinera samman komponenterna i ovanstående ordning och blanda dem väl med användning av en 10 ml serologisk pipett tills en likformig färg erhålls.
- Överför beredd blandning aluminiumvågskålarna. De kommer att få de vävnadssnitt när de väl har dehydratiserats.
- Dehydratisera sektionerna i ökande koncentrationer av etanol i 2 min i följande ordning: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
- Att avlägsna kvarvarande etanol, sänk avsnitten i propylenoxid 3 gånger i 2 minuter varje gång. Avlägsna de dehydratiserade-sektioner från den 24-brunnars odlingsplatta i 20 ml glasflaskor. Använd alltid glasflaskor när du arbetar med propylenoxid som det löser plast och upprätthålla försiktighet, eftersom det är farligt.
- Använda en böjd glas pipettspets eller en fin pensel för att överföra de sektioner från propylenoxidenheter solutipå i hartset och lämnar O / N för infiltrering vid RT. Var noga med att inte späda hartset med propylenoxid.
- Bädda avsnittet med hartset på poly-klor-tri-fluoro-etylen (PCTFE) filmsheets:
- Placera aluminium väger skålar innehållande proverna i en 50 - 60 ° C ugn under 10 - 15 minuter före inbäddning av avsnitten om PCTFE filmsheets.
- När inbäddning sektioner arbeta med en aluminium väger rätt åt gången. Med hjälp av en fin pensel, måla ett tunt lager av harts på en PCTFE foliebanan.
- Flytta en del av vävnaden vid en tidpunkt från aluminium vågskålen till PCTFE filmarket. Ta bort överflödigt harts från hela vävnaden, försiktigt så att inte störa det.
- Efter att ha flyttat alla avsnitt från en vågskål till PCTFE filmarket, placera en andra PCTFE ark över den första, vilket skapar en smörgås av vävnad och harts mellan 2 ark.
- Polymerisera hartset i en inkubator i 3 dagar vid 55-60 ° C.
- Materialet är nu redo för ultratunn sektionering och ultra undersökning, specialiserade tekniker som ofta utförs av EM kärnanläggningar. Förvara proverna mellan PCTFE filmark säkert vid RT utan ultra nedbrytning.
Obs: De efterföljande stegen för ultratunn sektionering och elektronmikroskopi undersökning överföring förklaras i ett särskilt protokoll 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det här avsnittet visar de resultat som kan uppnås vid olika kritiska steg i protokollet. Särskilt resultaten visar exempel på hjärnsektioner som innehåller metoxi-X04 färgade plack i viss region och lager av intresse: hippocampus CA1, skikt radiatum och lacunosum-moleculare. Placken och regional / lamellär organisation av hippocampus successivt visualiseras med en kombination av UV och ljusa fält filter (Figur 1). De valda hjärnan sektioner därefter immun och bearbetas för EM och samtidigt hålla reda på sina Ap plack, med tanke på att de fortfarande är fluorescerande efter immunfärgning och bli mörkare än den omgivande neuropil efter behandling med osmiumtetroxid och inbäddning (Figur 1). Detta gör att man kan identifiera de områden (i allmänhet ett par millimeter i kvadrat) för att undersöka med elektronmikroskop baserat på locaning av plack. Dessutom är en förbättrad protokoll för pre-inbäddning immunfärgning av mikroglia med IBA1 beskrivs här. Detta protokoll ger en exceptionell visualisering av mikroglia cellkroppar, stora och små processer (Figur 2) samt penetration av antikroppar i hjärnan sektioner. Det underlättar således identifieringen av mikroglia cellkroppar och processer på ultra nivå, och studiet av deras interaktioner med Ap plack (figur 3 och 4).
Figur 1. Visualisering av Ap plack i 21-månader gamla APP-PS1 möss med ljusmikroskop, efter systemisk injektion av fluorescerande färgämne metoxi-X04. AB) Dubbel avbildning av en hippocampus behållaren med ljusa fält och fluorescens lägen. Regionerna och skikten av intresse visualiseras under starkt fält(A), och Ap-plack successivt lokaliserad med användning av ett UV-filter vid ett intervall av 340-380 nm (B). CD) Dual avbildning av en annan hippocampus avsnitt innan (C) och efter (D) före inbäddning immunfärgning för IBA1, följt av post-fixering i osmiumtetroxid, dehydratisering i etanol, och inbäddning i ett plastharts såsom krävs för transmissionselektronmikroskopi. Det bör observeras, är plattan (omgiven av en streckad linje) fortfarande synlig vid vävnadsbehandling för elektronmikroskopi. Visualisera plack vid trimning av vävnadsblock möjliggör en exakt urval av de områden bild med hög rumslig upplösning. Skalstrecken = 300 pm för A och B, 150 um för C och D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Vi sualization av mikroglia cellkroppen och Fine Processer 21-månader gamla APP-PS1 möss genom IBA1 färgning vid Light mikroskopisk nivå. AB) Exempel på IBA1-färgade mikroglia visar en klustrade fördelning när de associerar med Ap plack (identifierade genom korrelativ fluorescens avbildning av metoxi-X04, omgiven av en streckad linje) som observerats före osmiumtetroxid efter fixering och plast harts inbäddning. CD) Exempel på IBA1-färgade mikroglia i samband med Ap plack efter osmiumtetroxid efter fixering och plast harts inbäddning. Observera att placken blir mörkare än den omgivande neuropil efter osmium efter fixering, vilket möjliggör spårning av var de befinner sig. Skalstreck = 250 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
060 / 54060fig3.jpg "/>
Figur 3. Dual Visualisering av Ap plack och IBA1-immunfärgning i sex månader gamla APP-PS1 möss på Ultra nivå. A) Exempel på tät kärna Ap plack identifieras av dess kompakta fibrillärt struktur (se infälld bild) och tillsammans med dystrofa neuriter med ultrastrukturella särdrag hos autophagy. B) Exempel på IBA1-färgade microglial process (m, färgad i violett) finns i närheten Ap plack som innehåller amyloidavsättningar. Mitokondriella förändringar (visas med asterisker) kan också ses i microglial processen. Det bör observeras, var detta bilden förvärvades i vävnads harts gränsen (vit, till höger om bilden) där genomträngningen av antikroppar och färgningsintensitet är maximal. Skalstrecken = 2 um för A, 1 pm för B. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Ytterligare exempel på IBA1-immun mikroglia i sex månader gamla APP-PS1 möss som observerades med transmissionselektronmikroskopi. AD) Exempel på IBA1-färgade microglial cellkroppen och processer (m) förvärvade längre bort från vävnads harts gränsen , visar en utmärkt penetration av antikroppar och färgningsintensitet djupare inom sektionen med hjälp av detta protokoll. bv = blodkärl, d = dendrit, i = integration, s = dendritiska ryggraden, t = axonet terminalen. Pilarna visar synaptiska klyftor. Skalstrecken = 1 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll förklarar en motsvarande metod för att rikta tät kärna Ap plack med EM. Metoxi-X04 in vivo injektion möjliggör snabb urval av hjärnsektioner som innehåller Ap plack inom vissa regioner och lager av intresse, till exempel hippocampus CA1, skikt radiatum och lacunosum-moleculare. I föreliggande exempel, var metoxi-X04 pre-screening i kombination med pre-inbäddning immunfärgning för IBA1 att studera hur olika microglial fenotyper interagerar med synapser vid ultrastrukturell nivå i närvaro av tät kärna Ap-plack.
Mikroglia är oerhört lyhörda för deras omgivning och deras inflammatorisk aktivitet har länge studerats i samband med undergräva normal hjärnfunktion och förbättra utvecklingen av AD. Framför allt var dessa celler inblandade i neurodegenerativa processer på grund av deras omfattande aktivering och frisättning av proinflammatoriska cytokiner, vilket leder till chrONIC neuroinflammation, och störningar i hjärnans normala homeostas 15. Under de senaste åren har emellertid dessa inhemska immunceller visades också att aktivt omforma neuronala kretsar i den friska hjärnan, vilket leder till identifiering av nya patogena mekanismer 16,17. Deras fysiologiska roller vid synapser kan bli oreglerad under neuroinflammation i AD, vilket resulterar i förvärras synaptiska förlust, för närvarande det bästa patologiska korrelat av kognitiv nedgång på olika neurodegenerativa tillstånd 18,19.
De ändringar som gjorts till den tidigare pre-inbäddning IBA1 färgningsmetoden 13 nu möjliggöra en bättre penetration av antikroppar över hjärnan sektioner, samt visualisering av mikroglia cellkroppar och fina processer i ultra nivå. Sammantaget måste det protokoll som ska utföras noggrant från mus perfusion tills plast harts inbäddning av vävnadssnitt, med tanke på att ultra nedbrytninginträffar vid något däremellan steg kan äventyra integriteten av cellmembran, organeller, cytoskelett element, osv.
Detta protokoll kunde genomföras utan någon immunfärgning (genom utelämnande avsnitt 6) för att enbart visualisera tät kärna Ap-plack, men det ger också ett kraftfullt verktyg för att studera de komplexa mekanismerna för AD patogenes med avseende på Ap-avsättning, såsom olika antikroppar kan användas för att fokusera på olika celltyper, inkluderande perifert-härledda makrofager, endogen mikroglia, astrocyter oligodendrocyter och deras progenitorer, samt många neuronala subtyper.
Med tanke på injektion av metoxi-X04 in vivo, kan detta protokoll inte utföras på fasta hjärnsektioner, vilket utesluter dess användning med obduktions mänsklig hjärnvävnad. Också, i motsats till immunfärgning mot A-beta vilka etiketter lösliga och olösliga former av A-beta, användning av färgämnena bindning till p-veckade sheet proteinstrukturer, såsom metoxi-X04 tillåter endast visualisering av tät kärna plack, som utgör en annan begränsning.
Likväl kan viktiga tillämpningar är att studera roller mikroglia och andra celltyper, som överlappar och förstärker sin verksamhet, och kan ha direkta effekter på plack homeostas och neuronal funktion under loppet av AD patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), Academic Press. New York. (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. è Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
