Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54070
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Toledo College of Medicine and Life Sciences, 2Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Pathophysiology, Southern Medical University (China)

Abstract

נויטרופילים הם לויקוציטים הנפוצים ביותר במחזור דם אנושי מגויסים במהירות לאתרים דלקתיים. לקרקע הוא אירוע קטלני זה משפר את הפונקציונליות phagocytic של נויטרופילים. למרות מחקרים מקיפים חשפו את קיומה וחשיבותה של הטרמה נויטרופילים במהלך זיהום ופגיע, פירושו של ביטוי חזותי תהליך זה in vivo לא היה בהישג ידי. הפרוטוקול ספק מאפשר ניטור של התהליך הדינמי של נויטרופילים יחולו בחיות חיים על ידי שילוב שלוש מתודולוגיות: 1) אות כתב DsRed - משמש כמדד יחול 2) תיוג נויטרופילים vivo - מתקבל על ידי הזרקה של אנטיגן נגד לימפוציטים קרינה מצומדות 6G (Ly6G) נוגדן חד-שבטי (מב) ו -3) הדמיה confocal intravital. שלבים קריטיים כמה מעורבים בפרוטוקול זה: דלקת עור אוזן עכבר נגרם oxazolone, הרגעה מתאימה של חיות, זריקות חוזרות ונשנות של מב אנטי Ly6G, ו קודםention של סחיפה המוקד במהלך ההדמיה. למרות מספר מגבלות נצפו, כגון הגבלת זמן הדמיה הרציפה (~ 8 שעות) ב שמאלי ואת הדליפה של isothiocyanate-dextran והעמסה מכלי דם במדינה הדלקתית, פרוטוקול זה מספק מסגרת יסוד הדמית intravital של התנהגות ותפקוד נויטרופילים דרוכים, אשר ניתן להרחיב בקלות הבדיקה של תאי חיסון אחרים במודלי דלקת עכבר.

Introduction

נויטרופילים הם לויקוציטים בשפע קצרים מועד ביותר במחזור. הם מגויסים במהירות לאתרים של זיהום או פציעה, שבו הם משרתים פגוציטים כפי מקצועיים באמצעות שחרור ביניים חמצן וחנקן תגובתי יחד עם גרגירים המכילים פפטידים מיקרוביאלית פרוטאזות 1. במהלך גיוסם, נויטרופילים הם "דרוכים" על ידי סוכנים שונים כולל מוצרי חיידקים, chemoattractants, וציטוקינים דלקתיים, וכתוצאה מכך פונקציונלית תָא בַּלעָן משופרת במידה ניכרת עם הגיעם אתר של דלקת 2. המנגנונים של הטרמה נויטרופילים נחקרו רבות במבחנה 3,4; עם זאת, ניטור דינמי של התהליך in vivo מצטער לא יכל להסיג עד כה.

לאחרונה, הדמית intravital הפכה טכניקה חשובה הדמיה לכימות הדינמיקה הסלולר של תהליכים ביולוגיים באורגניזמים חיים. Intraviהדמית טל יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ עירור אחד פוטונים קונבנציונליים (למשל, confocal) או מיקרוסקופיה multiphoton מתקרבת 5. במשך הזמן, שיפורים משמעותיים הושגו טכניקה זו מאפשרת רזולוציית תמונה מוגברת, עומק הדמיה משופרת, ירד נזקי רקמות, 6,7 ייצוב תמונה משופרת. בהינתן היכולת הייחודית שלה כדי לאפשר הדמיה דינמית של הגירה ואינטראקציה הסלולר לאורך זמן, מיקרוסקופיה intravital יושמה בהרחבה בתחומים מגוונים של מחקר באימונולוגיה 8. הדמית Intravital מאפשרת אימונולוגים כדי להבין טובים יותר את הקשר התגובה חיסונית ברמה התאית ומולקולרית הם חיים במודלים של בעלי חיים.

התקדמות המהונדסת וכן עקומים בעכברי כתב ספקה כלים שימושיים לניטור ההתנהגויות הדינמיות של נויטרופילים ב בעלי חיים. אמרגן מונחה M ליזוזים חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת עקומהעכברים שימשו רחב לאפיין תנועתיות של נויטרופילים, מונוציטים, מקרופאגים במהלך תהליכים דלקתיים שונים כולל extravasation, זיהום חיידקי, ודלקת סטרילית 9-15. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים המבטא biosensor העברת אנרגיה תהודה הקרינה cytoplasmic הועסק בחקר פעילות קינאז mitogen ו- A קינאז חלבון תאי-מוסדר נויטרופילים במעי מודלק 16. מודל Murine עם סגוליות גבוהות עבור ביטוי קרינת נויטרופילים הוא עכבר הקטשופ העקום, מייצר recombinase Cre וכן tdTomato חלבון פלואורסצנטי, שבעצמה מצמידה את הביטוי של 6G אנטיגן לימפוציטים (Ly6G) 17. ויזואליזציה של נויטרופילים Ly6G המחסרים באמצעות מודל זה הוכיחה כי התאים האלה להפעיל פונקציונליות נורמלית במגוון הקשרים דלקתיים סטרילי או זיהומיות in vivo. עכברים טרנסגניים המבטאים את p ניאון DsRedrotein גן בשליטת העכבר interleuikin-1β (IL-1β) אמרגן (pIL1-DsRed) כבר נוצל כדי להמחיש את התנהגויות ניע של תאים מייצרים IL-1β - האמין לכלול נויטרופילים, מונוציטים דלקתיים, מקרופאגים הופעל - המתעורר בעור מודלק 18.

בשנת vivo תיוג יכול לשמש גישה חלופית לאיתור התנהגויות תאית ומולקולרית של נויטרופילים ברקמות דלקתיות. לאחר הזרקה תוך ורידית של מינונים נמוכים של שכותרתו fluorescently אנטי-GR-1 נוגדן חד-שבטי (מב), מפל גיוס של Gr-1 + נויטרופילים כבר דמיינו בנגעים בעור העכבר נגוע Staphylococcus aureus 19. בשנת vivo הממשל של conjugates המכיל streptavidin- מצומדות 705 נקודות קוונטיות ננומטר מב אנטי Ly6G biotinylated תווית במיוחד נויטרופילים במחזור 20. יתר על כן, אנדוציטוזה של conjugates כזה לתוך neutrophשלפוחית ​​il מאפשר מעקב התחבורה שלפוחית ​​במהירות גבוהה ב נויטרופילים נודדות אל interstitium. בשנת vivo תיוג עם נוגדנים הקרינה מצומדות נגד P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1), L-selectin (CD62L), integrin αM (CD11b chemokine ו) (מוטיב CXC) קולטן 2 (CXCR2) במודל של דלקת הנגרמת TNFα יש הבהיר את מנגנוני ויסות בבית לשחק במהלך מוקדם דלקת 21. נויטרופילים Polarized לבלוט PSGL-1 מועשר uropods לקיים אינטראקציה עם ההווה CD62L על טסיות מופעל, וכתוצאה מכך חלוקה מחדש של CD11b ו CXCR2, קולטנים שמניעים הגירה נויטרופילים וליזום את הדלקת.

IL-1β הוא אחד הגנים החתים כי הוא מוגבה ב נויטרופילים דרוכים 22. בעכברים הכתב pIL1-DsRed, אותות הקרינה DsRed (כלומר., הפעלה של האמרגן IL-1β) לתאם באופן חיובי עם IL-1β ביטוי mRNA וייצור חלבון IL-1β. <sup> 18 כדי לפקח על תהליך של הטרמה נויטרופילים, שיטה מיקרוסקופית intravital פותחה מעורבים אינדוקציה של דלקת עור עם oxazolone (שור) במודל העכבר pIL1-DsRed הבאים in vivo תיוג של נויטרופילים עם מב הקרינה מצומדות אנטי Ly6G. Via מודל זה, ניתן ללמוד את ההתנהגות ותפקוד של נויטרופילים דרוכים במודלים של בעלי חיים של מחלות והפרעות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים מבוצעים בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש מאונ' טולדו.

1. phenotyping של עכברים pIL1-DsRed

הערה: Offspring מופקים על ידי גידול עכברים הטרוזיגוטיים pIL1-DsRed עם wild-type (WT) עכברים C57BL6. שלושה עד ארבעה שבוע גורים ישנים נחשבים מוכנים phenotyping. דימום submandibular של עכברים כדלקמן פרוטוקול הוקם עם שינויים קלים 23.

  1. בידוד של תאי דם לבנים מן הדם המלא של גורי עכבר
    1. הוסף 20 μl של הפרין לכל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    2. רוכש גור אחד מהכלוב. רשום את תג הזיהוי של הגור. אין הוא הכרחי כדי להרדים גורים לפני איסוף הדם מהעורק submandibular.
    3. החזק גור בעורפו צוואר לנקב את וריד submandibular ב הדואר כיס לחי באמצעות אזמל 5 מ"מ. להפעיל כוח מספיק כדי ליצור לנקב קטן, כך טיפות דם להפריש מנקודת החדירה. שימוש במחט חדשה עבור כל גור.
    4. אסוף 3 - 5 טיפות של דם לכל גור בתוך שפופרת microcentrifuge המכיל הפרין. נקה את האתר לנקב ולהפעיל לחץ כדי להקל המוסטאסיס.
    5. שם גור בכלוב חדש ולבחון למשך 30 דקות לפני ההחזרה לכלוב למתקן החיה.
    6. איסוף דם מעכברים בוגרים של פנוטיפ המכונה בקרות חיוביות ושליליות.
    7. הוסף 500 μl של חיץ lysing של כדוריות דם אדומות על צינור אחד, צינורות מערבולת, דגירה במשך 5 - 10 דקות על הקרח.
    8. לאט לאט להוסיף 400 - 500 μl של בסרום שור העוברי (FBS) מתחת השעיות התא בצינור אחד. ממשק ברור ניתן להבחין בין השעית התא העליונה שכבה ו השכבה התחתונה של FBS.
    9. צינורות שווים דגימות צנטריפוגות ב 1500 גרם × למשך 5 דקות.
    10. חזור על שלבי 1.1.7 - 1.1.9 לפרווהיס להסיר תאי דם אדומים. אל תחזור אם תמוגה מספיק בפעם הראשונה. הגלולה צריכה להיות קשה להבחין לאחר צנטריפוגה.
  2. Lipopolysaccharide (LPS) גירוי והתרבות
    1. תאים Resuspend ב 200 μl של מכון הזיכרון רוזוול פארק שלם (RPMI) בינוני 1640.
    2. מעבירים את ההשעיה התא זרימה cytometry צינור.
    3. הפוך LPS הפתרון עובד על ידי ערבוב 10 μl של פתרון המניות LPS (1 מ"ג / מ"ל) עם 990 μl של המדיום RPMI להשלים 1640.
    4. הוסף 20 μl של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS הפתרון עובד 200 μl של השעיה התא.
    5. צינורות שווי רופפים דגירת דגימות במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  3. ניתוח cytometry זרימה
    1. פתח את תוכנית רכישת נתונים עבור cytometry הזרימה. הגדרת תבנית רכישה לפני לדגום רכישה.
    2. לחץ על כלי Dot-מגרש בלוח הכלי. צייר FO פיזור rward (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) העלילה. הגדר את הפרמטרים מתח FSC ו SSC כדי בקנה מידה ליניארי.
    3. בחר את ספי הנמוך ביותר של FSC ו SSC הדבר נתמך על ידי cytometer. החל ספי 200 ו -50 עבור FSC ו SSC, בהתאמה.
    4. בתוך FSC לעומת העלילה SSC, לצייר G1 השער הכולל מונוציטים, גרנולוציטים, ותאים דנדריטיים, ולא כולל פסולת, תאי דם אדומים לימפוציטים.
    5. לחץ על הכלי היסטוגרמה בפלטת הכלי. צייר היסטוגרמה FL2 (ערוץ הקרינה אדום). השתמש מדגם ביקורת שלילי להגדיר את הבסיס של אותות FL2 ומדגם בקרה חיובי לצייר שער כולל את כל אירועי DsRed החיוביים.
    6. בלוח הבקרה fluidics של cytometer, להגדיר את מצב הנוזלים כדי "להפעיל" ואת קצב הזרימה "HI" (כ 60 μl / min). רוכשת 10,000 אירועים עבור כל דגימה.
    7. לקבוע פנוטיפ גור על ידי מדידת אחוז התאים חיוביים DsRed משער G1.

class = "jove_title"> 2. אינדוקציה של דלקת עור של עכברים pIL1-DsRed

  1. להרדים העכבר על ידי הזרקה (IP) הזרקה של קוקטייל הרדמה המכיל 100 מ"ג / ק"ג קטמין, 10 מ"ג / xylazine ק"ג, ו 1 מ"ג / ק"ג acepromazine. עכברים הרדימו כראוי לא מראים אחורית נסיגה כפה קמצוץ בוהן.
  2. החל קרם להסרת שיער על פני השטח הגבי של שתי האוזניים של העכבר. מתן 30 שניות עד 1 דקות. נגב פני אוזן עם צמר גפן במים רטוב ולאפשר אוויר יבש.
  3. מדוד את עובי האוזן באמצעות מיקרומטר ולהחליף עכבר בכלוב נפרד. שימו לב עד ההתאוששות מן ההרדמה (~ 15 - 30 דקות). כדי לפתור דלקת עור הנגרמת על ידי מוצר הסרת השיער, לאפשר עכבר כדי לנוח במשך 3 ימים לפני ניסויים נוספים מתבצעים.
  4. הכן 1.25% (w / v) OX ידי המסת 16.7 מ"ג של OX ב 1 מ"ל אצטון ערבוב 750 μl של פתרון OX / אצטון עם 250 μl של שמן זית. כן פתרון רכב על ידי ערבוב 750 μl של אצטון עם 250 &# 181; l של שמן זית.
  5. Re-להרדים עכבר באמצעות זריקת ip של קוקטייל הרדמה (2.1). מדוד את עובי האוזן כמו קודם.
  6. החל 12.5 μl של OX 1.25% על כל צד של האוזן הימנית. החל 12.5 μl של פתרון הרכב שמן אצטון / זית על כל צד של האוזן השמאלית.
  7. שמור עכבר להיפרד-חבריהם לכלוב עד התאושש לחלוטין כדי למנוע עלבון אוזניו ידי עכברים אחרים, ואז להחליף את העכבר בכלוב המקורי ולחזור מתקן דיור בעלי חיים.
    הערה: הסרת השיער עלולה לגרום דלקת עור קלה הבאה על ידי שינוי של עובי אוזן. דלקת קטין זה תיפתר לאחר-מכן 3 ימים אושר על ידי עובי אוזן נורמלי. לאחר יישום מקומי למשך 24 שעות, אוזניים שטופלו OX להראות משמעותי (p <0.01) נפיחות פתרון הרכב לעומת האוזניים לבד שטופלו.

3. תיוג של נויטרופילים עכברים pIL1-DsRed

הערה: תיוג vivo של נויטרופילים ידי f במינון נמוךluorescence מצומדות מב ספציפי נויטרופילים כדלקמן פרוטוקול שפותח לאחרונה 19. זריקות רטרו-מסלולית מבוצעות על פי פרוטוקול הוקם עם כמה שינויים 24.

  1. הכן פתרון עובד מב אנטי Ly6G ידי דילול 10 μl של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​Alexa פלואוריד 647 מצומדות אנטי Ly6G מב (שיבוט 1A8) ב 90 μl של בופר פוספט (PBS).
  2. העברת 100 μl של פתרון העבודה נגד Ly6G מב (50 מיקרוגרם / מ"ל) לתוך מזרק אינסולין U-100 עם 28 מחט מד.
  3. להרדים עכבר מבוגר pIL1-DsRed על ידי זריקה ip של קוקטייל הרדמה שתואר לעיל (2.1). מניחים את הבטן העכבר הרדים למטה על לוח עבודה נקייה.
  4. החל לחץ כלפי מטה עדין על גב עור גחון בעין אחת עכבר כדי לבלוט את גלגל העין באופן חלקי מהשקע.
  5. בזהירות במקום מחט, שפוע למטה, בזווית של כ -30 מעלות על canthus המדיאלי לתוך רטרו מסלוליתסִינוּס.
    הערה: מפעיל הרשת הסלולרית יכול להרגיש את הלחץ, חדירה והתנגדות הקלה פעם מחדיר מחט לתוך הסינוס.
  6. לאט חלקה להזריק 100 μl של מב אנטי Ly6G פתרון עובדים (5 מיקרוגרם מב / עכבר / הזרקה) לתוך העכבר. הסר את המחט במהירות. כמות קטנה של דימום מצביעה על זריקה מוצלחת.
  7. מייד להחיל 1.25% OX פתרון רכב על ימין ועל אוזני עכבר שמאליות.
  8. לאחר 8 שעות, לנהל 100 μl של פתרון העבודה נגד Ly6G מוכן טרי מב (5 מיקרוגרם מב / עכבר / הזרקה) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית לאותו עכבר.
  9. כדי להמחיש את כלי הדם, מיד לפני הדמיה, לנהל 100 μl של 30 מ"ג / מ"ל ​​והעמסת isothiocyanate (FITC) מצומדות dextran (150 KDA) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית.

4. הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים PIL-1-DsRed עכברים

  1. להרדים עכבר עם זריקת ip של קוקטייל הרדמה (2.1).0; החל משחת וטרינרים לעיני עכבר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה של הדמיה.
    1. כן 1 מיליליטר חצי מנת קוקטייל הרדמה על ידי דילול 500 μl של קוקטייל הרדמה מקורי עם נפח שווה של PBS.
    2. העבר חצי מנה קוקטייל ההרדמה כדי מזרק 1 מ"ל עם מחט מד פרפר 27.
    3. הכנס מחט של פרפר לתוך בטן עכבר intraperitoneally ולתקן את כנף הפרפר אל הבטן על ידי מקליטה.
  2. מניחים coverslip זכוכית במרכז הבמה הדמיה. קלטת את הקצוות של coverslip כדי להחזיקו במקום.
  3. מניחים ירידה של PBS על פני השטח הגחון של האוזן העכבר כמו גם על coverslip.
  4. עמדה הרדימה עכבר עם האוזן שלה על coverslip. הר קצה האוזן, צד הגב למטה, על ידי הרבדה לאוזן בין coverslip ו זכוכית שקופית, גם מוחזק במקום באמצעות קלטת.
  5. הפעל מיקרוסקופ confocal קרינה רב-ליזר וכל הדואר הקשורquipment. לכבות את האורות בחדר כדי למזער את החשיפה אור הסביבה.
  6. פתח את תוכנת רכישת התמונה. בחר את ערוצי ליזר לגילוי של צבעי ניאון בתפריט הרשימה דיי.
  7. התאם את המיקוד על עור האוזן הדלקתי על ידי תצפית של אותות ירוקים מכלי דם האותות אדומים מתאי DsRed + דרך עיני.
  8. בצע סריקה מהירה עם מהירות סריקה של 2 מיקרו-שניות / פיקסלים ורזולוציה של 512 × 512 פיקסלים. בחר pseudocolor לכל ערוץ בתפריט התצוגה החי. התאם את הידית להתמקד להגדיר סוף ולהתחיל מיקום של סריקה.
  9. לבצע סריקות איטיות עם מהירות סריקה של 4 - 8 μsec / פיקסלים ורזולוציה של 800 × 800 או 1,024 × 1,024 פיקסלים. התאם את המתח הגבוה, לזכות, וכן לקזז על כל ערוץ פרט למקסם את עוצמת האותות תוך הימנעות רוויה (פיקסלים אדומים). לא צריך להיות רק כמה פיקסלים אדומים בכל ערוץ.
  10. יצירת קבוצות תמונה תלת-ממדיות על ידי סריקת הדואר העור האוזן מתחיל באופן שטחי את השכבה הקרנית ועל התקדמותם כלפי מטה עם x, y, כרכים z של 317 מיקרומטר × 317 מיקרומטר × 30 מיקרומטר (אובייקטיבי 40X), 635 מיקרומטר × 635 מיקרומטר × 30 מיקרומטר (אובייקטיבי 20X), או 1,270 מיקרומטר × 1,270 מיקרומטר × 50 מיקרומטר (אובייקטיבי 10X) בשעה 2 מיקרומטר Z- צעדים.
    הערה: השכבה הקרנית היא השכבה החיצונית ביותר של האפידרמיס ולהיות יכולה מקומי מבוססת בקלות על אות autofluorescence החזקה שלה.
  11. בניסויים הדמיה זמן לשגות, שיא תלת ממדי תמונות כל 2 דקות או 4 עד 8 שעות.
  12. לסירוגין, כמו העכבר מתחיל להתאושש מההרדמה, ציין מבוסס על תצפיות של שפם מתעוות, לנהל 5 - 10 μl של קוקטייל הרדמה חצי מנה דרך מחט פרפר.
    הערה: היי זהירה של מינון ההרדמה - מנת יתר עלול לגרום למות עכבר. לחלופין, הרדמת משאיפת בצנצנת יכולה להיות מיושמת על העכבר עבור הרדמה לטווח קצר לביןחרטומו יוכל לשמש עבור הדמיה לטווח ארוך.
  13. הסר את העכבר הרדים מהבמה כאשר ההדמיה תושלם. ניתוק הקלטת ולהסיר מחט פרפר מן בטן העכבר. החזר את העכבר בכלוב נפרד במתקן דיור בעלי חיים.
    הערה: עבור הדמיה לטווח קצר (<1 שעה), עכברים להחלים לחלוטין מן ההרדמה במהירות 1 - 3 שעות. עבור הדמיה לטווח ארוכה (~ 8 שעות), עכברים להתאושש לאט, עם תקופת החלמה טיפוסית של 12 - 16 שעות. לפיכך, ממשל מים אוראלי מומלץ לפחות מספר פעמים במהלך תקופת ההחלמה על מנת למנוע התייבשות חמורה.
  14. מערכי נתוני הדמית תהליך, לעקוב אחר תאים בודדים, ליצור נתיבי נדידה, ולחשב את הכיווניות ומהירויות של נדידת תאים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ב -25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקרנת עכברי pIL1-DsRed מתבצעת על פי איתות קרינת DsRed פנוטיפי המיוצרת על ידי לויקוציטים הדם ההיקפיים שלהם באמצעות cytometry זרימה. גירוי LPS ידוע לגרום ייצור IL-1β בתאים מיאלואידית כולל נויטרופילים, מונוציטים, ותאים דנדריטיים 26-28. לפיכך, לויקוציטים מבודד מודגרת עם LPS עבור 4 שעות לפני ניתוח תזרים cytometry. לאחר מכן, gating מוגדר במחזור התאים מיאלואידית על בסיס גודל תא (FSC) ומורכב פנימיים (SSC) (איור 1 א) 29, ואת אות DsRed נמדדת אוכלוסייה לנשלטת. במחזור תאים מיאלואידית מעכברים WT מינימלית להביע DsRed, ואילו אותם תאים מעכברים pIL1-DsRed להביע אותות DsRed להבחין (1B איור). עכברי pIL1-DsRed המזוהים בשיטת phenotyping זה משמשים לניסויים באים. יצוין כי תהליך phenotyping המלא לוקח רק כמהשעות - הרבה יותר קצרה מאשר בשיטות גנוטיפ המסורתיות כולל קציר רקמות, עיכול אנזימטי, בידוד DNA, PCR ו אלקטרופורזה.

אמרגן הפעלת IL-1β זוהתה לאחרונה כסמן של נויטרופילים יחול 22. לכן, התהליך הדינמי של הטרמה נויטרופילים ניתן דמיין והעריך בחיות חיים באמצעות עכברי pIL1-DsRed. כדי לגרום דלקת עור, שור העור sensitizer הוא למריחה על עור, על האוזן הימנית של עכברי pIL1-DsRed ורכב לבד מוחלים על האוזן השמאלית של אותו בעל חיים. כדי לתייג נויטרופילים בחי חיים, פרוטוקול שפותח לאחרונה מתבצע על ידי מתן כמות קטנה של שכותרתו fluorescently אנטי Ly6G מב מייד לפני 8 שעות לאחר יישום OX. כדי לאתר כלי דם, FITC-dextran מוזרק מיד לפני הדמיה.

בגיל 24 שעות לאחר יישום שור,מספר רב של DsRed + / Ly6G + תאים נמצאים (איור 2 א) שטח extravascular ולייצג דרוך נויטרופילים. מספר קטן של DsRed / Ly6G + תאים נמצאים גם, אשר ככל הנראה מייצגי נויטרופילים נחים. יתר על כן, אוכלוסייה קטנה של DsRed + / Ly6G - תאים הם נצפו, העשויים להכיל מונוציטים דלקתיים מקרופאגים מופעל. בסרטון 40 דקות זמן לשגות, נויטרופילים Ly6G + המתעוררים בתוך הנגע בעור דלקתי להפגין תנועת הזחילה אמבה דמוי טיפוסי (סרט משלימה 1). נתיבי הנדידה Cell מתבצע המעקב אחר להשוות התנהגויות ניע של DsRed + / Ly6G + ו DsRed - / Ly6G + אוכלוסיות נויטרופילים (איור 2 ב). עלילת מסלול מנתח עולה כי שני אוכלוסיות נויטרופילים להציג הגירה "אקראית" פעם בחלל תאיים הוזן (איור 2 ג). מעניין,DsRed + / Ly6G + נויטרופילים התערוכה מהירות גבוהה משמעותית לעומת DsRed שלהם - / Ly6G + עמיתיהם (איור 2 ד). הדבר מצביע על קשר בין תחול נויטרופילים תנועתיות מואץ נגעים דלקתיים.

כדי לפקח על העיתוי של הטרמה נויטרופילים, סדרה של קטעי וידאו זמן לשגות נרשמו החל בזמנים שונים לאחר טיפול OX (סרטים משלימים 2 - 4). DsRed - / Ly6G + תאים, נויטרופילים המנוחה, להיות מורגש על שטח extravascular כבר לאחר 8 - 12 שעות לאחר יישום OX ומספרם להישאר נמוך יחסית לאחריו (איור 2E, סרטים משלימים 3, 4). נהפוך הוא, מספר DsRed + / Ly6G + תאים, נויטרופילים דרוך, ותגבר בנקודות זמן מאוחר יותר, החל מהשעה 14 - 16 שעות לאחר יישום OX. חלק DsRed + תאים בהדרגה לרכוש אותות DsRed לאחר גיוס למרחב extravascular בתקופה זו (איור 2F, משלימה Movie 5). בשעה 16 - 20 שעות, ברוב של נויטרופילים Ly6G + extravascular נחשבים "דרוך" מבוסס על הביטוי DsRed שלהם. תצפיות אלו חושפות את הגודל, טמפו, ומיקום של הטרמה נויטרופילים המתרחש נגעים דלקתיים בעלי חיים.

איור 1
איור 1:. Phenotyping של עכברים pIL1-DsRed (א) cytometry זרימה מנתח להפגין אוכלוסייה של תאי מיאלואידית (G1) מבוסס על FSC ופרמטרים SSC. (ב) Histograms בערוץ FL2 להראות את אחוז התאים DsRed + בתוך השער G1 של תאים מעכברים PIL-DsRed (אדום) או מעכברים WT (כחול). נתונים מייצגים ב"להאס שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. ויזואליזציה של פעילויות ניע של DsRed + / Ly6G + נויטרופילים ב דלקת עור (א) תמונות מיקרוסקופיה confocal סטטי רשמה 24 שעות לאחר המופע טיפול OX שלוש אוכלוסיות לויקוציטים במרחב extravascular, כלומר, DsRed + / Ly6G + תאים. (כוכביות), DsRed - / Ly6G + תאים (משולשים), ו DsRed + / Ly6G - תאים (חיצים). בר = 20 מיקרומטר. DsRed + / Ly6G + תאים (אדום) ו DsRed - / Ly6G + תאים (כחול) מושווים עבור migratoנתיבים ר"י (B), מגרשים המסלול (C), ומהירות (D) מסרט 40 דקות זמן לשגות שרשמה מיקרוסקופיה confocal החל 24 שעות לאחר יישום OX (סרט משלימה 1). (ד) ברים מצביע מתכוונים ערכי מהירות. *** P <0.001. (E) המספרים של DsRed + / Ly6G + תאי DsRed - / Ly6G + תאים נספרים מתוך סדרה של זמן לשגות סרטים נרשמו בזמן נקודות שונות לאחר יישום OX (סרטים משלימים 2 עד 4). הנתונים המוצגים הם המספרים הסלולריים / מ"מ 2 (אמצעי ± סטיית תקן) מחושבים משלוש תמונות רצופות. (F) תמונות סטטיות נוצרות מסרט זמן לשגות רשמה 11 כדי 14.5 שעות לאחר הציור OX (סרט משלימה 5). החץ מצביע על תא Ly6G + שרוכש ביטוי DsRed במרחב extravascular במהלך תקופת המעקב.בר = 50 מיקרומטר. תמונות הן בתמונות בהפניה 22 עם רשות (כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc.). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

. סרט משלימה 1: התנהגות ניע של DsRed + נויטרופילים ב דלקת עור (ב 24 שעות לאחר הציור OX) תמונות מיקרוסקופיה Confocal להראות את תנועתיות של DsRed + / Ly6G + תאים (ורוד) ו DsRed - / Ly6G + תאים (כחול) מרחב extravascular. כלי דם נראים בירוק. בר = 20 מיקרומטר. הווידאו לשכפל בהפניה 22 עם רשות (כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc.). אנא CLאיכס כאן כדי לצפות בסרטון זה.

. סרט משלימה 2: התנהגות ניע של DsRed + נויטרופילים ב דלקת עור (ב 4 שעות לאחר הציור OX) תמונות מיקרוסקופיה Confocal להראות DsRed + / Ly6G + תאים (ורוד) ו DsRed - / Ly6G + תאים (כחול) במרחב extravascular . כלי דם נראים בירוק. Autofluorescence הוא הווה הקשורים זקיקי שיער. בר = 100 מיקרומטר. הווידאו לשכפל בהפניה 22 עם רשות (כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc.). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

סרט משלימה 3: התנהגות ניע של DsRed + נויטרופילים ב Inf. נגעי עור lammatory (בשעה 8 שעות לאחר הציור OX) תמונות מיקרוסקופיה Confocal להראות DsRed + / Ly6G + תאים (ורוד) ו DsRed - / Ly6G + תאים (כחול) במרחב extravascular. כלי דם נראים בירוק. Autofluorescence הוא הווה הקשורים זקיקי שיער. בר = 100 מיקרומטר. הווידאו לשכפל בהפניה 22 עם רשות (כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc.). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

סרט משלימה 4: התנהגות ניע של DsRed + נויטרופילים ב דלקת עור (ב -11 - 19 שעות לאחר הציור OX) תמונות מיקרוסקופיה Confocal להראות DsRed + / Ly6G + תאים (ורוד) ו DsRed - / Ly6G + תאים (כחול). extravaשטח scular. כלי דם נראים בירוק. Autofluorescence הוא הווה הקשורים זקיקי שיער. בר = 100 מיקרומטר. הווידאו לשכפל בהפניה 22 עם רשות (כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc.). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

סרט משלימה 5: רכישת איתותי DsRed ידי Ly6G + נויטרופילים מתוך סרט הזמן לשגות מוצג משלים וידאו 4, וידאו גדלה גבוה זה מראה את התהליך שבו תא + Ly6G (מסומן בחץ) רוכש ביטוי DsRed ב extravascular. שטח במהלך תקופת המעקב (11-14.5 שעות לאחר ציור OX). בר = 50 מיקרומטר. הווידאו לשכפל בהפניה 22 עם רשות (כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של Immunologists, Inc.). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מטרת מחקר זה היא לפתח טכנולוגיה לניטור התהליך יחול נויטרופילים בעלי חי חיים, אשר טרם התקיימו על ידי הטכניקות זמינות כרגע. כדי להשיג מטרה זו, שלוש מתודולוגיות הוקמה מבוצעת: 1) אינדוקציה של דלקת עור IL-1β עכברי כתב DsRed מונחה אמרגן כאמצעי של הטרמה, 2) in vivo תיוג של נויטרופילים עם מינונים נמוכים של מצומדות-קרינה אנטי Ly6G מב, ו -3) הדמיה מיקרוסקופית confocal intravital. השילוב של שלוש שיטות אלה מאפשר הדמיה של פעילויות הניע של נויטרופילים דרוכים (DsRed + / Ly6G +) ב דלקת עור. כיוון ההגירה והמהירות של נויטרופילים הדרוכים לכמת נוסף באמצעות מעקב נתיב נדידה. על ידי הקלטת סדרה של קטעי וידאו זמן לשגות, קינטיקה בזמן האמת של הופעתה נויטרופילים דרוכה מנוטרת באתר דלקתי ורכישת ביטוי DsRed על ידי iנויטרופילים ndividual הוא ציין גם במרחב extravascular. לכן, התהליך הדינמי של הטרמה נויטרופילים כבר דמיין בהצלחת חי חיות בפעם הראשונה באמצעות הטכנולוגיה המוצגת כאן.

טכנולוגיה זו היא מועסקת בכמה שלבים קריטיים. ראשית, רקמות עור הם חלקי הגוף הנוחים ביותר עבור הדמית intravital. יישום מקומי של OX על האוזן העכבר מאפשר הדמיה ישירה של התנהגויות תא החיסון בעור מודלק תחת מיקרוסקופ confocal. שנית, העכבר חייב להיות מסומם כל זמן במהלך ההדמיה מחייבת הזרקות חוזרות של הרדמה. עם זאת, על-הרגעה עלולה לגרום עכבר למות במהלך ההדמיה. כדי למנוע מינון יתר, מינונים נמוכים של הרדמה (וחצי או שליש המנה המלאה) מומלצי הדמיה לטווח ארוך. שלישית, הקרינה מצומדות מב ספציפי נויטרופילים חייב להיות מוזרק לסירוגין בשל תוחלת החיים הקצרה של נויטרופילים בעכברים (זמן מחצית החיים של 8-10 שעות 30). ד"ר אחרון, פוקוסIFT היא בעיה רצינית במהלך הדמית הזמן לשגות, אשר יכול להיגרם על ידי גורמים שונים כולל הפרשי טמפרטורות, תנועת גוף עכבר, אוזן נפיחות לאורך זמן, ואת תנודות נובעות פעולת המכשיר 31. כמה שיטות פותחו כדי למנוע היסחפות, כגון ניהול של מנה קבועה של סדציה במהלך הדמיה, לתקן את אוזן העכבר במקום על ידי מקליטה בשקופית זכוכית מעל זה על הבמה, התקנה בתא סביבתי לספק חמצן וחום אל מסומם אורגניזם כמו גם על ידי מחדש באופן ידני התמקדות ההיקף כשצריך 32,33.

זה חשוב לא פחות לציין את המגבלות של פרוטוקול זה. ראשית, החלמת עכבר איטית (12 - 16 שעות) לאחר שעת הדמית תקופת 8 באורך הוא ציין עקב הרגעה רציפה, המציין כי בפרוטוקול זה לא יכול להיות מתאים לניסוי כה ארוך. גישה חלופית היא להשתמש בעכברים כמה ברצף על פני תקופת הדמיה ולא uלשיר אחד בלבד. שנית, דליפה הדרגתית של FITC-dextran במחזור הוא ציין במהלך הדמיה לאורך זמן, אשר נגרמת ככל הנראה על ידי חדירות מוגברת של כלי דם בעור במדינה הדלקתית 34. לכן, להדמיה של כלי דם נפגע במידה ניכרת נתון קרינה מופחתת במחזור בשלבים מאוחר יותר של הדמיה. לחלופין, אפשר להשתמש לקטינים מצומדות fluorescently כגון isolectin B4 לציון כלי דם כמו זו מקיימת לתאי אנדותל כלי הדם 35.

בנוסף להדמיה של התהליך יחול נויטרופילים נגעים דלקתיים בעור, הטכנולוגיה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת גם במסגרות ניסיוניות רבות אחרות. בשילוב עם חלונות הדמיה שפותחה לאחרונה, מיקרוסקופיה intravital המגדירה את ההתנהגויות של נויטרופילים דרוכים הייתה להעריכם ברקמות עמוקות ואיברים כולל מוח, בלוטות חלב, ריאות, אברי בטן 36-39. יתר על כן, ויזואליזציה של פריםing / הפעלה של סוגי תאים אחרים כגון מונוציטים מקרופאגים יכולה להיות מושגת באמצעות עכברי pIL1-DsRed יחד עם תיוג in vivo באמצעות קרינת מצומדות מב ספציפית לסוג של עניין התא. יחדיו, לא רק טכנולוגיה זו לספק מסגרת יסוד הדמית intravital של התהליך הטרמה של נויטרופילים בחי חיים, אבל זה גם חושף גישות חדשות לחקר ההתנהגות והתפקוד של תאים חיסוניים אחרים במדינות שונות דלקתיות התגלגלות ברקמות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin sodium APP Pharmaceuticals NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer Lonza 10-548E
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F0926
Lipopolysaccharides Sigma-Aldrich L4391
Ketamine hydrochloride Hospira NDC 0409-2051-05
Xylazine LLOYD Laboratory NADA #139-236
Acepromazine Boehringer Ingelheim ANADA 200-361
Hair-removal cream Church & Dwight
Acetone Fisher Scientific A16P4
Oxazolone Sigma-Aldrich E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody BioLegend 127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle BD 329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa Sigma-Aldrich 74817
Butterfly infusion set (27 G needle) BD 387312
FACSCalibur cytometer BD
CellQuest Pro software BD
Confocal microscope Olympus FV1000
Metamorph Software Universal Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
  3. Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
  4. El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
  5. Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
  6. Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
  7. Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
  8. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  9. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  10. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  11. Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
  12. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  13. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
  14. Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
  15. Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
  16. Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
  17. Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
  18. Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
  19. Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
  20. Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
  21. Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
  22. Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
  23. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  24. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  25. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  26. Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
  27. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
  28. Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
  29. Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
  30. Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
  31. Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
  32. Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
  33. Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
  34. Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
  35. Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
  36. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  37. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  38. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
  39. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).

Tags

אימונולוגיה גיליון 112 אימונולוגיה מיקרוסקופיה intravital נויטרופילים תחול, עכבר דלקת עור מיקרוסקופיה confocal תנועתיות
הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yao, Y., Liu, Y., Takashima, A.… More

Yao, Y., Liu, Y., Takashima, A. Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice. J. Vis. Exp. (112), e54070, doi:10.3791/54070 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter