Abstract
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine humaine et sont rapidement recrutés pour des sites inflammatoires. Amorçage est un événement critique qui améliore la fonctionnalité phagocytaire des neutrophiles. Bien que des études approfondies ont dévoilé l'existence et l' importance de neutrophiles amorçage lors de l' infection et des blessures, des moyens de visualisation de ce processus in vivo ont été indisponibles. Le protocole fourni permet de surveiller le processus dynamique de neutrophiles amorçage chez les animaux vivant en combinant trois méthodes: 1) Signal rapporteur DsRed - utilisé comme une mesure d'amorçage 2) in vivo étiquetage des neutrophiles - réalisé par injection de l' antigène anti-lymphocyte fluorescence conjugué 6G (Ly6G) anticorps monoclonal (mAb) et 3) l'imagerie confocale intravitale. Plusieurs étapes critiques sont impliqués dans ce protocole: la souris inflammation induite par l'oxazolone-cutanée de l'oreille, la sédation appropriée des animaux, des injections répétées de mAb anti-Ly6G et prevention de la dérive de mise au point lors de l'imagerie. Bien que quelques limitations ont été observées, telles que la limite de temps d'imagerie continue (~ 8 h) chez une souris et la fuite de l'isothiocyanate de fluorescéine-dextran de vaisseaux sanguins dans l'état inflammatoire, ce protocole fournit un cadre fondamental pour l'imagerie intravitale de le comportement apprêté neutrophile et la fonction, qui peut être facilement étendu à l'examen d'autres cellules immunitaires dans les modèles d'inflammation de la souris.
Introduction
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants et de courte durée en circulation. Ils sont rapidement recrutés pour les sites d'infection ou d'une blessure, où ils servent phagocytes comme professionnels par la libération d'oxygène et d' azote intermédiaires réactifs ainsi que des granulés contenant des peptides et des protéases 1 antimicrobiens. Au cours de leur recrutement, les neutrophiles sont "apprêtées" par divers agents , y compris les produits microbiens, chemoattractants et cytokines inflammatoires, entraînant nettement amélioré la fonctionnalité phagocytaire arrivée à un site d'inflammation 2. Les mécanismes d'amorçage de neutrophiles ont été étudiés in vitro 3,4; Toutefois, le suivi dynamique du processus in vivo n'a pas été possible à ce jour.
Récemment, l'imagerie intravitale est devenue une technique importante pour la visualisation et la quantification de la dynamique cellulaire des processus biologiques dans les organismes vivants. Intraviimagerie tal peut être réalisée par excitation au microscope un photon classique (par exemple, confocale) ou des approches microscopie multiphotonique 5. Au fil du temps, des améliorations substantielles ont été réalisées dans cette technique permettant une meilleure résolution d'image, l' amélioration de la profondeur d'imagerie, une diminution de photovieillissement de tissu, et le renforcement de 6,7 de stabilisation d'image. Compte tenu de sa capacité unique de permettre une visualisation dynamique de la migration cellulaire et l' interaction au fil du temps, la microscopie intravitale a été largement appliquée à divers domaines d'études en immunologie 8. imagerie intravitale permet immunologistes de mieux comprendre et contextualiser les réponses immunitaires à la fois au niveau cellulaire et moléculaire dans la vie des modèles animaux.
Des progrès récents dans transgéniques ainsi que des souris knock-in rapporteuses ont fourni des outils utiles pour la surveillance des comportements dynamiques des neutrophiles chez les animaux vivants. Lysozyme M promoteur-driven améliorée protéine fluorescente verte knock-inles souris ont été largement utilisés pour caractériser la motilité des neutrophiles, des monocytes et des macrophages au cours de divers processus inflammatoires comprenant une extravasation, une infection bactérienne, une inflammation stérile et 9-15. En outre, des souris transgéniques exprimant une résonance de fluorescence cytoplasmique de transfert d'énergie biocapteur ont été utilisés dans l' étude de l'activité des neutrophiles mitogene kinase extracellulaire régulée et la protéine kinase A l' intérieur de l' intestin enflammées 16. Un modèle de souris avec une spécificité élevée pour l' expression de la fluorescence dans des neutrophiles est la souris knock-in Catchup, qui produit la recombinase Cre, ainsi que la tdTomato protéine fluorescente, qui est lui - même couplé à l' expression de l' antigène des lymphocytes 6G (Ly6G) 17. Visualisation des neutrophiles Ly6G déficientes par ce modèle a montré que ces cellules exercent une fonctionnalité normale dans une variété de contextes in vivo inflammatoires stériles ou infectieuses. Des souris transgéniques exprimant la DsRed fluorescente protein gène sous le contrôle de la souris interleuikin-1β (IL-1β), le promoteur (pIL1-DsRed) ont été utilisés pour visualiser les comportements motiles de cellules produisant de l'IL-1 ß - censé inclure les neutrophiles, les monocytes inflammatoires et des macrophages activés - émergents dans la peau enflammée 18.
In vivo l' étiquetage peut servir comme une approche alternative pour tracer les comportements cellulaires et moléculaires de neutrophiles dans les tissus enflammés. Après injection intraveineuse de faibles doses de fluorescence anticorps anti Gr-1-anticorps monoclonal (mAb), la cascade de recrutement de Gr-1 + neutrophiles a été visualisées dans des lésions de la peau de souris infectées par Staphylococcus aureus 19. L' administration in vivo des conjugués contenant de la streptavidine conjugués 705 points quantiques nm et biotinylé anti-Ly6G mAb étiqueter spécifiquement neutrophiles circulants 20. En outre, l'endocytose de ces conjugués dans neutrophvésicules IL permet le suivi du transport vésiculaire à grande vitesse dans les neutrophiles qui migrent dans le tissu interstitiel. In vivo , le marquage avec des anticorps fluorescents conjugués contre la P-sélectine glycoprotéine ligand-1 (PSGL-1), L-sélectine (CD62L), l' intégrine aM (CD11b ) et chimiokines (CXC motif) récepteur 2 (CXCR2) dans un modèle inflammatoire induite par le TNFa a élucidé les mécanismes de régulation en jeu lors de l' inflammation précoce 21. polarisants neutrophiles font saillie uropodes PSGL-1-enrichi à interagir avec CD62L présent sur les plaquettes activées, ce qui entraîne une redistribution des CD11b et CXCR2, des récepteurs qui stimulent la migration des neutrophiles et déclenchent l'inflammation.
IL-1β est l' un des gènes de signature qui est élevée dans les 22 neutrophiles amorcées. Chez les souris rapporteurs pIL1-DsRed, des signaux de fluorescence DsRed (ie., L' activation du promoteur IL-1β) une corrélation positive avec l' IL-1β expression de l' ARNm et de la production de la protéine IL-1β. <sup> 18 Pour surveiller le processus de neutrophiles amorçage, une méthode de microscopie intravitale a été développé impliquant l' induction de l' inflammation de la peau avec oxazolone (OX) dans le modèle de la souris pIL1-DsRed après marquage in vivo des neutrophiles avec fluorescence conjugué anti-Ly6G mAb. À travers ce modèle, il est possible d'étudier le comportement et la fonction des neutrophiles amorcées dans des modèles animaux de diverses maladies et affections.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux sont effectuées en conformité avec les instituts nationaux de directives de santé et approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Toledo.
1. phénotypage de pIL1-DsRed Souris
NOTE: Offspring sont générés par l'élevage des souris pIL1-DsRed hétérozygotes souris de type sauvage (WT) C57BL6. Trois à quatre semaines vieux chiots sont considérés comme prêts pour le phénotypage. Saignements Submandibulaire de souris suit un protocole établi avec des modifications mineures 23.
- Isolement des globules blancs du sang total de Pups souris
- Ajouter 20 ul d'héparine à chaque tube de 1,5 ml.
- Acquérir un chiot de la cage. Enregistrez l'étiquette d'identification du chiot. Il est pas nécessaire pour anesthésier les chiots avant le prélèvement de sang dans la veine sous-maxillaire.
- Tenez chiot par le cou scruff et percer la veine submandibulaire dans ee abajoue en utilisant un 5 mm lancette. Appliquer une force adéquate pour créer une petite perforation, de sorte que des gouttes de sang exsudent du point de pénétration. Utilisez une nouvelle aiguille pour chaque chiot.
- Collecter 3 - 5 gouttes de sang par chiot dans un tube à centrifuger contenant de l'héparine. Nettoyer le site de ponction et appliquer une pression pour faciliter l'hémostase.
- Mettez chiot dans une nouvelle cage et observer pendant 30 minutes avant de retourner la cage à l'animalerie.
- Recueillir le sang des souris adultes d'un phénotype connu en tant que témoins positifs et négatifs.
- Ajouter 500 pi de tampon de lyse des globules rouges dans chaque tube, les tubes à vortex et laisser incuber pendant 5 à 10 min sur la glace.
- ajouter lentement 400 - 500 ul de sérum de fœtus bovin (FBS), sous les suspensions de cellules dans chaque tube. Une interface claire peut être observée entre la suspension de cellules de couche supérieure et la couche inférieure de FBS.
- tubes Cap et des échantillons de centrifugation à 1500 × g pendant 5 min.
- Répétez les étapes 1.1.7 - 1.1.9 à la fourrureTher éliminer les globules rouges. Ne pas répéter si la lyse est suffisante pour la première fois. Le culot doit être difficile de discerner après centrifugation.
- Lipopolysaccharide (LPS) Stimulation et Culture
- Resuspendre les cellules dans 200 pi de complète Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen.
- Transférer la suspension cellulaire à un tube de cytométrie en flux.
- Faire LPS solution de travail en mélangeant 10 pl de LPS solution mère (1 mg / ml) avec 990 ul de milieu RPMI 1640 complet.
- Ajouter 20 pi de 10 pg / ml de LPS solution de travail à 200 ul de suspension cellulaire.
- Des tubes à bouchon lâche et incuber les échantillons pendant 4 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Analyse par cytométrie en flux
- Ouvrez le programme d'acquisition de données pour la cytométrie de flux. Mettre en place modèle d'acquisition avant d'échantillonner acquisition.
- Cliquez sur l'outil Dot-Plot dans la palette d'outils. Tracez une foscatter rward (FSC) vs diffusion latérale (SSC) parcelle. Définissez les paramètres tension FSC et SSC à échelle linéaire.
- Sélectionnez les seuils les plus bas du FSC et SSC autorisés par le cytomètre. Appliquer les seuils de 200 et 50 pour le FSC et SSC, respectivement.
- Dans le FSC vs SSC terrain, dessiner une grille G1 qui comprend les monocytes, les granulocytes et les cellules dendritiques, et exclut les débris, les cellules et les lymphocytes du sang rouge.
- Cliquez sur l'outil Histogramme dans la palette d'outils. Dessinez un FL2 (canal de fluorescence rouge) histogramme. Utilisez un échantillon de contrôle négatif pour définir la ligne de base des signaux FL2 et un échantillon de contrôle positif pour dessiner une porte d'inclure tous les événements positifs DsRed.
- Sur le panneau de commande fluidiques du cytomètre, régler le mode fluide à "RUN" et le débit à "HI" (environ 60 pi / min). Acquérir 10.000 événements pour chaque échantillon.
- Déterminer le phénotype chiot en mesurant le pourcentage de cellules positives DsRed de la grille G1.
- Anesthetize souris par voie intrapéritonéale (ip) injection d'un cocktail anesthésique contenant 100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine, et 1 mg / kg d'acépromazine. souris anesthésiés de façon adéquate ne montrent pas la patte arrière retrait pincement de l'orteil.
- Appliquer la crème d'épilation à la surface dorsale des deux oreilles de la souris. Attendre 30 secondes à 1 minute. Essuyez la surface de l'oreille avec du coton mouillé à l'eau et laisser sécher à l'air.
- Mesurer l'épaisseur de l'oreille en utilisant un micromètre et remplacer la souris dans une cage séparée. Observer jusqu'à la récupération de l'anesthésie (~ 15-30 min). Pour résoudre l'inflammation cutanée induite par le produit d'épilation, laisser la souris se reposer pendant 3 jours avant l'expérimentation plus poussée est effectuée.
- Préparer 1,25% (p / v) OX en dissolvant 16,7 mg de OX dans 1 ml d'acétone et on mélange 750 ul d'une solution / acétone OX avec 250 ul d'huile d'olive. Préparer la solution de véhicule en mélangeant 750 ul d'acétone avec 250 &# 181; l d'huile d'olive.
- Re-anesthésier la souris par injection ip de cocktail anesthésique (2.1). Mesurer l'épaisseur de l'oreille comme avant.
- Appliquer 12,5 pi de 1,25% OX sur chaque côté de l'oreille droite. Appliquer 12,5 pi de véhicule d'huile solution acétone / olive sur chaque côté de l'oreille gauche.
- Gardez la souris séparée de la cage camarades jusqu'à guérison complète pour empêcher l'insulte à ses oreilles par d'autres souris, puis remplacer la souris dans sa cage d'origine et retourner au centre d'hébergement des animaux.
NOTE: L'épilation peut entraîner une inflammation mineure de la peau suite par le changement de l'épaisseur de l'oreille. Cette inflammation mineure sera résolu 3 jours plus tard confirmé par l'épaisseur de l'oreille normale. Après application topique pendant 24 heures, les oreilles OX traités montrent significative (p <0,01) gonflement solution du véhicule par rapport oreilles seuls traités.
3. Étiquetage des neutrophiles dans pIL1-DsRed Souris
REMARQUE: marquage in vivo des neutrophiles par une faible dose de fluorescence-conjugué spécifique neutrophiles mAb suit un protocole récemment mis au point 19. Les injections rétro-orbitaire sont réalisées selon un protocole établi avec quelques modifications 24.
- Préparer l'anti-Ly6G solution de travail en diluant mAb 10 pi de 0,5 mg / ml d'Alexa Fluor 647 conjugué anticorps monoclonal anti Ly6G (clone 1A8) dans 90 ul de tampon phosphate salin (PBS).
- Transférer 100 ul de solution de travail anti-Ly6G mAb (50 pg / ml) dans une seringue d'insuline U-100 avec une aiguille de calibre 28.
- Anesthetize un adulte pIL1-DsRed souris par injection ip du cocktail anesthésiant décrit précédemment (2.1). Placez l'abdomen de la souris anesthésiée sur une planche de travail propre.
- Appliquer une pression vers le bas douce à la partie dorsale de la peau et ventrale à un oeil de la souris pour faire saillie partiellement le globe oculaire de la prise.
- Placez délicatement l'aiguille, biseau vers le bas, à un angle d'environ 30 ° au niveau du canthus médial dans le rétro-orbitalsinus.
NOTE: L'opérateur peut sentir la pression, la pénétration et la résistance soulagée une fois que les inserts des aiguilles dans le sinus. - Lentement et doucement injecter 100 pi d'anti-Ly6G mAb solution (5 ug mAb / souris / injection) dans la souris de travail. Retirer rapidement l'aiguille. Une petite quantité de sang suggère une injection réussie.
- Appliquer immédiatement 1,25% OX et une solution de véhicule sur le droit et les oreilles gauche de la souris.
- Au bout de 8 h, administrer 100 ul d'anticorps anti-Ly6G solution fraîchement préparée de mAb de travail (5 pg de mAb / souris / injection) par injection rétro-orbital dans la même souris.
- Pour visualiser les vaisseaux sanguins, immédiatement avant l'imagerie, administrer 100 ul de 30 mg / ml d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dextran (150 kDa) par injection de rétro-orbital.
4. Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage dans PIL-1-DsRed Souris
- Anesthetize souris avec injection ip de cocktail anesthésique (2.1).0; Appliquer une pommade vétérinaire aux yeux de souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie pour l'imagerie.
- Préparer 1 ml d'une demi-dose du cocktail anesthésiant en diluant 500 pi d'un cocktail anesthésiant original avec un volume égal de PBS.
- Transfert demi-dose de cocktail anesthésique à 1 ml seringue avec une aiguille de calibre 27 papillon.
- Insérez l'aiguille de papillon dans l'abdomen de la souris par voie intrapéritonéale et fixer l'aile de papillon à l'abdomen en collant.
- Placer une lamelle couvre-objet en verre au centre de la scène d'image. Collez les bords de la lamelle pour le maintenir en place.
- Placer une goutte de PBS sur la surface ventrale de l'oreille de souris, ainsi que sur la lamelle.
- Position anesthésié la souris avec son oreille sur la lamelle. Monter la pointe de l'oreille, face dorsale vers le bas, en prenant en sandwich l'oreille entre la lamelle et une lame de verre, également maintenu en place par du ruban adhésif.
- Tourner sur un multi-laser fluorescence microscope confocal et tous les e connexesquipment. Éteignez les lumières des chambres pour minimiser l'exposition de la lumière ambiante.
- Ouvrez le logiciel d'acquisition d'image. Sélectionnez les canaux laser pour la détection de colorants fluorescents dans le menu Liste Dye.
- Réglez la mise au point sur la peau de l' oreille enflammée par l' observation des signaux verts des vaisseaux sanguins et des signaux rouges des DsRed + cellules à travers l' oculaire.
- Effectuez un balayage rapide avec une vitesse de balayage de 2 ms / pixel et résolution de 512 × 512 pixels. Sélectionnez un pseudocolor pour chaque canal dans le menu Live View. Réglez le bouton de mise au point pour définir la fin et commencer à l'emplacement de la numérisation.
- Effectuer des analyses lentes avec une vitesse de balayage de 4-8 microsecondes / pixel et résolution de 800 × 800 ou 1.024 × 1.024 pixels. Régler la haute tension, le gain et le décalage sur chaque canal individuel afin de maximiser l'intensité des signaux tout en évitant la saturation (pixels rouges). Il devrait y avoir seulement quelques pixels rouges dans chaque canal.
- Créer des séries d'images en trois dimensions par balayage ee oreille peau commençant superficiellement dans la couche cornée et en progressant vers le bas avec x, y, z des volumes de 317 um x 317 um x 30 um (objectif 40X), 635 pm x 635 pm x 30 pm (objectif 20X), soit 1,270 um x 1270 um x 50 um (objectif 10X) à 2 pm z-étapes.
NOTE: Le stratum corneum est la couche la plus externe de l'épiderme et peut être facilement localisé en fonction de son signal d'autofluorescence forte. - Dans des expériences d'imagerie time-lapse, d'enregistrer des images en trois dimensions toutes les 2 ou 4 min pour un maximum de 8 heures.
- Par intermittence, comme la souris commence à se remettre de l'anesthésie, a noté basée sur l'observation des moustaches de secousses, administrer 5 - 10 pi de l'anesthésie demi-dose cocktail à travers l'aiguille de papillon.
NOTE: Soyez prudent de la dose d'anesthésie - surdosage peut entraîner la mort de la souris. Alternativement, l'anesthésie par inhalation dans un bocal pourrait être appliqué à la souris pour l'anesthésie de courte durée et uncône de nez pourrait être utilisé pour l'imagerie à long terme. - Retirez la souris anesthésiée de la scène lorsque l'imagerie est terminée. Détachez bande et retirer l'aiguille de papillon de l'abdomen de la souris. Retour de la souris dans une cage séparée dans l'installation de logement des animaux.
NOTE: Pour l'imagerie à court terme (<1 h), les souris récupérer pleinement de l'anesthésie rapidement 1-3 h. Pour l'imagerie à long terme (~ 8 h), les souris récupèrent lentement, avec une période de récupération typique de 12-16 h. Ainsi, l'administration de l'eau par voie orale est recommandée au moins plusieurs fois au cours de la période de récupération pour prévenir la déshydratation sévère. - Processus ensembles de données d'imagerie, le suivi des cellules individuelles, génèrent des voies de migration, et de calculer la directivité et la vitesse de migration des cellules en utilisant l' image logiciel d'analyse 25.
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Representative Results
Criblage des souris pIL1-DsRed est effectuée sur la base du signal de fluorescence de DsRed phénotypiques produite par les leucocytes du sang périphérique en utilisant la cytométrie de flux. Stimulation par le LPS est connu pour induire la production d' IL-1β dans les cellules myéloïdes , y compris les neutrophiles, les monocytes et les cellules dendritiques 26-28. Ainsi, les leucocytes isolés sont incubés avec LPS pendant 4 heures avant de cytométrie en flux analyse. Ensuite, gating est réglé pour la circulation des cellules myéloïdes basées sur la taille des cellules (FSC) et de la complexité interne (SSC) (figure 1A) 29, et le signal DsRed est mesuré dans cette population fermée. Circulantes cellules myéloïdes de souris WT expriment minimalement DsRed, alors que les mêmes cellules de souris pIL1-DsRed expriment des signaux distinguables DsRed (figure 1B). Les souris pIL1-DsRed identifiés par cette méthode de phénotypage sont utilisées pour les expériences ultérieures. Il convient de noter que le processus de phénotypage complet ne prend que quelquesheures - beaucoup plus courtes que les méthodes de génotypage traditionnelles, y compris la récolte des tissus, la digestion enzymatique, l'isolement de l'ADN, la PCR et l'électrophorèse.
L' activation du promoteur IL-1β a été récemment identifié comme un marqueur de 22 neutrophile amorçage. Ainsi, le processus dynamique de neutrophiles amorçage peut être visualisée et évaluée chez les animaux vivants en utilisant des souris pIL1-DsRed. Pour induire une inflammation de la peau, l'OX sensibilisateur de la peau est appliquée par voie topique sur l'oreille droite de souris pIL1-DsRed et le véhicule seul est appliqué sur l'oreille gauche du même animal. Pour marquer des neutrophiles chez des animaux vivants, un protocole récemment mis au point est effectuée en administrant une petite quantité d'marqué par fluorescence anti Ly6G mAb immédiatement avant et 8 heures après l'application OX. Pour localiser les vaisseaux sanguins, le FITC-dextran est injectée immédiatement avant l'imagerie.
À 24 h après l'application de OX, ungrand nombre de DsRed + / Ly6G + cellules se trouvent dans l'espace extravasculaire (figure 2A) et représentent neutrophiles apprêtée. Un petit nombre de DsRed / Ly6G + cellules sont également présents, qui représentent le plus probable neutrophiles au repos. En outre, une petite population de DsRed + / Ly6G - cellules sont observées, qui peuvent comprendre des monocytes inflammatoires et les macrophages activés. Dans un 40 min vidéo time-lapse, Ly6G + neutrophiles émergents au sein d' une lésion inflammatoire de la peau présentent un mouvement d'exploration de amibe typique (Film supplémentaire 1). Cellulaires voies migratoires sont suivies pour comparer les comportements motiles de la DsRed + / Ly6G + et DsRed - populations / Ly6G + neutrophiles (figure 2B). L'intrigue de la piste analyses révèlent que présentent les deux populations neutrophiles migration "aléatoire" une fois l'espace extracellulaire a été saisi (figure 2C). Fait intéressant,DsRed + / Ly6G + neutrophiles présentent une vitesse nettement plus élevée par rapport à leurs DsRed - / Ly6G + homologues (Figure 2D). Ceci suggère une association entre neutrophiles amorçage et la motilité accélérée dans les lésions inflammatoires.
Pour surveiller le calendrier des neutrophiles amorçage, une série de vidéos en accéléré ont été enregistrées à partir de différents moments après le traitement de OX (Films supplémentaires 2 - 4). DsRed - / Ly6G + cellules, les neutrophiles de repos, devient détectable dans l'espace extravasculaire dès le 8 - 12 heures après l' application de OX et leur nombre reste relativement faible par la suite (Figure 2F, Films supplémentaires 3, 4). Au contraire, le nombre de cellules DsRed + / Ly6G +, les neutrophiles apprêtées, augmenter progressivement à des points de temps plus tard, à partir de 14 - 16 h après l' application de OX. Certains DsRed
Figure 1:. Phénotypage des souris pIL1-DsRed (A) Cytométrie en flux Les analyses montrent une population de cellules circulantes myéloïdes (G1) sur la base des paramètres FSC et SSC. (B) histogrammes sur le canal FL2 montrent le pourcentage de DsRed cellules + au sein G1 porte des cellules de souris Pil-DsRed (rouge) ou de souris WT (bleu). Les données sont représentatives d'au least trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Visualisation des Motile Activités de DsRed + / Ly6G + neutrophiles dans les lésions cutanées inflammatoires (A) confocale statique des images de microscopie enregistrées 24 heures après le traitement OX montrent trois populations leucocytaires dans l'espace extravasculaire, à savoir, les cellules DsRed + / Ly6G +. (astérisques), DsRed - / Ly6G + cellules (triangles), et DsRed + / Ly6G - cellules (flèches). Bar = 20 pm. DsRed + / Ly6G + cellules (rouge) et DsRed - / Ly6G + cellules (bleu) sont comparés pour migratochemins de ry (B), des parcelles de piste (C) et la vitesse (D) à partir d' un film de temps lapse 40 min enregistrée par microscopie confocale à partir de 24 heures après l' application de OX (Movie supplémentaire 1). (D) Les barres indiquent les valeurs moyennes de vitesse. *** P <0,001. (E) Les numéros de DsRed + / Ly6G + cellules et DsRed - / Ly6G + cellules sont comptées à partir d' une série de films de time-lapse enregistrées à différents points de temps après l' application de OX (Films supplémentaires 2 à 4). Les données présentées sont les nombres de cellules / mm 2 (moyen ± SD) , calculée à partir de trois images consécutives. (F) Les images statiques sont créés à partir d' un film accéléré enregistré 11 à 14,5 heures après la peinture de OX (Film supplémentaire 5). La flèche indique une cellule Ly6G + qui acquiert l' expression de DsRed dans l'espace extravasculaire au cours de la période d'observation.Bar = 50 pm. Les images sont reproduites de la référence 22 avec la permission (droit d' auteur 2015. L'Association américaine des immunologistes, Inc.). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Film supplémentaire 1: Motile Comportement de DsRed + neutrophiles dans les lésions cutanées inflammatoires (à 24 h après la peinture OX) images de microscopie confocale montrent la motilité des DsRed + / Ly6G + cellules (rose) et DsRed - / Ly6G + cellules (bleu) dans l'espace extravasculaire. Les vaisseaux sanguins sont vus dans le vert. Bar = 20 pm. La vidéo est reproduit de la référence 22 avec la permission (droit d' auteur 2015. L'Association américaine des immunologistes, Inc.). S'il vous plaît clbeurk ici pour voir cette vidéo.
. Film supplémentaire 2: Motile Comportement de DsRed + neutrophiles dans les lésions cutanées inflammatoires (à 4 heures après la peinture OX) images de microscopie confocale montrent DsRed + / Ly6G + cellules (rose) et DsRed - cellules / Ly6G + (bleu) dans l'espace extravasculaire . Les vaisseaux sanguins sont vus dans le vert. Autofluorescence est présent et associé à des follicules pileux. Bar = 100 um. La vidéo est reproduit de la référence 22 avec la permission (droit d' auteur 2015. L'Association américaine des immunologistes, Inc.). S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo.
Film supplémentaire 3: Motile Comportement de DsRed + neutrophiles dans Inf. Lésions cutanées lammatory (à 8 h après la peinture OX) images de microscopie confocale montrent DsRed + / Ly6G + cellules (rose) et DsRed - / Ly6G + cellules (bleu) dans l'espace extravasculaire. Les vaisseaux sanguins sont vus dans le vert. Autofluorescence est présent et associé à des follicules pileux. Bar = 100 um. La vidéo est reproduit de la référence 22 avec la permission (droit d' auteur 2015. L'Association américaine des immunologistes, Inc.). S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo.
Film supplémentaire 4: Motile Comportement de DsRed + neutrophiles dans les lésions cutanées inflammatoires (à 11-19 heures après la peinture OX) images de microscopie confocale montrent DsRed + / Ly6G + cellules (rose) et DsRed - / Ly6G + cellules (bleu) dans le. Extravaespace scular. Les vaisseaux sanguins sont vus dans le vert. Autofluorescence est présent et associé à des follicules pileux. Bar = 100 um. La vidéo est reproduit de la référence 22 avec la permission (droit d' auteur 2015. L'Association américaine des immunologistes, Inc.). S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo.
Film supplémentaire 5: Acquisition de signaux DsRed par Ly6G + neutrophiles Tiré du film time-lapse montré dans supplémentaire Vidéo 4, cette vidéo de plus fort grossissement montre le processus dans lequel une cellule Ly6G + (indiqué par une flèche) acquiert expression DsRed dans le extravasculaire. l'espace au cours de la période d'observation (11 à 14,5 h après la peinture de OX). Bar = 50 pm. La vidéo est reproduit de la référence 22 avec la permission (droit d'auteur 2015. L'Association américaine de Immunologists, Inc.). S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
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Discussion
Le but de cette étude est de développer une technologie pour surveiller le processus de neutrophiles amorçage chez les animaux vivants, qui n'a pas encore été remplies par les techniques actuellement disponibles. Pour atteindre cet objectif, trois méthodes établies sont exécutées: 1) l' induction d' une inflammation cutanée chez des souris IL-1 ß reporter DsRed promoteur-driven comme une mesure de l' amorçage, 2) marquage in vivo des neutrophiles avec de faibles doses de fluorescence conjugué anti Ly6G mAb et 3) intravitale imagerie par microscopie confocale. La combinaison de ces trois méthodes permet la visualisation de l'activité des neutrophiles motiles amorcées (DsRed + / Ly6G +) dans les lésions inflammatoires de la peau. La direction de la migration et de la vitesse des neutrophiles apprêtées est encore quantifiées via le suivi des parcours migratoire. En enregistrant une série de vidéos en accéléré, en temps réel cinétique de apprêtée émergence de neutrophiles est contrôlée au site inflammatoire et l'acquisition d'expression DsRed par iertaines neutrophiles est également observée dans l'espace extravasculaire. Ainsi, le processus dynamique de neutrophiles amorçage a été visualisé avec succès sur des animaux vivants pour la première fois en utilisant la technologie présentée ici.
Cette technologie est utilisée dans plusieurs étapes critiques. Tout d'abord, les tissus de la peau sont les parties du corps les plus commodes pour l'imagerie intravitale. L'application topique de OX sur l'oreille de la souris permet la visualisation directe des comportements des cellules immunitaires de la peau enflammée par microscopie confocale. Deuxièmement, la souris doit être sous sédation en permanence lors de l'imagerie qui nécessite des injections répétées d'anesthésique. Cependant, la sédation excessive peut causer die de la souris lors de l'imagerie. Pour éviter un surdosage, de faibles doses d'anesthésique (une moitié ou un tiers de la dose totale) sont recommandés pour l'imagerie à long terme. Troisièmement, mAb spécifiques neutrophiles fluorescence conjugué doit être injecté par intermittence en raison de la courte durée de vie des neutrophiles murins (demi-vie de 8-10 h 30). Enfin, l'accent drift est un problème majeur lors de l' imagerie time-lapse, qui pourrait être causée par de multiples facteurs , y compris les variations de température, le mouvement du corps de la souris, gonflement de l' oreille au fil du temps, et les vibrations découlant de fonctionnement de l'instrument 31. Plusieurs méthodes ont été développées pour éviter la dérive, comme l'administration d'une dose constante de la sédation lors de l'imagerie, la fixation de l'oreille de la souris en place par l'enregistrement d'une lame de verre au-dessus de la scène, l'installation d'une chambre environnementale pour fournir de l'oxygène et de la chaleur à la sédation organisme ainsi que par manuellement re-focalisation du champ d' application si nécessaire 32,33.
Il est tout aussi important de préciser les limites de ce protocole. Tout d'abord, une reprise lente de la souris (12-16 h) après une imagerie période de 8 h de longueur est observée en raison de la sédation continue, ce qui indique que ce protocole peut ne pas convenir à ces longues expériences. Une autre approche consiste à utiliser plusieurs souris en séquence sur la période d'imagerie plutôt que uchanter seul. Deuxièmement, une fuite progressive de circulation FITC-dextran est observée lors de l' imagerie au fil du temps, ce qui est probablement causée par une augmentation de la perméabilité des vaisseaux sanguins de la peau dans l'état inflammatoire 34. Ainsi, la visualisation des vaisseaux sanguins est fortement compromise étant donné réduit la fluorescence en circulation à des étapes ultérieures de l'imagerie. En variante, on peut utiliser des lectines conjugués par fluorescence , tels que isolectine B4 pour marquer les vaisseaux sanguins que ceux - ci adhèrent aux cellules endotheliales vasculaires 35.
En plus de la visualisation du processus d'amorçage des neutrophiles dans les lésions inflammatoires de la peau, la technologie décrite ici peut également être appliquée dans bien d'autres paramètres expérimentaux. En combinaison avec des fenêtres d'imagerie récemment mis au point, la microscopie intravitale définissant les comportements des neutrophiles apprêtées pourrait être évaluée dans les tissus profonds et organes , y compris le cerveau, les glandes mammaires, les poumons et les organes abdominaux 36-39. De plus, la visualisation de la priming / activation d'autres types cellulaires telles que les monocytes et les macrophages pourrait être obtenue en utilisant des souris pIL1-DsRed avec marquage in vivo par fluorescence conjugué anticorps monoclonal spécifique du type cellulaire d'intérêt. Pris ensemble, non seulement cette technologie fournit un cadre fondamental pour l'imagerie intravitale du processus d'amorçage des neutrophiles chez les animaux vivants, mais elle dévoile également de nouvelles approches pour étudier le comportement et la fonction des autres cellules immunitaires dans divers états inflammatoires qui se déroulent dans différents tissus.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
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