Abstract
Cette méthode décrit une chromatographie sensible, spécifique, fiable et reproductible en phase inverse liquide à haute performance (HPLC-RP) l'essai développé et validé pour la quantification des nucleotides extracellulaires puriques et les nucléosides produites par purifiée leucémie lymphoïde chronique (CLL), les cellules dans différentes conditions de culture . La séparation chromatographique de l'adénosine 5'-monophosphate (AMP), l'adénosine (ADO) et inosine (INO) est effectuée à la température ambiante sur une colonne en phase inverse à base de silice qui est utilisé pour la rétention du composé polaire. Le procédé comprend une phase mobile binaire, qui est constitué d'acétate d'ammonium à 7 mM et de l'acétonitrile à un débit de 1,00 ml / min de débit. Les éluats sont surveillés à l'aide d'un détecteur UV Photodiode Array fixé à 260 nm. Une courbe d'étalonnage est générée pour calculer l'équation analytique pour la quantification de chaque composé de purine. le contrôle du système, l'acquisition de données et l'analyse sont ensuite effectuées. L'application de ce protocole, AMP, INO et ADO éluent à 7, 11 et 11,9 min, respectivement, et le temps total de course pour chaque échantillon est de 20 min. Ce protocole peut être appliqué à différents types de cellules et de lignées cellulaires (à la fois en suspension et adhérents), en utilisant des milieux de culture comme matrice. Les avantages sont la préparation des échantillons faciles et rapides et que l'exigence d'une faible quantité de surnageant pour l'analyse. En outre, l'utilisation d'un milieu exempt de sérum permet de sauter l'étape de précipitation des protéines avec de l'acétonitrile qui influe sur la concentration finale des composés de purine. L'une des limites de la méthode est l'exigence de la colonne d'équilibration exécuter avant chaque exécution d'un seul échantillon, ce qui rend le temps total d'exécution de l'expérience plus longue et la prévention des applications de criblage à haut débit.
Introduction
Adenosine (ADO) est une purine nucléoside avec une molécule d'adénine attachée à un fragment de molécule de sucre ribose par une liaison glycosidique. Lorsqu'ils sont présents dans le milieu extracellulaire, elle protège les cellules contre les dommages excessifs par l'action du système immunitaire. Ce rôle a été mis en évidence en utilisant différents modèles de maladies, telles que la colite 1, 2 diabète, l' asthme 3, la septicémie 4 et 5 lésion ischémique. L' une des principales fonctions d'ADO est l'inhibition des réponses immunitaires dans le microenvironnement de la tumeur, ce qui contribue à la tumeur évasion immunitaire 6. Pour cette raison, les mécanismes impliqués dans la formation ADO et la signalisation sont d' un intérêt thérapeutique considérable 7.
ADO niveaux dans le microenvironnement des tissus sont relativement faibles dans des conditions physiologiques normales, et certainement inférieure au seuil de sensibilité des cellules immunitaires. Cependant, au cours de l'hypoxie, l'ischémie, l'inflammation, l'infection, métaboliquele stress et la transformation tumorale , ils augmentent rapidement 8. Les niveaux d'ADO extracellulaires élevées en réponse à des signaux de tissu perturbant ont une double fonction: signaler une lésion tissulaire de façon autocrine et paracrine et pour générer des réponses tissulaires qui peuvent être généralement considérés comme cytoprotecteur.
Extracellulaires ADO peut être formé par une variété de mécanismes, qui comprennent la libération des compartiments intracellulaires médiés par les transporteurs de nucléosides 9 ou accumulation en raison de la dégradation altérée exploité par l' adénosine désaminase. La voie principale menant à une augmentation des niveaux extracellulaires ADO implique l'action d'une cascade de ectonucléotidases, qui sont associées à la membrane ectoenzymes générant ADO par phosphohydrolysis de nucléotides libérés de cellules mortes ou mourantes. Cette voie passe par l'action séquentielle de CD39 (triphosphate ectonucleoside diphosphohydrolase-1) qui convertit l'adénosine extracellulaire 5'-triphosphate (ATP) ou l' adénosine 5'-diphosphate (ADP) en adénosine 5'-monophosphate (AMP) et de CD73 (5'-nucléotidase) qui transforme l' AMP à 10 ADO.
Extracellulaires ADO provoque ses réactions physiologiques en se liant à quatre transmembranaire ADO récepteurs, à savoir A1, A2A, A2B et A3. Chaque récepteur a des affinités différentes pour ADO et la distribution des tissus spécifiques. Tous les récepteurs ont sept domaines transmembranaires et sont couplés aux protéines G à des protéines de liaison au GTP intracellulaire (protéines G), qui peut induire (protéine Gs) ou à inhiber (Gi protéine) activité de l'adénylate cyclase et, par la suite, la production d'AMPc intracellulaire. Par conséquent, les changements de l' impact cytoplasmique des taux d'AMPc sur l' activité protéine kinase intracellulaire pendant 11 réponses physiologiques. Dans des conditions physiologiques ADO extracellulaire est inférieure à 1 uM, qui peut activer indifféremment A1, A2A et récepteurs A3. Cependant, l'activation du sous-type A2B nécessite considérablement plus élevésLes concentrations du nucleoside, tels que ceux produits dans des conditions physiopathologiques. En variante, OAD extracellulaire peut être dégradée à l'inosine (INO) par l'adénosine désaminase (ADA) et de CD26, une protéine ADA complexant localisant l'ADA sur la surface cellulaire. Une autre possibilité est que ADO est internalisé par la cellule par les transporteurs de nucléosides (ORL) et phosphorylée à AMP par ADO protéine kinase 12,13.
L'objectif de ce protocole est de décrire une méthode d'analyse de la chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour quantifier en un seul passage AMP du substrat et des produits ADO et INO, telle que générée par les lymphocytes humains. Notre expérience a été initialement obtenue en utilisant des cellules de patients chroniques leucémie lymphoïde (CLL), qui sont caractérisés par l'expansion d'une population mature de lymphocytes CD19 + / CD5 + B exprimant constitutivement CD39 14,15. Nous avons montré environ 30%des CLL patients expriment le ectoenzyme CD73 et que ce phénotype est corrélée à un mauvais pronostic 16. Cette sous-population de cellules leucémiques co-exprimant CD39 et CD73 peut activement produire ADO extracellulaire d'ADP et / ou AMP. La pré - incubation de cellules CD73 + leucémiques avec des α, la synthèse d'ADO extracellulaire β-méthylène-ADP (PCAP), un inhibiteur connu de l' activité enzymatique CD73, bloque complètement confirmant que l'enzyme CD73 représente un goulot d'étranglement de cette cascade 16.
les cellules CLL expriment également ADA et l'ADA protéine complexant CD26, qui sont responsables de la conversion de ADO dans INO. En utilisant des inhibiteurs de l'ADA spécifiques, tels que érythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) Je wiadenine (EHNA) et du chlorhydrate désoxycoformycine (FNC), il est possible de bloquer la dégradation ADO extracellulaire dans INO. En outre, le prétraitement avec un inhibiteur de l'ADA, en combinaison avec le dipyridamole, qui bloque les transporteurs de nucléosides, augmente l'accumulation dans la cellule ADOsurnageants.
Nous avons ensuite étendu ce protocole à des cellules dérivées d'autres lignées, y compris les lymphocytes T et les cellules myéloïdes, confirmant la production d'ADO CD73-dépendante. Ces résultats suggèrent que ce protocole HPLC est très polyvalent et qu'il peut être appliqué à différentes lignées cellulaires et à différentes conditions de culture (figure 1).
Figure 1. Représentation schématique de la machinerie enzymatique responsable de la production ADO extracellulaire. Adenosine 5'-triphosphate (ATP) et / ou l' adénosine 5'-diphosphate (ADP) peut être dégradé par CD39 à l' adénosine 5'-monophosphate (AMP), qui à son tour, est converti par CD73 dans l'adénosine nucléoside (ADO). Une fois que ADO est produite dans l'espace extracellulaire, elle peut rentrer dans la cellule par les transporteurs de nucléosides (ENT), être converti en l'inosine (INO) oulier à différents types de récepteurs P1 ADO. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocol
des échantillons de sang de CLL sont obtenus conformément aux lignes directrices institutionnelles et de la Déclaration d'Helsinki.
1. Isolement des leucémique Lymphocytes d'échantillons de sang de patients atteints de LLC
- Prélever un échantillon de sang dans l' héparine de sodium (vert-top) tube 17.
- Faire dilution 1: 3 de sang total avec RT 1x tampon phosphate salin (PBS).
- On purifie des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir d'échantillons de sang par centrifugation en gradient de densité.
- Sous - couche 5 ml de milieu de centrifugation de densité (par exemple, Ficoll) dans un tube de centrifugeuse de 15 ml soigneusement et transférer 10 ml de sang dilué. centrifuger immédiatement à 1500 g pendant 20 min à température ambiante.
- Aspirer partie du surnageant avec une pipette Pasteur en verre relié à une pompe à vide et de recueillir l'anneau PBMC à l'interphase entre les médias de centrifugation de densité et du plasma dilué avec une pipette de 5 ml. Transférer dans un tube de centrifugation de 50 ml et on lave avec du PBS (50 ml volume final). Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Aspirer le surnageant avec une pipette Pasteur en verre, resuspendre le culot dans 50 ml de PBS et on compte les cellules en utilisant un hémocytomètre.
- CMSP Stain avec anti-CD19 et -CD5 anticorps pour cytométrie en flux suivant un protocole standard pour immunocoloration et vérifier la composition des sous - populations PBMC 18.
Remarque: les lymphocytes CLL sont CD19 + / CD5 +. - Vérifiez le% de CD19 + / CD5 + cellules en utilisant un cytomètre de flux 18. Purifier les lymphocytes B de patients avec un ≥95% de CD19 + / CD5 + cellules leucémiques en suivant les instructions détaillées à l' étape 2 pour l'isolement négatif des cellules B 19.
2. Purification des cellules leucémiques B par Isolation négative
- Remettre en suspension 10 7 PBMC / ml dans du PBS 0,1% de sérum albumine bovine (BSA) , 2 mM d' EDTA, pH 7,4 (tampon d'isolement).
- Ajouter 101; g d'anticorps monoclonal de souris anti-CD3, -CD14 et -CD16 anticorps primaires pour 10 7 cellules et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
- Laver les cellules avec le tampon d'isolement et centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension les cellules dans le tampon d'isolement 7 à 10 PBMC / ml.
- Avant incubation avec les cellules, la remise en suspension de mouton anti-IgG de souris de billes magnétiques dans le flacon. Transférer 100 ul de billes par 10 7 cellules à un tube.
- Ajouter 1 ml de tampon d'isolement et de placer le tube dans un support d'aimant pendant 1 min. Jeter le surnageant avec une pipette de 5 ml.
- Retirer le tube de l'aimant et remettre en suspension les billes lavées dans 100 ul de tampon d'isolement.
- Incuber 10 7 cellules avec 100 ul de billes magnétiques pendant 30 min à 4 ° C avec une inclinaison douce et de rotation.
- Placer le tube dans le support magnétique pendant 2 minutes et transférer le surnageant avec les cellules non liées CD19 + / + CD5un tube frais avec une pipette de 5 ml.
- A la fin du protocole d'isolement, la tache 100 ul de cellules avec anti-CD19 et des anticorps pour -CD5 cytométrie en flux et incuber pendant 30 min à 4 ° C. Laver les cellules avec 3 ml de PBS 1% de BSA, jeter l'excès de surnageant et vérifier à nouveau la pureté des cellules B par cytométrie en flux 19.
Remarque: Effectuez une étape supplémentaire d'isolement négatif si la pureté des cellules B est inférieure à 95%.
3. Préparation du Standard et Inhibiteurs Solutions mères
- Pour préparer AMP, peser 0,00345 g d'AMP et de le dissoudre dans 5 ml de milieu sans sérum pour avoir une solution standard 2 mM d'AMP.
- Pour préparer ADO, peser 0,00265 g d'ADO et le dissoudre dans 5 ml de milieu sans sérum pour avoir une solution standard 2 mM d'ADO.
- Pour préparer INO, peser 0.00268 g de l'INO et le dissoudre dans 5 ml de milieu sans sérum pour avoir une solution standard 2 mM de INO.
- Préparer une solution 400 uM de l'AMP, ADO etINO en mélangeant 1 ml de la solution mère 2 mM dans 4 ml de exempt de sérum moyen (5 ml de volume final).
- Faire une dilution 1: 4 de chaque solution étalon de 400 pm pour obtenir une concentration de 100 uM par pipetage de 500 ul de la solution 400 uM dans 1500 ul de milieu sans sérum (2 ml de volume final).
- Préparer des dilutions en série de chaque composé dans un milieu sans sérum pour obtenir les concentrations suivantes: 100 uM - 50 pM - 25 pM - 10 pM - 5 uM - 2,5 uM - 1 pM - 0,5 pM - 0,25 uM.
Remarque: Par exemple, la pipette 1 ml de la solution à 100 pM dans 1 ml de milieu sans sérum (dilution 1: 2) pour obtenir une concentration de 50 uM et procéder à des dilutions restantes.
- Préparer une solution mère 10 mM de APCP dissous dans du PBS; aliquote et stock à - 30 ° C.
- Préparer des solutions mères à 10 mM de chlorhydrate EHNA, dCF dipyridamole et dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO); aliquote et stock à -30° C.
4. Programme de la méthode HPLC
- Préparer un tampon d'acétate d'ammonium, 7 mM en dissolvant 0,770 g d'acétate d'ammonium dans 2 litres d'eau déminéralisée à double (tampon A). Ajuster le pH à 3,0 avec de l'acide chlorhydrique.
- Préparer une bouteille en verre contenant au moins 2 L de ultrapure acétonitrile pour HPLC (tampon B) et connecter la colonne de garde et la colonne de HPLC.
Remarque: Les colonnes et les tampons sont à la température ambiante pendant l'utilisation. - Connectez-vous au logiciel de HPLC et sélectionnez le bouton "parcourir le projet". Allez dans le menu "Fichier" et sélectionner "nouvelle méthode", puis "méthode de l'instrument".
- Programmer la méthode de la colonne d'équilibration selon le tableau 1. Définir un taux de 1,00 ml / min et programmer le détecteur UV à lire à 260 nm. Enregistrer la méthode de l'instrument et sélectionner à nouveau "nouvelle méthode" dans le menu "Fichier" puis "méthode set". Choisissez la méthode de l'instrument précédemment enregistréet enregistrer la méthode actuelle définie avec le même nom.
| Temps | Débit (ml / min) | %UNE | % B |
| 1.00 | 100 | 0 | |
| 1.24 | 1.00 | 100 | 0 |
| 6.22 | 1.00 | 2 | 98 |
| 18.65 | 1.00 | 2 | 98 |
Tableau 1: méthode de la colonne d'équilibration Représentation schématique des changements de solvants pour l'équilibration de la colonne.. Tampon A: mM d'acétate d'ammonium 7, pH 3,0. Tampon B: acétonitrile.
- Répétez l'étape 4.3 pour programmer la méthode de l'échantillon d'exécution indiqué dans le tableau 2. Régler un taux de 1,00 m de débitL / min et le programme détecteur UV à lire à 260 nm. Enregistrer la méthode de l'instrument et répétez la même procédure que celle décrite à l'étape 4.4 pour enregistrer la méthode set ..
| Temps | Débit (ml / min) | %UNE | % B |
| 1.00 | 0 | 100 | |
| 3.74 | 1.00 | 0 | 100 |
| 13,71 | 1.00 | 15 | 85 |
| 17.00 | 1.00 | 100 | 0 |
| 20.00 | 1.00 | 100 | 0 |
Tableau 2: Exécutez la méthode d'échantillonnage. Représentation schématique des changements de solvant pour la mesure de HPLC de composés de purine. Chamoiser A: mM d'acétate d'ammonium 7, pH 3,0. Tampon B: acétonitrile.
- Sélectionnez le bouton "échantillons exécuter", choisissez "nouvelle méthode d'ensemble de l'échantillon" dans le menu "Fichier".
- Sélectionnez l'option "vide" et entrez le numéro du flacon (dans l'échantillonneur automatique), le nom de l'échantillon, le volume d'injection (50 pi). Sélectionnez l'ensemble de la méthode enregistrée avant pour la colonne "méthode set" et entrez le temps d'exécution total (min).
Remarque: Entrez la méthode de la colonne d'équilibration (tableau 1) dans la colonne "méthode set" avant chaque exemple d' exécution et entrez le temps d'exécution total (min).
5. Génération d'une courbe d'étalonnage standard pour chaque composé
- Injecter 50 ul de (milieu spécifique sans sérum, qui ne contient pas l' adénosine désaminase) blanc et de chaque échantillon standard suivant les méthodes décrites dans le tableau 1 et le tableau 2.
- Utilisez la colonne équilibrationméthode (tableau 1) avant chaque exemple d' exécution et définir les conditions de gradient décrites dans le tableau 2 pour obtenir la séparation de pic adéquat. Reportez - vous au tableau 3 pour les temps de rétention déclarés d'AMP, ADO et INO dans ces conditions de CLHP.
| Temps de rétention | λ max | |
| AMP | 8.00 min | 260 |
| INO | 11.00 min | 260 |
| ADO | 11.90 min | 260 |
Tableau 3: temps de rétention des composés de purine temps de rétention typiques observées pour AMP, ADO et INO.. Le détecteur UV est programmé pour lire à 260 nm.
- Tracer les zones de pic de la concentration nominale de chaque standard pour obtenir la courbe d'étalonnage en neuf points (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 M).
- Calculer l'équation d'une ligne droite pour AMP, ADO et INO: y = mx + b,
où x est la concentration uM et y correspond à la zone de pointe.
Figure 2. Génération d'une courbe étalon interne. Courbe standard d'étalonnage représentant pour ADO et l'équation relative obtenue. S'il vous plaît cliquez sur sone pour voir une version plus grande de cette figure.
6. Prétraitement avec le Inhibiteurs et incubation avec le substrat (AMP)
- Pour tester AMP consommation, ADO et la génération de INO sans inhibition de CD73, ADA et transporteurs de nucléosides, resuspendre 2 x 10 6 CD19 + / cellules CD5 + CLL (isolé et purifié dans les étapes 1 et 2) dans 250 pi de milieu sans sérum et cellules de la plaque dans une plaque à 48 puits (ou dans un tube de 1,5 ml).
- Pour bloquer l'activité enzymatique de CD73, diluer 1: 1000 de la solution mère de PCAP (10 mM) dans le milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 10 uM. Remettre en suspension à 2 x 10 6 cellules CLL dans 250 ul de milieu de culture contenant de PCAP et prétraiter 60 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire.
- Pour bloquer la conversion de ADO dans INO, diluer 1: 1000 de la solution mère de EHNA chlorhydrate et / ou dCF (à la fois 10 mM) dans un milieu sans sérum pour avoir une concentration finale de 10 uM.Remettre en suspension à 2 x 10 6 cellules CLL dans 250 ul de milieu de culture contenant EHNA et / ou DCF. Incuber pendant 30 min à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire.
- Pour bloquer l'absorption d'ADO à travers les transporteurs de nucléosides, diluer 1: 1000 de la solution mère de dipyridamole (10 mM) dans un milieu sans sérum pour avoir une concentration finale de 10 uM. Remettre en suspension à 2 x 10 6 cellules CLL dans 250 ul de milieu de culture contenant du dipyridamole et laisser incuber pendant 30 min à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire.
- Préparer des solutions uniques de PCAP, EHNA, dCF et dipyridamole dilué 1: 1000 dans 400 uM AMP.
- Ajouter 250 ul de 400 uM d'AMP ou d'AMP ainsi que des inhibiteurs d'obtenir une concentration finale de 200 uM d'AMP. Inclure une condition en l'absence du substrat à utiliser comme échantillon à blanc.
- Laisser incuber 30 à 60 minutes à 37 ° C.
Remarque: La concentration optimale de l'AMP et le temps d'incubation a été déterminée expérimentalement. - à til fin du temps d'incubation, on recueille 500 pi de surnageants dans des tubes de microcentrifugation à froid (glace) et centrifuger à 17 000 xg immédiatement à 4 ° C pendant 5 min.
- Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation et stocker immédiatement à -80 ° C ou de procéder à la préparation des échantillons pour l'HPLC fonctionne.
7. Préparation des échantillons pour HPLC
- Filtrer les surnageants dans de nouveaux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation avec les filtres de 0,2 um seringue. Utiliser des seringues 1 ml pour le filtrage.
- Si le système HPLC est muni d'un passeur d'échantillons, de préparer les flacons de verre pour HPLC et en utilisant 0,1 ml de micro-implants pour petits volumes d'échantillons.
- Le transfert d'au moins 100 pi d'échantillon dans la fiole en verre avec une micropipette ou d'une pipette Pasteur en verre. Veillez à transférer sans bulles et fermer le flacon avec le bouchon à vis.
- Les échantillons sont alors prêts pour l'analyse par RP-HPLC.
8. HPLC Measugences de purines
- Sélectionnez le bouton "échantillons d'exécution"; choisissez "nouvelle méthode d'ensemble de l'échantillon" dans le menu "Fichier".
- Sélectionnez l'option "vide" et indiquer: le numéro du flacon (dans l'échantillonneur automatique), le nom de l'échantillon, le volume d'injection (50 pi).
- Sélectionner la méthode de la colonne d'équilibrage et de la méthode de l' échantillon d'exécution décrite dans le tableau 1 et le tableau 2, respectivement, pour tous les essais à blanc et l' échantillon qui suivent.
Remarque: Définissez la méthode de la colonne d'équilibrage (tableau 1) avant chaque échantillon run. - Injecter 50 ul de (milieu sans sérum) blanc et de chaque échantillon.
- Déterminer la concentration des purines dans chaque échantillon, quantifier l'AMP, ADO et INO en obtenant des aires des pics aux temps de rétention décrits dans le tableau 3.
- Sélectionnez le bouton «processus» et à côté de l'option «intégrer». Vous pouvez également choisir manuellement le début d'unepoints de chaque pic unique e d'extrémité pour obtenir la mesure de surface. Cela se fait en traçant une ligne entre les points de début et de fin de pointe.
- Déterminer la concentration en uM appliquant l'équation obtenue pour la courbe d' étalonnage: y = mx + b, où x représente la concentration en uM et y est la surface du pic mesurée à partir de l'échantillon inconnu.
Note: Un exemple de l'étalonnage courbe standard ADO est rapporté dans la figure 2, où: x = (y zone - 981,02) / 40026
- Considérant que 2 x 10 6 cellules ont été remises en suspension dans 0.500 ml de milieu, calculer les pmoles d'AMP, ADO et INO consommés et / ou produits par 10 6 cellules CLL appliquant la proportion suivante:
umoles: 1000 ml = x umoles: 0,250 ml
Remarque: Les pmoles de 1,000 ml (nombre pmoles dans 1 L) sont équivalents à la concentration en uM et x sont des micromoles de nucleotide ou nucléoside produites par 10 6 cellules.- Enfin, convertir les umoles en nmoles consommés et / ou produits par 10 6 cellules CLL:
x nmol = 1,000 pmoles
- Enfin, convertir les umoles en nmoles consommés et / ou produits par 10 6 cellules CLL:
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Representative Results
Pour évaluer le pourcentage (%) de cellules leucémiques dans les CMSP fraîchement purifiés à partir d'un patient atteint de CLL représentative, les cellules sont marquées avec des anticorps anti-CD5 et anti-CD19. Le panneau de gauche de la figure 3 représente un tracé de points cytofluorimétrique avec une porte sélective sur des cellules vivantes. La figure 3 montre un exemple de PBMC d'un patient CLL avant (panneau du milieu) et après ( à droite panneau) purification des cellules B.
Un exemple de dosage par HPLC de composés de purine dans les cellules CD73 + leucémiques est représenté sur la figure 4A. Les différents temps de rétention de l'AMP, l'INO et ADO à 260 nm permettent la quantification simultanée des composés. Lorsque le test est exécuté correctement, tous les nucléotides et nucléosides ont une séparation de pic adéquat. A partir d'une concentration de 200 uM d'AMP en tant que substrat, les pics obtenus pour ADO et INO sont clairementvisibles et les concentrations sont dans la plage de la courbe d'étalonnage standard. Cependant, en utilisant des concentrations aussi basses du substrat (par exemple, 100 pm) donne de bons résultats. Après l' intégration maximale, les zones de chaque pic sont convertis en concentrations uM et enfin en nmoles de composé produit par 10 6 lymphocytes leucémiques par l'utilisation de courbes d' étalonnage.
Le chromatogramme HPLC d'ADO produite par des cellules CD73 + après 60 min de pré - traitement avec 10 pM PCAP indique un blocage complet de la synthèse ADO extracellulaire (figure 4A). En raison de la conversion enzymatique rapide de ADO dans INO actionné par le complexe ADA / CD26, le prétraitement des cellules CLL avec 10 uM de chlorhydrate de 10 uM ou EHNA dCF est nécessaire pour inhiber la dégradation de l'ADA. Dans ces conditions, les concentrations ADO extracellulaires sont significativement augmentés. Chromatogrammes représentatifs de Figurer 4 met en évidence la façon dont le prétraitement avec EHNA chlorhydrate et / ou dCF (figure 4B - C) inhibe complètement la conversion ADO dans INO.
Figure 3. Analyse cytofluorimétrie du% de cellules leucémiques + / CD5 + CD19 dans les CMSP fraîchement purifiés d'un patient CLL représentant. Après gating sur des cellules vivantes (panneau de gauche), le% de cellules CD19 + / CD5 + CLL est évaluée. Avant l'isolement négatif des lymphocytes B (panneau du milieu), le% de cellules leucémiques correspond à 75%. Après purification (panneau de droite) le% de lymphocytes B CLL atteint 95%. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 4. Quantification des nucléotides et nucléosides puriques extracellulaire consommées et produites par des cellules leucémiques après l' exposition à l' AMP et les différents inhibiteurs. (A) Des chromatogrammes représentatifs d'ADO et INO générés par les lymphocytes CD73 + leucémiques avec ou sans prétraitement avec α, β-méthylène- ADP (APCP, 10 uM, 60 min), un inhibiteur spécifique de CD73 activité enzymatique. (B) représentatif de chromatogramme HPLC obtenu à partir de surnageants de cellules CD73 + leucémiques prétraité ou non avec l'adénosine désaminase (ADA) , l' inhibiteur érythro-9- adénine (EHNA) , le chlorhydrate de (2-hydroxy-3-de nonyl) (10 uM, 30 min) avant incubation avec l'AMP en tant que substrat (200 uM, 30 min). (C) chromatogramme représentatif obtenu à partir de surnageants de CD73
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Discussion
Le protocole décrit ici permet d'évaluer l'activité du CD39 / CD73 machines adénosinergique dans des milieux de culture cellulaire à partir de cellules leucémiques humaines purifiées. Grâce à cette méthode HPLC, nous pouvons suivre et mesurer quantitativement la production enzymatique de ADO (CD73-dépendant) et sa dégradation subséquente à l'INO (CD26 / ADA dépendant). L'utilisation d'inhibiteurs de l'enzyme permet de contrôler le protocole et d'avoir des contrôles internes. Les avantages et les nouveautés de ce protocole sont que i) il peut être appliqué à des cellules qui se développent dans la culture, que ii) il faut une petite quantité de milieux de culture et que iii) la préparation de l'échantillon est extrêmement facile.
Notre système consiste en un module de séparation équipé d'une pompe basse pression de mélange et de dégazage sous vide en ligne quaternaire avec un passeur d'échantillons. La séparation chromatographique de l'AMP, ADO et INO est réalisée sur une colonne en phase inverse à base de silice qui est utilisé pour la rétention du composé polaire. the système binaire de phase mobile est constituée d'un tampon A (acétate d'ammonium 7 mM dans de l'eau à double désionisée, pH 3,0 ajusté avec de l'acide chlorhydrique) et le tampon B (acétonitrile).
Cette méthode HPLC est sensible, fiable et reproductible et peut être appliquée à différents modèles de culture cellulaire, les cellules adhérentes et en suspension. Il pourrait également être appliquée pour comparer les différentes conditions de culture, telles que normoxie (21% de O 2) et de l' hypoxie (1-3% O 2) ou de comparer les différents états d'activation des cellules. Ici, nous effectuons le traitement des cellules avec des composés de purine dans des plaques de culture cellulaire, mais peut-être des tubes à centrifuger également utilisés pour des traitements de courte durée.
Le procédé décrit ici permet la quantification des nucléotides puriques et les nucléosides extracellulaire consommées et produites dans la réaction en évitant l'utilisation de composés radiomarqués , tels que ceux utilisés dans la Chromatographie sur couche mince (CCM) 10 Dosages. En outre, le stratifiéC système est plus sensible et sélective par rapport à la méthode CCM. Cependant, un système RP-HPLC avec spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) la détection est maintenant considéré comme le meilleur choix pour des mesures quantitatives de nucléotides et nucléosides. Une limitation de cette méthode HPLC est l'exigence d'une colonne d'équilibration exécuter avant chaque exécution d'un seul échantillon, ce qui rend le temps total d'exécution de l'expérience plus longue et limite considérablement les possibilités de projections à haut débit. Des méthodes plus rapides alternatifs sont représentés par le dosage de phosphate vert malachite, une méthode colorimétrique qui permet la mesure indirecte de la conversion d' AMP en ADO, et PAR LE méthode basée luciférase-20. Cependant, ces deux méthodes ne proposent pas une mesure directe de l'adénosine.
Le traitement des échantillons pour cette analyse est minimale et la précipitation des protéines avec de l'acétonitrile est pas nécessaire, car le protocole est basé sur l'utilisation d'un milieu exempt de sérum. Une alternativedans le milieu sans sérum peut être remise en suspension des cellules dans du PBS 5 mM de glucose avant l'incubation avec le substrat.
L'étape critique principale à l'intérieur du protocole est d'obtenir une population pure de cellules B. En effet, les mesures de l' AMP, ADO et INO peuvent être fausses en raison de la présence d'autres populations de cellules exprimant les ectoenzymes impliqués dans cette cascade (par exemple, les lymphocytes T). Un deuxième point critique est d'injecter des milieux de culture filtré dans le système HPLC sans aucune contamination de cellules qui peuvent affecter l'intégrité et la vie de la colonne.
En conclusion, cet essai est relativement rapide et très fiable, permettant une surveillance en temps réel de la consommation de nucléotides et la génération de nucléoside dans les populations de cellules différentes.
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Acknowledgments
Ce travail est soutenu par l'Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 mm x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 mm x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
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