Abstract
호중구는 인간의 혈액 순환에서 가장 풍부한 백혈구하고 신속하게 염증 사이트에 채용된다. 초벌은 중성 백혈구의 식세포 기능을 향상시키는 중요한 이벤트입니다. 광범위한 연구는 감염과 부상 중에 존재와 호중구 프라이밍의 중요성을 발표했지만, 사용할 수 있었다 생체 내에서이 과정을 시각화의 의미합니다. 형광 접합 된 항 - 림프구 항원을 주입함으로써 달성 - 2) 생체 호중구 라벨링 프라이밍의 척도로 사용 - 1)을 DsRed 리포터 신호는 제공된 프로토콜은 세 가지 방법을 조합함으로써 살아있는 동물에서 프라이밍 호중구의 동적 프로세스의 모니터링을 가능하게 6G (Ly6G) 단일 클론 항체 (단클론 항체), 3) 생체 내에 공 촛점 이미징. 몇 가지 중요한 단계는이 프로토콜에 관련된 : 옥사 졸론 유발 마우스 귀 피부 염증, 동물의 적절한 진정 작용, 항 Ly6G 단클론 항체의 반복 주사 및 이전을촬영시 초점 드리프트의 ention. 몇 가지 제한이 그러한 한 마우스에서의 연속 촬영 시간 (~ 8 시간)의 한계 및 형광 염료 덱스 트란 염증 상태의 혈관에서의 누설로 관찰되었지만,이 프로토콜의 생체 내에 이미징을위한 기본 틀을 제공한다 쉽게 마우스 염증 모델에서 다른 면역 세포의 검토로 확장 될 수 프라임 호중구 동작 및 기능.
Introduction
호중구는 순환에서 가장 풍부하고 단명 한 백혈구 수 있습니다. 그들은 신속하게 그들이 항균 펩타이드 및 단백질 분해 효소 1을 포함하는 과립과 함께 활성 산소와 질소 중간체의 출시를 통해 같은 전문 식세포를 제공 감염이나 부상의 사이트에 채용된다. 그들의 채용 동안 호중구 염증 (2)의 위치에 도착하면 현저하게 향상 식세포 기능의 결과로, 미생물 제품, 화학 유인 물질 및 염증성 사이토킨을 포함하는 다양한 에이전트 "프라이밍"된다. 호중구 프라이밍 메커니즘은 광범위하게 연구 시험 관내 3,4-되었다; 그러나, 생체 내에서 처리를 동적으로 모니터링은 현재까지 불가능 하였다.
최근 생체 내에 영상은 시각화 및 생물에 생물학적 과정의 세포 역학을 정량화하기위한 중요한 기술이되고있다. Intravi탈 촬상는 종래의 광자 현미경 여기를 통해 (예를 들어, 공 초점)을 수행하거나 다 광자 현미경 (5)에 접근 할 수있다. 시간이 지남에 상당한 개선이 증가 영상 해상도 개선 촬상 깊이를 가능하게이 기술에서 달성되어, 광 손상 조직, 향상된 이미지 안정화 -6,7- 감소. 시간이 지남에 따라 세포 마이그레이션 및 상호 작용의 동적 시각화를 가능하게하는 독특한 능력을 감안할 때, 생체 내에 현미경 광범위 면역학 8 연구의 다양한 분야에 적용되고있다. 생체 내에 영상은 더 잘 이해하고 동물 모델 생활에서 모두 세포 및 분자 수준에서 면역 반응을 상황화하는 면역 학자 수 있습니다.
최근 유전자 변형의 발전뿐만 아니라 노크에서 기자 마우스 등 살아있는 동물에서 호중구의 동적 행동을 모니터링하기위한 유용한 도구를 제공하고 있습니다. 라이소자임 M 프로모터 기반의 강화 된 녹색 형광 단백질 노크에서생쥐는 크게 넘쳐, 세균 감염 및 염증 멸균 9-15 포함한 다양한 염증 과정 동안 호중구, 단핵구 및 대 식세포의 운동성을 특성화하는데 사용되어왔다. 또한, 세포질 형광 공명 에너지 전달, 바이오 센서를 발현하는 형질 전환 마우스는 염증 부위 내에 16 호중구 세포 미토 겐 - 조절 키나아제 및 단백질 키나아제 A의 활동을 연구에 사용되었다. 호중구의 형광 발현 특이성을 가진 쥐 모델 자체 림프구 항원 6G (Ly6G) (17) 식으로 결합되는 형광 단백질 tdTomato,뿐만 아니라 Cre 호텔 재조합 효소를 생산시 Catchup 녹아웃 마우스이다. 이 모델을 통해 Ly6G 결핍 호중구의 시각화는 이러한 세포에서 멸균 또는 감염성 생체 내 염증 다양한 상황에서 정상적인 기능을 발휘 있음을 보여 주었다. 을 DsRed 형광 페이지를 발현하는 형질 전환 마우스호중구 염증 단핵구 활성화 대 식세포를 포함 할 것으로 - - (IL-1β) 프로모터 (pIL1-을 DsRed)는 IL-1β 생산 세포의 운동성 동작을 시각화하는데 이용 된 interleuikin-1β 마우스의 제어하에 유전자 rotein 신흥 염증이 피부 십팔인치
생체 내에서 라벨은 염증 조직에서 호중구의 세포 및 분자 행동을 추적하는 또 다른 방법이 될 수 있습니다. 안티 GR-1 단일 클론 항체 (단클론 항체) 라벨 형광의 낮은 용량의 정맥 주사, GR-1 + 호중구의 모집 캐스케이드 후 황색 포도상 구균 (19)에 감염된 마우스의 피부 병변에 가시화되고있다. streptavidin-를 포함하는 복합체의 생체 내 투여 결합 705 nm의 양자점과 바이오틴 안티 Ly6G 단클론 항체는 특히 순환 호중구 (20) 레이블을 붙입니다. neutroph에 이러한 접합체 또한, 엔도 시토 시스IL 소체는 간질로 이주 호중구 고속 소낭 수송의 추적을 허용한다. 생체 P- 셀렉틴 대 형광 복합 항체 αM 인테그린 리간드 -1 (PSGL-1), L 셀렉틴 (CD62L)을 당 단백질로 표지 (는 CD11b를 TNFα에 의한 염증 모델)과 케모카인 (CXC 모티브) 수용체 2 (CXCR2)는 초기 염증 21시 놀이 규제 메커니즘을 해명했다. 편광 호중구는 CD11b를하고 CXCR2, 호중구의 이동을 유도하고 염증을 시작 수용체의 재분배 결과, 활성화 된 혈소판에서 CD62L 존재와 상호 작용하는 uropods을 PSGL-1이 풍부한 돌출.
IL-1β는 준비하는 호중구 (22)에 상승 서명 유전자 중 하나입니다. pIL1-을 DsRed 기자 마우스에서,을 DsRed 형광 신호 (예., IL-1β의 프로모터의 활성화) 긍정적으로 mRNA 발현과 IL-1β 단백질 생산 IL-1β와 상관 관계. <SUP> 18 호중구 프라이밍의 프로세스를 모니터링하기 위해, 생체 내에 현미경 방법은 형광 접합 된 항 Ly6G 단클론 항체와 호중구의 생체 표지 다음 pIL1-을 DsRed 마우스 모델에서 옥사 졸론 (OX)와 피부 염증의 유도를 포함하는 개발되었다. 이 모델을 통해 다양한 질병과 질환의 동물 모델에서 호중구 뇌관의 동작 및 기능을 연구 할 수있다.
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Protocol
모든 동물 실험은 건강 지침의 국립 연구소에 따라 수행 톨레도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인됩니다.
pIL1-을 DsRed 마우스 1. 표현형
참고 : 자손은 야생형 (WT) C57BL6 마우스를 이형 pIL1-을 DsRed 마우스 번식에 의해 생성됩니다. 세 주 네 오래된 새끼는 표현형에 대한 준비가 간주됩니다. 마우스의 턱밑 출혈은 약간의 수정 (23) 설립 프로토콜을 따른다.
- 마우스 새끼 전혈에서 백혈구의 분리
- 각 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 헤파린의 20 μl를 추가합니다.
- 케이지에서 한 강아지를 획득. 강아지의 식별 태그를 기록합니다. 턱밑 정맥에서 채혈 전에 새끼를 마취 할 필요가 없습니다.
- 목의 목덜미에 의해 강아지를 잡고 일에 턱밑 정맥을 관통5 밀리미터 란셋을 사용하여 전자 뺨 파우치. 혈액 방울 침투의 관점에서 스며 있도록 작은 구멍을 만들 충분한 힘을 적용합니다. 각각의 강아지에 대한 새 바늘을 사용합니다.
- 헤파린 함유 microcentrifuge 관에서 강아지 당 혈액의 5 방울 - 3를 수집합니다. 펑크 사이트를 청소하고 지혈을 용이하게하기 위해 압력을 적용합니다.
- 새 케이지에서 강아지를 넣고 동물 시설에 케이지를 반환하기 전에 30 분 동안 관찰한다.
- 긍정적이고 부정적인 컨트롤로 알려진 표현형의 성인 쥐에서 혈액을 수집합니다.
- 각 튜브, 소용돌이 튜브에 붉은 혈액 세포 용균 버퍼의 500 μl를 추가, 5 부화 - 얼음에 10 분.
- 각 튜브에 세포 현탁액을 아래에 소 태아 혈청 (FBS) 500 μL - 천천히 400을 추가한다. 명확한 계면은 상층의 세포 현탁액 및 FBS의 하층 사이에서 관찰 될 수있다.
- 캡 튜브와 원심 분리기 샘플을 5 분 동안 1,500 × g에서.
- 모피에 1.1.9 - 반복 1.1.7 단계THER는 적혈구를 제거합니다. 용해 처음 충분한 경우 반복하지 않는다. 펠렛 원심 분리 후 식별하기 어려울 수 있습니다.
- 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 자극과 문화
- 전체 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지 200 μl의의를 Resuspend 세포.
- 튜브 유세포에 세포 현탁액을 전송.
- 완전 RPMI 1640 배지 990 μL와 LPS 스톡 용액 10 μL (1 ㎎ / ㎖)을 혼합하여 용액을 작동 LPS를 만든다.
- 세포 현탁액 200 μL에 솔루션을 작업 10 μg의 / ml의 LPS의 20 μl를 추가합니다.
- 캡 튜브는 느슨하게 5 % CO 2와 37 ° C에서 4 시간 동안 샘플을 품어.
- 유동 세포 계측법 분석
- 유동 세포 계측법에 대한 데이터 취득 프로그램을 연다. 인수를 샘플링하기 전에 인수 템플릿을 설정합니다.
- 도구 팔레트에서 도트 플롯 도구를 클릭합니다. FO 그리기사이드 분산 형 (SSC) 플롯 대 rward 산란 (FSC). 리니어 스케일에 FSC와 SSC 전압 매개 변수를 설정합니다.
- 세포 계수기에 의해 허용 FSC와 SSC의 가장 낮은 임계 값을 선택합니다. 각각, FSC와 SSC에 대한 임계 값 200과 50을 적용합니다.
- SSC 플롯을 대 FSC 내 파편 적혈구와 림프구, 단핵구, 과립구 및 수지상 세포를 포함하고, 배제 게이트 G1을 그린다.
- 도구 팔레트에서 히스토그램 도구를 클릭합니다. FL2 (적색 형광 채널) 히스토그램을 그립니다. 모든 양을 DsRed 이벤트를 포함하는 게이트를 그릴 FL2 신호의 기준과 양성 대조군 샘플을 설정하는 대조군 샘플을 사용한다.
- 사이토의 유체 제어 패널에서 유체 모드 "RUN"과 유량에 "HI"(약 60 μL / 분)을 설정합니다. 각 샘플 10,000 이벤트를 취득.
- G1은 게이트에서을 DsRed 양성 세포의 비율을 측정하여 강아지의 표현형을 결정합니다.
- 100 밀리그램 / kg 케타민, 10 밀리그램 / kg 자일 라진 및 1 ㎎ / ㎏ 아세 프로 마진을 포함하는 마취 칵테일을 복강 내 (IP) 주사하여 마우스를 마취. 적절하게 마취 마우스는 발가락 핀치에 뒷 발 철수를 표시하지 않습니다.
- 마우스의 양쪽 귀에의 지느러미 표면에 헤어 제거 크림을 적용합니다. 1 분 30 초를 기다립니다. 물에 적신 솜으로 귀 표면을 닦고 자연 건조를 할 수 있습니다.
- 마이크로 미터를 사용하여 귀 두께를 측정하고 별도의 새장에 마우스를 교체합니다. (- 30 분 ~ 15) 마취에서 회복 될 때까지 관찰한다. 제모 제품에 의한 피부 염증을 해결하기 위해 상기 실험을 수행하기 전에 마우스를 3 일 동안 휴식을 허용한다.
- 1 ml의 아세톤에 OX 16.7 mg의 용해와 올리브 오일의 250 μL와 OX / 아세톤 용액 750 μl를 혼합하여 1.25 % (w / v)의 OX를 준비합니다. 250과 아세톤 750 μl를 혼합하여 차량의 솔루션을 준비합니다# 181; 올리브 오일의 리터.
- 마취 칵테일 (2.1)의 IP 주사로 마우스를 다시하는 것은-마취. 이전과 귀 두께를 측정한다.
- 오른쪽 귀 양쪽에 1.25 %의 OX의 12.5 μl를 적용합니다. 왼쪽 귀 양쪽에 아세톤 / 올리브 오일 차량 액의 12.5 μl를 적용합니다.
- 완벽하게 한 다음, 다른 마우스에 의해 귀에 모욕을 방지 원래의 새장에 마우스를 교체하고 동물의 주거 시설로 돌아 회복 될 때까지 마우스 케이지 동료로부터 분리하십시오.
참고 : 머리 제거 귀 두께의 변화에 의해 다음과 같은 작은 피부 염증의 원인이 될 수 있습니다. 이 작은 염증 3 일 후 해결 정상적인 귀 두께에 의해 확인됩니다. 24 시간 동안 국소 도포 한 후, OX 처리 귀는 유의 한 (P <0.01)에 비해 차량의 솔루션을 단독으로 처리 귀 부종을 보여줍니다.
pIL1-을 DsRed 마우스에서 호중구의 3 라벨링
참고 : 저용량 F에 의한 호중구의 생체 표지에luorescence-결합 호중구 특정 단클론 항체는 최근에 개발 된 프로토콜 19을 따른다. 레트로 궤도 주사는 약간의 수정 (24)와 함께 설립 프로토콜에 따라 수행된다.
- 인산염 완충 식염수 (PBS)의 90 μl를 0.5 ㎎ / ㎖ 알렉사 플 루어 647 - 복합 안티 Ly6G 단클론 항체 (클론 1A8)의 10 μl를 희석 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 솔루션을 준비합니다.
- 28 게이지 바늘과 U-100 인슐린 주사기에 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 솔루션 (50 μg의 / ㎖) 100 ㎕를 전송합니다.
- 이전에 기술 된 마취 칵테일 (2.1)의 IP를 주입하여 성인 pIL1-을 DsRed 마우스를 마취. 깨끗한 작업 보드의 마취 마우스 복부를 내려 놓습니다.
- 부분적으로 소켓에서 안구 돌출 한 마우스의 눈에 부드러운 아래 피부 지느러미에 압력과 복부를 적용합니다.
- 조심스럽게 복고풍 궤도에 내측 눈구석에서 약 30 °의 각도로, 아래로 베벨, 바늘을 배치공동.
참고 : 운영자가 동에 바늘을 삽입 한 번 압력, 침투 및 안심 저항을 느낄 수 있습니다. - 천천히 부드럽게 마우스로 용액 (5 μg의 단클론 항체 / 마우스 / 분사)를 작동 방지 Ly6G 단클론 항체의 100 μl를 주입. 빨리 바늘을 제거합니다. 출혈 소량 성공적인 주입 나왔다.
- 바로 오른쪽 마우스 왼쪽 귀에 1.25 %의 OX 차량 솔루션을 적용 할 수 있습니다.
- 8 시간 후, 동일한 마우스로 역 궤도 사출을 통해 새롭게 제조 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 용액 (5 μg의 단클론 항체 / 마우스 / 분사) 100 μl를 관리 할 수 있습니다.
- 즉시 이미징 전에 혈관을 시각화 30 ㎎ / ㎖ 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 100 μl를 관리하려면 복고풍 궤도 주입을 통해 덱스 트란 (150 kDa의)를 π 공역 계.
PIL-1을 DsRed 마우스에서 호중구 초벌 4. 생체 내에 영상
- 마취 칵테일 (2.1)의 IP를 주입으로 마우스를 마취.0; 동안 이미징을위한 마취하에 건조를 방지하기 위해 마우스 눈 수의학 연고를 적용합니다.
- PBS 동량 원래 마취 칵테일 500 ㎕의 희석하여 1 ml의 절반 - 용량 마취 칵테일을 준비한다.
- 나비 27 게이지 바늘로 1 ML의 주사기에 절반 용량 마취 칵테일을 전송합니다.
- 복강 마우스 복부에 나비 바늘을 삽입하고 테이핑에 의해 복부에 나비 날개를 고정합니다.
- 촬상 스테이지의 중심에 유리 커버 슬립을 놓는다. 제자리에 고정하는 커버 슬립의 가장자리를 테이프입니다.
- 마우스 귀 복부 표면뿐만 아니라, 커버 슬립을 PBS 방울을 놓는다.
- 위치는 커버 슬립을 통해 자사의 귀 마우스를 마취. 또한 테이프를 통해 장소에서 개최 된 커버 슬립과 유리 슬라이드 사이의 귀를 사이에 의해 아래로 귀 끝, 등쪽를 탑재합니다.
- 멀티 레이저 형광 공 초점 현미경과 관련된 모든 전자 켭니다quipment. 주변 광에 노출을 최소화하기 위해 실내 조명을 끄십시오.
- 이미지 수집 소프트웨어를 엽니 다. 염료 목록 메뉴에서 형광 염료의 검출을위한 레이저 채널을 선택합니다.
- 접안 렌즈를 통해을 DsRed + 세포에서 혈관과 빨간 신호에서 녹색 신호를 관찰하여 염증이 귀 피부에 초점을 조정합니다.
- 스캔 2 μS / 픽셀의 속도와 512 × 512 픽셀의 해상도와 빠른 검사를 수행합니다. 라이브 뷰 메뉴의 각 채널에 대한 사색을 선택합니다. 끝을 설정하고 검사의 위치를 시작하는 데 초점 노브를 조정합니다.
- 8 마이크로 초 / 픽셀 800 × 800 또는 1024 × 1024 픽셀의 해상도 - 스캔 (4)의 속도로 천천히 스캔을 수행합니다. 높은 전압 이득을 조정하고, 채도 (적색 화소)를 피하면서 신호의 세기를 최대화하기 위해 각 채널 오프셋. 각 채널에서 몇 빨간색 픽셀이 있어야합니다.
- 제를 주사하여 입체 화상 세트를 만들전자 귀 피부, 635 μm의 × 635 μm의 × 30 μm의 (20X 목적), 또는 1270 μm의 ×를 각질층에서 표면적으로 시작하여 X, Y, 317 μm의 × 30 μm의 (40X 목표) × 317 μm의의 Z 볼륨으로 하향 진행 2 μm의 Z-단계에서 1270 μm의 × 50 μm의 (10X 목적).
주 : 각질층은 표피의 최 외층이고 용이 강한 자기 형광 신호에 기초하여 국부적 수있다. - 저속 촬상 실험에서, 레코드 3 차원 영상까지 8 시간마다 2 ~ 4 분.
- 나비 바늘을 통해 절반 용량 마취 칵테일의 10 μL - 마우스가 마취에서 회복하기 시작 일시적으로, 경련 수염의 관찰에 기초하여 기록, 5를 관리 할 수 있습니다.
참고 : 마취 량의주의하십시오 - 과다 복용 마우스 사망의 원인이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 용기에 흡입 마취제 단기 마취 A의 마우스에도 적용 할 수있다노즈콘 장기 촬상에 사용될 수있다. - 이미징이 완료되면 무대에서 마취 마우스를 제거합니다. 테이프를 분리하고 마우스의 복부에서 나비 바늘을 제거합니다. 동물의 주거 시설에서 별도의 케이지에 마우스를 돌려줍니다.
참고 : - 3 시간 단기 영상 (<1 시간)의 경우, 마우스는 완전히 1에 신속하게 마취에서 회복. 16 시간 - 장기 영상 (~ 8의 시간)의 경우, 마우스 (12)의 통상의 회복 기간을 서서히 회복. 따라서, 경구 투여 물은 심각한 탈수를 방지하기 위해 회복 기간 중 적어도 몇 회에서 추천된다. - 처리 영상 데이터 세트는 개별 셀을 추적 이동성 경로를 생성하고, 화상 해석 소프트웨어 (25)를 사용하여 세포 이동의 방향성 및 속도를 계산한다.
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Representative Results
pIL1-을 DsRed 마우스의 선별은 유세포 분석기를 사용하여 말초 혈 백혈구에 의해 생산 된 표현형을 DsRed 형광 신호에 기초하여 수행된다. LPS 자극은 호중구, 단구, 수상 세포 및 26-28을 포함하여 골수 세포에서 IL-1β 생산을 유도하는 것으로 알려져있다. 따라서, 고립 된 백혈구 분석 유동 세포 계측법하기 전에 4 시간 동안 LPS와 함께 배양한다. 다음으로, 게이트는이 게이트 인구 측정 셀 사이즈 (FSC) 내부 복잡성 (SSC) (도 1A) 29을 DsRed 및 신호에 기초하여 골수 세포를 순환 설정된다. pIL1-을 DsRed 마우스에서 같은 세포가 구별을 DsRed 신호 (그림 1B)를 표현하면서 WT 생쥐에서 순환 골수 세포는 최소한으로,을 DsRed을 표현한다. 표현형이 방법에 의해 확인 된 pIL1-을 DsRed 마우스 후속 실험에 사용된다. 완전한 표현형 프로세스가 몇 소요 주목해야한다시간 - 조직 수확, 소화 효소, DNA 분리, PCR과 전기 영동을 포함한 기존의 유전자형 방법보다 훨씬 짧다.
IL-1β의 프로모터 활성화는 최근 호중구의 마커 (22)를 프라이밍로 확인되었습니다. 따라서, 호중구 프라이밍의 동적 프로세스를 가시화하고 pIL1-을 DsRed 마우스를 사용하여 살아있는 동물에서 평가 될 수있다. 피부 염증을 유도하는, 피부 증감 OX 국소 단독 같은 동물의 왼쪽 귀에인가 pIL1-을 DsRed 마우스 및 차량 우측 귀에인가된다. 살아있는 동물의 호중구 라벨을, 최근에 개발 된 프로토콜이 작은 직전 형광 표지 항 Ly6G 단클론 항체 량 OX 애플리케이션 후 8 시간을 투여함으로써 수행된다. 혈관을 찾으려면, FITC-덱스 트란은 촬영 직전에 주입된다.
OX 애플리케이션, 후 24 시간에서을 DsRed 많은 수의 + / Ly6G + 셀 혈관 외 공간 (그림 2A)에서 발견되고 호중구를 뇌관을 나타냅니다. 소수을 DsRed / Ly6G + 세포는 대부분 휴식 호중구를 대표하는 발견된다. 더욱이을 DsRed + / Ly6G 작은 집단 - 세포가 관찰되는 염증성 단핵구 및 대 식세포 활성화를 포함 할 수있다. 40 분 시간 경과 비디오에서 염증성 피부 병변 내에서 신흥 Ly6G + 호중구는 전형적인 아메바 같은 크롤링 운동 (보충 영화 1)을 나타낸다. / Ly6G + 호중구 인구 (그림 2B) - 셀 철새 경로는을 DsRed + / Ly6G + 및을 DsRed이의 운동성 행동을 비교하기 위해 추적됩니다. 트랙 플롯은 세포 외 공간 (그림 2C)를 입력 한 후 모두 호중구 인구를 표시하는 것이 "임의의"마이그레이션을 공개 분석한다. 재미있게,/ Ly6G + 대응 (그림 2D) - 자신을 DsRed와 비교을 DsRed + / Ly6G + 호중구 전시 상당히 높은 속도. 이 염증성 병변에서 호중구 프라이밍과 가속 운동 사이의 관계를 의미한다.
OX 처리 (- 4 보충 영화 2) 다음과 같은 서로 다른 시간에 시작 기록 된 호중구 프라이밍, 시간 경과 비디오의 일련의 타이밍을 모니터링 할 수 있습니다. 을 DsRed는 - OX 신청 후 12 시간과 번호는 (그림 2E, 기업 영화 3, 4) 이후 상대적으로 낮게 유지 - / Ly6G + 세포, 휴식의 호중구는 빠르면 8과 혈관 외 공간에서 검출된다. OX 애플리케이션 후 16 시간 - 반대로을 DsRed + / Ly6G + 세포 수는 프라임 호중구 14에서 시작하여, 이후의 시점에서 점진적으로 증가한다. 일부을 DsRed
그림 1 :. pIL1-을 DsRed 마우스의 표현형 (A) 세포 계측법 흐름은 FSC와 SSC 매개 변수를 기반으로 골수 세포 (G1)를 순환의 인구를 보여 분석한다. FL2 채널에서 (B) 히스토그램을 DsRed PIL - 마우스 (레드)에서 세포의 G1 게이트 내에는 DsRed + 세포의 백분율을 표시하거나 WT 마우스에서 (청색). 데이터 르의 대표3 개의 독립적 인 실험 AST. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 염증성 피부 병변을 DsRed + / Ly6G + 호중구의 운동성 활동의 시각화 (A) 정적 공 초점 현미경 이미지 즉, 혈관 외 공간에서 OX 치료 쇼 후 3 백혈구 인구를 24 시간을 기록을 DsRed + / Ly6G + 세포를. (별표)을 DsRed - / Ly6G + 세포 (삼각형), 및을 DsRed + / Ly6G - 세포 (화살표). 바 = 20 μm의. 을 DsRed가 + / Ly6G + 세포 (적색)과을 DsRed - / Ly6G + 세포 (파란색) migrato에 대한 비교OX 응용 프로그램 (보충 영화 1) 후 24 시간을 시작 공 초점 현미경으로 촬영 한 40 분 시간 경과 영화에서 공예 경로 (B), 트랙 플롯 (C) 및 속도 (D). (D) 바 속도 값을 의미 나타냅니다. *** P <0.001. (E)을 DsRed + / Ly6G + 세포의 숫자을 DsRed - / Ly6G + 세포 OX 응용 프로그램 (보충 영화 4까지 2) 후 다른 시간 지점에서 기록 된 시간 경과 영화의 시리즈에서 계산됩니다. 표시된 데이터는 세 개의 연속 된 이미지로부터 계산 된 세포 수 / mm 2 (± SD 수단)이다. (F) 정적 이미지는 OX 그림 (보충 영화 5) 후 14.5 시간에 11에서 기록 된 시간 경과 영화에서 만들어집니다. 화살표는 관찰 기간 동안 혈관 외 공간을 DsRed 식을 취득하는 Ly6G + 세포를 나타낸다.바 = 50 μm의. 이미지가 권한 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 사)와 참조 (22)에서 재생된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 기업 영화 1 : - / Ly6G + 세포 (파란색)에서 (OX 그림 후 24 시간에서) 염증성 피부 병변을 DsRed + 호중구의 운동성 행동 공 초점 현미경 영상을 DsRed + / Ly6G + 세포 (분홍색)과을 DsRed의 운동성을 보여 혈관 외 공간. 혈관이 녹색으로 볼 수 있습니다. 바 = 20 μm의. 비디오가 권한 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 사)와 참조 (22)에서 재생됩니다. 카스티하세요이 비디오를 보려면 여기를 ICK.
. 보충 영화 2 : - 혈관 외 공간에서 / Ly6G + 세포 (파란색) (OX 그림 후 4 시간에서) 염증성 피부 병변을 DsRed + 호중구의 운동성 행동 공 초점 현미경 영상을 DsRed + / Ly6G + 세포 (분홍색)과을 DsRed을 보여 . 혈관이 녹색으로 볼 수 있습니다. 자기 형광은 현재와 모낭과 관련된 것입니다. 바 = 100 μm의. 비디오가 권한 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 사)와 참조 (22)에서 재생된다. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 3 : Inf를에을 DsRed + 호중구의 운동성 행동. 혈관 외 공간에서 / Ly6G + 세포 (파란색) - lammatory 피부 병변은 (OX 그림 후 8 시간에서) 공 초점 현미경 이미지 (분홍색)을 DsRed + / Ly6G + 셀을 DsRed을 보여줍니다. 혈관이 녹색으로 볼 수 있습니다. 자기 형광은 현재와 모낭과 관련된 것입니다. 바 = 100 μm의. 비디오가 권한 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 사)와 참조 (22)에서 재생된다. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 4 : 운동성 염증성 피부 병변을 DsRed + 호중구의 행동 (11시 - OX 그림 후 19 시간) 공 초점 현미경 이미지 (핑크)을 DsRed + / Ly6G + 세포를 보여을 DsRed -에서 / Ly6G + 세포 (파란색). extravascular 공간. 혈관이 녹색으로 볼 수 있습니다. 자기 형광은 현재와 모낭과 관련된 것입니다. 바 = 100 μm의. 비디오가 권한 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 사)와 참조 (22)에서 재생된다. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
기업 영화 5 Ly6G + 호중구을 DsRed 신호 획득이 고배율 비디오 (화살표로 표시) Ly6G + 세포가 혈관 외에을 DsRed 식을 취득하는 프로세스를 도시 기업 비디오 4에 도시 된 시간 경과 영화에서. 관찰 기간 (OX 그림 후 11-14.5 시간) 동안 공간. 바 = 50 μm의. 비디오는 권한 (저작권 2015 년 필자의 미국 협회 기준 22 재생munologists, 주식 회사). 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구의 목적은 아직 현재의 기술에 의해 실현되지 않은 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 과정을 모니터링하는 기술을 개발하는 것이다. 이 목표를 달성하기 위해 세 가지 설정 방법이 수행됩니다 : 피부 염증의 1) 유도 IL-1β 프로모터 기반을 DsRed 기자 마우스에서 프라이밍의 측정, 형광 접합 된 항 Ly6G의 낮은 복용량으로 호중구의 2) 생체 표지로 단클론 항체, 3) 생체 내에 공 촛점 현미경 이미지. 이 세 가지 방법의 조합은 염증성 피부 병변에서 준비하는 호중구 (을 DsRed + / Ly6G +)의 운동성 활동의 시각화를 가능하게한다. 프라이머 작업 호중구의 이동 방향과 속도는 더 철새 경로 추적을 통해 정량화된다. 시간 경과 비디오 시리즈를 기록함으로써, 프라이밍 호중구 출현 실시간 동역학 I에 의해 염증성 사이트을 DsRed 발현 습득 모니터링ndividual 호중구는 혈관 외 공간에서 관찰된다. 따라서, 호중구 프라이밍의 동적 과정이 성공적으로 여기에 제시된 기술을 사용하여 처음으로 살아있는 동물에서 가시화되었다.
이 기술은 몇 가지 중요한 단계에서 사용된다. 먼저, 피부 조직을 생체 내에 이미징을위한 가장 편리한 신체 부위이다. 마우스 귀 OX의 국소 적용은 공 초점 현미경 아래에 염증이 피부의 면역 세포 행동의 직접 시각화 할 수 있습니다. 둘째, 마우스를 마취의 반복 주사를 필요로 촬영하는 동안 끊임없이 진정해야합니다. 그러나, 과도한 진정 작용 이미징 동안 마우스 다이의 원인이 될 수 있습니다. 과다 복용을 방지하기 위해 마취 (절반 또는 전체 용량의 세 번째)의 저용량 장기 이미징을 권장합니다. 셋째, 형광 공역 호중구 특정 단클론 의한 뮤린 호중구 (30 ~ 10 시간의 반감기)의 짧은 수명에 간헐적으로 주입한다. 마지막으로, 초점 박사IFT는 온도 변화, 마우스 본체의 움직임, 귀는 시간이 지남에 부종 및 장비 (31)의 동작에서 발생하는 진동 등의 여러 요인에 의해 발생 될 수 시간 경과 이미징 동안 큰 문제입니다. 몇 가지 방법이 진정으로 산소 및 온기를 제공하는 환경 챔버를 설치하는 단계에서 그 위에 유리 슬라이드 테이핑에 의해 제자리에 마우스 귀 고정 등 촬상 동안 진정의 일정 용량을 투여로, 리프팅을 방지하기 위해 개발되어왔다 유기체뿐만 아니라, 수동에 의해 다시 포커싱 범위를 필요 32,33.
이 프로토콜의 한계를 명시 똑같이 중요하다. 우선, 느린 마우스 복구 - 길이 촬상 기간을 8 시간 후 (12 ~ 16 시간)는이 프로토콜은 오랜 실험에 적합하지 않을 수 있음을 나타내는 인해 지속적인 진정으로 관찰된다. 다른 방법은 U보다는 촬상 기간 동안 순차적으로 여러 마우스를 사용하는하나의 노래. 둘째, 순환 FITC 덱스 트란 점진적 누출 가능성 염증 상태 (34)에 피부 혈관 투과성의 증가에 의해 발생되는 시간에 따른 촬상 동안 관찰된다. 따라서, 혈관의 시각화가 현저 촬상 이후 단계에서 순환 감소 형광을 주어 손상된다. 대안 적으로, 하나의 이러한 혈관 내피 세포 (35) 부착으로 혈관을 표시하는 등의 동종 렉틴 B4 같은 형광 공액 렉틴을 사용할 수있다.
염증성 피부 병변 호중구 프라이밍 프로세스의 시각화에 더하여, 여기에서 설명 된 기술은 다른 많은 실험 설정에서 적용될 수있다. 최근에 개발 된 이미징 윈도우와 함께, 준비하는 호중구의 행동을 서술 생체 내에 현미경 뇌, 유방 동맥, 폐, 복부 장기 36 ~ 39를 포함하여 깊은 조직 및 기관에서 평가 될 수있다. 프림의 또한, 시각화예컨대, 단핵구 및 대 식세포와 같은 다른 세포 유형 ING / 활성화를 통해 생체 표지와 함께 pIL1을 DsRed - 마우스를 사용하여 얻을 수있는 형광 - 공액 관심의 세포 유형에 특이 단클론 항체. 종합적뿐만 아니라이 기술은 살아있는 동물의 호중구의 프라이밍 처리의 생체 내에 이미징을위한 기본 틀을 제공 할뿐만 아니라 다른 조직에서 전개 각종 염증 상태의 다른 면역 세포의 동작 및 기능을 연구하기위한 새로운 접근 방법을 공개 않는다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
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