Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intra Imaging av nøytrofile Grunning Bruke IL-1B Arrangøren drevet DsRed Reporter Mus

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54070
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Toledo College of Medicine and Life Sciences, 2Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Pathophysiology, Southern Medical University (China)

Abstract

Nøytrofile er de mest tallrike leukocytter i menneskets blodsirkulasjonen og er raskt rekruttert til inflammatoriske områder. Grunning er en kritisk hendelse som forbedrer phagocytic funksjonaliteten av nøytrofile. Selv om omfattende studier har avdekket eksistensen og betydningen av nøytrofile priming under infeksjoner og skader, betyr å visualisere denne prosessen in vivo har vært utilgjengelig. Protokollen gitt muliggjør kontroll av den dynamiske prosessen med nøytrofil priming i levende dyr ved å kombinere tre metoder: 1) DsRed reporter signal - som brukes som et mål for priming 2) in vivo nøytrofil merking - oppnådd ved injeksjon av fluorescens-konjugert anti-lymfocytt antigen 6G (Ly6G) monoklonalt antistoff (mAb) og 3) intra konfokal avbildning. Flere kritiske trinn er involvert i denne protokollen: oksazolon-indusert mus øret hudbetennelse, riktig sedasjon av dyr, gjentatte injeksjoner av anti-Ly6G mAb, og prevention av fokus drift under bildebehandling. Selv om noen få begrensninger er blitt observert, så som grensen for kontinuerlig avbildning tid (~ 8 timer) i en mus, og den lekkasje av fluorescein isotiocyanat-dekstran fra blodkarene i den inflammatoriske tilstand, gir denne protokollen en grunnleggende rammeverk for intravital avbildning av primet nøytrofile atferd og funksjon, som lett kan utvides til undersøkelse av andre immunceller i mus betennelse modeller.

Introduction

Nøytrofile er de mest tallrike og kortvarige leukocytter i omløp. De er raskt rekruttert til nettstedene til infeksjon eller skade, hvor de tjener som profesjonelle fagocytter gjennom utgivelsen av reaktive oksygen- og nitrogenmellom sammen med granulat som inneholder antimikrobielle peptider og proteaser 1. Under rekruttering, er nøytrofile "primet" av ulike agenter inkludert mikrobielle produkter, chemoattractants og inflammatoriske cytokiner, noe som resulterer i vesentlig styrket phagocyte funksjonalitet ved ankomst til et område av betennelse to. Mekanismene for nøytrofile priming har blitt grundig studert in vitro 3,4; har imidlertid dynamisk overvåkning av prosessen in vivo ikke vært mulig til dags dato.

Nylig har intrabilde blitt en viktig teknikk for å visualisere og kvantifisere de cellulære dynamikken i biologiske prosesser i levende organismer. Intravital bildebehandling kan utføres via vanlig ett foton eksitasjon mikroskopi (f.eks confocal) eller multiphoton mikros nærmer fem. Over tid har betydelige forbedringer er oppnådd i denne teknikken gir økt bildeoppløsning, forbedret bildedybde, redusert vev photodamage, og forbedret bildestabilisering 6,7. Gitt sin unike evne til å aktivere dynamisk visualisering av cellemigrasjon og samhandling over tid har intravital mikroskopi blitt mye brukt til ulike studieretninger i immunologi 8. Intra bildebehandling gjør immunologer å bedre forstå og kontekstualisere immunresponser både på cellulært og molekylært nivå i levende dyremodeller.

Nylige fremskritt innen transgen samt knock-in reporter mus har gitt nyttige verktøy for å overvåke de dynamiske atferd av nøytrofile i levende dyr. Lysozym M promoter-drevet forbedret grønt fluorescerende protein knock-inmus har blitt mye brukt for å karakterisere motilitet av nøytrofiler, monocytter og makrofager i løpet av forskjellige inflammatoriske prosesser, inkludert ekstravasasjon, bakteriell infeksjon, og steril betennelse 9-15. Videre har transgene mus som uttrykker en cytoplasma fluorescens resonans energi overføring biosensor vært ansatt i å studere aktivitetene til nøytrofile ekstracellulære-regulert mitogen kinase og protein kinase A innenfor betent tarmen 16. En murin modell med høy spesifisitet for fluorescens-ekspresjon i neutrofiler er catchup knock-in mus, som produserer Cre rekombinase, så vel som den fluorescerende protein tdTomato, som selv er koplet til ekspresjon av lymfocytt antigen 6G (Ly6G) 17. Visualisering av Ly6G-manglende neutrofiler via denne modellen har vist at disse cellene utøver normal funksjon i en rekke sterile eller smittsomme in vivo-inflammatoriske sammenhenger. Transgene mus som uttrykker DsRed fluorescerende protein genet under kontroll av muse interleuikin-1β (IL-1β) promoter (pIL1-DsRed) er blitt anvendt for å visualisere de bevegelige atferd av IL-1-produserende celler - antas å omfatte nøytrofiler, inflammatoriske monocytter og aktiverte makrofager - voksende i betent hud 18.

In vivo merking kan fungere som et alternativ tilnærming for å spore de cellulære og molekylære atferd av nøytrofile i betent vev. Etter intravenøs injeksjon av lave doser av fluorescensmerket anti-Gr-1 monoklonalt antistoff (mAb), rekruttering kaskade av Gr-1 + nøytrofile er visualisert i mus hudlesjoner infisert med Staphylococcus aureus 19. In vivo administrering av konjugater som inneholder streptavidin konjugerte 705 nm kvanteprikker og biotinylert anti-Ly6G mAb spesifikt merke sirkulerende nøytrofile 20. Videre endocytose av slike konjugater inn neutrophil vesikler tillater sporing av høyhastighets vesikkeltransport nøytrofile migrere inn i interstitium. In vivo merking med fluorescens-konjugert antistoff mot P-selektin glykoprotein ligand-en (PSGL-1), L-selectin (CD62L), inte αM (CD11b ) og chemokine (CXC motiv) reseptor 2 (CXCR2) i en TNFa-indusert inflammatorisk modellen har belyst de regulatoriske mekanismer som spiller inn under tidlig betennelse 21. Polariserte neutrofiler rage PSGL-1-anriket uropods å samvirke med CD62L til stede på aktiverte blodplater, noe som resulterer i en omfordeling av CD11b og CXCR2, recep som driver nøytrofil migrering og initiere betennelse.

IL-1β er en av signaturen gener som er forhøyet i primet nøytrofile 22. I pIL1-DsRed rapportør mus, DsRed fluorescens-signaler (f.eks. Aktivering av IL-1β promoter) positivt korrelerer med IL-1β mRNA-ekspresjon og IL-1β proteinproduksjon. <sup> 18 For å overvåke prosessen med nøytrofil grunning, ble en intravital mikroskopi metode utviklet omfatter induksjon av betennelse i huden med oksazolon (OX) i den pIL1-DsRed musemodell følgende in vivo merking av neutrofiler med fluorescens-konjugert anti-Ly6G mAb. Via denne modellen, er det mulig å studere oppførselen og funksjon av primede neutrofiler i dyremodeller av forskjellige sykdommer og lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk er utført i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Toledo.

1. fenotyping av pIL1-DsRed Mus

MERK: Offspring er generert av avl heterozygote pIL1-DsRed mus med villtype (WT) C57BL6 mus. Tre til fire uker gamle valper regnes klar for fenotyping. Submandibular blødning av mus følger en etablert protokoll med mindre modifikasjoner 23.

  1. Isolering av White Blood Cells fra Whole Blood av Muse Pups
    1. Tilsett 20 mL av heparin til hver 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    2. Anskaffe en valp fra buret. Spill identifisering tag av valpen. Det er ikke nødvendig å bedøve unger før blodprøvetaking fra submandibular blodåre.
    3. Hold valpen etter nakken Scruff og pierce submandibular blodåre i the kinnet posen ved hjelp av en 5 mm lansett. Påfør tilstrekkelig kraft til å lage en liten punktering, slik at dråper blod utstråler fra det punktet av penetrasjon. Bruk en ny nål til hver valp.
    4. Samle 3 - 5 dråper blod per valp i en heparin holdig mikrosentrifugerør. Rengjør stikkstedet og press for å lette hemostase.
    5. Sett valpen i nytt bur og observere i 30 minutter før du går tilbake i buret til dyret anlegget.
    6. Samle opp blod fra voksne mus av en kjent fenotype som positive og negative kontroller.
    7. Legg 500 mL av røde blodlegemer lysebuffer til hvert rør, vortex rør, og inkuber i 5 - 10 min på is.
    8. Tilsett langsomt 400 - 500 ul av føtalt bovint serum (FBS) under cellesuspensjoner i hvert rør. En klar grensesnitt kan observeres mellom det øvre lag cellesuspensjonen og den nedre-lag av FBS.
    9. Cap-rør og sentrifugeres prøvene ved 1500 x g i 5 min.
    10. Gjenta trinn 1.1.7 - 1.1.9 til pelsther fjerne røde blodceller. Ikke gjenta hvis lyse er tilstrekkelig for første gang. Pelleten bør være vanskelig å skjelne etter sentrifugering.
  2. Lipopolysakkarid (LPS) stimulering og kultur
    1. Resuspender celler i 200 ul av fullstendig Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium.
    2. Overfør cellesuspensjonen til en flowcytometri rør.
    3. Gjøre LPS arbeidsløsning ved å blande 10 ul LPS stamoppløsning (1 mg / ml) med 990 ul av fullstendig RPMI 1640 medium.
    4. Tilsett 20 ul 10 ug / ml LPS virke løsning til 200 ul celle-suspensjon.
    5. Kork løst og inkuber prøvene i 4 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
  3. Flowcytometrisystemer Analysis
    1. Åpne datainnsamlingsprogram for flowcytometri. Sett opp oppkjøp mal før prøve oppkjøpet.
    2. Klikk på Dot-Plot verktøy i verktøypaletten. Tegn en forward scatter (FSC) vs side scatter (SSC) plot. Sett FSC og SSC spenning parametere til lineær skala.
    3. Velg de laveste grenseverdiene FSC og SSC tillatt av cytometeret. Påfør terskler 200 og 50 for FSC og SSC, henholdsvis.
    4. Innenfor FSC vs SSC tomt, tegne en gate G1 som inkluderer monocytter, granulocytter og dendrittiske celler, og utelukker rusk, røde blodceller og lymfocytter.
    5. Klikk Histogram verktøy i verktøypaletten. Tegn en FL2 (rød fluorescens kanal) histogram. Bruk en negativ kontrollprøve for å stille grunnlinjen for FL2 signaler og en positiv kontrollprøve for å tegne en gate for å inkludere alle DsRed positive hendelser.
    6. På lufthåndtering kontrollpanel cytometer, setter væsken modus til "RUN" og strømningshastigheten til "HI" (ca. 60 mL / min). Erverve 10.000 hendelser for hver prøve.
    7. Bestem valp fenotype ved å måle prosentandelen av DsRed positive celler fra G1 gate.
  1. Bedøve mus ved intraperitoneal (ip) injeksjon av et anestetikum cocktail inneholdende 100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin, og 1 mg / kg acepromazin. Tilstrekkelig bedøvet mus viser ikke hind labben uttak til tå klype.
  2. Påfør hår-fjerning krem ​​til dorsalflaten på begge ørene av musen. Vent 30 sek til 1 min. Tørk øre overflaten med vann-fuktet bomull og la det lufttørke.
  3. Mål øret tykkelse ved hjelp av mikrometer og erstatte musen i et eget bur. Observer til utvinning fra anestesi (~ 15-30 min). For å løse huden inflammasjon indusert av hårfjernings produkt, lar mus til å hvile i 3 dager før ytterligere eksperimentering utføres.
  4. Forbered 1,25% (w / v) OX ved å oppløse 16,7 mg av OX i 1 ml aceton og blande 750 ul av OX / acetonløsning med 250 ul av olivenolje. Forbered kjøretøyet løsning ved å blande 750 mL aceton med 250 &# 181; l olivenolje.
  5. Re-bedøve mus med ip injeksjon av anestesi cocktail (2,1). Måle øretykkelsen som før.
  6. Påfør 12,5 mL av 1,25% OX på hver side av høyre øre. Anvende 12,5 mL av aceton / olivenolje kjøretøy løsningen på hver side av venstre øre.
  7. Hold muse atskilt fra bur-kameratene til helt frisk for å hindre fornærmelse mot ørene av andre mus, deretter erstatte musen i sin opprinnelige bur og gå tilbake til dyr boliger anlegget.
    MERK: Hårfjerning kan føre til mindre hud inflammasjon etter ved endring av øret tykkelse. Dette mindre betennelse vil bli løst 3 dager senere bekreftet av normal øret tykkelse. Etter lokal applikasjon for 24 timer, OX-behandlede ører viser signifikant (p <0,01) hevelse i forhold kjøretøy løsning alene-behandlede ører.

3. Merking av neutrofiler i pIL1-DsRed Mus

MERK: In vivo merking av nøytrofile ved lav dose fluorescence-konjugert nøytrofil-spesifikt mAb følger en nylig utviklet protokoll 19. Retro-orbital injeksjoner er utført i henhold til en etablert protokoll med noen modifikasjoner 24.

  1. Fremstille anti-Ly6G mAb arbeidsløsning ved å fortynne 10 pl 0,5 mg / ml Alexa Fluor 647-konjugert anti-Ly6G mAb (klon 1A8) i 90 ul fosfatbufret saltvann (PBS).
  2. Overfør 100 ul av anti-Ly6G mAb arbeidsløsning (50 ug / ml) inn i en U-100 insulinsprøyte med 28 gauge nål.
  3. Bedøve en voksen pIL1-DsRed mus med ip-injeksjon av den tidligere beskrevne bedøvelse cocktail (2,1). Plasser bedøvet musen magen ned på en ren arbeids bord.
  4. Bruke milde press på huden dorsal og ventral til en mus øye til delvis stikke øyeeplet ut av stikkontakten.
  5. Plasser forsiktig nålen, bevel ned, i en vinkel på ca 30 ° på den mediale canthus inn i retro-orbitalsinus.
    MERK: Operatøren kan føle press, penetrering og lettet motstand når nålen settes inn i sinus.
  6. Sakte og jevnt injisere 100 mL av anti-Ly6G mAb arbeidsløsning (5 mikrogram mAb / mus / injeksjon) i musen. Fjern nålen raskt. En liten blødning antyder en vellykket injeksjon.
  7. Umiddelbart gjelder 1,25% OX og kjøretøy løsning på høyre og venstre muse ører.
  8. Etter 8 timer, administrere 100 pl nyfremstilt anti-Ly6G mAb arbeidsløsning (5 ug mAb / mus / injeksjon) via retro-orbital injeksjon i den samme mus.
  9. For å visualisere blodårene, umiddelbart før avbildning, administrere 100 ul 30 mg / ml fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert dextran (150 kDa) via retro-orbital injeksjon.

4. intra Imaging av nøytrofile Grunning i pIL- 1-DsRed Mus

  1. Anesthetize mus med ip injeksjon av anestesi cocktail (2,1).0; Påfør veterinær salve på muse øynene for å hindre tørrhet mens under narkose for bildebehandling.
    1. Fremstille 1 ml halv-dose bedøvelse cocktail ved å fortynne 500 mL av opprinnelig bedøvelse cocktail med et like stort volum av PBS.
    2. Overfør halv dose bedøvelse cocktail til 1 ml sprøyte med en sommerfugl 27 gauge nål.
    3. Sett nålen av sommerfugl i musen magen intraperitonealt og fikse vingen sommerfugl til magen ved taping.
  2. Plassere et dekkglass på midten av avbildningstrinnet. Tape kantene av dekkglass for å holde den på plass.
  3. Plassere en dråpe av PBS på den ventrale overflaten av museøre så vel som på dekkglass.
  4. Posisjon bedøvet mus med sitt øre over dekkglass. Montere spissen av øret, med ryggsiden ned, ved sandwiching øret mellom dekkglass og en glassplate, også holdt på plass via båndet.
  5. Slå på en multi-laser fluorescens konfokalmikroskop og alle relaterte equipment. Slå av rommet lys for å redusere ambient lys.
  6. Åpne bildet oppkjøpet programvare. Velg laser kanaler for påvisning av fluorescerende fargestoffer i Dye listemenyen.
  7. Juster fokus på betent øre huden ved observasjon av grønne signaler fra blodkar og røde signaler fra DsRed + celler gjennom okularet.
  8. Utfør en rask skanning med skannehastighet på 2 ms / pixel og oppløsning på 512 × 512 piksler. Velg en pseudocolor for hver kanal i Live View-menyen. Juster fokus knotten for å angi slutt og begynne plassering av skanning.
  9. Utfør langsomme skanner med skannehastighet på 4-8 usekunder / pixel og oppløsning på 800 × 800 eller 1024 × 1024 piksler. Juster høy spenning, få, og utlignet på hver enkelt kanal for å maksimere intensiteten av signaler samtidig unngå metning (røde piksler). Det bør være bare noen få røde piksler i hver kanal.
  10. Lag tredimensjonale bildesett ved å skanne the øre huden begynner overfladisk i stratum corneum og progresjon nedad med x, y, z-volumer av 317 um x 317 um x 30 um (40X objektiv), 635 um x 635 um x 30 um (20X objektiv), eller 1,270 um x 1270 um x 50 um (10X objektiv) 2 um z-trinn.
    MERK: stratum corneum er det ytterste laget av epidermis og kan lett lokaliseres på grunnlag av sin sterke autofluorescence signal.
  11. I time-lapse bildebehandling eksperimenter, rekord tredimensjonale bilder hver 2 eller 4 min i opptil 8 timer.
  12. Midlertidig, som mus begynner å gjenopprette fra anestesi, bemerket basert på observasjon av rykninger kinnskjegg, administrere 5 - 10 mL av halv dose bedøvelse cocktail gjennom butterfly nål.
    MERK: Vær forsiktig med anestesi dose - overdose kan føre musen død. Alternativt kan inhalering anestesi i en krukke påføres på mus for kortsiktig anestesi og ennesekonus kunne brukes for langsiktig avbildning.
  13. Fjern det bedøvet mus fra scenen når bilde er fullført. Ta tape og fjerne butterfly nål fra musen mage. Returner musen til et eget bur i dyre boliger anlegget.
    MERK: For kortsiktige imaging (<1 time), mus fullt igjen fra anestesi raskt i 1-3 timer. For langsiktig imaging (~ 8 timer), mus gjenopprette sakte, med en typisk utvinning periode på 12 - 16 timer. Dermed er oral vann administrasjon anbefales minst flere ganger i løpet av rekonvalesensperioden for å hindre alvorlig dehydrering.
  14. Prosess bildebehandling datasett, spore individuelle celler, genererer trekkveier, og beregne retningen og hastigheten til celle migrasjon ved hjelp av bildeanalyse programvare 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Screening av pIL1-DsRed mus blir utført basert på den fenotypiske DsRed fluorescens-signal som frembringes av sine perifere blodleukocytter ved hjelp av strømningscytometri. LPS-stimulering er kjent for å indusere IL-1β produksjon i myeloide celler, inkludert neutrofiler, monocytter, dendrittiske celler og 26-28. Således er isolerte leukocytter inkubert med LPS i 4 timer før strømningscytometri-analyse. Deretter blir gating innstilt for sirkulering av myeloide celler basert på cellestørrelsen (FSC) og indre kompleksitet (SSC) (figur 1A) 29, og DsRed signal måles i denne gated populasjonen. Sirkulasjons myeloide celler fra WT mus minimal uttrykke DsRed, mens de samme cellene fra pIL1-DsRed mus uttrykke skjelnes DsRed signaler (Figur 1b). De pIL1-DsRed mus identifisert av denne fenotyping metoden er brukt for senere eksperimenter. Det bør bemerkes at den komp fenotyping prosessen tar bare noen fåtimer - mye kortere enn de tradisjonelle genotyping metoder inkludert vev innhøsting, enzymatisk fordøyelse, DNA, PCR og elektroforese.

IL-1β promoter-aktivering har nylig blitt identifisert som en markør for nøytrofile priming 22. Dermed kan den dynamiske prosessen med nøytrofile priming visualiseres og vurderes i levende dyr med pIL1-DsRed mus. Å indusere hudbetennelse, er hudsensibiliserende OX topikalt på høyre øre av pIL1-DsRed mus og kjøretøy alene er brukt på det venstre øret av det samme dyret. Å merke nøytrofile celler i levende dyr, er et nylig utviklet protokoll utført ved å administrere en liten mengde av fluoresceinmerket anti-Ly6G mAb umiddelbart før og 8 timer etter påføring OX. For å finne blodårer, er FITC-dekstran injisert umiddelbart før bildebehandling.

På 24 timer etter OX søknad, enstort antall DsRed + / Ly6G + celler er funnet i den ekstravaskulære rom (figur 2A) og representerer primet nøytrofiler. Et lite antall DsRed / Ly6G + celler er også funnet, noe som mest sannsynlig representerer hviler nøytrofile. Videre er en liten populasjon av DsRed + / Ly6G - celler er observert, som kan omfatte inflammatoriske monocytter og aktiverte makrofager. I en 40 min time-lapse video, Ly6G + nøytrofile vekst innenfor en inflammatorisk hud lesjon utviser typisk amøbe-lignende krypende bevegelse (Supplemental Movie 1). Celletrekkveier spores sammenligne bevegelige atferd av den DsRed + / Ly6G + og DsRed - / Ly6G + nøytrofile populasjoner (figur 2B). Sporplottet analyser viser at både nøytrofile populasjoner vise "tilfeldig" migrasjon når det ekstracellulære rom er inngått (figur 2C). Interessant,DsRed + / Ly6G + nøytrofile utstillings en ​​betydelig høyere hastighet sammenlignet med sine DsRed - / Ly6G + kolleger (figur 2D). Dette tyder på en sammenheng mellom nøytrofile priming og akselerert bevegelighet i inflammatoriske lesjoner.

For å overvåke timingen av nøytrofile priming, en serie av tids-lapse videoer ble spilt starter på forskjellige tider følgende OX behandling (Supplemental Movies 2 - 4). DsRed - / Ly6G + celler, hvile nøytrofile, bli synlig i ekstravaskulær plass så tidlig som 8-12 timer etter OX søknad og deres tall er fortsatt relativt lav etterpå (Figur 2E, supplerende Filmer 3, 4). Tvert imot, det antall DsRed + / Ly6G + celler, de primede neutrofiler, øker progressivt ved senere tidspunkter, som begynner med 14 - 16 timer etter påføring OX. noen DsRed + celler gradvis overta DsRed signaler etter rekruttering til ekstravaskulær plass i denne perioden (figur 2F, Supplemental Movie 5). På 16-20 timer, er et flertall av ekstravaskulære Ly6G + nøytrofile betraktet som "primet" basert på deres DsRed uttrykk. Disse observasjonene viser omfanget, tempo, og plasseringen av nøytrofile grunning skjer på betente kviser i levende dyr.

Figur 1
Figur 1:. Fenotyping av pIL1-DsRed Mus (A) Flowcytometri analyser viser en populasjon av sirkulerende myeloide celler (G1) basert på FSC og SSC parametere. (B) Histogram ved FL2kanalen viser prosentandelen av DsRed + celler i G1 port av cellene fra pIL-DsRed mus (rød) eller fra WT mus (blå). Dataene er representative for least tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Visualisering av bevegelige aktiviteter av DsRed + / Ly6G + Neutrophils i Inflammatoriske hudlesjoner (A) Statisk Konfokalmikroskopi bilder registrert 24 timer etter OX behandling viser tre leukocyttpopulasjonene i ekstravaskulær plass, det vil si, DsRed + / Ly6G + celler. (skjult), DsRed - / Ly6G + celler (trekanter), og DsRed + / Ly6G - celler (piler). Bar = 20 mikrometer. DsRed + / Ly6G + celler (rød) og DsRed - / Ly6G + celler (blå) sammenlignet for migratory baner (B), spor plott (C) og hastighet (D) fra en 40 min time-lapse film spilt inn av konfokalmikroskopi starte 24 timer etter OX søknad (Supplemental Movie 1). (D) Barer indikerer at hastighetsverdiene. *** P <0,001. (E) Antallet DsRed + / Ly6G + celler og DsRed - / Ly6G + celler telles fra en serie av tids-lapse video tatt opp på forskjellige tidspunkter etter OX søknad (Supplemental Movies 2 til 4). Dataene som vises er celletall / mm 2 (gjennomsnitt ± SD) beregnet ut fra tre etterfølgende bilder. (F) Statiske bilder er laget av en time-lapse film spilt inn 11 til 14,5 timer etter OX maleri (Supplemental Movie 5). Pilen viser en Ly6G + celle som kjøper DsRed uttrykk i ekstravaskulær plass i løpet av observasjonsperioden.Bar = 50 mikrometer. Bildene er gjengitt fra referanse 22 med tillatelse (Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc.). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

. Supplemental Movie 1: Motile Opptreden av DsRed + neutrofiler i Inflammatoriske hudlesjoner (på 24 timer etter OX maleri) Konfokalmikroskopi Bildene viser bevegeligheten av DsRed + / Ly6G + celler (rosa) og DsRed - / Ly6G + celler (blå) i ekstravaskulære rom. Blodårene blir sett i grønt. Bar = 20 mikrometer. Videoen er gjengitt fra referanse 22 med tillatelse (Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc.). Vennligst click her for å se denne videoen.

. Supplemental Movie 2: Motile Opptreden av DsRed + neutrofiler i Inflammatoriske hudlesjoner (ved 4 timer etter OX maleri) Konfokalmikroskopi bildene viser DsRed + / Ly6G + celler (rosa) og DsRed - / Ly6G + celler (blå) i ekstravaskulær plass . Blodårene blir sett i grønt. Autofluorescence er til stede, og i forbindelse med hårsekker. Bar = 100 mikrometer. Videoen er gjengitt fra referanse 22 med tillatelse (Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc.). Klikk her for å se denne videoen.

Supplemental Movie 3: Motile Opptreden av DsRed + neutrofiler i Inf. lammatory hudlesjoner (8 timer etter OX maleri) Konfokalmikroskopi bildene viser DsRed + / Ly6G + celler (rosa) og DsRed - / Ly6G + celler (blå) i ekstravaskulær plass. Blodårene blir sett i grønt. Autofluorescence er til stede, og i forbindelse med hårsekker. Bar = 100 mikrometer. Videoen er gjengitt fra referanse 22 med tillatelse (Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc.). Klikk her for å se denne videoen.

Supplemental Movie 4: Motile Opptreden av DsRed + neutrofiler i Inflammatoriske hudlesjoner (på 11-19 timer etter OX maleri) Konfokalmikroskopi bildene viser DsRed + / Ly6G + celler (rosa) og DsRed - / Ly6G + celler (blå) i. extravascular plass. Blodårene blir sett i grønt. Autofluorescence er til stede, og i forbindelse med hårsekker. Bar = 100 mikrometer. Videoen er gjengitt fra referanse 22 med tillatelse (Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc.). Klikk her for å se denne videoen.

Supplemental Movie 5: Kjøp av DsRed Signaler ved Ly6G + nøytrofile granulocytter fra time-lapse film vist i supplerende Video 4, viser høyere forstørrelse video prosessen der en Ly6G + celle (markert med en pil) kjøper DsRed uttrykk i ekstravaskulær. plass i løpet av observasjonsperioden (11 til 14,5 timer etter OX maleri). Bar = 50 mikrometer. Videoen er gjengitt fra referanse 22 med tillatelse (Copyright 2015. The American Association of Immunologists, Inc.). Klikk her for å se denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med denne studien er å utvikle en teknologi for å overvåke prosessen med nøytrofile priming i levende dyr, som ennå ikke har blitt oppfylt av de tilgjengelige teknikker. For å oppnå dette målet, blir tre etablerte metoder utført: 1) induksjon av betennelse i huden i IL-1 p-promotordrevet DsRed rapportør mus som et mål for priming, 2) in vivo merking av neutrofiler med lave doser av fluorescens-konjugert anti-Ly6G mAb, og 3) intravital konfokal mikroskopi avbildning. Kombinasjonen av disse tre metodene gir visualisering av bevegelige aktiviteter primet nøytrofile (DsRed + / Ly6G +) ved betennelses hudlesjoner. Migrasjonen retning og hastighet på det grunnede nøytrofile er videre kvantifisert via vandrende banen sporing. Ved å ta opp en serie av tidsintervall videoer, er sanntidskinetikk primet nøytrofile veksten målt ved inflammatorisk stedet og erverv av DsRed uttrykk av iindivid nøytrofile er også observert i ekstravaskulære rom. Dermed har dynamisk prosess av nøytrofile priming blitt visualisert i levende dyr for første gang ved hjelp av teknologien som presenteres her.

Denne teknologien er ansatt i flere kritiske trinn. Først hudvevet er de mest praktiske kroppsdeler for intra bildebehandling. Lokal applikasjon av OX på musen øret tillater direkte visualisering av immuncelle atferd i betent huden under konfokalmikroskopi. For det andre må musen være bedøvet konstant under avbildning som nødvendig gjentatte injeksjoner med bedøvelse. Imidlertid kan over-sedasjon føre musa dør under bildebehandling. For å unngå overdose, er lave doser av bedøvelse (en halv eller en tredjedel av full dose) anbefales for langsiktig bildebehandling. For det tredje, fluorescens-konjugert nøytrofil-spesifikt mAb må injiseres intermitterende på grunn av den korte levetid av murine neutrofiler (halveringstid på 8-10 timer 30). Sist, fokus drIFT er et stort problem i løpet av time-lapse imaging, noe som kan være forårsaket av flere faktorer, inkludert temperaturvariasjoner, mus kroppsbevegelse, øret hevelse over tid, og vibrasjoner som følge av drift av apparatet 31. Flere metoder har blitt utviklet for å forhindre avdrift, for eksempel administrasjon av en konstant dose av sedasjon under avbildning, å feste museøre på plass ved å lime en glassplate over det på scenen, å installere et miljøkammer for å tilveiebringe oksygen og varme til den sederte organismen så vel som ved manuelt å re-fokusering rammen når det er nødvendig 32,33.

Det er like viktig å oppgi begrensningene i denne protokollen. Først en langsom mus bedring - er (12 16 timer) etter en bildeperiode 8 timer i lengde observert på grunn av kontinuerlig sedasjon, noe som indikerer at denne protokollen ikke kan være egnet for slike langvarige eksperimenter. En alternativ tilnærming er å bruke flere mus i rekkefølge over bildeperioden i stedet for usynge eneste. For det andre er en gradvis lekkasje av sirkulerende FITC-dekstran observert under avbildning over tid, noe som sannsynligvis forårsaket av øket permeabilitet av hud blodkar i den inflammatoriske tilstand 34. Således er synliggjøring av blodkar markert svekket gitt redusert fluorescens i omløp ved senere stadier av bildebehandling. Alternativt kan man anvende fluorescently konjugerte lektiner som isolectin B4 å merke blodkar som disse holder seg til vaskulære endotelceller 35.

I tillegg til visualiseringen av prosessen med nøytrofile priming i inflammatoriske lesjoner i huden, kan teknologien som er beskrevet her også anvendes i mange andre eksperimentelle innstillinger. I kombinasjon med nyutviklede bilde vinduer, kan intramikros opptegning av atferd av primet nøytrofile bli vurdert i dype vev og organer, inkludert hjernen, melkekjertler, lunger, og abdominal organer 36-39. Videre visualisering av priming / aktivering av andre celletyper slik som monocytter og makrofager kan oppnås ved anvendelse av pIL1-DsRed mus sammen med in vivo merking via fluorescens-konjugert mAb spesifikk for celletype av interesse. Tatt sammen, ikke bare denne teknologien gir en grunnleggende rammeverk for intra avbildning av grunning prosessen av nøytrofile i levende dyr, men det avslører også nye tilnærminger for å studere atferd og funksjonen til andre immunceller i ulike betennelsestilstander som utfolder seg i ulike vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin sodium APP Pharmaceuticals NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer Lonza 10-548E
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F0926
Lipopolysaccharides Sigma-Aldrich L4391
Ketamine hydrochloride Hospira NDC 0409-2051-05
Xylazine LLOYD Laboratory NADA #139-236
Acepromazine Boehringer Ingelheim ANADA 200-361
Hair-removal cream Church & Dwight
Acetone Fisher Scientific A16P4
Oxazolone Sigma-Aldrich E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody BioLegend 127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle BD 329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa Sigma-Aldrich 74817
Butterfly infusion set (27 G needle) BD 387312
FACSCalibur cytometer BD
CellQuest Pro software BD
Confocal microscope Olympus FV1000
Metamorph Software Universal Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
  3. Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
  4. El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
  5. Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
  6. Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
  7. Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
  8. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  9. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  10. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  11. Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
  12. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  13. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
  14. Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
  15. Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
  16. Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
  17. Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
  18. Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
  19. Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
  20. Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
  21. Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
  22. Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
  23. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  24. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  25. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  26. Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
  27. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
  28. Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
  29. Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
  30. Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
  31. Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
  32. Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
  33. Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
  34. Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
  35. Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
  36. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  37. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  38. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
  39. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).

Tags

Immunologi immunologi intramikroskopi nøytrofile grunning, mus hudbetennelse konfokal mikroskopi motilitet
Intra Imaging av nøytrofile Grunning Bruke IL-1B Arrangøren drevet DsRed Reporter Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yao, Y., Liu, Y., Takashima, A.… More

Yao, Y., Liu, Y., Takashima, A. Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice. J. Vis. Exp. (112), e54070, doi:10.3791/54070 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter