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Immunology and Infection

न्युट्रोफिल भड़काना के intravital इमेजिंग आईएल 1β प्रमोटर संचालित DsRed रिपोर्टर चूहों का उपयोग

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54070
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Toledo College of Medicine and Life Sciences, 2Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Pathophysiology, Southern Medical University (China)

Abstract

न्यूट्रोफिल मानव रक्त परिसंचरण में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स कर रहे हैं और जल्दी से भड़काऊ साइट्स के लिए भर्ती कर रहे हैं। भड़काना एक महत्वपूर्ण घटना है कि न्यूट्रोफिल की phagocytic कार्यक्षमता को बढ़ाती है। हालांकि व्यापक अध्ययन के संक्रमण और चोट के दौरान अस्तित्व और न्यूट्रोफिल भड़काना के महत्व का अनावरण किया है, इस प्रक्रिया को विवो में उपलब्ध नहीं किया गया है visualizing का मतलब है। प्रतिदीप्ति संयुग्मित विरोधी लिम्फोसाइट प्रतिजन के इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया - 2) इन विवो न्यूट्रोफिल लेबलिंग भड़काना के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया - 1) DsRed संवाददाता संकेत: प्रदान प्रोटोकॉल तीन तरीके के संयोजन से न्यूट्रोफिल रहने वाले जानवरों में भड़काना के गतिशील प्रक्रिया की निगरानी के लिए सक्षम बनाता है 6G (Ly6G) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) और 3) intravital confocal इमेजिंग। कई महत्वपूर्ण कदम इस प्रोटोकॉल में शामिल कर रहे हैं: oxazolone प्रेरित माउस कान त्वचा में सूजन, पशुओं के उचित बेहोश करने की क्रिया, विरोधी Ly6G एमएबी के बार-बार इंजेक्शन, और पिछलाइमेजिंग के दौरान ध्यान केंद्रित करने के बहाव के ention। हालांकि कुछ सीमाएं ऐसा ही एक माउस में निरंतर इमेजिंग समय (~ 8 घंटा) की सीमा और fluorescein आइसोथियोसाइनेट-dextran भड़काऊ राज्य में रक्त वाहिकाओं से रिसाव के रूप में मनाया गया है, इस प्रोटोकॉल के intravital इमेजिंग के लिए एक बुनियादी ढांचा प्रदान करता है primed न्यूट्रोफिल व्यवहार और समारोह है, जो आसानी से माउस सूजन मॉडल में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की परीक्षा के लिए विस्तारित किया जा सकता है।

Introduction

न्यूट्रोफिल संचलन में सबसे प्रचुर मात्रा में और अल्पकालिक ल्यूकोसाइट्स हैं। वे तेजी से संक्रमण या चोट की साइटों, जहां वे रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और proteases 1 युक्त कणिकाओं के साथ प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन मध्यवर्ती की विज्ञप्ति के माध्यम के रूप में पेशेवर फ़ैगोसाइट की सेवा के लिए भर्ती कर रहे हैं। उनकी भर्ती के दौरान, न्यूट्रोफिल माइक्रोबियल उत्पादों, chemoattractants, और भड़काऊ साइटोकिन्स सहित विभिन्न एजेंटों द्वारा "primed" कर रहे हैं, सूजन 2 के एक स्थल पर आगमन पर स्पष्ट रूप से बढ़ाया भक्षककोशिकीय कार्यक्षमता में जिसके परिणामस्वरूप। न्यूट्रोफिल भड़काना के तंत्र में बड़े पैमाने पर इन विट्रो 3,4 में अध्ययन किया गया है; हालांकि, विवो में प्रक्रिया की निगरानी गतिशील तिथि करने के लिए संभव नहीं हो पाया है।

हाल ही में, intravital इमेजिंग visualizing और रहने वाले जीवों में जैविक प्रक्रियाओं की गतिशीलता सेलुलर बढ़ाता के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक बन गया है। Intraviताल इमेजिंग पारंपरिक एक फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी के माध्यम से किया जा सकता है (जैसे, confocal) या multiphoton माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण 5। समय के साथ, पर्याप्त सुधार इस तकनीक वृद्धि की छवि संकल्प, बेहतर इमेजिंग गहराई को सक्षम करने में हासिल किया गया है, ऊतक photodamage, और बढ़ाया छवि स्थिरीकरण 6.7 कमी आई है। अपनी अनूठी सेलुलर प्रवास और समय के साथ बातचीत के गतिशील दृश्य सक्षम करने की क्षमता को देखते हुए, intravital माइक्रोस्कोपी बड़े पैमाने पर इम्यूनोलॉजी 8 में अध्ययन के विभिन्न क्षेत्रों के लिए लागू किया गया है। Intravital इमेजिंग बेहतर समझते हैं और पशु मॉडल में रहने वाले दोनों सेलुलर और आणविक स्तर पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया contextualize करने immunologists सक्षम बनाता है।

ट्रांसजेनिक में हाल के अग्रिमों के रूप में अच्छी तरह से दस्तक संवाददाता चूहों के रूप में रहने वाले जानवरों में न्यूट्रोफिल के गतिशील व्यवहार की निगरानी के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान की है। Lysozyme एम प्रमोटर संचालित बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन दस्तकचूहों को मोटे तौर पर परिस्त्राव, बैक्टीरियल संक्रमण, सूजन और बाँझ 9-15 सहित विभिन्न सूजन प्रक्रियाओं के दौरान न्यूट्रोफिल, monocytes, और मैक्रोफेज की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों एक cytoplasmic प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण biosensor व्यक्त सूजन आंत 16 के भीतर न्युट्रोफिल कोशिकी विनियमित माइटोजन काइनेज और प्रोटीन काइनेज एक की गतिविधियों के अध्ययन में नियोजित किया गया है। एक murine न्यूट्रोफिल में प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति के लिए उच्च विशिष्टता के साथ मॉडल कैटचप दस्तक माउस, जो Cre recombinase के रूप में अच्छी तरह का उत्पादन फ्लोरोसेंट प्रोटीन tdTomato, जो अपने आप लिम्फोसाइट प्रतिजन 6G (Ly6G) 17 की अभिव्यक्ति के लिए युग्मित है के रूप में है। इस मॉडल के माध्यम से Ly6G की कमी न्यूट्रोफिल के दृश्य का प्रदर्शन किया है कि इन कोशिकाओं बाँझ या में संक्रामक विवो भड़काऊ संदर्भों की एक किस्म में सामान्य कार्यक्षमता डालती है। ट्रांसजेनिक चूहों DsRed फ्लोरोसेंट पी व्यक्तन्यूट्रोफिल, भड़काऊ monocytes, और सक्रिय मैक्रोफेज शामिल करने के लिए माना जाता है - - माउस interleuikin-1β (आईएल 1β) प्रमोटर (pIL1-DsRed) आईएल 1β उत्पादक कोशिकाओं की गतिशील व्यवहार कल्पना करने के लिए उपयोग किया गया है के नियंत्रण में जीन rotein उभरते सूजन त्वचा 18 में।

विवो में लेबलिंग में सूजन के ऊतकों में न्यूट्रोफिल के सेलुलर और आणविक व्यवहार पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में काम कर सकते हैं। लेबल विरोधी जीआर 1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) fluorescently की कम खुराक की नसों में इंजेक्शन, जीआर 1 + न्यूट्रोफिल की भर्ती के झरना के बाद स्ताफ्य्लोकोच्चुस 19 से संक्रमित माउस त्वचा के घावों में कल्पना की गई है। Streptavidin- युक्त conjugates के vivo प्रशासन संयुग्मित 705 एनएम क्वांटम डॉट्स और biotinylated विरोधी Ly6G एमएबी विशेष रूप से घूम न्यूट्रोफिल 20 लेबल। इसके अलावा, neutroph में इस तरह के conjugates के endocytosisआईएल पुटिकाओं interstitium में पलायन neutrophils में उच्च गति पुटिका परिवहन की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। विवो में पी selectin के खिलाफ प्रतिदीप्ति संयुग्मित एंटीबॉडी, ग्लाइकोप्रोटीन ligand-1 (PSGL-1), एल selectin (CD62L) αM इंटीग्रिन साथ लेबलिंग (CD11b ) और केमोकाइन (CXC मूल भाव) रिसेप्टर 2 (CXCR2) एक TNFα प्रेरित भड़काऊ मॉडल के शुरू में सूजन 21 के दौरान खेलने पर विनियामक तंत्र elucidated किया गया है। फूट डालना न्यूट्रोफिल फैलाना PSGL-1-समृद्ध uropods CD11b और CXCR2, रिसेप्टर्स कि न्यूट्रोफिल प्रवास ड्राइव और सूजन आरंभ के पुनर्वितरण में जिसके परिणामस्वरूप, सक्रिय प्लेटलेट्स पर CD62L वर्तमान के साथ बातचीत करने के लिए।

आईएल 1β हस्ताक्षर जीन है कि primed न्यूट्रोफिल 22 में उठाया है में से एक है। PIL1-DsRed संवाददाता चूहों में, DsRed प्रतिदीप्ति संकेतों (अर्थात्।, आईएल 1β प्रमोटर के सक्रियण) सकारात्मक आईएल 1β mRNA अभिव्यक्ति और आईएल 1β प्रोटीन के उत्पादन के साथ संबंध स्थापित। <sup> 18 न्यूट्रोफिल भड़काना की प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए, एक intravital माइक्रोस्कोपी विधि त्वचा की सूजन के प्रतिदीप्ति संयुग्मित विरोधी Ly6G एमएबी साथ न्यूट्रोफिल के vivo लेबलिंग निम्नलिखित pIL1-DsRed माउस मॉडल में oxazolone (बैल) के साथ प्रेरण शामिल विकसित किया गया था। इस मॉडल के माध्यम से, यह व्यवहार और विभिन्न बीमारियों और विकारों के पशु मॉडल में primed न्यूट्रोफिल के समारोह में अध्ययन करने के लिए संभव है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार में प्रदर्शन और टोलेडो विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं।

1. pIL1-DsRed चूहे की phenotyping

नोट: वंश जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) C57BL6 चूहों के साथ विषमयुग्मजी pIL1-DsRed चूहों प्रजनन से उत्पन्न कर रहे हैं। तीन से चार सप्ताह के लिए पुराने पिल्ले phenotyping के लिए तैयार माना जाता है। चूहों का खून बह रहा है अवअधोहनुज मामूली संशोधनों के 23 के साथ एक स्थापित प्रोटोकॉल निम्नानुसार है।

  1. माउस पिल्ले के पूरे रक्त से सफेद रक्त कोशिकाओं के अलगाव
    1. प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब हेपरिन के 20 μl जोड़ें।
    2. पिंजरे से एक पिल्ला मोल। पिल्ला की पहचान टैग रिकॉर्ड। यह अवअधोहनुज नस से खून संग्रह से पहले पिल्ले anesthetize करने के लिए आवश्यक नहीं है।
    3. गर्दन कूड़ा द्वारा पिल्ला पकड़ो और वीं में अवअधोहनुज नस बेधई गाल थैली एक 5 मिमी नुकीला का उपयोग कर। एक छोटे से पंचर बनाने के लिए इतना है कि रक्त की बूंदों प्रवेश के बिंदु से पसीजना पर्याप्त बल लागू करें। एक पिल्ला के लिए एक नई सुई का प्रयोग करें।
    4. एक हेपरिन युक्त microcentrifuge ट्यूब में पिल्ला प्रति रक्त के 5 बूँदें - 3 लीजिए। पंचर साइट को साफ और रक्तस्तम्भन की सुविधा के लिए दबाव डालते हैं।
    5. नए पिंजरे में पिल्ला रखो और जानवरों की सुविधा के लिए पिंजरे लौटने से पहले 30 मिनट के लिए निरीक्षण करते हैं।
    6. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में जाना जाता है एक phenotype के वयस्क चूहों से खून ले लीजिए।
    7. प्रत्येक ट्यूब, भंवर ट्यूबों के लिए लाल रक्त कोशिका lysing बफर के 500 μl जोड़ें, और 5 के लिए सेते हैं - बर्फ पर 10 मिनट।
    8. प्रत्येक ट्यूब में सेल निलंबन के नीचे भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 500 μl - धीरे 400 जोड़ें। एक स्पष्ट इंटरफेस ऊपरी परत सेल निलंबन और FBS के निचले-परत के बीच मनाया जा सकता है।
    9. कैप ट्यूब और 5 मिनट के लिए 1,500 × छ सेंट्रीफ्यूज नमूने हैं।
    10. दोहराएँ 1.1.7 कदम - 1.1.9 फर के लिएवहाँ लाल रक्त कोशिकाओं को हटा दें। यदि सेल पहली बार पर्याप्त है दोहराना नहीं है। गोली centrifugation के बाद विचार करने के लिए मुश्किल होना चाहिए।
  2. Lipopolysaccharide (LPS) उत्तेजना और संस्कृति
    1. पूरा रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) 1640 मध्यम के 200 μl में Resuspend कोशिकाओं।
    2. ट्यूब एक प्रवाह cytometry सेल निलंबन स्थानांतरण।
    3. पूरा RPMI 1640 मध्यम के 990 μl के साथ LPS शेयर समाधान के 10 μl (1 मिलीग्राम / एमएल) के मिश्रण से समाधान काम कर LPS बनाओ।
    4. 10 माइक्रोग्राम / एमएल सेल निलंबन के 200 μl का हल काम कर एलपीएस के 20 μl जोड़ें।
    5. कैप नलियों शिथिल और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए नमूने सेते हैं।
  3. फ्लो का विश्लेषण
    1. से फ्लो के लिए डाटा अधिग्रहण कार्यक्रम खोलें। अधिग्रहण टेम्पलेट अधिग्रहण नमूना करने के लिए पूर्व निर्धारित करें।
    2. उपकरण पट्टी में डॉट प्लॉट उपकरण पर क्लिक करें। एक के लिए ड्राrward तितर बितर (एफएससी) बनाम ओर तितर बितर (एसएससी) साजिश है। रैखिक पैमाने पर करने के FSC और एसएससी वोल्टेज मानकों को निर्धारित करें।
    3. FSC और एसएससी की सबसे कम थ्रेसहोल्ड कोशिकामापी द्वारा अनुमति का चयन करें। क्रमश: FSC और एसएससी के लिए थ्रेसहोल्ड लागू 200 और 50,।
    4. एफएससी बनाम एसएससी साजिश के भीतर, एक गेट G1 जो monocytes, granulocytes, और वृक्ष के समान कोशिकाओं शामिल है, और शामिल मलबे, लाल रक्त कोशिकाओं और लिम्फोसाइटों आकर्षित।
    5. उपकरण पट्टी में हिस्टोग्राम उपकरण पर क्लिक करें। एक FL2 (लाल प्रतिदीप्ति चैनल) हिस्टोग्राम ड्रा। एक गेट आकर्षित करने के लिए सभी DsRed सकारात्मक घटनाओं में शामिल करने के लिए FL2 संकेतों के आधार रेखा और एक सकारात्मक नियंत्रण नमूना स्थापित करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना का प्रयोग करें।
    6. कोशिकामापी की Fluidics नियंत्रण कक्ष पर, द्रव मोड "रन" और प्रवाह की दर "हाय" (लगभग 60 μl / मिनट) की स्थापना की। प्रत्येक नमूना के लिए 10,000 घटनाओं मोल।
    7. G1 गेट से DsRed सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत को मापने के द्वारा पिल्ला phenotype निर्धारित करते हैं।
  1. intraperitoneal (आईपी) 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine, 10 मिलीग्राम / किलो xylazine, और 1 मिलीग्राम / किग्रा acepromazine युक्त एक संवेदनाहारी कॉकटेल के इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize। पर्याप्त रूप से anesthetized चूहों को पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए हिंद पंजा वापसी नहीं दिखाते।
  2. माउस के दोनों कानों के पृष्ठीय सतह के लिए बालों को हटाने क्रीम लगाओ। 1 मिनट 30 सेकंड रुको। पानी गीला कपास के साथ कान की सतह को साफ कर लें और हवा शुष्क करने की अनुमति।
  3. उपाय कान मोटाई माइक्रोमीटर का उपयोग करते हुए और एक अलग पिंजरे में माउस की जगह। (- 30 मिनट ~ 15) संज्ञाहरण से वसूली तक का निरीक्षण करें। त्वचा की सूजन बालों को हटाने के उत्पाद से प्रेरित हल करने के लिए, माउस 3 दिनों के लिए आराम करने के लिए पहले आगे प्रयोग किया जाता है की अनुमति देते हैं।
  4. 1 मिलीलीटर एसीटोन में बैल की 16.7 मिलीग्राम भंग और जैतून का तेल के 250 μl के साथ बैल / एसीटोन समाधान के 750 μl मिश्रण से 1.25% (w / v) बैल तैयार करें। 250 और साथ एसीटोन के 750 μl मिश्रण से वाहन समाधान तैयार# 181; जैतून का तेल के एल।
  5. संवेदनाहारी कॉकटेल (2.1) के आईपी इंजेक्शन द्वारा माउस को फिर से anesthetize। पहले के रूप में कान मोटाई मापने।
  6. सही कान के प्रत्येक पक्ष पर 1.25% बैल की 12.5 μl लागू करें। बाएं कान के प्रत्येक पक्ष पर एसीटोन / जैतून का तेल वाहन समाधान के 12.5 μl लागू करें।
  7. माउस पिंजरे के साथियों से अलग जब तक पूरी तरह से अन्य चूहों द्वारा अपने कान के अपमान को रोकने के लिए, तो इसके मूल पिंजरे में माउस की जगह है और पशु आवास सुविधा के लिए वापसी करना बरामद रखें।
    नोट: बालों को हटाने कान मोटाई के परिवर्तन द्वारा निम्न नाबालिग त्वचा की सूजन में परिणाम हो सकता है। इस छोटी सी सूजन 3 दिन बाद हल हो जाएगा सामान्य कान मोटाई से इसकी पुष्टि की। 24 घंटे के लिए सामयिक आवेदन के बाद, बैल का इलाज कान महत्वपूर्ण (पी <0.01) की तुलना में वाहन समाधान अकेले इलाज कान में सूजन दिखा।

pIL1-DsRed चूहे में न्यूट्रोफिल 3. लेबलिंग

नोट: कम खुराक च द्वारा न्यूट्रोफिल की विवो लेबलिंग मेंluorescence संयुग्मित न्यूट्रोफिल विशेष एमएबी एक हाल ही में विकसित प्रोटोकॉल 19 इस प्रकार है। रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन में कुछ संशोधनों के साथ 24 एक स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 90 μl में 0.5 मिलीग्राम / एमएल एलेक्सा स्त्राव 647 संयुग्मित विरोधी Ly6G एमएबी (क्लोन 1A8) के 10 μl गिराए द्वारा विरोधी Ly6G एमएबी काम कर समाधान तैयार है।
  2. 28 गेज सुई के साथ एक अंडर 100 इंसुलिन सिरिंज में विरोधी Ly6G एमएबी काम कर समाधान (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के 100 μl स्थानांतरण।
  3. पहले से वर्णित संवेदनाहारी कॉकटेल (2.1) के आईपी इंजेक्शन द्वारा एक वयस्क pIL1-DsRed माउस anesthetize। anesthetized माउस पेट के नीचे एक स्वच्छ काम बोर्ड पर रखें।
  4. एक माउस आंखों के लिए त्वचा को कोमल पृष्ठीय नीचे दबाव और उदर लागू आंशिक रूप से सॉकेट से नेत्रगोलक फैलाना है।
  5. ध्यान रेट्रो कक्षीय में औसत दर्जे का नेत्रकोण में लगभग 30 डिग्री के कोण पर सुई जगह है, नीचे बेवल,साइनस।
    नोट: ऑपरेटर दबाव, प्रवेश और एक बार साइनस में सुई सम्मिलित राहत मिली प्रतिरोध महसूस कर सकते हैं।
  6. धीरे से और आसानी विरोधी Ly6G एमएबी के 100 μl काम कर माउस में समाधान (5 माइक्रोग्राम एमएबी / माउस / इंजेक्शन) इंजेक्षन। सुई जल्दी से निकालें। खून बह रहा है की एक छोटी राशि के लिए एक सफल इंजेक्शन चलता है।
  7. तुरंत सही और बाईं माउस कान पर 1.25% बैल और वाहन समाधान लागू होते हैं।
  8. 8 घंटे के बाद, एक ही माउस में रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन के माध्यम से हौसले से तैयार विरोधी Ly6G एमएबी काम समाधान (5 माइक्रोग्राम एमएबी / माउस / इंजेक्शन) के 100 μl प्रशासन।
  9. रक्त वाहिकाओं कल्पना, तुरंत इमेजिंग से पहले 30 मिलीग्राम / एमएल fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) के 100 μl प्रशासन रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन के माध्यम से dextran (150 केडीए) संयुग्मित।

जनहित याचिका-1-DsRed चूहे में न्युट्रोफिल भड़काना 4. intravital इमेजिंग

  1. संवेदनाहारी कॉकटेल (2.1) के आईपी इंजेक्शन के साथ माउस anesthetize।0; माउस आँखों के लिए पशु चिकित्सा मरहम लागू जबकि इमेजिंग के लिए संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए।
    1. पीबीएस के एक बराबर मात्रा के साथ मूल संवेदनाहारी कॉकटेल के 500 μl गिराए द्वारा 1 मिलीलीटर आधा खुराक संवेदनाहारी कॉकटेल तैयार करें।
    2. एक तितली 27 गेज सुई के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज के लिए आधा खुराक संवेदनाहारी कॉकटेल स्थानांतरण।
    3. intraperitoneally माउस पेट में तितली की सुई डालें और टेप से पेट के लिए तितली पंख तय कर लो।
  2. इमेजिंग मंच के केंद्र में एक गिलास coverslip रखें। coverslip के किनारों टेप जगह में पकड़ करने के लिए।
  3. पीबीएस की एक बूंद माउस कान के उदर सतह पर और साथ ही coverslip पर रखें।
  4. स्थिति coverslip पर अपने कान के साथ माउस anesthetized। कान की नोक, पृष्ठीय पक्ष माउंट नीचे, coverslip और एक गिलास स्लाइड, भी टेप के माध्यम से जगह में आयोजित बीच कान sandwiching द्वारा।
  5. एक बहु लेजर प्रतिदीप्ति confocal खुर्दबीन और सभी संबंधित ई चालू करेंquipment। परिवेश प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए कमरे में रोशनी को बंद कर दें।
  6. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें। डाई सूची मेनू में फ्लोरोसेंट रंगों का पता लगाने के लिए लेजर चैनलों का चयन करें।
  7. रक्त वाहिकाओं और DsRed + ऐपिस के माध्यम से कोशिकाओं से लाल संकेतों से हरी संकेतों के अवलोकन से सूजन कान त्वचा पर ध्यान केंद्रित करने को समायोजित करें।
  8. 2 μs / पिक्सेल की गति स्कैन और 512 × 512 पिक्सल के संकल्प के साथ एक तेजी से स्कैन करते हैं। लाइव देखें मेनू में प्रत्येक चैनल के लिए एक pseudocolor का चयन करें। अंत सेट और स्कैनिंग के स्थान शुरू करने के लिए ध्यान केंद्रित घुंडी को समायोजित करें।
  9. 8 μsec / पिक्सेल और 800 × 800 या 1024 × 1024 पिक्सल के संकल्प - 4 की गति स्कैन के साथ धीमी गति से स्कैन करते हैं। उच्च वोल्टेज समायोजित हासिल है, और प्रत्येक व्यक्ति के चैनल पर ऑफसेट संकेतों की तीव्रता को अधिकतम जबकि संतृप्ति (लाल पिक्सल) से परहेज। वहाँ हर चैनल में केवल कुछ ही लाल पिक्सल होना चाहिए।
  10. वें स्कैनिंग द्वारा तीन आयामी छवि सेट बनाएँई कान त्वचा परत corneum में अल्पज्ञता शुरुआत और एक्स, वाई, × 317 माइक्रोन × 30 माइक्रोन (40x उद्देश्य) 317 माइक्रोन के Z संस्करणों के साथ नीचे की ओर प्रगति, 635 माइक्रोन × 635 माइक्रोन × 30 माइक्रोन (20X उद्देश्य), या 1,270 माइक्रोन × 1,270 माइक्रोन × 50 2 माइक्रोन Z-कदम पर माइक्रोन (10X उद्देश्य)।
    ध्यान दें: परत corneum एपिडर्मिस की सबसे बाहरी परत है और आसानी से अपनी मजबूत autofluorescence संकेत के आधार पर अनुवादित किया जा सकता है।
  11. समय चूक इमेजिंग प्रयोगों में, रिकॉर्ड तीन आयामी चित्र अप करने के लिए 8 घंटे के लिए हर 2 या 4 मिनट।
  12. तितली सुई के माध्यम से आधे खुराक संज्ञाहरण कॉकटेल के 10 μl - रहकर, के रूप में माउस संज्ञाहरण से उबरने के लिए शुरू होता है, हिल मूंछ के अवलोकन के आधार पर उल्लेख किया, 5 प्रशासन।
    नोट: संज्ञाहरण खुराक के सतर्क रहो - अधिक मात्रा माउस मौत का कारण बन सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक जार में साँस लेना संज्ञाहरण अल्पकालिक संज्ञाहरण और एक के लिए माउस के लिए लागू किया जा सकता हैनाक शंकु लंबी अवधि इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  13. मंच से anesthetized माउस निकालें जब इमेजिंग पूरा हो गया है। टेप को अलग करें और माउस के पेट से तितली सुई को हटा दें। पशु आवास की सुविधा में एक अलग पिंजरे करने के लिए माउस लौटें।
    नोट: - 3 घंटा अल्पकालिक इमेजिंग (<1 घंटा) के लिए, चूहों पूरी तरह से संज्ञाहरण से जल्दी से 1 में ठीक हो। लंबी अवधि इमेजिंग (~ 8 घंटा) के लिए, चूहों धीरे धीरे ठीक, 12 की एक विशिष्ट अवधि के सुधार के साथ - 16 घंटा। इस प्रकार, मौखिक पानी प्रशासन गंभीर निर्जलीकरण को रोकने के लिए वसूली की अवधि के दौरान कम से कम कई कई बार सिफारिश की है।
  14. प्रक्रिया इमेजिंग डेटासेट, व्यक्ति की कोशिकाओं पर नज़र रखने के प्रवासी पथ उत्पन्न, और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 25 दिशात्मकता और सेल प्रवास के वेग की गणना।

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Representative Results

pIL1-DsRed चूहों की स्क्रीनिंग प्ररूपी DsRed प्रतिदीप्ति संकेत उनके परिधीय रक्त प्रवाह cytometry का उपयोग कर ल्यूकोसाइट्स द्वारा उत्पादित के आधार पर किया जाता है। LPS उत्तेजना न्यूट्रोफिल, monocytes, और वृक्ष के समान कोशिकाओं 26-28 सहित माइलॉयड कोशिकाओं में आईएल 1β उत्पादन को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। इस प्रकार, पृथक ल्यूकोसाइट्स 4 घंटा प्रवाह cytometry विश्लेषण करने से पहले के लिए LPS के साथ incubated हैं। अगले, gating सेल आकार (एफएससी) और आंतरिक जटिलता (एसएससी) (चित्रा 1 ए), 29, और DsRed संकेत के आधार पर माइलॉयड कोशिकाओं घूम इस गेटेड आबादी में मापा जाता है के लिए निर्धारित है। WT चूहों से घूम माइलॉयड कोशिकाओं न्यूनतम व्यक्त करते DsRed, जबकि pIL1-DsRed चूहों से ही कोशिकाओं से अलग पहचाना DsRed संकेतों (चित्रा 1 बी) व्यक्त करते हैं। pIL1-DsRed चूहों इस phenotyping विधि द्वारा की पहचान बाद के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पूरा phenotyping प्रक्रिया में केवल कुछ लेता हैघंटे - ऊतक फसल, enzymatic पाचन, डीएनए अलगाव, पीसीआर और वैद्युतकणसंचलन सहित पारंपरिक जीनोटाइपिंग तरीकों की तुलना में काफी कम है।

आईएल 1β प्रमोटर सक्रियण हाल ही में न्यूट्रोफिल के एक मार्कर भड़काना 22 के रूप में पहचान की गई है। इस प्रकार, न्यूट्रोफिल भड़काना के गतिशील प्रक्रिया कल्पना और pIL1-DsRed चूहों का उपयोग रहने वाले जानवरों में मूल्यांकन किया जा सकता है। त्वचा की सूजन को प्रेरित करने के लिए, त्वचा sensitizer बैल topically pIL1-DsRed चूहों और वाहन अकेले ही पशु के बाएं कान पर लागू किया जाता है की सही कान पर लागू किया जाता है। रहने वाले जानवरों में न्यूट्रोफिल लेबल करने के लिए, एक हाल ही में विकसित प्रोटोकॉल ठीक पहले fluorescently लेबल विरोधी Ly6G एमएबी की एक छोटी राशि और बैल आवेदन के बाद 8 घंटा प्रशासन द्वारा किया जाता है। रक्त वाहिकाओं का पता लगाने के लिए, FITC-dextran तुरंत इमेजिंग के लिए पहले इंजेक्शन है।

बैल आवेदन, एक के बाद 24 घंटे मेंDsRed की बड़ी संख्या + / Ly6G + कोशिकाओं extravascular अंतरिक्ष (2A चित्रा) में पाए जाते हैं और primed न्यूट्रोफिल का प्रतिनिधित्व करते हैं। की एक छोटी संख्या DsRed / Ly6G + कोशिकाओं को भी पाए जाते हैं, जो सबसे अधिक संभावना आराम कर न्यूट्रोफिल प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, DsRed + / Ly6G की एक छोटी सी आबादी - कोशिकाओं को मनाया जाता है, जो भड़काऊ monocytes और सक्रिय मैक्रोफेज शामिल हो सकता है। एक 40 मिनट का समय व्यतीत हो जाने के वीडियो में, एक सूजन त्वचा घाव के भीतर उभरते Ly6G + न्यूट्रोफिल ठेठ अमीबा की तरह रेंगने आंदोलन (पूरक मूवी 1) दिखा रहे हैं। / Ly6G + न्यूट्रोफिल आबादी (चित्रा 2 बी) - सेल प्रवासी पथ DsRed + / Ly6G + और ​​DsRed के गतिशील व्यवहार तुलना करने के लिए ट्रैक किए गए हैं। ट्रैक की साजिश का पता चलता है कि दोनों न्यूट्रोफिल आबादी प्रदर्शित "यादृच्छिक" पलायन एक बार बाह्य अंतरिक्ष दर्ज किया गया है (चित्रा -2) का विश्लेषण करती है। दिलचस्प है,DsRed + / Ly6G + न्यूट्रोफिल प्रदर्शनी एक काफी उच्च वेग उनकी DsRed के साथ तुलना में - / Ly6G + समकक्षों (चित्रा 2 डी)। इस न्यूट्रोफिल भड़काना और भड़काऊ घावों में त्वरित गतिशीलता के बीच एक संघ पता चलता है।

न्यूट्रोफिल भड़काना, समय चूक वीडियो की एक श्रृंखला के समय पर नजर रखने के लिए बैल उपचार (पूरक फिल्म 2 - 4) के बाद अलग अलग समय पर शुरू दर्ज किए गए। DsRed - 12 घंटा बैल आवेदन के बाद और उनकी संख्या उसके बाद अपेक्षाकृत कम रहने (चित्रा 2 ई, पूरक फिल्म 3, 4) - / Ly6G + कोशिकाओं, आराम न्यूट्रोफिल, detectable extravascular अंतरिक्ष में के रूप में जल्दी के रूप में 8 हो गई है। इसके विपरीत, DsRed + / Ly6G + कोशिकाओं की संख्या, primed न्यूट्रोफिल, उत्तरोत्तर बाद में समय बिंदुओं पर बढ़ाने के लिए, 14 में शुरुआत - बैल आवेदन के बाद 16 घंटा। कुछ DsRed + कोशिकाओं को धीरे-धीरे इस अवधि (चित्रा 2 एफ, पूरक मूवी 5) के दौरान extravascular अंतरिक्ष पर भर्ती के बाद DsRed संकेतों के अधिग्रहण। 16 से कम - 20 घंटा, extravascular Ly6G + न्यूट्रोफिल के बहुमत के रूप में "primed" उनके DsRed अभिव्यक्ति के आधार पर माना जाता है। इन टिप्पणियों परिमाण, गति, और स्थान न्यूट्रोफिल भड़काना के रहने वाले जानवरों में भड़काऊ घावों पर होने वाली प्रकट करते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1:। PIL1-DsRed चूहे की phenotyping (ए) से फ्लो माइलॉयड कोशिकाओं (G1) FSC और एसएससी मापदंडों के आधार पर घूम की आबादी का प्रदर्शन विश्लेषण करती है। (बी) FL2 चैनल पर Histograms से जनहित याचिका-DsRed चूहों (लाल) कोशिकाओं की G1 फाटक के भीतर DsRed + कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाने या WT चूहों से (नीला)। डेटा le पर के प्रतिनिधि हैंतीन स्वतंत्र प्रयोगों एएसटी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। सूजन त्वचा घावों में DsRed + / Ly6G + न्यूट्रोफिल की गतिशील गतिविधियों के दृश्य (ए) स्टेटिक confocal माइक्रोस्कोपी छवियों extravascular अंतरिक्ष, अर्थात् में तीन ल्युकोसैट आबादी बैल उपचार शो के बाद 24 घंटे दर्ज की गई, DsRed + / Ly6G + कोशिकाओं। (तारक), DsRed - / Ly6G + कोशिकाओं (त्रिकोण), और DsRed + / Ly6G - कोशिकाओं (तीर)। बार = 20 माइक्रोन। DsRed + / Ly6G + कोशिकाओं (लाल) और DsRed - / Ly6G + कोशिकाओं (नीला) migrato के लिए तुलना कर रहे हैंRY पथ (बी), ट्रैक भूखंडों (सी), और वेग (डी) एक 40 मिनट के समय चूक फिल्म confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा दर्ज बैल आवेदन (पूरक मूवी 1) के बाद 24 घंटे शुरू करने से। (डी) बार वेग मूल्यों मतलब संकेत मिलता है। *** पी <0.001। (ई) DsRed + / Ly6G + कोशिकाओं की संख्या DsRed - / Ly6G + कोशिकाओं बैल आवेदन (पूरक फिल्म 4 में से 2) के बाद अलग-अलग समय अंक पर दर्ज की गई समय चूक फिल्मों की एक श्रृंखला से गिने जाते हैं। दिखाया गया डेटा सेल नंबर / 2 मिमी (± एसडी साधन) की गणना की लगातार तीन छवियों से कर रहे हैं। (एफ) स्थिर चित्र एक फिल्म समय चूक बैल चित्रकला (पूरक मूवी 5) के बाद 14.5 मानव संसाधन के लिए 11 से दर्ज से बनाया जाता है। तीर एक Ly6G + सेल कि प्रेक्षण अवधि के दौरान extravascular अंतरिक्ष में DsRed अभिव्यक्ति प्राप्त कर लेता है इंगित करता है।बार = 50 माइक्रोन। छवियों के साथ अनुमति (कॉपीराइट 2015. प्रतिरक्षाविज्ञानी के अमेरिकन एसोसिएशन, इंक) संदर्भ 22 से reproduced हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

। पूरक मूवी 1: - में / Ly6G + कोशिकाओं (नीला) सूजन त्वचा घावों में DsRed + न्यूट्रोफिल की गतिशील व्यवहार (बैल चित्रकला के बाद 24 घंटे में) Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों DsRed + / Ly6G + कोशिकाओं (गुलाबी) और DsRed की गतिशीलता दिखाने extravascular अंतरिक्ष। रक्त वाहिकाओं को हरे रंग में देखा जाता है। बार = 20 माइक्रोन। वीडियो अनुमति (कॉपीराइट 2015. प्रतिरक्षाविज्ञानी के अमेरिकन एसोसिएशन, Inc.) के साथ संदर्भ 22 से reproduced है। सीएल कृपयाइस वीडियो को देखने के लिए यहाँ Ick।

। पूरक मूवी 2: - extravascular अंतरिक्ष में / Ly6G + कोशिकाओं (नीला) सूजन त्वचा घावों में DsRed + न्यूट्रोफिल की गतिशील व्यवहार (बैल चित्रकला के बाद 4 घंटा में) Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों DsRed + / Ly6G + कोशिकाओं (गुलाबी) और DsRed दिखाने । रक्त वाहिकाओं को हरे रंग में देखा जाता है। Autofluorescence वर्तमान और बालों के रोम के साथ जुड़े है। बार = 100 माइक्रोन। वीडियो के साथ अनुमति (कॉपीराइट 2015. प्रतिरक्षाविज्ञानी के अमेरिकन एसोसिएशन, इंक) संदर्भ 22 से reproduced है। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 3: सिंगपुर में DsRed + न्यूट्रोफिल की गतिशील व्यवहार। extravascular अंतरिक्ष में / Ly6G + कोशिकाओं (नीला) - lammatory त्वचा के घावों (बैल चित्रकला के बाद 8 घंटे में) Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों DsRed + / Ly6G + कोशिकाओं (गुलाबी) और DsRed दिखा। रक्त वाहिकाओं को हरे रंग में देखा जाता है। Autofluorescence वर्तमान और बालों के रोम के साथ जुड़े है। बार = 100 माइक्रोन। वीडियो के साथ अनुमति (कॉपीराइट 2015. प्रतिरक्षाविज्ञानी के अमेरिकन एसोसिएशन, इंक) संदर्भ 22 से reproduced है। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 4: सूजन त्वचा घावों में DsRed + न्यूट्रोफिल की गतिशील व्यवहार (11 - बैल चित्रकला के बाद 19 घंटा) Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों DsRed + / Ly6G + कोशिकाओं दिखाने (गुलाबी) और DsRed - में / Ly6G + कोशिकाओं (नीला)। extravascular अंतरिक्ष। रक्त वाहिकाओं को हरे रंग में देखा जाता है। Autofluorescence वर्तमान और बालों के रोम के साथ जुड़े है। बार = 100 माइक्रोन। वीडियो के साथ अनुमति (कॉपीराइट 2015. प्रतिरक्षाविज्ञानी के अमेरिकन एसोसिएशन, इंक) संदर्भ 22 से reproduced है। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 5: Ly6G + न्यूट्रोफिल द्वारा DsRed सिग्नल का अधिग्रहण फिल्म समय चूक पूरक वीडियो 4 में दिखाया गया है, इस उच्च बढ़ाई वीडियो प्रक्रिया है जिसमें एक Ly6G + सेल (एक तीर के साथ संकेत दिया) extravascular में DsRed अभिव्यक्ति प्राप्त कर लेता है पता चलता है। प्रेक्षण अवधि (बैल चित्रकला के बाद 11-14.5 एचआर) के दौरान अंतरिक्ष। बार = 50 माइक्रोन। वीडियो अनुमति (कॉपीराइट 2015. आईएम के अमेरिकन एसोसिएशन के साथ संदर्भ 22 से reproduced हैmunologists, Inc.)। यहाँ इस वीडियो को देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन का उद्देश्य रहने वाले जानवरों, जो नहीं किया गया है अभी तक वर्तमान में उपलब्ध तकनीक के द्वारा पूरा किया गया में न्यूट्रोफिल भड़काना की प्रक्रिया की निगरानी के लिए एक तकनीक विकसित करने का है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, तीन की स्थापना के तरीके में प्रदर्शन कर रहे हैं: 1) भड़काना का एक उपाय, 2) में प्रतिदीप्ति संयुग्मित विरोधी Ly6G की कम खुराक के साथ neutrophils के विवो लेबलिंग के रूप में आईएल 1β प्रमोटर संचालित DsRed संवाददाता चूहों में त्वचा की सूजन की प्रेरण एमएबी, और 3) intravital confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग। इन तीन तरीकों के संयोजन primed न्यूट्रोफिल (DsRed + / Ly6G +) भड़काऊ त्वचा के घावों में गतिशील गतिविधियों के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है। पलायन की दिशा और primed न्यूट्रोफिल के वेग आगे प्रवासी पथ पर नज़र रखने के माध्यम से मात्रा निर्धारित है। समय चूक वीडियो की एक श्रृंखला रिकॉर्डिंग करके, primed न्यूट्रोफिल उद्भव के वास्तविक समय कैनेटीक्स मैं द्वारा भड़काऊ साइट और DsRed अभिव्यक्ति के अधिग्रहण पर नजर रखी हैndividual न्यूट्रोफिल भी extravascular अंतरिक्ष में मनाया जाता है। इस प्रकार, न्यूट्रोफिल भड़काना के गतिशील प्रक्रिया को सफलतापूर्वक पहली बार यहाँ प्रस्तुत तकनीक का उपयोग कर के लिए जानवरों के रहने में कल्पना की गई है।

यह तकनीक कई महत्वपूर्ण कदम में कार्यरत है। सबसे पहले, त्वचा के ऊतकों intravital इमेजिंग के लिए सबसे सुविधाजनक शरीर के अंगों कर रहे हैं। माउस कान पर बैल की सामयिक आवेदन confocal माइक्रोस्कोपी के तहत सूजन त्वचा में प्रतिरक्षा सेल व्यवहार के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है। दूसरा, माउस इमेजिंग जो संवेदनाहारी के दोहराने इंजेक्शन जरूरी दौरान लगातार बेहोश किया जाना चाहिए। हालांकि, पर बेहोश करने की क्रिया इमेजिंग के दौरान माउस मरने का कारण बन सकता है। अधिक मात्रा से बचने के लिए, संवेदनाहारी (एक आधा या पूरी खुराक की एक तिहाई) की कम खुराक लंबे समय तक इमेजिंग के लिए सिफारिश कर रहे हैं। तीसरा, प्रतिदीप्ति संयुग्मित न्यूट्रोफिल विशेष एमएबी murine न्यूट्रोफिल (8-10 घंटा 30 के आधे-जीवन) के कम उम्र के कारण रुक-रुक कर इंजेक्ट किया जाना चाहिए। पिछले है, फोकस डॉIFT समय चूक इमेजिंग के दौरान एक प्रमुख मुद्दा है, जो तापमान विविधताओं, माउस शरीर आंदोलन, कान समय के साथ सूजन, और साधन 31 के संचालन से उत्पन्न होने वाले कंपन सहित कई कारकों के कारण हो सकता है। कई तरीकों मंच पर इस पर एक गिलास स्लाइड टेप, बेहोश करने के लिए ऑक्सीजन और गर्मी प्रदान करने के लिए एक पर्यावरण कक्ष की स्थापना के द्वारा जगह में माउस कान फिक्सिंग ऐसी इमेजिंग के दौरान बेहोश करने की क्रिया के एक निरंतर खुराक के प्रशासन के रूप में बहती रोकने के लिए विकसित किया गया है, जीव के रूप में अच्छी तरह से मैन्युअल रूप से फिर से ध्यान केंद्रित गुंजाइश जब आवश्यक 32,33।

यह भी उतना ही इस प्रोटोकॉल की सीमाओं को राज्य के लिए महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, एक धीमी गति से माउस वसूली - लंबाई में (12 से 16 घंटा) एक इमेजिंग अवधि 8 घंटे के बाद निरंतर बेहोश करने की क्रिया की वजह से मनाया जाता है, यह दर्शाता है कि इस प्रोटोकॉल ऐसे लंबा प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण कई चूहों यू के बजाय इमेजिंग अवधि में अनुक्रम में उपयोग करने के लिए हैकेवल एक ही गाते हैं। दूसरा, घूम FITC-dextran के एक क्रमिक रिसाव समय के साथ इमेजिंग, जो की संभावना भड़काऊ राज्य में 34 त्वचा से रक्त वाहिकाओं की वृद्धि की पारगम्यता के कारण होता है के दौरान मनाया जाता है। इस प्रकार, रक्त वाहिकाओं के दृश्य स्पष्ट रूप से इमेजिंग के बाद के चरणों में प्रचलन में कम रोशनी दी समझौता किया है। वैकल्पिक रूप से, एक के रूप में इन संवहनी endothelial कोशिकाओं 35 का पालन रक्त वाहिकाओं को चिह्नित करने के इस तरह के isolectin बी 4 के रूप में fluorescently संयुग्मित lectins उपयोग कर सकते हैं।

त्वचा भड़काऊ घावों में न्यूट्रोफिल भड़काना की प्रक्रिया के दृश्य के अलावा, प्रौद्योगिकी यहाँ वर्णित भी कई अन्य प्रयोगात्मक सेटिंग में लागू किया जा सकता है। हाल ही में विकसित इमेजिंग खिड़कियों के साथ संयोजन में, intravital माइक्रोस्कोपी primed न्यूट्रोफिल के व्यवहार का वर्णन गहरी ऊतकों और मस्तिष्क, स्तन ग्रंथियों, फेफड़ों और पेट अंगों 36-39 सहित अंगों में मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके अलावा, रस्मी के दृश्यऐसे monocytes और मैक्रोफेज के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं का आईएनजी / सक्रियण के माध्यम से इन विवो लेबलिंग के साथ-साथ pIL1-DsRed चूहों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता प्रतिदीप्ति संयुग्मित ब्याज की सेल प्रकार के एमएबी विशिष्ट। साथ में ले ली, न केवल इस तकनीक के रहने वाले जानवरों में न्यूट्रोफिल की भड़काना प्रक्रिया के intravital इमेजिंग के लिए एक बुनियादी ढांचा प्रदान करता है, लेकिन यह भी व्यवहार और विभिन्न ऊतकों में खुलासा विभिन्न राज्यों में भड़काऊ अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के समारोह के अध्ययन के लिए नए तरीकों का खुलासा किया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin sodium APP Pharmaceuticals NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer Lonza 10-548E
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F0926
Lipopolysaccharides Sigma-Aldrich L4391
Ketamine hydrochloride Hospira NDC 0409-2051-05
Xylazine LLOYD Laboratory NADA #139-236
Acepromazine Boehringer Ingelheim ANADA 200-361
Hair-removal cream Church & Dwight
Acetone Fisher Scientific A16P4
Oxazolone Sigma-Aldrich E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody BioLegend 127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle BD 329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa Sigma-Aldrich 74817
Butterfly infusion set (27 G needle) BD 387312
FACSCalibur cytometer BD
CellQuest Pro software BD
Confocal microscope Olympus FV1000
Metamorph Software Universal Imaging

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 112 इम्यूनोलॉजी intravital माइक्रोस्कोपी न्यूट्रोफिल भड़काना, माउस त्वचा की सूजन confocal माइक्रोस्कोपी गतिशीलता
न्युट्रोफिल भड़काना के intravital इमेजिंग आईएल 1β प्रमोटर संचालित DsRed रिपोर्टर चूहों का उपयोग
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Yao, Y., Liu, Y., Takashima, A. Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice. J. Vis. Exp. (112), e54070, doi:10.3791/54070 (2016).

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