Summary
Bu makalede, kan-beyin bariyerini geçer ve seçici olarak p-kıvrımh için yoğun bir çekirdek Aβ plaklarda bulunan yaprak bağlanan metoksi-x04 kullanarak Alzheimer hastalığı fare modellerinde amiloid Aβ plaklar görselleştirmek için bir protokol açıklamaktadır. Bu elektron mikroskobu için immün ve işleme öncesinde plak içeren doku kesitlerinde önceden tarama sağlar.
Abstract
Ayrıntılı bir protokolünü Alzheimer hastalığı fare modellerinde beyin kesitlerinde amiloid Aβ plaklar tespit etmek için ön-işlemden geçirilmesi gömme immün ve doku işleme (özellikle iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (IBA1), mikroglia tarafından ifade edilen bir kalsiyum bağlama proteini) elektron mikroskobu (EM). Metoksi-x04 yoğun çekirdekli Aβ plaklarda bulunan p-kıvrımh bir yaprak bağlanan seçici, kan-beyin bariyerini geçer ve bir flüoresan boya olan. metoksi-x04 hayvanların enjeksiyon öncesinde kurban ve beyin sabitleme öncesi tarama ve zaman alıcı manipülasyonlar ile daha fazla işlem için plaka ihtiva eden beyin bölümlerinin seçimi olanak sağlar. bölümlerin sadece küçük bir fraksiyonu mevcut çok az plaklar içerebilir spesifik beyin bölgelerinde veya tabakaların içinde erken AD patolojisinden okuyan bu özellikle yararlıdır. Kongo Kırmızısı, Tioflavin S ve Thiofl doku bölümleri ölüm sonrası işlemleravin T (hatta metoksi-x04) ile β-pilili yaprak etiket, ancak aşırı boya kaldırmak için etanol ile kapsamlı takas gerektirir ve bu işlemlerin ultrastrüktürel korunması ile uyumsuz olabilir. Aynı zamanda sadece doğru yerde Aβ plaklar içeren küçük bir bölümünü elde etmek için, Aβ (ve IBA1 gibi diğer hücresel belirteçleri) ilgi bölgelerinden tüm beyin kesitlerinde için etiketleme yapmak verimsiz olacaktır. Önemlisi, Aβ plaklar elektron mikroskobu ile incelenmesi alanlarında kesin kimlik (genellikle birkaç milimetre karelik kadar) sağlayan, EM için doku işlendikten sonra hala görebilir.
Introduction
Amiloid Aβ plak oluşumu, Alzheimer hastalığı (AD), ana nöropatolojik özelliğidir. Ancak artan kanıtlar hastalığın ilerlemesi 1,2 bağışıklık sisteminin önemli roller önerir. Özellikle, klinik öncesi ve klinik çalışmalardan elde edilen yeni veriler AD patolojiye ana sürücü ve katılımcı olarak bağışıklık disfonksiyonu kurdu. Bu bulgularla, santral ve periferik bağışıklık hücreleri AD 3 olarak umut verici terapötik hedefler ortaya çıkmıştır. Aşağıdaki protokol Aβ plak birikimi ve AD mikroglial fenotipik değişiklikler arasındaki ilişki yeni bir bakış açısı oluşturmak için ışık ve elektron mikroskobu (EM) birleştirir. Bu protokol, floresan boya metoksi-x04 in vivo enjeksiyonu kullanılan AD fare modellerinde Aβ plakların etiketleme sağlar. Metoksi-x04 kolayca beyin dokusundan girmek için kan-beyin bariyerini ve yüksek a ile β-kıvrımlı yaprak bağlanabilen bir Kongo Kırmızı türeviffinity. Boya flüoresan olduğu için, iki foton mikroskopi 4 Aβ Leke birikmesinin, in vivo tespiti için de kullanılabilir. Bir kez Aβ bağlı metoksi-x04 ayırmak veya plaklar uzak yeniden dağıtma ve flüoresanını fazla muhafaza etmez. Genellikle beyin dinamiği 5 non-invaziv görüntüleme için izin periferik uygulanır. Floresan da karşılıklı otopsi Aβ plaklar 6 civarında nöron ölümünün araştırılması dahil olmak üzere, analiz için izin, aldehit tespit sonucu kalır.
Aβ gösteren 7 (APP genindeki Lys670Asn / Met671Leu bir çift mutasyonunu coexpressing ve insan presenilin PS1-A264E varyantı APP-PS1) Bu protokol, APPswe / PS1A 246E farelerinin beyin bölümleri seçmek metoksi-x04 özelliklerinin avantajını özel ilgi bölgelerinde (hipokampus CA1, tabakalar radiatum ve lacunosum-moleculare plaklar) Mikroglial hücre gövdeleri ve EM ile süreçlerini görselleştirmek için) mikroglial işaretleyici iyonize kalsiyum-bağlayıcı adaptörü molekülü 1 (IBA1 karşı immün gömme öncesi önce. fareler transcardial perfüzyon yoluyla 24 saat önce beyin fiksasyon metoksi-x04 çözümü intraperitoneal verilir. Koronal beyin kesitleri bir vibratome kullanılarak elde edilir. hipokampus CA1 içeren bölümler tabakalar radiatum ve lacunosum-moleculare bölgesindeki Aβ plaklarının varlığı için bir flüoresan mikroskobu altında elenir. IBA1 için immün ozmiyum tetroksit sonrası sabitleme ve plastik reçine gömme seçilen beyin kesitleri üzerinde gerçekleştirilir. Bu protokolün sonunda bölümler ultra ince kesit ve ultrastrüktürel inceleme için hazır, daha fazla ultrastrüktürel bozulma olmadan arşivlenebilir. Önemlisi, plaklar hala mevcut protokolde olduğu gibi, örneğin IBA1 için, farklı antikorlarla immün sonra floresan edilir. Onlar koyu t halinehan osmiyum tetroksit sonrası fiksasyon takiben çevreleyen neuropil, bağımsız doğru, birkaç milimetre karelik genellikle aşağı, ilgi alanları belirlemeye yardımcı olur metoksi-x04 boyaması, transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi gereken.
Bu karşılıklı yaklaşım ultrastrüktürel düzeyde incelemek için spesifik beyin bölümlerini tanımlamak için etkili bir yol sunar. sadece doku bölümlerinin sadece küçük bir kısmını da mevcut birkaç Aβ plaklar içerebilir spesifik beyin bölgelerinde veya tabakaların içinde erken AD patolojisinden okuyan bu özellikle yararlıdır. Özellikle bu zamanlarda, sadece doğru yerde Aβ plaklar içeren küçük bir bölümünü elde etmek için çeşitli beyin kesitlerinde (örneğin IBA1 gibi diğer hücresel belirteçleri ve çift etiketleme) Aβ için immün kullanmak verimsiz olacaktır. metoksi-x04 canlı farelerin ek olarak, enjeksiyon feda ve doku işleme Compromis does not öncesindeultrastrüktürel korunması e. Böyle sabit doku kesitlerinde Kongo Kırmızısı, Thioflavin S, Thioflavin T veya metoksi-x04 ile postmortem boyanması gibi alternatif yöntemler etanol boyama farklılaşma, ozmotik strese neden olur ve ultrastrüktür bozan 8-11 gerektirir. Kongo Kırmızı da bilinen insan kanserojen 12'dir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Université Laval Hayvan Bakım Komitesi tarafından yönetilen gibi tüm deneyler onaylanmış ve Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi ile uyumlu, Kurumsal hayvan etik komitenin kurallarına altında yapıldı. yaş 4 ile 21 ay arasında, APP-PS1 erkek fareler kullanılmıştır. yiyecek ve suya serbest erişim ile 25 ° C - Bu hayvanlar, 22, 12 saat ışık-karanlık çevrimi altında muhafaza edilmiştir.
1. Metoksi-x04 Çözeltisinin Hazırlanması
- % 10 dimetil sülfoksit (DMSO),% 45 propilen glikol ve% 45 sodyum fosfat tamponlu tuzlu su (100 mM fosfat tampon maddesi içinde% 0.9 NaCl ihtiva eden bir çözelti içine metoksi-x04 çözülmesiyle metoksi-x04 9 bir 5 mg / mL çözelti , pH 7.4).
- bir mikro kullanarak, metoksi-x04 bileşikten 5 mg ağırlığında. davlumbaz altında DMSO içinde metoksi-x04 çözülür ve berrak yeşil bir çözelti elde edilene kadar karıştırılır. Arda propilen glikol ve ph ekleyinHer bir ek ile birlikte karıştırılarak bir solüsyon üzerine durdurulmuştur osphate.
- çevirici O / N 4 ° C'da, çözelti karıştırılır. sarımsı yeşil emülsiyon elde. Çözelti bir bozulma olmadan en fazla iki ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
2. Metoksi-x04 Çözelti Enjeksiyon
- önceden perfüzyon 24 saat, fareler tartılır ve 27 ½ G iğne kullanılarak vücut ağırlığı için 10 mg / kg'lık bir dozda, her bir fare metoksi-x04 intraperitoneal verir.
Enjekte edilen farelerin 3. transcardial perfüzyon
- Perfüzyon bir gün önce, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS),% 3.5 akrolein ve% 4 paraformaldehid (PFA) Çözeltilerin 13 uygun hacimleri hazırlamak ve 4 ° CO / N saklayın.
Not: Bu çözeltiler perfüzyon ve her iki immünohistokimya önceden yerleştirilmesi için kullanılacaktır. akrolein çalışırken hem aşındırıcı ve toksik olduğu gibi özel dikkatAraştırmacılar ve çevre. akrolein plastik aşındırıcı Ek olarak, her zaman akrolein çözeltilerin hazırlanması için uygun bir cam kullanın. - perfüzyon gününde, 25 um partikül tutma kaba filtre kağıdı kullanılarak, PFA ve akrolein filtre.
- perfüzyon sırasında 25 ml / dakika bir akış hızında, 15 ml PBS, akrolein 75 mi, ve sırasıyla fare dolaşıma PFA 150 ml sunmak için bir peristaltik pompa gibi çalışır.
Dikkatli kullanın. PFA ve akrolein zararlı dumanlar önlemek için bir davlumbaz içine kesinlikle perfüzyon gerçekleştirin.- Pompayı kurmak PBS çözeltisi içine bir ucunu, PBS (yaklaşık 15 ml tutarak) boru doldurun ve diğer ucunu bir 25 G kanatlı kan toplama iğne düzeltmek için. Her zaman, tüp sıkışmış hava kabarcıkları serbest olduğundan emin olun.
- PBS ile doldurulmuş boru ile perfüzyon pompası ayarlandıktan sonra akrolein şişesi doğrudan tüp yerleştirin.
- birintraperitonal 27 ½ G iğne ile, sodyum pentobarbital vücut ağırlığı doz 90 mg / kg olan bir seferde bir fare aesthetize. Kuyruk / ayak tutam yanıtları değerlendirin. Fare gibi caydırıcı, ağrılı uyaranlara tepkisiz olması durumunda devam edin.
- çalışma yüzeyine forepaws ve pençelerin bantla tarafından (yukarı yüz sırt üstü yatarken) yatar pozisyonda fare sabitleyin ve dikkatle diğer organlara zarar vermeden kalp maruz. diyaframı delen sonra hızlı çalışması için emin olun.
- göğüs kafesi ile kaudal başlayan göğüs orta hat boyunca cerrahi makas ile deri yoluyla bir kesi gerçekleştirmek ve klavikula rostral geçin.
- ventral göğüs kafesi tabanı boyunca iki ek yanal kesiler olun. Yavaşça hareket ve tüm göğüs boşluğu maruz emin olun, cildin iki flep pin.
- göğüs boşluğu maruz künt forseps ile kılıç şeklinde sürecini tutun ve sivri makas sakinleştirmeyes. , Diyafram ve göğüs kafesi kesti akciğerleri delinmesiyle önlemek için dikkatli olmak ve clavicles için kesi rostral devam ediyor. diyaframı delen sonra hızlı çalışması için emin olun.
- Yavaşça künt forseps ile perikard kesesi gözyaşı. Künt forseps ile sabit kalbi tutun sağ atrium kesti ve PBS infüzyon başlar. Hemen sol ventrikül içine kan toplama iğne takın.
- Daha sonra, (150 ml karşılık gelen) 6 dakika boyunca PFA geçiş (75 mi tekabül eden) 3 dakika boyunca akrolein, ardından PBS ile fare (hortumda) serpmek. tüp girmesini kabarcıklarını engellemek için çözüm geçmeden önce, pompa akışını duraklatmak emin olun.
- Fare başını kesmek ve tespit edilmiş olan beyin özü ve 4 ° C'de en az 2 saat boyunca% 4 PFA ihtiva eden bir cam şişeye doğrudan yerleştirin.
- beyin ayıklamak için, kafatası maruz deri yoluyla kesmek için makas ve cımbız kullanın. Dikkatle kafatası op kırmakgözlerinin arasındaki en, ve bunun küçük parçalar halinde kapalı çip yatan beyin ortaya çıkarmak.
- Dikkatle vibratome kesit için devam etmeden önce ek 2 saat süreyle% 4 PFA ile maruz beyin ve yazı Fix çıkarın.
Bir vibratome kullanarak 4. Beyin Kesit
- soğutulmuş PBS ile sabit beynini 3 kere yıkayın. Keskin bir jilet kullanarak, (bu bölge soruşturma altında olmadığı sürece) koku Ampulü çıkarmak ve 2 içine enine beyin kesti - prosedürünü hızlandırmak amacıyla eş zamanlı olarak kesitli olabilir bütün bunlar yaklaşık olarak eşit yükseklikte 3 adet.
- dikey tepsiye güvenli numune plakası üzerine beyin dokusu parçaları Tutkal. Düzgün kesme yüzeyi numune plakasına sıkıca yapışır ve kesit işlemi sırasında yerinden almaz emin olun. tüm beyin yüzeyi tamamen batık dek tepsinin içine yeterli PBS çözüm ekleyin. Inci tutmak önemlidirE beyin parçaları ve sonraki bölümlerde tam bu aşamada boyunca PBS dalmış.
- , Vibratome tepsiyi yerleştirin 0.5 mm / sn, 90 Hz kesit frekans ve 50 um kalınlığında kesitler elde etmek amacıyla 50 um besleme kalınlığına kesit hızını ayarlar. Sonra ince bir fırça kullanılarak, dondurarak saklama çözeltisi (% 40 PBS,% 30 etilen glikol ve% 30 gliserol) ihtiva eden 20 ml'lik bir cam şişe içine bölümleri aktarın. sonraki kullanıma kadar -20 ° C 'de şişeleri saklayın. aşağıdaki adımlarda tarif edildiği gibi alternatif olarak, yakın taranması için PBS bölümleri tutun.
Metoksi-x04-lekeli Plaketlerinin Varlığının 5. Bölüm Taraması
- Stereotaksik fare beyninin yardımı örneği için ilgili bölgeyi ihtiva eden 14 seçeneğini beyin bölümleri, bu örnekte kullanılan hipokampüs CA1 Atlas. Yeterince, dondurarak saklama çözeltisi ihtiva eden 24 oyuklu bir kültür plakasına olan bir kuyuya her bir bölümü yerleştirinböylece kurumasını bölümleri önlemek için.
- , Bölümleri kuruma aşağıdaki prosedürü kullanarak önlemek için, arka arkaya her bir bölümü inceleyin:
- tek kullanımlık bir pipet ile bir mikroskop lamı PBS bir damlacık ekleyin ve damlacık bölümü yerleştirin.
- metoksi-x04 etiketli Aβ plaklar içeren bölgelerinin belirlenmesi için bir floresan mikroskobu altında bölümü inceleyiniz.
Not: metoksi-x04 kolayca flüoresans ultraviyole (UV) filtre (eksitasyon 340-380 nm) kullanılarak görüntülenebilir.
- yapısal bölgeye doğrudan plakların varlığını ilişkilendirmek için her görüntü her iki alanda da aynı bölgeyi göstermek gerekir, çünkü mikroskop sahne hareket ettirmeden parlak alanda ilgi alanları (ROI) bölgelerinin görüntülerin yanı sıra floresan modunda Yakalama doku kesiti.
- Kaydet ve hayvan sayısına göre çekilen görüntüleri adlandırın. Ayrıca plaka iyi numarası ve resim alanını ta kayıtken. Örneğin, Örn: 9978A1B; Hayvan sayısı: 9978; Peki sayısı: A1; Alan: Parlak. Görüntüleme tamamlandıktan sonra geri onun iyi belirlenmiş bölümüne yerleştirin.
Not: Sonunda, incelenen her bir bölüm için, iki resim, parlak alanda bir ve UV alanında başka elde edilir. - kuyu sayısına göre Görüntü J aynı ROI iki görüntü (parlak alanında tek ve UV alanında diğer) açın ve MosaicJ eklentisi kullanarak, iki görüntü kenarlarını hizalayın ve hizalanmış ve kombine görüntüyü kaydetmek o geldi.
- Özellikle hayvan sayısı ile ayrı bir klasörde resmi kaydedin. belirlemek ve doku bölümünde plaklar lokalize ve iki farklı alanda (parlak ve UV) bütün bölümün tam bir görünümü var görüntüleri birleştirin.
- Tarama işlemi tamamlandıktan sonra immün ya da daha fazla işlemci, CA kadar, kriyoprotektan ihtiva eden bir 24-çukurlu kültür plakasına -20 ° C'de incelendi bölümleri depolamakdışarı rried.
6. IBA1 için immün Ön gömme
Not: oda sıcaklığında yavaş hareket eden rocker plaka koyarak seçilmiş serbestçe yüzen bölümlerde IBA1 için immün gerçekleştirin.
- İyice yaklaşık 1 ml PBS, 10 dakika boyunca sürekli olarak, her bir yıkama ile bölümleri 3 kez yıkayın.
- 10 dakika boyunca PBS çözeltisi içinde% 0.3 hidrojen peroksit ile endojen peroksidazlar söndürün. Bu adım, bir arka plan boyama önlemek için önemlidir spesifik olmayan peroksidaz aktivitesi, önler.
- 10 dakika her biri için PBS içinde 3 kez doku yıkayın.
- 30 dakika boyunca PBS çözeltisi içinde% 0.1 sodyum borohidrid bölümleri inkübe edin. Bu adım, sabitleme adımından kalan aldehitleri azaltmak için çok önemlidir, ve akrolein doku fiksasyon kullanıldığında özellikle önemlidir.
- 10 dakika her zaman için PBS 3 kez doku yıkayın ve tüm kabarcıklarını çıkarmak için emin olun.
- 1 saat bölümleri engelleyin.Farklı antikorlar farklı engelleme süreleri ve çözümler gerekebilir. (PH 7.4 TBS) IBA1 için,% 10 cenin sığır serumu,% 3 sığır serum albümini ve% 0.01 Triton X-100, 50 mM Tris-tamponlu tuzlu su içinde ihtiva eden bloklama tamponu hazırlayın.
Not: bloke etme adımı, birincil antikorun özel olmayan bağlanmasını önlemek içindir. Triton X-100 ve düşük konsantrasyonda daha iyi bir boyama için membran az geçirgenliği sağlar ve EM altındaki dokuların en ultrastrüktürel özellikleri korumak için yeterince düşüktür. - 4 ° CO / N olarak: dokusundan Bloklama tamponunu çıkarın ve birincil antikor çözeltisi içinde inkübe (bloke tamponu içinde [1000 1] seyreltilmiş tavşan anti-IBA1).
- 10 dakika her zaman için TBS içinde 3 kere yıkayın.
- 90 dakika 0.05 M TBS: ikincil antikor (biyotin konjuge edilmiş keçi anti-tavşan) [200 1] inkübe edin.
- 5 dakika her zaman için TBS içinde 5 kez yıkayın.
- TBS içinde avidin-biotin kompleksi çözeltisi (: [100 1], Biyotin, avidine [100: 1]) inkübe1 saat süre ile çözelti.
- 5 dakika her zaman için TBS içinde 5 kez yıkayın.
- % 0.05 diaminobenzidin (DAB) ve 8 dakika için TBS içinde% 0.015 hidrojen peroksit ile IBA1 boyama Ortaya.
Not: DAB gelişme zamanlama protokolü protokolü değişebilir ve hızlı bir şekilde ışık mikroskobu altında lekeli bölümleri incelenerek tespit edilmelidir.
Not: IBA1, bir (temsilci örneğin Şekil 2) açıkça 20X de IBA1 lekeli mikroglia hücre gövdeleri ve süreçleri görselleştirmek mümkün olmalıdır. bilinen bir kanserojen olarak, DAB kullanılarak dikkatli olun. - (Yukarıda anlatıldığı gibi) dikkatli bir şekilde, bu aşama sırasında bölümler izleyerek aşırı geliştirilmesi kaçının. 5 dakika, her seferinde soğutulmuş PB 5 kez bölümleri yıkayarak reaksiyonu durdurun.
Elektron Mikroskopi 7. İşleme
- bir cam şişede PBS içinde% 1 ozmiyum tetroksit çözeltisi hazırlayın. Osmiyum tetroksit ışığa olduğu; g kapağıAlüminyum folyo ile lass şişe ışıktan çözelti korumak için.
çok tehlikeli kimyasal olarak, osmiyum tetroksit kullanılarak dikkatli olun. Bu ve bir davlumbaz içine aşağıdaki adımları uygulayın. - bölümler PBS çıkarın ve düz ince bir fırça kullanarak onları yayıldı. kurumasını bölümleri tutmak için bir defada bu adımı bir kuyu gerçekleştirin. derhal bölümlerde herhangi kıvrımlar kalıcı hale gelecektir olarak, osmiyum tetroksit ekleme ve sadece bölümleri kıracak doku sonrası osmiyum tespit düzleştirmek için denemeden önce bölümleri düzleştirmek için emin olun.
- katlama bölümleri önlemek için, bir transfer pipeti ile bir seferde ozmiyum tetroksit bir damla ekleme, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ozmiyum tetroksit bölümleri bırakın. ışıktan bölümleri korumak için alüminyum folyo ile kuyu örtün.
Not: Bu adım bölümlerinde lipidler giderir. Doku osmiyum sonrası tespit sonrasında çok koyu görünür. - Bölümler ozmiyum tetro içinde ikenXide, 20 g komponent A karıştırılarak bir tek beher içinde plastik reçine hazırlanması 20 gr bileşen B, 0.6 g bileşen C, ve 0.4 gr bileşen D üzerinde sırayla bileşenlerin birlikte birleştirin ve de 10 mi serolojik bir pipet kullanarak karıştırın kadar homojen bir renk elde edilir.
- alüminyum tartı yemekleri hazırlanan karışımı aktarın. onlar susuz edildikten sonra onlar doku kesitlerinde alacaksınız.
- % 35,% 35,% 50,% 70,% 80,% 90,% 100,% 100,% 100: aşağıdaki sırayla 2 dakika süreyle etanol artan konsantrasyonlarda bölümleri kurutmak.
- 2 dakika her zaman için 3 kez, kalan etanol kaldırmak propilen oksit bölümleri batırmak için. 20 ml'lik bir cam şişe içine 24 oyuklu bir kültür plakasına gelen susuz kesitleri çıkarın. Her zaman plastik erir propilen oksit ile çalışırken cam şişeleri kullanın ve tehlikeli olduğu gibi, dikkatli korumak.
- propilen oksit soluti bölümler aktarmak için bir bombeli cam pipet veya ince bir fırça kullanınreçine içine ve üzerine oda sıcaklığında infiltrasyon için O / N bırakın. propilen oksit ile reçine sulandırmak için dikkatli olun.
- poli-kloro-tri-floro-etilen (PCTFE) filmsheets üzerine reçine ile bölümü yerleştirme:
- PCTFE filmsheets ilgili bölümler gömme önce 15 dakika - 10 60 ° C fırında - 50 içine örnekleri içeren alüminyum tartı yemekleri yerleştirin.
- bölümleri gömerken, bir alüminyum bir defada çanak tartı ile çalışır. ince bir fırça kullanılarak, tek bir PCTFE film tabakasının üzerine reçinenin ince bir tabaka boya.
- PCTFE film tabakasının çanak ağırlığında alüminyumdan bir defada dokusunun bir bölümünü hareket ettirin. onu rahatsız etmemek için dikkatli olmak, doku etrafında aşırı reçine çıkarmak.
- PCTFE film tabakasının çanak ağırlığında birinden tüm bölümleri taşıdıktan sonra, doku sandviç yaratarak, birinci üzerinden ikinci PCTFE yaprak yerleştirin ve 2 yaprak arasında reçine.
- 5 ° C'de 3 gün boyunca bir kuluçka makinesi içinde reçine polimerize5-60 ° C.
- malzeme artık ultra ince kesit ve ultrastrüktürel inceleme, genellikle EM çekirdek tesisleri tarafından gerçekleştirilen özel teknikler için hazırdır. ultrastrüktürel bozulma olmadan oda sıcaklığında güvenle PCTFE ince levhalar arasındaki örnekleri saklamak.
Not: Kesit çok ince ve transmisyon elektron mikroskobu incelemesi için sonraki adımlar ayrı bir protokole 13 açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölüm, protokol farklı kritik aşamada elde edilebilir sonuçları göstermektedir. hipokampus CA1, tabakalar radiatum ve lacunosum-moleculare: Özellikle sonuçları beyin metoksi-x04 lekeli belirli bir bölgedeki plaklar ve ilgi katmanları içeren bölümlerinin örneklerini göstermektedir. Plaklar ve hipokampus lamelli / bölgesel örgüt gittikçe UV ve parlak bir alan filtreleri (Şekil 1) bir kombinasyonu kullanılarak görüntülenmiştir. Seçilen beyin bölümleri sonradan boyanmış ve Aβ plaklar takip tutarken hala floresan aşağıdaki immün olduğunu düşünüyor, EM için işlenir ve osmiyum tetroksit ve gömme (Şekil 1) ile tedaviyi takiben çevreleyen neuropil daha koyu hale gelir. Bu loca dayalı elektron mikroskobu ile incelenmesi bir alanlarına (genellikle birkaç milimetre kare) tanımlamak için izin verirplakların tion. Ayrıca, IBA1 ile mikroglia ön gömme immün için geliştirilmiş bir protokol burada tanımlanmıştır. Bu protokol, beyin bölümlerinde olağanüstü mikroglial hücre gövdeleri, büyük ve küçük süreçler (Şekil 2) görselleştirme yanı sıra antikorların nüfuz verir. Bu nedenle yapısal düzeyde mikroglial hücre gövdeleri ve süreçlerin tanımlanması ve Aβ plaklar (Şekil 3 ve 4) ile olan etkileşimleri çalışma kolaylaştırır.
Şekil Floresan Boya Metoksi-x04. AB Sistemik Enjeksiyon sonrasında Işık Mikroskobu kullanarak 21 aylık APP-PS1 Farelerde Aβ Plaketlerinin 1. Görselleştirme) parlak bir alan ve floresan modlarını kullanarak bir hipokampal bölümün İkili görüntüleme. bölgeler ve ilgi katmanları parlak alan altında görüntülenmiştir380 nm (B) - (A) ve Aβ plaklar arka arkaya 340 aralığında bir UV filtresi kullanılarak lokalize. CD) Çift önce başka hipokampal kesit görüntüleme (C) ve sonra (D), etanol içinde ozmiyum tetroksit, dehidrasyon sonrası tespit ardından IBA1 için immün öncesi gömme ve transmisyon elektron mikroskobu için gerekli olan, bir plastik reçine gömme. Dikkat edilmesi gereken, (bir noktalı çizgi ile çevrili) plak elektron mikroskobu için doku işleme üzerine hala görülebilir. doku blokları keserken plaklar görselleştirme yüksek uzaysal çözünürlükte görüntü alanlarının kesin bir şekilde seçilmesini sağlar. Ölçek çubukları = A ve B için 300 mikron, C ve D için 150 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Vi Işık Mikroskobik Düzeyde IBA1 Boyama tarafından 21 aylık APP-PS1 Farelerde Mikroglial Hücre Vücut ve Güzel Süreçlerin sualization. osmiyum tetroksit sonrası tespit ve plastik reçine gömme önce görüldüğü gibi bir noktalı çizgi ile çevrili) onlar metoksi-x04 bağıntılı floresan görüntüleme tarafından tespit Aβ plaklar (ilişkilendirmek zaman IBA1 lekeli mikroglia AB) Örnekler kümelenmiş dağılımını gösteren. osmiyum tetroksit sonrası fiksasyon ve plastik reçine gömme sonra Aβ plaklar ile ilişkili IBA1 boyanmış mikroglia CD) örnekler. Plaklar böylece konum izleme sağlayan osmiyum sonrası fiksasyon takiben çevreleyen nöropilde daha koyu hale unutmayın. Ölçek çubuğu = 250 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
060 / 54060fig3.jpg "/>
Distrofik neurites ile Şekil 3. Çift Aβ plaklar ve IBA1-immün ultrastrüktürel Düzeyi. A) kompakt fibriler yapısı ile tanınan yoğun çekirdek Aβ plak Örnek 6 aylık APP-PS1 Farelerde (inset bakınız Görselleştirme) ve dernek otofaji ultrastrüktürel özellikleri ile. B IBA1 boyanmış mikrogliyal sürecin (m) Örnek; menekşe renkli) yakın amiloid birikimi içeren Aβ plaketi bulundu. (Yıldız ile gösterilen) Mitokondriyal değişiklikler de mikroglial süreç içinde görülebilir. Dikkat edilmesi gereken, bu resim antikorlar ve boyama yoğunluğu penetrasyonu maksimal olduğu (resmin sağ tarafında, beyaz) doku-reçine sınırında elde edildi. Ölçek çubukları = 2 A um, 1 mikron B. bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Doku reçine sınırından uzak edinilen IBA1 lekeli mikroglial hücre gövdesi ve süreçlerin (m) Transmisyon Elektron Mikroskobu. AD) Örneklerle Gözlemlenen olarak 6 aylık APP-PS1 Farelerde IBA1-immunohistokimyasal mikroglia Şekil 4. İlave Örnekler , antikorların mükemmel penetrasyon gösteren ve bu protokolü kullanarak bölümünde derin yoğunluğu boyama. bv = kan damarı, d = dendrit, içinde = içerme, s = dendritik omurga, t akson terminali =. ok uçları sinaptik yarık göstermektedir. Ölçek çubukları = 1 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol EM ile yoğun çekirdek Aβ plaklar hedefleyen bir bağlaşık bir yaklaşım açıklar. In vivo enjeksiyon metoksi-x04 Örneğin, hipokampus CA1, tabakalar radiatum ve lacunosum-moleculare Aβ belirli bölgeler içinde plaket ve ilgi katmanları ihtiva beyin bölümlerinin hızlı seçilmesini sağlar. Bu örnekte, metoksi-x04 Ön görüntüleme mikroglial fenotipleri yoğun ana Aβ plaklar mevcudiyetinde ultra-yapı seviyesinde sinaps etkileşime kadar farklı çalışma IBA1 için immün öncesi gömme ile bir araya getirilmiştir.
Mikroglia çevrelerine son derece duyarlı ve onların inflamatuar aktivite, uzun, normal beyin fonksiyonları zarar ve AD ilerlemesini artırılması bağlamında ele alınmıştır. Özel olarak, bu hücreler Chr yol nedeniyle geniş bir aktivasyonu ve proenflamatuar sitokinlerin serbest bırakılması nörodejeneratif süreçlerine dahil edilmiştironik nöroenflamasyon, normal beyin bozulması 15 homeostazı. Son yıllarda, bununla birlikte, bu yerleşik bağışıklık hücreleri Ayrıca yeni patojenik mekanizmalar 16,17 belirlenmesine yol sağlıklı beyindeki nöronal devreler yeni model gösterilmiştir. Sinapslarda fizyolojik rolleri kızışmalı sinaptik kayıp, çeşitli nörodejeneratif koşullar 18,19 arasında bilişsel gerileme şu anda en iyi patolojik açıklayıcı kavramdır sonuçlanan AD nöro sırasında düzensiz hale gelebilir.
Önceki ön gömme IBA1 boyama yöntemi 13 yapılan modifikasyonlar artık ultra-yapı seviyesinde iyi beyin bölümleri arasında antikor nüfuz yanı sıra mikroglial hücre gövdeleri ve ince süreçlerin görselleştirme sağlar. Genel olarak, protokol bu ultrastrüktürel bozulmayı dikkate alınarak doku kesitlerinde plastik reçine gömme kadar fare perfüzyon titizlikle yapılması gerekmektedirHerhangi bir arada aşamada meydana vb hücre zarının, organeller, hücre iskeleti elemanları, bütünlüğünü tehlikeye atabilir.
Bu protokol sadece yoğun çekirdek Aβ plaklar görselleştirmek için (bölüm 6 atlayarak) herhangi bir immün olmadan yapılabilir olabilir, ama aynı zamanda farklı antikorlar için kullanılabilir olarak, Aβ birikimi ile ilişkisi AD patogenezinde karmaşık mekanizmaları incelemek için güçlü bir araç sağlar çevresel olarak türetilmiş makrofajlar, endojen mikroglia, astrositler, oligodendrositler ve progenitör, hem de çok sayıda nöronal alt tipleri de dahil olmak üzere farklı hücre tipleri üzerinde odaklanmaktadır.
Metoksi-x04 in vivo enjeksiyonu göz önüne alındığında, bu protokol ölüm sonrası insan beyni örnekleriyle kullanımını engellemektedir ki, tespit edilmiş olan beyin kesitlerinde gerçekleştirilemez. Ayrıca, aksine çözünür ve çözünmez Aβ formlarını, bağlama boyaların kullanımını etiketler Aβ karşı immün için ß-pilili sBöyle metoksi-x04 olarak heet protein yapılarının yalnızca başka bir sınırlama teşkil yoğun çekirdek plaklar, görselleştirme sağlar.
Bununla birlikte, önemli uygulamalar örtüşen ve faaliyetlerini artırmak ve AD patoloji boyunca plak homeostasis ve nöronal fonksiyonu üzerinde doğrudan etkileri olabilir mikroglia ve diğer çeşitli hücre tipleri, rolleri okuyan içerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), Academic Press. New York. (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. è Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
