Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intravital Imaging af neutrofil Priming Brug af IL-1-promotor-drevet dsRed Reporter Mus

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54070
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Toledo College of Medicine and Life Sciences, 2Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Pathophysiology, Southern Medical University (China)

Abstract

Neutrofiler er de mest udbredte leukocytter i humant blod cirkulation og er hurtigt rekrutteret til inflammatoriske steder. Priming er en kritisk begivenhed, der forbedrer fagocytiske funktionalitet af neutrofiler. Selv omfattende undersøgelser har afsløret eksistensen og betydningen af neutrofil priming under infektion og skade, betyder visualisere denne proces in vivo har været utilgængelig. Protokollen tilvejebragt muliggør overvågning af den dynamiske proces med neutrofil priming i levende dyr ved at kombinere tre metoder: 1) DsRed reporter signal - der anvendes som et mål for priming 2) in vivo neutrofil mærkning - opnås ved injektion af fluorescens-konjugeret anti-lymfocyt antigen 6G (Ly6G) monoklonalt antistof (mAb) og 3) intravital konfokal billeddannelse. Flere kritiske trin er involveret i denne protokol: oxazolon-induceret mus øre betændelse i huden, passende sedation af dyr, gentagne injektioner af anti-Ly6G mAb, og prevention af fokus afdrift under billedbehandling. Selv om der er observeret et par begrænsninger, såsom grænsen for kontinuerlig imaging tid (~ 8 timer) i en mus og udsivning af fluoresceinisothiocyanat-dextran fra blodkar i den inflammatoriske tilstand, denne protokol giver en grundlæggende ramme for intravital billeddannelse af primet neutrofil adfærd og funktion, som let kan udvides til undersøgelse af andre immunceller i muse inflammationsmodeller.

Introduction

Neutrofiler er de mest udbredte og kortlivede leukocytter i omløb. De er hurtigt rekrutteret til de steder på infektion eller skade, hvor de tjener som professionelle fagocytter gennem frigivelse af reaktive oxygen og nitrogen mellemprodukter sammen med granulat, der indeholder antimikrobielle peptider og proteaser 1. Under deres rekruttering, er neutrofiler "primet" ved forskellige midler, herunder mikrobielle produkter, kemoattraktanter og inflammatoriske cytokiner, hvilket resulterer i markant forbedret fagocyt funktionalitet ved ankomsten til et sted for inflammation 2. Mekanismerne i neutrofile priming er blevet grundigt undersøgt in vitro 3,4; imidlertid dynamisk overvågning af processen in vivo ikke været muligt hidtil.

For nylig er intravital billeddannelse blevet en vigtig teknik til at visualisere og kvantificere de cellulære dynamik biologiske processer i levende organismer. Intravital billeddannelse kan udføres via konventionelle et-foton excitation mikroskopi (f.eks konfokal) eller multifoton mikroskopi nærmer 5. Over tid er der opnået betydelige forbedringer i denne teknik muliggør øget billedopløsning, forbedret billedbehandling dybde, nedsat væv solskader, og forbedret billedstabilisering 6,7. I betragtning af sin unikke evne til at aktivere dynamisk visualisering af cellulære migration og interaktion over tid, er intravital mikroskopi blevet grundigt anvendt til forskellige områder af undersøgelsen i immunologi 8. Intravital billedbehandling giver immunologer til bedre at forstå og kontekstualisere immunreaktioner på både det cellulære og molekylære niveau i levende dyremodeller.

Nylige fremskridt i transgene samt knock-in reporter mus har givet nyttige værktøjer til overvågning af dynamiske adfærd af neutrofiler i levende dyr. Lysozym M-promotor-drevet forstærket grønt fluorescerende protein knock-inmus udstrækning er blevet anvendt til at karakterisere motilitet af neutrofiler, monocytter og makrofager under forskellige inflammatoriske processer, herunder ekstravasation, bakteriel infektion, og sterilt inflammation 9-15. Endvidere er transgene mus, der udtrykker en cytoplasmatisk fluorescensresonansenergioverførsel biosensor blevet anvendt i at studere aktiviteter neutrofil ekstracellulær-reguleret mitogen kinase og proteinkinase A inden betændt tarm 16. En murin model med høj specificitet for fluorescens ekspression i neutrofiler er catchup knock-in-mus, som producerer Cre-rekombinase samt det fluorescerende protein tdTomato, som kobles til ekspression af lymfocyt antigen 6G (Ly6G) 17. Visualisering af Ly6G-deficiente neutrofiler via denne model har vist, at disse celler udøver normal funktionalitet i en række forskellige sterile eller infektiøse in vivo inflammatoriske sammenhænge. Transgene mus, der udtrykker DsRed fluorescerende protein genet under kontrol af muse interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) er blevet anvendt til at visualisere de motile adfærd af IL-1-producerende celler - antages at indbefatte neutrofiler, inflammatoriske monocytter og aktiverede makrofager - emerging i betændt hud 18.

In vivo mærkning kan tjene som en alternativ metode til sporing af de cellulære og molekylære adfærd af neutrofiler i betændte væv. Efter intravenøs injektion af lave doser af fluorescensmærket anti-Gr-1-monoklonalt antistof (mAb), rekruttering kaskade af Gr-1 + neutrofiler er blevet visualiseret i mus hudlæsioner inficeret med Staphylococcus aureus 19. In vivo administrering af konjugater indeholdende streptavidin- konjugeret 705 nm quantum dots og biotinyleret anti-Ly6G mAb specifikt mærke cirkulerende neutrofile 20. Endvidere endocytose af sådanne konjugater til neutrophil vesikler muliggør sporing af højhastigheds-vesikel transport i neutrofiler, der migrerer ind i interstitium. In vivo mærkning med fluorescens-konjugeret antistoffer mod P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), L-selectin (CD62L), integrin αM (CD11b ) og chemokin (CXC motiv) receptor 2 (CXCR2) i en TNF-induceret inflammatorisk model har belyst de regulatoriske mekanismer på spil i den tidlige inflammation 21. Polariserede neutrofiler stikker PSGL-1-beriget uropods at interagere med CD62L til stede på aktiverede blodplader, hvilket resulterer i en omfordeling af CD11b og CXCR2, receptorer, der driver neutrofil migration og initierer inflammation.

IL-1β er en af signatur-gener, der er forhøjet hos primede neutrofiler 22. I pIL1-dsRed reporter mus, dsRed fluorescenssignaler (dvs.., Aktivering af IL-1β-promotor) positivt korrelere med IL-1β mRNA-ekspression og IL-1β proteinproduktion. <sup> 18 Sådan overvågning af neutrofil priming blev en intravital mikroskopi metode udviklet involverer induktion af hudinflammation med oxazolon (OX) i pIL1-DsRed musemodel følgende in vivo mærkning af neutrofiler med fluorescens-konjugeret anti-Ly6G mAb. Via denne model, er det muligt at studere og funktion af primede neutrofiler i dyremodeller af forskellige sygdomme og lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg udføres i overensstemmelse med National Institutes of retningslinjer Sundhed og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Toledo.

1. fænotype af pIL1-DsRed mus

BEMÆRK: Afkom genereres ved avl heterozygote pIL1-dsRed mus med vildtype (WT) C57BL6 mus. Tre til fire uger gamle hvalpe anses klar til fænotypebestemmelse. Submandibulære afblødning af mus følger en etableret protokol med mindre modifikationer 23.

  1. Isolering af hvide blodlegemer fra fuldblod af Mouse Hvalpe
    1. Tilsæt 20 pi heparin til hver 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    2. Anskaf en hvalp fra buret. Optag identifikation tag hvalpen. Det er ikke nødvendigt at bedøve unger før blodprøvetagning fra submandibulære vene.
    3. Hold hvalp ved hals harmoniske og gennembore submandibulære vene i the kindposen anvendelse af en 5 mm lancet. Påfør tilstrækkelig kraft til at skabe en lille punktering, så dråber blod udstråler fra et penetration. Brug en ny nål til hver hvalp.
    4. Saml 3 - 5 dråber blod pr pup i en heparin-holdige mikrocentrifugerør. Rengør indstiksstedet og pres for at lette hæmostase.
    5. Sæt hvalp i nye bur og observere i 30 min før han vendte tilbage buret til dyret facilitet.
    6. Indsamle blod fra voksne mus af en kendt fænotype som positive og negative kontroller.
    7. Der tilsættes 500 pi af røde blodlegemer lyseringsbuffer til hvert rør, vortexrør, og der inkuberes i 5 - 10 min på is.
    8. Tilsæt langsomt 400 - 500 pi føtalt bovint serum (FBS) under cellesuspensionerne i hvert rør. En klar grænseflade kan observeres mellem det øverste lag cellesuspension og nederste lag af FBS.
    9. Cap rør og centrifugeres prøverne ved 1500 x g i 5 min.
    10. Gentag trin 1.1.7 - 1.1.9 til pelsther fjerne røde blodlegemer. Gentag ikke, hvis lyse er tilstrækkelig første gang. Pelleten bør være vanskeligt at skelne efter centrifugering.
  2. Lipopolysaccharid (LPS) Stimulering og kultur
    1. Resuspender celler i 200 pi komplet Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium.
    2. Overfør cellesuspensionen til en flowcytometri rør.
    3. Foretag LPS arbejdsopløsning ved at blande 10 pi LPS stamopløsning (1 mg / ml) med 990 pi komplet RPMI 1640 medium.
    4. Tilsæt 20 pi 10 pg / ml LPS arbejdsopløsning til 200 pi cellesuspension.
    5. Cap rør løst og inkuber prøverne i 4 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
  3. Flowcytometrianalyse
    1. Åbn datafangst program for flowcytometri. Opsæt erhvervelse skabelon før prøve erhvervelse.
    2. Klik på Dot-Plot værktøj i værktøjskassen. Tegn en forward scatter (FSC) vs sidespredning (SSC) plot. Indstil FSC og SSC spænding parametre til lineær skala.
    3. Vælg de laveste tærskler for FSC og SSC tilladt af cytometret. Anvend tærskler 200 og 50 for FSC og SSC, hhv.
    4. Inden for FSC versus SSC plot, tegne en gate G1, som indbefatter monocytter, granulocytter og dendritiske celler, og udelukker snavs, røde blodlegemer og lymfocytter.
    5. Klik på Histogram redskab i værktøjskassen. Tegn en FL2 (rød fluorescens kanal) histogram. Anvende en negativ kontrolprøve at indstille grundlinjen i FL2-signaler og en positiv kontrolprøve at tegne en port til at omfatte alle dsRed positive begivenheder.
    6. På Fluidik kontrolpanel cytometeret, indstille fluidet til "RUN" og strømningshastigheden til "HI" (ca. 60 pl / min). Anskaf 10.000 begivenheder for hver prøve.
    7. Bestem pup fænotype ved at måle procentdelen af ​​dsRed positive celler fra G1 gate.
  1. Bedøver musen ved intraperitoneal (ip) injektion af et anæstetikum cocktail indeholdende 100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin, og 1 mg / kg acepromazin. Tilstrækkeligt bedøvede mus viser ikke bagpote tilbagetrækning til tå knivspids.
  2. Påfør hårfjerning creme til den dorsale overflade af begge ører med musen. Vent 30 sek til 1 min. Tør øre overfladen med vand befugtede bomuld og lad det lufttørre.
  3. Måle tykkelsen øre under anvendelse mikrometer og erstatte musen i et separat bur. Overhold indtil bedring efter anæstesi (~ 15-30 min). At løse hudinflammation induceres af hårfjerning produkt, tillade musen til at hvile i 3 dage før yderligere eksperimenter gennemføres.
  4. Forbered 1,25% (vægt / volumen) OX ved opløsning 16,7 mg OX i 1 ml acetone og blanding 750 pi OX / acetoneopløsning med 250 pi olivenolie. Forbered køretøj opløsning ved at blande 750 pi acetone med 250 &# 181; l af olivenolie.
  5. Re-bedøver musen ved ip injektion af bedøvelsesmiddel cocktail (2.1). Mål øretykkelse som før.
  6. Påfør 12,5 pi 1,25% OX på hver side af højre øre. Påfør 12,5 pi olievehikel opløsning acetone / olivenolie på hver side af venstre øre.
  7. Hold musen adskilt fra bur-hjælpere indtil fuldt tilbagebetalt at forhindre fornærmelse mod sine ører af andre mus, derefter erstatte musen i sin oprindelige bur og vende tilbage til stalde facilitet.
    BEMÆRK: Hårfjerning kan resultere i mindre hud inflammation efter ved skift af øret tykkelse. Denne mindre inflammation vil blive løst 3 dage senere bekræftet af normal tykkelse øre. Efter lokal applikation i 24 timer, OX-behandlede ører viser signifikant (p <0,01) hævelse sammenlignet køretøj løsning alene-behandlede ører.

3. Mærkning af neutrofiler i pIL1-DsRed mus

BEMÆRK: In vivo mærkning af neutrofiler ved lavdosis fluorescence-konjugeret neutrofil-specifik mAb følger en nyligt udviklet protokol 19. Retro-orbitale injektioner udføres i henhold til en fastlagt protokol med et par ændringer 24.

  1. Forbered anti-Ly6G mAb arbejdsopløsning ved fortynding 10 pi 0,5 mg / ml Alexa Fluor 647-konjugeret anti-Ly6G mAb (klon 1A8) i 90 pi phosphatpufret saltvand (PBS).
  2. Overfør 100 ul anti-Ly6G mAb arbejdsopløsning (50 ug / ml) i en U-100 insulinsprøjte med 28 gauge nål.
  3. Bedøver en voksen pIL1-DsRed musen ved ip injektion af den tidligere beskrevne anæstetiske cocktail (2.1). Placer bedøvet musen maven ned på en rent arbejdsmiljø bord.
  4. Påfør blid nedadgående pres på huden dorsale og ventrale til en mus øje til delvist rage øjeæblet ud af stikkontakten.
  5. Placer forsigtigt nålen, affase ned, i en vinkel på ca. 30 ° ved den mediale øjenkrog ind i retroorbitalbihule.
    BEMÆRK: Operatøren kan føle sig presset, penetration og lettet modstand, når nålen indsætter i sinus.
  6. Langsomt og jævnt injicere 100 pi anti-Ly6G mAb arbejdsopløsning (5 ug mAb / mus / injektion) i musen. Fjern kanylen hurtigt. En lille mængde blødning antyder en succesfuld injektion.
  7. gælder Umiddelbart 1,25% OX og køretøj løsning på højre og venstre musen ører.
  8. Efter 8 timer, administrere 100 pi frisk fremstillet anti-Ly6G mAb arbejdsopløsning (5 ug mAb / mus / injektion) via retro-orbital injektion i samme mus.
  9. At visualisere blodkar, umiddelbart før billeddannelse, administrere 100 pi 30 mg / ml fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret dextran (150 kDa) gennem retroorbital injektion.

4. Intravital Imaging af neutrofil Priming i Pil-1-DsRed mus

  1. Bedøver musen med ip injektion af bedøvelsesmiddel cocktail (2.1).0; Påfør veterinær salve til mus øjne til at forebygge tørhed, mens under anæstesi til billeddannelse.
    1. Forbered 1 ml halv dosis bedøvelsesmiddel cocktail ved fortynding 500 pi oprindelige bedøvelsesmiddel cocktail med et tilsvarende volumen PBS.
    2. Overfør halv dosis bedøvelsesmiddel cocktail til 1 ml sprøjte med en sommerfugl 27 gauge nål.
    3. Stik nålen af ​​sommerfugl i mus maven intraperitonealt og løse sommerfuglen fløj til maven ved at tape.
  2. Placer et dækglas i centrum af det billeddannende fase. Tape kanterne af dækglasset for at holde det på plads.
  3. Placer en dråbe PBS på den ventrale overflade af muse øre samt på dækglasset.
  4. Position bedøvet mus med dens øre over dækglasset. Monter spidsen af ​​øret, dorsale side ned, ved indlægning øret mellem dækglasset og et objektglas, også holdes på plads via tape.
  5. Tænd et multi-laser fluorescens konfokal mikroskop og alle de relaterede equipment. Sluk værelse lys for at minimere omgivende eksponering lys.
  6. Åbn billede erhvervelse software. Vælg laser kanaler til påvisning af fluorescerende farvestoffer i menuen Dye List.
  7. Juster fokus på det betændte øre huden ved observation af grønne signaler fra blodkarrene og røde signaler fra de dsRed + celler gennem okularet.
  8. Udfør en hurtig scanning med scan hastighed på 2 mikrosekunder / pixel og opløsning på 512 × 512 pixels. Vælg en pseudofarve for hver kanal i Live View-menuen. Juster knop fokus for at indstille ende og begynde placeringen af ​​scanning.
  9. Udfør langsomme scanninger med scan hastighed på 4-8 usek / pixel og opløsning på 800 × 800 eller 1.024 × 1.024 pixels. Juster højspænding, forstærkning og offset på hver enkelt kanal for at maksimere intensiteten af ​​signaler samtidig undgå mætning (røde pixels). Der bør kun være nogle få røde pixels i hver kanal.
  10. Opret tredimensionelle billedsæt ved at scanne the ørehuden begynder overfladisk i stratum corneum og forløber nedad med x, y, z volumener 317 um × 317 um x 30 um (40X objektiv), 635 um × 635 um x 30 um (20X objektiv), eller 1.270 um × 1270 um x 50 um (10X objektiv) på 2 um z-trin.
    BEMÆRK: Stratum corneum er det yderste lag af epidermis og kan let lokaliseret baseret på den stærke autofluorescens signal.
  11. I time-lapse imaging eksperimenter, optage tre-dimensionelle billeder hver 2 eller 4 min til op til 8 timer.
  12. Perioder anses musen begynder at komme fra anæstesi, bemærkede baseret på observation af trækninger whiskers, administrere 5 - 10 pi halv dosis anæstesi cocktail gennem butterfly nål.
    BEMÆRK: Vær forsigtig med anæstesi dosis - overdosis kan forårsage musen død. Alternativt kunne inhalationsanæstesi i en krukke påføres på musen for kortfristet anæstesi og etnæsekegle kunne anvendes til langsigtet billeddannelse.
  13. Fjern den bedøvede mus fra scenen når billeddannelse er færdig. Frigør tape og fjerne butterfly nål fra musens abdomen. Retur musen til en separat bur i stalde facilitet.
    BEMÆRK: kortsigtet imaging (<1 time), mus sig helt fra bedøvelsen hurtigt i 1 - 3 ud hr. Til langvarig billeddannelse (~ 8 t), mus inddrive langsomt, med en typisk restitutionsperiode på 12 - 16 timer. Således er oral vand administration anbefales mindst flere gange i løbet af tilbagebetalingsperioden for at forhindre svær dehydrering.
  14. Proces imaging datasæt, spore individuelle celler, generere vandrende stier, og beregne retningen og hastigheden af celle migration ved hjælp billede analyse software 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Screening af pIL1-DsRed mus udføres baseret på den fænotypiske DsRed fluorescenssignal produceret af deres perifere blodleukocytter anvendelse af flowcytometri. LPS-stimulering vides at inducere IL-1β-produktion i myeloide celler, herunder neutrofiler, monocytter og dendritiske celler 26-28. Således er isolerede leukocytter inkuberet med LPS i 4 timer før flowcytometrianalyse. Dernæst gating indstillet til cirkulation myeloide celler baseret på cellestørrelse (FSC) og indre kompleksitet (SSC) (figur 1A) 29, og DsRed signal måles i denne låge population. Cirkulerende myeloide celler fra WT mus minimalt udtrykke DsRed, medens de samme celler fra pIL1-dsRed mus udtrykker skelnelige dsRed signaler (Figur 1B). De pIL1-dsRed mus identificeret ved denne fænotype metode bruges til efterfølgende eksperimenter. Det skal bemærkes, at den fuldstændige fænotypebestemmelse processen tager kun nogle fåtimer - meget kortere end de traditionelle genotypebestemmelsesmetoder herunder væv høst, enzymatisk fordøjelse, DNA-isolering, PCR og elektroforese.

IL-1β promotoraktivering er for nylig blevet identificeret som en markør for neutrofil priming 22. Således kan den dynamiske proces af neutrofil priming visualiseres og vurderes i levende dyr under anvendelse pIL1-dsRed mus. For at inducere hudinflammation, huden sensitiverende OX topisk påført på højre øre af pIL1-dsRed mus og vehikel alene påføres på venstre øre af samme dyr. For at mærke neutrofiler i levende dyr, er en nylig udviklet protokol udføres ved administration af en lille mængde af fluorescens-mærket anti-Ly6G mAb umiddelbart før og 8 timer efter OX ansøgning. For at finde blodkar, er FITC-dextran injiceres umiddelbart før billeddannelse.

På 24 timer efter OX ansøgning, enstort antal DsRed + / Ly6G + celler findes i det ekstravaskulære rum (figur 2A) og repræsenterer primet neutrofiler. Et lille antal DsRed / Ly6G + celler er også fundet, som sandsynligvis repræsenterer hvilende neutrofiler. Desuden er en lille population af DsRed + / Ly6G - celler observeres, som kan omfatte inflammatoriske monocytter og aktiverede makrofager. I en 40 min time-lapse video, Ly6G + neutrofiler nye inden en inflammatorisk hud læsion udviser typiske amøbe-lignende gennemgang bevægelse (Supplemental Movie 1). Cell vandrende stier spores at sammenligne motile adfærd af den DsRed + / Ly6G + og DsRed - / Ly6G + neutrofile populationer (figur 2B). Sporet plot analyser afslører, at både neutrofile befolkninger vise "tilfældig" migration, når det ekstracellulære rum er indtastet (Figur 2C). Interessant,DsRed + / Ly6G + neutrofiler udviser en signifikant højere hastighed end deres dsRed - / Ly6G + modstykker (figur 2D). Dette tyder på en sammenhæng mellem neutrofil priming og accelereret motilitet i inflammatoriske læsioner.

For at overvåge timingen af neutrofil priming, en serie af time-lapse videoer blev indspillet starter på forskellige tidspunkter efter OX behandling (Supplemental Film 2 - 4). DsRed - / Ly6G + celler, de hvile neutrofiler, bliver påvises i det ekstravaskulære rum så tidligt som 8 - 12 timer efter OX ansøgning og deres numre forblive relativt lav derefter (figur 2E, supplerende film 3, 4). Tværtimod er antallet af dsRed + / Ly6G + -celler, de primede neutrofiler, øges progressivt på senere tidspunkter, der begynder ved 14 - 16 timer efter OX ansøgning. Nogle DsRed + celler gradvist erhverve dsRed signaler efter rekruttering til det ekstravaskulære rum i denne periode (figur 2F, Supplemental Movie 5). Ved 16-20 timer, er et flertal af de ekstravaskulære Ly6G + neutrofiler betragtes som "primet" baseret på deres DsRed udtryk. Disse observationer afslører størrelsen, tempo, og placering af neutrofil priming forekommer ved inflammatoriske læsioner i levende dyr.

figur 1
Figur 1:. Fænotype af pIL1-dsRed Mus (A) Flowcytometri analyser demonstrerer en population af cirkulerende myeloide celler (G1) baseret på FSC og SSC-parametre. (B) Histogrammer på FL2-kanalen viser procentdelen af dsRed + -celler inden G1 gate af cellerne fra pIL-DsRed mus (rød) eller fra WT mus (blå). Data er repræsentative for på least tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Visualisering af bevægelige aktiviteter DsRed + / Ly6G + Neutrofile i inflammatoriske hudlæsioner (A) Statisk konfokal mikroskopi billeder optaget 24 timer efter OX behandling show tre leukocytpopulationer i det ekstravaskulære rum, dvs, DsRed + / Ly6G + celler. (asterisker), dsRed - / Ly6G + celler (trekanter), og dsRed + / Ly6G - celler (pile). Bar = 20 um. DsRed + / Ly6G + celler (rød) og dsRed - / Ly6G + celler (blå) sammenlignes for migratory stier (B), spor plots (C), og hastighed (D) fra en 40 min time-lapse film optaget ved konfokal mikroskopi startende 24 timer efter OX applikation (Supplemental Movie 1). (D) Bars indikerer betyder velocity værdier. *** P <0,001. (E) Antallet af dsRed + / Ly6G + celler og DsRed - / Ly6G + celler tælles fra en serie af time-lapse film optaget på forskellige tidspunkter efter OX applikation (Supplemental film 2 til 4). De viste data er de celletal / mm2 (gennemsnit ± SD) beregnet fra tre på hinanden følgende billeder. (F) Statiske billeder er skabt ud fra en time-lapse film optaget 11-14,5 timer efter OX maleri (Supplemental Movie 5). Pilen viser en Ly6G + celle, der erhverver DsRed udtryk i den ekstravaskulære rum i observationsperioden.Bar = 50 um. Billeder er gengivet fra henvisning 22 med tilladelse (Copyright 2015. American Association of immunologer, Inc.). Klik her for at se en større version af dette tal.

. Supplerende Movie 1: bevægelige Behavior af DsRed + neutrofiler i inflammatoriske hudlæsioner (ved 24 timer efter OX maleri) konfokal mikroskopi billeder viser motilitet dsRed + / Ly6G + celler (lyserød) og DsRed - / Ly6G + celler (blå) i det ekstravaskulære rum. Blodkar ses i grønt. Bar = 20 um. Videoen er gengivet fra henvisning 22 med tilladelse (Copyright 2015. American Association of immunologer, Inc.). Venligst click her for at se denne video.

. Supplerende Movie 2: bevægelige Behavior af DsRed + neutrofiler i inflammatoriske hudlæsioner (ved 4 timer efter OX maleri) konfokal mikroskopi billeder viser dsRed + / Ly6G + celler (pink) og dsRed - / Ly6G + celler (blå) i det ekstravaskulære rum . Blodkar ses i grønt. Autofluorescens er til stede og er forbundet med hårfollikler. Bar = 100 um. Videoen er gengivet fra henvisning 22 med tilladelse (Copyright 2015. American Association of immunologer, Inc.). Klik her for at se denne video.

Supplerende Movie 3: bevægelige Behavior af DsRed + neutrofiler i Inf. lammatory hudlæsioner (ved 8 timer efter OX maleri) konfokal mikroskopi billeder viser dsRed + / Ly6G + celler (pink) og DsRed - / Ly6G + celler (blå) i det ekstravaskulære rum. Blodkar ses i grønt. Autofluorescens er til stede og er forbundet med hårfollikler. Bar = 100 um. Videoen er gengivet fra henvisning 22 med tilladelse (Copyright 2015. American Association of immunologer, Inc.). Klik her for at se denne video.

Supplerende Movie 4: bevægelige Behavior af DsRed + neutrofiler i inflammatoriske hudlæsioner (ved 11-19 timer efter OX maleri) konfokal mikroskopi billeder viser dsRed + / Ly6G + celler (lyserød) og dsRed - / Ly6G + celler (blå) i. ekstravagscular plads. Blodkar ses i grønt. Autofluorescens er til stede og er forbundet med hårfollikler. Bar = 100 um. Videoen er gengivet fra henvisning 22 med tilladelse (Copyright 2015. American Association of immunologer, Inc.). Klik her for at se denne video.

Supplerende Movie 5: Køb af dsRed Signaler ved Ly6G + neutrofiler Fra time-lapse film vist i supplerende Video 4, denne højere forstørrelse video viser den proces, hvor en Ly6G + celle (vist med en pil) erhverver DsRed udtryk i det ekstravaskulære. plads i observationsperioden (11-14,5 timer efter OX maleri). Bar = 50 um. Videoen er gengivet fra henvisning 22 med tilladelse (Copyright 2015. Den amerikanske sammenslutning af Immunologists, Inc.). Klik her for at se denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Formålet med denne undersøgelse er at udvikle en teknologi til overvågning af processen af ​​neutrofil priming i levende dyr, som endnu ikke er blevet opfyldt af de aktuelt tilgængelige teknik. For at nå dette mål, er tre etablerede metoder udført: 1) induktion af hudinflammation i IL-1p-promotordrevet dsRed reporter mus som et mål for priming, 2) in vivo mærkning af neutrofiler med lave doser af fluorescens-konjugeret anti-Ly6G mAb, og 3) intravital konfokal mikroskopi billeddannelse. Kombinationen af disse tre metoder muliggør visualisering af motile aktiviteter primede neutrofiler (DsRed + / Ly6G +) i inflammatoriske hudlæsioner. Migrationen retning og hastighed af de primede neutrofiler yderligere kvantificeret via vandrende sti tracking. Ved optagelse af en serie af time-lapse videoer, er de realtid kinetik primet neutrofil fremkomsten overvåges inflammatorisk sted og erhvervelse af DsRed udtryk ved at jegndividual neutrofiler er også observeret i det ekstravaskulære rum. Således en gradvis og neutrofil priming er blevet visualiseret i levende dyr for første gang ved hjælp af teknologi, der præsenteres her.

Denne teknologi er ansat i flere kritiske trin. Første, hudvæv er de mest bekvemme kropsdele for intravital billeddannelse. Topisk anvendelse af OX på museøre tillader direkte visualisering af immuncellepopulationer adfærd i betændt hud under konfokal mikroskopi. For det andet skal musen blive bedøvet konstant under billedbehandling hvilket nødvendiggør gentagne injektioner af bedøvelsesmiddel. Imidlertid kan over-sedation forårsage mus dør under billedbehandling. For at undgå overdosering er lave doser af bedøvelse (en halv eller en tredjedel af den fulde dosis) anbefales til langvarig billeddannelse. Tredje, fluorescens-konjugeret neutrofil-specifik mAb skal injiceres intermitterende grund af den korte levetid af murine neutrofiler (halveringstid på 8-10 timer 30). Sidste, fokus drIFT er et stort problem i løbet af time-lapse billeddannelse, som kunne være forårsaget af flere faktorer, herunder temperaturvariationer, mus kropsbevægelser, øre hævelse over tid, og vibrationer som følge af driften af instrumentet 31. Der er blevet udviklet flere metoder til at forhindre drivende, såsom administration af en konstant dosis af sedation under billedbehandling, fastsættelse af museøre på plads ved at tape et objektglas over det på scenen, installere en miljømæssig kammer til at tilføre ilt og varme til sederet organisme, samt ved manuelt re-fokusering anvendelsesområdet nødvendigt 32,33.

Det er lige så vigtigt at angive begrænsningerne i denne protokol. Først en langsom mus genanvendelse - observeres (12 16 timer) efter et billeddannende periode 8 timer i længden på grund af kontinuerlig sedation, hvilket indikerer, at denne protokol ikke kan være egnet til sådanne langvarige forsøg. En alternativ fremgangsmåde er at anvende flere mus i rækkefølge over imaging periode frem for usynge eneste. For det andet er en gradvis lækage af cirkulerende FITC-dextran observeret under billedbehandling over tid, hvilket sandsynligvis skyldes øget permeabilitet af hudens blodkar i den inflammatoriske tilstand 34. Således er visualisering af blodkar markant kompromitteret givet reduceret fluorescens i omløb på senere stadier af billeddannelse. Alternativt kan man anvende fluorescerende konjugerede lektiner såsom isolectin B4 at markere blodkar da disse overholder vaskulære endotelceller 35.

Udover visualisering af processen for neutrofil priming i huden inflammatoriske læsioner, kan den her beskrevne teknologi også anvendes i mange andre eksperimentelle indstillinger. I kombination med nyligt udviklede imaging vinduer, kunne intravital mikroskopi afgrænse adfærd af primede neutrofiler vurderes i dybe væv og organer, herunder hjerne, mælkekirtler, lunger og abdominale organer 36-39. Endvidere visualisering af priming / aktivering af andre celletyper, såsom monocytter og makrofager kunne opnås ved anvendelse pIL1-dsRed mus sammen med in vivo mærkning via fluorescens-konjugeret mAb specifik for celletypen af interesse. Tilsammen, ikke alene denne teknologi giver en grundlæggende ramme for intravital billeddannelse af priming processen af ​​neutrofiler i levende dyr, men det afslører også nye metoder til at studere adfærd og funktionen af ​​andre immunceller i forskellige inflammatoriske tilstande udfolder sig i forskellige væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin sodium APP Pharmaceuticals NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer Lonza 10-548E
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F0926
Lipopolysaccharides Sigma-Aldrich L4391
Ketamine hydrochloride Hospira NDC 0409-2051-05
Xylazine LLOYD Laboratory NADA #139-236
Acepromazine Boehringer Ingelheim ANADA 200-361
Hair-removal cream Church & Dwight
Acetone Fisher Scientific A16P4
Oxazolone Sigma-Aldrich E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody BioLegend 127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle BD 329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa Sigma-Aldrich 74817
Butterfly infusion set (27 G needle) BD 387312
FACSCalibur cytometer BD
CellQuest Pro software BD
Confocal microscope Olympus FV1000
Metamorph Software Universal Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
  3. Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
  4. El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
  5. Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
  6. Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
  7. Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
  8. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  9. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  10. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  11. Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
  12. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  13. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
  14. Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
  15. Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
  16. Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
  17. Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
  18. Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
  19. Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
  20. Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
  21. Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
  22. Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
  23. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  24. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  25. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  26. Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
  27. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
  28. Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
  29. Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
  30. Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
  31. Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
  32. Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
  33. Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
  34. Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
  35. Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
  36. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  37. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  38. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
  39. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).

Tags

Immunologi Immunologi intravital mikroskopi neutrofiler priming, mus betændelse i huden konfokal mikroskopi motilitet
Intravital Imaging af neutrofil Priming Brug af IL-1-promotor-drevet dsRed Reporter Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yao, Y., Liu, Y., Takashima, A.… More

Yao, Y., Liu, Y., Takashima, A. Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice. J. Vis. Exp. (112), e54070, doi:10.3791/54070 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter