Le dépistage de la fonctionnelle non-codant des variants génétiques utilisant mobilité électrophorétique Maj Assay (EMSA) et l'ADN-affinité Précipitations Assay (DAPA)

Summary

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

Abstract

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Introduction

Des études de séquençage et de génotypage à base d'études, y compris l'ensemble du génome des études d'association (GWAS), des études de locus candidat, et profond de séquençage, ont identifié de nombreuses variantes génétiques qui sont statistiquement associés à une maladie, trait, ou d'un phénotype. Contrairement aux prévisions initiales, la plupart de ces variantes (85-93%) sont situées dans des régions non codantes et ne changent pas la séquence d'acides aminés des protéines ^1,2. L' interprétation de la fonction de ces variantes non codantes et déterminer les mécanismes biologiques qui les relient à la maladie associée, trait ou un phénotype a révélé difficile ^3-6. Nous avons développé une stratégie générale visant à identifier les mécanismes moléculaires qui lient les variantes à une importante phénotype intermédiaire – l'expression du gène. Ce pipeline est spécifiquement conçu pour identifier la modulation de la liaison par des variants génétiques TF. Cette stratégie combine les approches de calcul et des techniques de biologie moléculaire visant à prédireeffets biologiques des variants candidats in silico, et vérifier ces prédictions empiriquement (Figure 1).

Figure 1:.. Approche stratégique pour l'analyse des étapes non codantes variantes génétiques qui ne sont pas inclus dans le protocole détaillé associé à ce manuscrit sont en gris S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Dans de nombreux cas, il est important de commencer en élargissant la liste des variantes à inclure tous ceux en haute liaison-déséquilibre (LD) avec chaque variante statistiquement associée. LD est une mesure d'association non aléatoire des allèles à deux positions chromosomiques différentes, qui peut être mesurée par la r ² statistique ^7. r ² est une mesure du linkage déséquilibre entre deux variantes, avec un r ² = 1 désignant liaison parfaite entre deux variantes. Allèles en haute LD se trouvent à la co-ségrégation sur le chromosome à travers les populations ancestrales. tableaux de génotypage actuels ne comprennent pas toutes les variantes connues dans le génome humain. Au lieu de cela, ils exploitent la LD dans le génome humain et comprennent un sous – ensemble des variantes connues qui agissent comme substituts pour les autres variantes dans une région particulière de LD ^8. Ainsi, une variante sans aucune conséquence biologique peut être associée à une maladie particulière, car il est en LD avec la variante-causal variante avec un effet biologique significatif. La procédure, il est recommandé de convertir la dernière version de 1000 génomes projeter ⁹ fichiers variante d'appel (VCF) dans des fichiers binaires compatibles avec PLINK ^10,11, un outil open-source pour toute analyse d'association du génome. Par la suite, toutes les autres variantes génétiques avec LD r ^2> 0,8 avec chacun va génétique d'entréeRiant peut être identifié en tant que candidats. Il est important d'utiliser la population de référence appropriée pour ce beau – par exemple, si un variant a été identifié chez les sujets d'origine européenne, des données provenant de sujets d'ascendance similaires devraient être utilisés pour l' expansion de LD.

l'expansion LD se traduit souvent par des dizaines de variantes de candidats, et il est probable que seule une petite fraction de ceux-ci contribuent au mécanisme de la maladie. Souvent, il est impossible d'étudier expérimentalement chacune de ces variantes individuellement. Il est donc utile de tirer parti des milliers de jeux de données accessibles au public de génomique fonctionnelle comme un filtre pour prioriser les variantes. Par exemple, le consortium ENCODE ¹² a effectué des milliers d'expériences de ChIP-seq décrivant la liaison de TFs et co-facteurs, et les marques de histones dans un large éventail de contextes, ainsi que des données chromatine d'accessibilité des technologies telles que DNase-seq ^13, ATAC -seq ¹⁴ et suivants ^15-FAIRE. Databases et les serveurs Web tels que le navigateur UCSC Genome ^16, Feuille de route Epigenomics ^17, Blueprint Epigénome ^18, cistrome ¹⁹ et ReMap ²⁰ offrent un accès gratuit aux données produites par ces autres techniques expérimentales et à travers un large éventail de types et conditions cellulaires. Quand il y a trop de variantes pour examiner expérimentalement, ces données peuvent être utilisées pour établir des priorités de ceux situés dans les régions régulatrices probables dans les types de cellules et de tissus concernés. En outre, dans les cas où une variante est dans un pic de ChIP-seq pour une protéine spécifique, ces données peuvent fournir des pistes potentielles à la TF (s) spécifique ou co-facteurs dont la liaison pourrait affecter.

Ensuite, les variants résultants en priorité sont sélectionnés expérimentalement pour valider la liaison en utilisant EMSA ^21,22 prédit une protéine dépendante du génotype. EMSA mesure la variation de la migration de l'oligonucléotide sur un gel TBE non réducteur. oligo- marqué par fluorescence est mis en incubation avec lelysat nucléaire, et la liaison des facteurs nucléaires retarder le mouvement de l'oligo sur le gel. De cette manière, oligo qui a lié des facteurs plus nucléaires présentera comme un signal fluorescent plus fort lors de la numérisation. Notamment, l'EMSA ne nécessite pas des prédictions sur les protéines spécifiques dont la liaison sera affectée.

Une fois que les variantes sont identifiées qui sont situés dans des régions régulatrices prévues et sont capables de facteurs nucléaires différentiellement contraignants, les méthodes de calcul sont utilisées pour prédire la TF spécifique (s) dont la liaison qu'ils pourraient affecter. Nous préférons utiliser CIS-BP ^23,24, RegulomeDB ^25, UNIProbe ²⁶ et JASPAR ^27. Une fois que le candidat TFs sont identifiés, ces prévisions peuvent être spécifiquement testées en utilisant des anticorps contre ces TFs (EMSA-supershifts et DAPA-Westerns). Une EMSA-supershift implique l'addition d'un anticorps spécifique TF au lysat nucléaire et oligo. Un résultat positif dans un EMSA-supershift est réédesented comme un nouveau changement dans la bande EMSA, ou une perte de la bande (examiné en référence ^28). Dans le DAPA complémentaire, d'un duplex oligonucléotidique 5'-biotinylée contenant de la variante et la 20 paire de bases de nucléotides flanquantes sont mises en incubation avec un lysat nucléaire du type de cellule approprié (s) pour capturer des facteurs nucléaires se liant spécifiquement oligos. Le complexe facteur nucléaire duplex oligonucléotide est immobilisé par des microbilles de streptavidine dans une colonne magnétique. Les facteurs liés nucléaires sont collectés directement par élution ^29,48. prédictions de liaison peuvent alors être évalués par un transfert de Western en utilisant des anticorps spécifiques de la protéine. Dans les cas où il n'y a pas de prédictions évidentes, ou trop de prédictions, les élutions de variantes pull-downs des expériences de DAPA peuvent être envoyés à un noyau de protéomique pour identifier les TFs candidats en utilisant la spectrométrie de masse, qui peuvent ensuite être validées en utilisant ces décrits précédemment méthodes.

Dans la suite de l'article, le protocole détaillé pour EMSA et DAPA analyse des variants génétiques est fourni.

Protocol

1. Préparation des solutions et réactifs Commandez des sondes ADN d'oligonucléotides personnalisés pour une utilisation dans EMSA et DAPA. Pour réduire la protéine liaison non spécifique, concevoir des oligos courts (entre 35-45 paires de bases (pb) de longueur) 30, et placer la variante d'intérêt dans le centre flanqué de sa séquence génomique endogène 17 pb. Pour oligos EMSA, ajoutez un 'fluorophore 5. Pour oligos DAPA, ajouter une balise 5 'de la biotine. </…

Representative Results

Dans cette section, les résultats représentatifs de ce qui les attend sont fournies lors de l'exécution d'un EMSA ou DAPA, et la variabilité en ce qui concerne la qualité de lysat est caractérisé. Par exemple, il a été suggéré que le gel et les échantillons de protéines de décongélation plusieurs fois peut entraîner une dénaturation. Afin d'explorer la reproductibilité de l'analyse EMSA dans le contexte de ces cycles "gel-dégel", deux 35 oligo…

Discussion

Bien que les progrès dans les technologies de séquençage et de génotypage ont grandement amélioré notre capacité à identifier les variants génétiques associés à la maladie, notre capacité à comprendre les mécanismes fonctionnels impactés par ces variantes est à la traîne. Une source importante du problème est que de nombreuses variantes associées à la maladie sont situés dans n sur le codage des régions du génome, qui affectent probablement plus difficiles à prédire-mécanismes qui contr?…

Materials

Custom DNA Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, for CE buffer
HEPES (1M)	Fisher Scientific	15630-080	For CE and NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	For CE, NE, and annealing buffer
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, for NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	For annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, for cell wash
DL-Dithiothreitol solution (1M)	Sigma	646563	Reducing agent
PMSF	Thermo Scientific	36978	Protease Inhibitor
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420	Prevents dephosphorylation of TFs
Nonidet P-40 Substitute	IBI Scientific	IB01140	NP-40, for nuclear extraction
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	For measuring protein concentration
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contains all necessary EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 Wells	Invitrogen	EC6265BOX	For EMSA
TBE Buffer (10X)	Thermo Scientific	B52	For EMSA
FactorFinder Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contains all necessary DAPA buffers
Licor Odyssey CLx	Licor		Recommended scanner for DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contains 10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	FBS, for culture media
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contains L-glutamine and 25mM HEPES