Summary
En este artículo se describe un protocolo para la visualización de las placas amiloides Aß en modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer utilizando metoxi-X04, que cruza la barrera sangre-cerebro y selectivamente se une a ß-plisadas las hojas que se encuentran en centros densos placas de Aß. Permite pre-selección de secciones de tejido que contiene de placa antes de la inmunotinción y el procesamiento para microscopía electrónica.
Abstract
Se proporciona un protocolo detallado para identificar amiloide placas Aß en secciones de cerebro de modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer antes de pre-incrustación de la inmunotinción (específicamente para ionizado molécula de unión a calcio adaptador 1 (Iba1), una proteína de unión de calcio expresada por microglia) y el procesamiento de tejido para microscopía electrónica (EM). Metoxi-X04 es un colorante fluorescente que atraviesa la barrera hematoencefálica y selectivamente se une a las hojas plegadas beta que se encuentran en centros densos placas de Aß. La inyección de los animales con metoxi-X04 antes del sacrificio y la fijación del cerebro permite la preselección y selección de las secciones del cerebro que contiene de placa para su posterior procesamiento con manipulaciones que consumen mucho tiempo. Esto es particularmente útil en el estudio de la patología AD temprano dentro de las regiones específicas del cerebro o capas que pueden contener muy pocas placas, presentes en sólo una pequeña fracción de las secciones. procesamiento post-mortem de las secciones de tejido con Rojo Congo, tioflavina S, y ThioflAvin T (o incluso con metoxi-X04) puede etiquetar láminas beta plegadas, pero requiere una amplia compensación con etanol para eliminar el exceso de colorante y estos procedimientos son incompatibles con la conservación ultraestructural. También sería ineficiente para llevar a cabo el etiquetado de Aß (y otros marcadores celulares como Iba1) en todas las secciones del cerebro de las regiones de interés, sólo para dar una pequeña fracción que contiene placas de Aß en el lugar correcto. Es importante destacar que las placas de Aß son todavía visibles después de la elaboración de tejidos para EM, lo que permite una identificación precisa de las zonas (generalmente hasta unos pocos milímetros cuadrados) para examinar con el microscopio electrónico.
Introduction
Amiloide la formación de placas de Aß es la principal característica distintiva neuropatológico de la enfermedad de Alzheimer (AD). Sin embargo el aumento de la evidencia sugiere importantes funciones del sistema inmune en 1,2 progresión de la enfermedad. En particular, los nuevos datos de los estudios preclínicos y clínicos establecidos disfunción inmune como principal impulsor y colaborador de patología de la EA. Con estos resultados, las células inmunes central y periférico han surgido como dianas terapéuticas prometedoras para AD 3. El siguiente protocolo combina la luz y microscopía electrónica (EM) para generar nuevos conocimientos sobre la relación entre la deposición de Aß placa y alteraciones fenotípicas microgliales en AD. Este protocolo permite el etiquetado de las placas de Aß en modelos de ratón de AD usando en la inyección in vivo del tinte fluorescente metoxi-X04. Metoxi-X04 es un derivado de rojo Congo que cruzan fácilmente la barrera sangre-cerebro para entrar en el parénquima cerebral y se unen hojas de β-plisadas con alta unaffinity. Puesto que el colorante es fluorescente, que puede ser utilizado para la detección in vivo de Aß deposición de la placa con microscopía de dos fotones 4. Una vez unido a Aß, metoxi-X04 no se disocia o redistribuir de distancia de las placas, y que conserva su fluorescencia con el tiempo. Se administra generalmente periféricamente para permitir la formación de imágenes no invasiva de la dinámica del cerebro 5. La fluorescencia también permanece después de la fijación de aldehído, lo que permite el análisis correlativo post-mortem, incluyendo la investigación de la muerte neuronal en la proximidad de las placas de Aß 6.
Este protocolo se aprovecha de las propiedades de metoxi-X04 para seleccionar secciones de cerebro de ratones APP SWE / PS1A 246E (APP-PS1; co-expresar una doble mutación en APP gen Lys670Asn / Met671Leu, y la variante de la presenilina PS1-A264E humano) 7 que exhiben Aß placas en regiones específicas de interés (CA1 del hipocampo, radiatum estrato, y lacunosum-moleculare) Antes de comprobar la validez de la incorporación de la inmunotinción contra el marcador microglial ionizado molécula adaptadora de unión de calcio-1 (Iba1) para visualizar los órganos y procesos con EM de células microgliales. Los ratones se les da una inyección intraperitoneal de solución de metoxi-X04, 24 hr antes de la fijación cerebro a través de la perfusión transcardial. secciones de cerebro coronales se obtienen usando un vibratome. Secciones que contienen el CA1 del hipocampo son examinados bajo un microscopio de fluorescencia para la presencia de placas de Aß en radiatum estratos y lacunosum-moleculare. La inmunotinción para Iba1, tetróxido de osmio posterior a la fijación, y la incrustación de resina plástica entonces se realizaron en las secciones del cerebro seleccionados. Al final de este protocolo, las secciones se pueden archivar sin más degradación ultraestructural, listo para la sección ultrafina y el examen ultraestructural. Es importante destacar que las placas están siendo fluorescente después de inmunotinción con anticuerpos diferentes, por ejemplo Iba1 como en el presente protocolo. Ellos se vuelven más oscuras tHan su neurópila circundantes después de tetróxido de osmio posterior a la fijación, de forma independiente de la tinción metoxi-X04, que permite identificar con precisión las regiones de interés, en general, a unos pocos milímetros cuadrados, que se examina con el microscopio electrónico de transmisión.
Este enfoque correlativo ofrece una forma eficaz de identificar las secciones específicas del cerebro a examinar en el nivel ultraestructural. Esto es particularmente útil en el estudio de la patología de Alzheimer precoz, dentro de las regiones o capas específicas del cerebro que sólo puede contener unas pocas placas de Aß, presentes en sólo una pequeña fracción de las secciones de tejido. Durante estos tiempos especialmente, sería ineficiente de usar la inmunotinción de Aß (y doble etiquetado para otros marcadores celulares como Iba1) en varias secciones del cerebro simplemente para dar una pequeña fracción que contiene placas de Aß en el lugar correcto. Además, la inyección de ratones vivos con metoxi-X04 antes del sacrificio y procesamiento de tejidos no hace compromise la conservación ultraestructural. Los métodos alternativos tales como la tinción post mortem con Rojo Congo, tioflavina S, tioflavina T o metoxi-X04 en secciones de tejido fijadas requieren la diferenciación tinción en etanol, 8-11 que causa el estrés osmótico y se altera la ultraestructura. Rojo Congo es también un conocido carcinógeno humano 12.
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Protocol
Nota: Todos los experimentos fueron aprobados y realizados bajo las directrices del comité de ética animal institucional, de conformidad con el Consejo Canadiense sobre el manejo de estos animales como administrado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Laval. Se utilizaron ratones macho APP-PS1 entre 4 y 21 meses de edad. Estos animales se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a 22 - 25 ° C, con acceso libre a comida y agua.
1. Metoxi-X04 Preparación de la solución
- Preparar una solución de 5 mg / ml de metoxi-X04 9 disolviendo metoxi-X04 en una solución que contiene 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO), 45% de propilenglicol, y 45% de solución salina tamponada con fosfato de sodio (0,9% de NaCl en tampón de fosfato 100 mM , pH 7,4).
- El uso de una microbalanza, pesar 5 mg del compuesto metoxi-X04. Bajo una campana extractora, disolver el metoxi-X04 en DMSO y se agita hasta que se obtiene una solución de color verdoso claro. Sucesivamente añadir propilenglicol y phosphate tampón de solución salina mientras se agitaba con cada adición.
- Se agita la solución a 4 ° C en un rotador O / N. Obtener una emulsión de color verde amarillento. La solución se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de dos meses sin degradación.
2. metoxi-X04 Injection Solution
- 24 horas antes de la perfusión, pesan los ratones y dar a cada ratón una inyección intraperitoneal de metoxi-X04 a una dosis de 10 mg / kg de peso corporal utilizando una aguja de 27 G ½.
3. transcardial perfusión de los ratones inyectados
- En el día antes de la perfusión, se preparan volúmenes adecuados de las soluciones de 4% de paraformaldehído (PFA) 13 solución salina tamponada con fosfato (PBS), 3,5% de acroleína, y y almacenar a 4 ° CO / N.
Nota: Estas soluciones se utilizan tanto para la perfusión y la inmunohistoquímica pre-incrustación. Tenga especial cuidado cuando se trabaja con acroleína, ya que es corrosivo y tóxico tanto paralos investigadores y el medio ambiente. Además, dado que la acroleína es corrosivo para el plástico, siempre el uso de vidrio adecuado para preparar soluciones de acroleína. - En el día de la perfusión, se filtra la PFA y acroleína mediante el uso de papel de filtro grueso de retención de partículas de 25 micras.
- Durante la perfusión, utilizar una bomba peristáltica para entregar 15 ml de PBS, 75 ml de acroleína y 150 ml de PFA sucesivamente en la circulación de ratón, a un caudal de 25 ml / min.
Con precaución. Realizar la perfusión estrictamente dentro de una campana de humos para evitar los humos nocivos de la PFA y acroleína.- Para configurar la bomba, inserte un extremo en la solución de PBS, llenar el tubo (que sostiene aproximadamente 15 ml) con PBS, y fijar una aguja de extracción de sangre con alas 25 G al otro extremo. En todo momento, asegúrese de que el tubo esté libre de las burbujas de aire atrapadas.
- Se coloca el tubo directamente en la botella acroleína después de fijar la bomba de perfusión con el tubo lleno de PBS.
- Unaesthetize un ratón a la vez con un 90 mg / kg de peso corporal dosis de pentobarbital de sodio inyectados por vía intraperitoneal usando un ½ aguja 27 G. Evaluar las respuestas a pellizcos de la cola / del dedo del pie. Proceder sólo si el ratón no responde a tales estímulos aversivos, dolorosas.
- Asegure el ratón en la posición supina (acostado sobre la espalda con la cara hacia arriba) con cinta adhesiva las patas delanteras y las patas traseras a la superficie de trabajo y exponer cuidadosamente el corazón sin causar daño a otros órganos. Asegúrese de trabajar rápidamente después de la perforación de la membrana.
- Realizar una incisión a través de la piel con unas tijeras quirúrgicas a lo largo de la línea media dorsal comenzando caudal a la caja torácica y proceder rostral a la clavícula.
- Hacer dos incisiones laterales adicionales a lo largo de la base de la caja torácica ventral. Mueva suavemente y el pin de los dos colgajos de piel, asegurándose para exponer toda la cavidad torácica.
- Mantenga el proceso xifoides con unas pinzas romas para exponer la cavidad torácica y estabilizar la punta de tijeras. Corte a través de la membrana y la caja torácica, teniendo cuidado de no perforar los pulmones, y continuar con la rostral incisión para las clavículas. Asegúrese de trabajar rápidamente después de la perforación de la membrana.
- romper suavemente el saco pericárdico con unas pinzas romas. Mantenga la constante del corazón con unas pinzas romas, cortar la aurícula derecha, y comenzar la infusión de PBS. Inmediatamente inserte la aguja de recogida de sangre en el ventrículo izquierdo.
- Perfundir el ratón con PBS (en el tubo) seguido de la acroleína para 3 min (correspondiente a 75 ml) y luego cambiar a PFA para 6 min (correspondiente a 150 ml). Asegúrese de hacer una pausa en el flujo de la bomba antes de solución de conmutación para evitar que las burbujas entren en el tubo.
- Decapitar al ratón y extraer el cerebro fijo y colocarlo directamente en un vial de vidrio que contiene PFA al 4% durante al menos 2 horas a 4 ° C.
- Para extraer el cerebro, utilizar tijeras y pinzas para cortar a través de la piel para exponer el cráneo. romper cuidadosamente el cráneo opes entre los ojos, y el chip de pequeñas piezas de la misma para exponer el cerebro subyacente.
- Retirar con cuidado el cerebro y post solución expuesta con PFA al 4% durante 2 horas más antes de proceder a vibratome seccionamiento.
4. El uso de un cerebro seccionamiento Vibratome
- Se lava el cerebro fija 3 veces con PBS enfriado. Utilizando una hoja de afeitar afilada, retire el bulbo olfatorio (a menos que esta región se encuentra bajo investigación) y cortar el cerebro transversalmente en 2 - 3 piezas de aproximadamente la misma altura, todo lo cual puede ser seccionada de manera simultánea con el fin de acelerar el procedimiento.
- Pegar las piezas de tejido cerebral verticalmente sobre la placa de muestra asegurado en la bandeja. Asegúrese de que la superficie de corte lisa se adhiere firmemente a la placa de muestra y no se desprendió durante el procedimiento de corte. Agregar suficiente solución de PBS en la bandeja hasta que toda la superficie del cerebro está completamente sumergido. Es importante mantener THpiezas cerebrales e y secciones posteriores sumergen totalmente en PBS a lo largo de este paso.
- Colocar la bandeja en el vibratome, ajustar la velocidad de corte de 0,5 mm / seg, la frecuencia de corte de 90 Hz, y el grosor de alimentación de 50 micras a fin de producir 50 micras de grosor. A continuación, traslado de las secciones en viales de vidrio de 20 ml que contienen solución de crioprotector (40% PBS, 30% de glicol de etileno, y 30% de glicerol) con un pincel fino. Almacenar los viales a -20 ° C hasta su uso posterior. Alternativamente, mantener las secciones en PBS para la detección inmediata como se describe en los siguientes pasos.
5. La sección de detección de la presencia de placas teñidas-metoxi-X04
- Con la ayuda de un cerebro de ratón estereotáxico atlas 14, secciones seleccione cerebrales contienen la región de interés, por ejemplo, el hipocampo CA1 como se usa en el presente ejemplo. Colocar cada sección en un pozo dentro de una placa de cultivo de 24 pocillos que contiene suficiente solución crioprotectoraa fin de evitar que las secciones se sequen.
- Examinar cada sección sucesivamente, para evitar la desecación de las secciones, usando el siguiente procedimiento:
- Añadir una gota de PBS a un portaobjetos de microscopio con una pipeta desechable, y coloque la sección sobre la gota.
- Examine la sección bajo un microscopio de fluorescencia para identificar las regiones que contienen placas de Aß metoxi-X04 etiquetados.
Nota: metoxi-X04 puede ser visualizado fácilmente usando un filtro de fluorescencia ultravioleta (UV) (excitación 340 a 380 nm).
- Capturar imágenes de las regiones de interés (ROI) en el campo brillante, así como en el modo de fluorescencia sin mover la platina del microscopio, ya que cada imagen debe mostrar la misma región en ambos campos con el fin de correlacionar la presencia de las placas directamente a la región estructural de la sección de tejido.
- Guardar y nombrar las imágenes tomadas en función del número de animales. Asimismo, registre el número pocillo de la placa y el campo de las imágenes taconocido. Por ejemplo, Ex: 9978A1B; Número de animales: 9978; número así: A1; Campo: brillante. Coloque la parte trasera en su designado bien una vez que se complete la formación de imágenes.
Nota: Al final, para cada sección examinada, se obtienen dos imágenes, una en campo claro y otro en el campo de los rayos UV. - Abra las dos imágenes de la misma ROI (uno en campo claro y el otro en el campo UV) en la imagen J, y usando el plugin MosaicJ, alinear los bordes de las dos imágenes y guardar la imagen alineada y combinado de acuerdo con el número de bien vino de.
- Guardar la imagen en una carpeta separada con el número del animal en particular. Se combinan las imágenes para identificar y localizar las placas en la sección de tejido, y tener una visión completa de toda la sección en los dos campos diferentes (brillante y UV).
- Una vez completado el proceso de selección, almacenar las secciones examinadas a -20 ° C en una placa de cultivo de 24 pocillos que contenía crioprotector hasta inmunotinción o de su procesamiento es carried a cabo.
6. Pre-incrustación de inmunotinción para Iba1
Nota: Realizar la inmunotinción para Iba1 en secciones de libre flotación seleccionados mediante la colocación de la placa en un agitador se mueve lentamente a temperatura ambiente.
- Es necesario lavar las secciones 3 veces con aproximadamente 1 ml de PBS, cada lavado una duración de 10 min.
- Quench peroxidasas endógenas con peróxido de hidrógeno 0,3% en solución de PBS durante 10 min. Este paso evita la actividad de peroxidasa no específica, que es importante para evitar la tinción de fondo.
- Lavar el tejido en PBS 3 veces durante 10 min cada uno.
- Incubar las secciones de borohidruro de sodio 0,1% en solución de PBS durante 30 min. Este paso es importante para reducir cualquier aldehídos restantes de la etapa de fijación, y es especialmente importante si la acroleína se utiliza en la fijación del tejido.
- Lavar el tejido en PBS 3 veces durante 10 minutos cada vez y asegúrese de eliminar todas las burbujas.
- Bloquear las secciones durante 1 hora.Diferentes anticuerpos pueden requerir diferentes tiempos y las soluciones de bloqueo. Para Iba1, preparar tampón que contiene 10% de suero fetal bovino, 3% de albúmina de suero bovino, y 0,01% de Triton X-100 en solución salina tamponada con 50 mM de Tris de bloqueo (TBS; pH 7,4).
Nota: La etapa de bloqueo es evitar la unión no específica del anticuerpo primario. La baja concentración de Triton X-100 permite ligera permeabilización de membranas para eliminar mejor las manchas, y es lo suficientemente baja para preservar la mayoría de las características ultraestructurales de tejido bajo EM. - Retire el tampón de bloqueo a partir del tejido, e incubar en solución de anticuerpo primario (anti-conejo Iba1, diluido [1: 1000] en tampón de bloqueo) a 4 ° CO / N.
- Lavar en TBS 3 veces durante 10 min cada vez.
- Incubar en anticuerpo secundario (de cabra anti-conejo conjugado con biotina) [1: 200] en 0,05 M TBS durante 90 min.
- Lavar en TBS 5 veces durante 5 minutos cada vez.
- Incubar en solución de complejo de avidina-biotina (avidina [1: 100], biotina [1: 100]) en TBSsolución durante 1 hr.
- Lavar en TBS 5 veces durante 5 minutos cada vez.
- Revelar la tinción Iba1 con 0,05% de diaminobencidina (DAB) y peróxido de hidrógeno 0,015% en TBS durante 8 min.
Nota: El tiempo de desarrollo de DAB puede variar de un protocolo a otro y debe ser determinada mediante el examen de forma rápida las secciones teñidas con un microscopio óptico.
Nota: Para Iba1, uno debe ser capaz de visualizar con claridad los cuerpos celulares y los procesos de la microglia Iba1-manchada en 20X (véase la Figura 2, por ejemplo representativo). Sea cauteloso utilizando DAB, ya que es un carcinógeno conocido. - Evitar el exceso de desarrollo, controlando cuidadosamente las secciones (como se describe arriba) durante este paso. Detener la reacción por lavado de las secciones en PB refrigerada 5 veces durante 5 min cada vez.
7. Proceso de Microscopía Electrónica
- Preparar la solución de tetróxido de osmio 1% en PBS en un vial de vidrio. El tetróxido de osmio es fotosensible; cubrir la glass vial con papel de aluminio para proteger la solución de la luz.
Tenga cuidado usando tetróxido de osmio, ya que es un producto químico muy peligroso. Realice este y los siguientes pasos dentro de una campana de humos. - Retire la PBS de las secciones y repartirlos plana utilizando un pincel fino. Realice este paso un pozo a la vez de mantener las secciones se sequen. Asegúrese de aplanar las secciones inmediatamente antes de la adición de tetróxido de osmio, como pliegues en las secciones conviertan en permanentes y tratar de aplanar el tejido posterior fijación de osmio sólo romper las secciones.
- Sumergir las secciones en tetróxido de osmio durante 30 min a RT, la adición de una gota de tetróxido de osmio a la vez con una pipeta de transferencia, para evitar que las secciones de plegado. Cubrir el pozo con papel de aluminio para proteger las secciones de la luz.
Nota: Este paso corrige los lípidos dentro de las secciones. El tejido aparecerá muy oscuro después de osmio posterior a la fijación. - Mientras que las secciones están en tetro osmioXide, preparar resina de plástico en un vaso de precipitados desechable mediante la mezcla de 20 g del componente A, 20 g del componente B, 0,6 g del componente C, y 0,4 g componente D. Combine los componentes juntos en el orden anterior y se mezclan bien con un 10 ml pipeta serológica hasta que se obtiene un color uniforme.
- Transferir la mezcla preparada a los platos de aluminio que pesa. Ellos recibirán las secciones de tejido una vez que han sido deshidratados.
- Deshidratar las secciones en concentraciones crecientes de etanol durante 2 min en el siguiente orden: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
- Para eliminar el etanol residual, sumergir las secciones en óxido de propileno 3 veces durante 2 min cada vez. Retire los deshidratados secciones de la placa de cultivo de 24 pocillos en 20 ml viales de vidrio. Siempre use viales de vidrio cuando se trabaja con óxido de propileno, ya que se disuelve de plástico, y mantener precaución, ya que es peligroso.
- Utilice una punta de pipeta de vidrio doblado o un pincel fino para transferir las secciones de soluti óxido de propilenoen en la resina y dejar O / N para la infiltración a TA. Tenga cuidado de no diluir la resina con óxido de propileno.
- Incrustar la sección con la resina en poli-cloro-tri-fluoro-etileno filmsheets (PCTFE):
- Colocar las cápsulas de aluminio con un peso que contienen las muestras en un 50 - 60 ° C horno durante 10 - 15 min antes de la incorporación de las secciones sobre filmsheets PCTFE.
- Cuando la incorporación de secciones, trabajar con una lata de aluminio con un peso plato a la vez. El uso de un pincel fino, pintar una fina capa de resina sobre una lámina de película de PCTFE.
- Mover una sección de tejido a la vez desde el pesaje de aluminio plato a la hoja de película de PCTFE. Eliminar el exceso de resina de todo el tejido, teniendo cuidado de no perturbarlo.
- Después de mover todas las secciones de un peso de plato a la hoja de película de PCTFE, colocar una segunda lámina de PCTFE más de la primera, creando un sándwich de tejido y resina en entre 2 hojas.
- Polimerizar la resina en una incubadora durante 3 días a 55 - 60 ° C.
- El material ya está listo para la sección ultrafina y el examen ultraestructural, técnicas especializadas que a menudo son realizadas por las instalaciones centrales de EM. Almacenar las muestras entre hojas de película de PCTFE con seguridad a temperatura ambiente sin degradación ultraestructural.
Nota: Los pasos posteriores para seccionar ultrafina y transmisión examen de microscopía electrónica se explican en un protocolo separado 13.
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Representative Results
Esta sección ilustra los resultados que se pueden obtener en diferentes pasos críticos del protocolo. En particular, los resultados muestran ejemplos de las secciones del cerebro que contienen metoxi-X04 placas teñidas en la región específica y capas de interés: el hipocampo CA1, radiatum estrato, y lacunosum-moleculare. Las placas y la organización regional / laminar del hipocampo se visualizan sucesivamente usando una combinación de UV y filtros de campo claro (Figura 1). Las secciones del cerebro son seleccionados posteriormente inmunoti~neron y se procesaron para EM, mientras que hacer el seguimiento de sus placas de Aß, considerando que son todavía fluorescente tras la inmunotinción, y llegan a ser más oscura que la rodea neurópila después del tratamiento con tetróxido de osmio y la incrustación (Figura 1). Esto permite identificar las zonas (generalmente unos pocos milímetros cuadrados) para examinar con el microscopio electrónico en base a la locala de las placas. Además, se describe aquí un protocolo mejorado para pre-incrustación de la inmunotinción de microglia con Iba1. Este protocolo produce una visualización excepcional de cuerpos de células microgliales, procesos grandes y pequeñas (Figura 2), así como la penetración de los anticuerpos dentro de las secciones del cerebro. Por lo tanto, facilita la identificación de los órganos y procesos de las células microgliales a nivel ultraestructural, y el estudio de sus interacciones con placas de Aß (Figuras 3 y 4).
Figura 1. Visualización de Aß en placas de 21 meses de edad, los ratones APP-PS1 utilizando microscopía de luz, después de la inyección sistémica del tinte fluorescente metoxi-X04. AB) de imagen dual de una sección del hipocampo utilizando los modos de campo y fluorescencia brillante. Las regiones y capas de interés se visualizaron bajo campo claro(A), y las placas de Aß localizados sucesivamente utilizando un filtro de UV a una gama de 340 a 380 nm (B). CD) de formación de imágenes Dual de otra sección del hipocampo antes de (C) y después (D) pre-incrustación de la inmunotinción para Iba1, seguido de post-fijación en tetróxido de osmio, deshidratación en etanol, y la incrustación en una resina de plástico como se requiere para microscopía electrónica de transmisión. Ha de observarse, la placa (rodeada por una línea de puntos) es todavía visible en el procesamiento de tejidos para microscopía electrónica. La visualización de las placas al recortar los bloques de tejido permite una selección precisa de las zonas de la imagen en alta resolución espacial. Las barras de escala = 300 m para A y B, de 150 micras para C y D. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Vi sualization de Microglial del cuerpo celular y los procesos finos de 21 meses de edad, los ratones APP-PS1 por Iba1 tinción en el nivel microscópico de luz. AB) Ejemplos de microglía teñida con Iba1 muestra una distribución agrupada cuando asocian con placas de Aß (identificadas por imágenes de fluorescencia correlativa de metoxi-X04; rodeadas por una línea de puntos), según lo observado antes de tetróxido de osmio posterior a la fijación y la incrustación de resina plástica. CD) Ejemplos de microglía teñida con Iba1 asociado con placas de Aß después de tetróxido de osmio posterior a la fijación e inclusión resina plástica. Tenga en cuenta que las placas se vuelven más oscuras que su neurópila circundantes después de osmio posterior a la fijación, lo que permite el seguimiento de su ubicación. Barra de escala = 250 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Visualización dual de placas de Aß y Iba1-inmunotinción de 6 meses de edad, los ratones APP-PS1 a nivel ultraestructural. A) Ejemplo de núcleo denso Aß placa reconocido por su estructura fibrilar compacto (ver recuadro) y la asociación con neuritas distróficas con las características ultraestructurales de la autofagia. B) Ejemplo de proceso de la microglía teñida con Iba1 (m; coloreado en violeta) se encontró cerca de la placa de Aß que contiene depósitos de amiloide. alteraciones mitocondriales (marcadas con asteriscos) también pueden ser vistos dentro del proceso de la microglia. Ha de observarse, la imagen se adquirió en la frontera de tejido de resina (blanco, a la derecha de la imagen), donde la penetración de los anticuerpos y la intensidad de tinción es máxima. Las barras de escala = 2 m para A, 1 m para B. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Ejemplos adicionales de microglía inmunotinción-Iba1 en 6 meses de edad, los ratones APP-PS1 como se ha observado con microscopio electrónico de transmisión. DC) Ejemplos de cuerpo manchado-Iba1 célula microglial y los procesos (m) adquirido más lejos de la frontera de tejido con resina , mostrando una excelente penetración de los anticuerpos y la intensidad de la tinción más profunda dentro de la sección usando este protocolo. bv = vaso sanguíneo, d = dendritas, en = inclusión, s = espina dendrítica, t = terminal del axón. Las puntas de flecha indican las hendiduras sinápticas. Las barras de escala = 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo explica un enfoque correlativa para dirigir centros densos placas Aß con EM. Metoxi-X04 en vivo por inyección permite una rápida selección de las secciones del cerebro que contienen placas de Aß en determinadas regiones y capas de interés, por ejemplo, el hipocampo CA1, radiatum estrato, y lacunosum-moleculare. En el presente ejemplo, metoxi-X04 selección previa se combinó con pre-incrustación de la inmunotinción para Iba1 para estudiar cómo los diferentes fenotipos microgliales interactúan con las sinapsis en el nivel ultraestructural en presencia de centros densos placas Aß.
La microglía son increíblemente sensibles a su entorno y su actividad inflamatoria se ha largo estudiado en el contexto de socavar la función normal del cerebro y la mejora de la promoción de la AD. En particular, estas células fueron implicados en procesos neurodegenerativos debido a su extensa activación y liberación de citoquinas pro-inflamatorias, lo que lleva a Chrneuroinflamación ONIC, y la alteración de la homeostasis normal del cerebro 15. En los últimos años, sin embargo, también se muestran estas células inmunes residentes para remodelar activamente circuitos neuronales en el cerebro sano, lo que lleva a la identificación de nuevos mecanismos patogénicos 16,17. Sus funciones fisiológicas en las sinapsis pueden llegar a ser mal regulada durante la neuroinflamación en el año, lo que resulta en la pérdida sináptica exacerbado, actualmente el mejor correlato patológico de deterioro cognitivo a través de varias condiciones neurodegenerativas 18,19.
Las modificaciones realizadas en el método de tinción Iba1 pre-incrustación anterior 13 ahora permiten una mejor penetración de los anticuerpos a través de las secciones del cerebro, así como la visualización de los cuerpos de las células microgliales finos y procesos a nivel ultraestructural. En general, el protocolo necesita ser realizada rigurosamente de la perfusión del ratón hasta la incrustación de resina de plástico de las secciones de tejido, teniendo en cuenta que la degradación ultraestructuralque ocurre en cualquier paso en el medio podría comprometer la integridad de las membranas celulares, orgánulos, elementos del citoesqueleto, etc.
Este protocolo se puede realizar sin ninguna inmunotinción (omitiendo la sección 6) para visualizar únicamente denso núcleo placas Aß, sino que también proporciona una herramienta poderosa para estudiar los complejos mecanismos de patogénesis de la EA con relación a la deposición de Aß, ya que diferentes anticuerpos pueden ser utilizados para centrarse en diferentes tipos de células, incluyendo macrófagos periféricamente derivados, microglia endógeno, astrocitos, oligodendrocitos y sus progenitores, así como muchos subtipos neuronales.
Teniendo en cuenta la inyección in vivo de metoxi-X04, este protocolo no se puede realizar en las secciones del cerebro fijas, lo que impide su uso con muestras de cerebro humano post mortem. También, al contrario de la inmunotinción contra Aß que las etiquetas de las formas solubles e insolubles de Aß, el uso de colorantes de unión a beta-plisadas sestructuras de proteínas Heet tales como metoxi-X04 sólo permite la visualización de las placas de núcleo denso, lo que constituye otra limitación.
Sin embargo, las aplicaciones importantes podrían incluir el estudio de las funciones de la microglía y otros diversos tipos de células, que se superponen y aumentar sus actividades, y podría tener efectos directos sobre la homeostasis de la placa y la función neuronal en el curso de patología de la EA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
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