HPLCベースのアッセイは、ヒト慢性リンパ球性白血病細胞における細胞外ヌクレオチド/ヌクレオシド代謝を監視します

Abstract

この方法は、異なる培養条件下で精製した慢性リンパ球性白血病（CLL）細胞によって産生される細胞外プリンヌクレオチド及びヌクレオシドの定量化のために開発、検証、敏感な特定の、信頼性が高く再現可能な逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）アッセイを記載します。アデノシン5'-一リン酸（AMP）、アデノシン（ADO）とイノシン（INO）のクロマトグラフィー分離は、極性化合物の保持のために使用されるシリカベースの逆相カラム上でRTで行われます。方法/分1.00 mlに、流速と7mMの酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルから成る2成分移動相を含みます。溶出液を260nmで設定フォトダイオードアレイUV検出器を用いて監視されます。標準検量線は、各プリン化合物の分析的定量化のための方程式を計算するために生成されます。システム制御、データ収集および分析が次に実施されます。このプロトコルを適用すると、AMP、INOとADOは、それぞれ、7、11および11.9分で溶出し、各試料の総実行時間は20分です。このプロトコルは、マトリックスとして培地を使用して、異なる細胞型および細胞株（懸濁および接着の両方）に適用されてもよいです。利点は、簡単かつ迅速に試料調製及び分析のために上清の少量の要求です。また、無血清培地の使用は、その影響のプリン化合物の最終濃度をアセトニトリルによるタンパク質沈殿のステップをスキップできます。この方法の制限の1つは、より長い実験の合計実行時間を製造し、ハイスループットスクリーニング適用を防ぐ、各単一のサンプルのランの前に平衡化カラムをランの要件です。

Introduction

アデノシン（ADO）は、グリコシド結合を介してリボース糖の分子部分に結合したアデニン分子とプリンヌクレオシドです。ときに細胞外環境中に存在し、それは、免疫系の作用によって過度の損傷から細胞を保護します。この役割は、大腸炎^1、糖尿病^2、喘息^3、敗血症^4、及び虚血性損傷⁵のような異なる疾病モデルを使用して強調されています。メインADO機能の一つは、腫瘍免疫回避⁶に貢献し、腫瘍微小環境における免疫応答の阻害です。この理由のために、ADO形成およびシグナル伝達に関与するメカニズムは、かなりの治療上の関心⁷です。

ADO組織微小環境中のレベルは、正常な生理学的条件下では相対的に低く、確かに免疫細胞の感度閾値以下。しかし、低酸素症、虚血、炎症、感染症、代謝中ストレスや腫瘍変換が、彼 ​​らは急速に^8を高めます。オートクリンおよびパラクリン方法で、組織の損傷を報告するために、一般的に細胞保護とみなすことができる組織応答を生成する：組織摂動信号に応答して上昇した細胞外ADOレベルは二重の機能を持っています。

細胞外ADOが原因アデノシンデアミナーゼによって操作損なわ分解のヌクレオシド輸送体⁹または蓄積によって媒介される細胞内コンパートメントからの放出を含む機構の様々なを通じて形成することができます。増加した細胞外ADOレベルに至る主な経路は、死んでいるか死にかけている細胞から放出されたヌクレオチドのphosphohydrolysisによってADOを生成する膜関連ectoenzymesあるectonucleotidases、のカスケードの作用を伴います。この経路は、CD39の連続作用を介して進行する（ectonucleoside三リン酸ジホ-1）細胞外アデノシン5'-三リン酸に変換します（ATP）またはAMPは^10を ADOに変換アデノシン5'-一リン酸（AMP）およびCD73（5'-ヌクレオチダーゼ）のアデノシン5'-二リン酸（ADP）、。

細胞外ADOは4貫通ADOの受容体、すなわちA1、A2A、A2BおよびA3に結合することによって、その生理学的応答を誘発します。各受容体は、ADOおよび特定の組織分布に対して異なる親和性を持っています。すべての受容体は、7回膜貫通ドメインを有し、（Gタンパク質）を誘導または阻害することができる細胞内のGTP結合タンパク質（Gタンパク質）に結合したGタンパク質（GIタンパク質）アデニル酸シクラーゼ活性と、続いて、細胞内cAMPの産生です。生理学的反応¹¹中の細胞内タンパク質キナーゼ活性のため、細胞内cAMPレベルの変化が影響。生理学的条件下で細胞外ADOは無差別A1、A2AおよびA3受容体を活性化することができ、1μM、以下です。しかし、A2Bサブタイプの活性化は、かなり高い必要このような病態生理学的条件の下で生成されるようなヌクレオシドの濃度は、。あるいは、細胞外ADOは、アデノシンデアミナーゼ（ADA）とCD26、細胞表面上のADAを局在ADA錯化タンパク質によってイノシン（INO）に分解することができます。別の可能性は、ADOがADOキナーゼタンパク質^12,13によってAMPにequilibrativeなヌクレオシドトランスポーター（ENT）およびリン酸化を介して細胞によって内在化されることです。

このプロトコルの目的は、ヒトのリンパ球によって生成されるように、単一の実行で基板AMP及び製品ADOとINOを定量化するために、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）の分析法を記載することです。我々の経験は、最初に構成CD39 ^14,15を発現^する CD19 ⁺ / CD5 ⁺ Bリンパ球の成熟集団の増殖によって特徴付けられる慢性リンパ球性白血病（CLL）患者由来の細胞を用いて得ました。我々は、約30％を示しました。CLL患者のCD73の細胞外酵素を発現し、この表現型は予後不良¹⁶と相関しています。 CD39およびCD73を共発現する白血病細胞のこの亜集団は、積極的にADPおよび/またはAMPから細胞​​外ADOを生成することができます。 α、βメチレン- ADP（APCP）、CD73酵素活性の既知の阻害剤とCD73 ⁺ CLL細胞、完全に遮断外ADO合成のプレインキュベーションは、CD73がそのカスケード¹⁶のボトルネック酵素を表していることを確認しました。

CLL細胞はまたINOへのADOの変換に関与しているADAおよびADA複合体形成タンパク質CD26を発現します。そのようなエリスロ-9-などの特定のADA阻害剤を用いて（2-ヒドロキシ-3-ノニル）Iはwiadenine（EHNA）塩酸塩およびデオキシコホルマイシン（DCF）、それはINOに外ADO劣化を阻止することが可能です。また、ジピリダモールと組み合わせて、ADA阻害剤での前処理は、ブロックヌクレオシドトランスポーターということは、細胞内のADOの蓄積を強化します上清。

それから、CD73依存ADOの生産を確認し、Tリンパ球および骨髄細胞を含む他の系統に由来する細胞に、このプロトコルを拡張しました。これらの知見は、このHPLCプロトコルは非常に汎用性があり、それは、異なる細胞系統に異なる培養条件（ 図1）に適用することができることを示唆しています。

図1 の細胞外ADOの産生を担う酵素機構の略図。アデノシン5'-三リン酸（ATP）および/ ​​またはアデノシン5'-二リン酸（ADP）は、アデノシン5'-一リン酸（AMP）へのCD39によって分解することができ、その今度は、ヌクレオシドアデノシン（ADO）にCD73によって変換されます。 ADOは、細胞外空間に生成されると、それは、ヌクレオシド輸送体（ENT）を介して細胞を再入力することができる、イノシンに変換する（INO）またはP1 ADO受容体の異なるタイプに特異的に結合する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Protocol

CLL血液試料を研究所のガイドライン及びヘルシンキ宣言に従って得られます。

CLL患者の血液サンプルから白血病リンパ球の1の単離

1. ヘパリンナトリウム（グリーン・トップ）チューブ¹⁷内の血液サンプルを採取します。
2. RT 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で全血の3希釈：1にします。
3. 密度勾配遠心分離により血液試料から末梢血単核細胞（PBMC）を精製します。
   1. 下敷き5密度遠心分離媒体（ 例えば、フィコール）のミリリットル15ミリリットルの遠心分離管で、慎重に希釈された血液の10ミリリットルを転送します。すぐに室温で20分間、1500×gで遠心します。
4. 吸引真空ポンプに接続されたガラスパスツールピペットで上清の一部と5ミリリットルピペットで密度遠心分離培地と希釈血漿の間の相間でのPBMCリングを集めます。 （50メートルを50ミリリットルの遠心管に移し、PBSで洗浄リットル最終容量）。 4℃で5分間、500×gで遠心分離します。
5. 吸引したガラスパスツールピペットで上清を、PBS 50mlにペレットを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。
6. ステイン抗CD19とのPBMCおよびフローサイトメトリーのための-CD5抗体は、免疫染色のための標準プロトコルに従い、PBMC亜集団組成¹⁸をチェックします。
   注：CLLリンパ球はCD19 ⁺ / CD5 ⁺です。
7. ¹⁸フローサイトメーターを用いて、CD19 ⁺ / CD5 ⁺細胞の％を確認してください。 CD19 ⁺ / CD5 ⁺ B細胞¹⁹の負の単離のためのステップ2で詳細な手順を以下の白血病細胞の≥95％を有する患者からのBリンパ球を精製します。

負の単離による白血病、B細胞の2精製

1. PBS、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）、2mMのEDTA、pH7.4の（分離緩衝液）中に再懸濁し^{、10 7}のPBMC / mlの。
2. 10を追加します。1; 10 ⁷細胞のマウスモノクローナル抗CD3、-CD14および-CD16一次抗体のgで4℃で30分間インキュベートします。
3. 4℃で5分間、500×gで単離緩衝液および遠心分離で細胞を洗浄します。
4. 10 ⁷のPBMC / mlで単離緩衝液中で細胞を再懸濁します。
5. 細胞とインキュベートする前に、ヒツジ抗マウスIgGにバイアル内の磁気ビーズを再懸濁します。チューブに10 ⁷個の細胞あたりのビーズの100μlのを転送します。
6. 分離バッファの1 mLを加え、1分間磁石ホルダーにチューブを配置します。 5ミリリットルピペットで上清を捨てます。
7. 磁石からチューブを外し、分離緩衝液100μlで洗浄したビーズを再懸濁します。
8. 穏やかに傾斜および回転させながら4℃で30分間、磁気ビーズ100μlの10 ⁷個^の細胞をインキュベートします。
9. 2分間マグネットホルダにチューブを置き、CD19 ⁺ / CD5 ⁺結合していない細胞と上清を移します5ミリリットルピペットで新しいチューブへ。
10. 分離プロトコルの終わりには、フローサイトメトリーのための抗CD19を有する細胞を100μlと-CD5抗体を染色し、4℃で30分間インキュベートします。 、PBS 1％BSAの3ミリリットルで細胞を洗浄上澄み液の過剰を破棄し^、19フローサイトメトリーにより再びB細胞の純度を確認してください。
    注：B細胞の純度は95％よりも低い場合には、追加の負の単離工程を行います。

標準および阻害剤原液の調製

1. AMPを準備するには、AMPの0.00345グラムを秤量し、AMPの2 mMの標準溶液を持つように無血清培地の5ミリリットルでそれを溶解します。
2. ADOを準備するには、ADOのうち0.00265グラムの重量を量るとADOの2 mMの標準溶液を持つように無血清培地の5ミリリットルでそれを溶解します。
3. INOを準備するには、INOの0.00268グラムを秤量し、INOの2 mMの標準溶液を持つように無血清培地の5ミリリットルでそれを溶解します。
4. AMP、ADOの400μM溶液を調製し、INO無血清培地（5 mlの最終容積）4ml中の2mMストック溶液1mlを混合し。
   1. 無血清培地の1500μlの400μM溶液（2 mlの最終容量）の500μLをピペットで100μMの濃度を得るために、各400μMの4希釈標準溶液：1にします。
   2. 以下の濃度を得るために、無血清培地中で各化合物の連続希釈液を準備し、100μM - 50μM - 25μM - 10μM - 5μM - 2.5μM - 1μM - 0.5μM - 0.25μM。
      注：たとえば、無血清培地1ml中の100μMの溶液をピペット1ミリリットル（1：2希釈）、50μMの濃度を得るために、残りの希釈液を進めます。
5. PBSに溶解しAPCPの10mMストック溶液を調製します。 30°C - でアリコートと在庫。
6. ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解したEHNA塩酸、DCF及びジピリダモールの10mMストック溶液を調製します。アリコートと在庫-30°C。

4.プログラムHPLC法

1. 二重脱イオン水2 L（緩衝液A）中の酢酸アンモニウム0.770グラムに溶解することにより7mMの酢酸アンモニウム緩衝液を調製します。塩酸でpHを3.0に調整します。
2. HPLC（緩衝液B）用の超純アセトニトリルの少なくとも2 Lを含むガラス瓶を準備し、HPLCにガードカラムとカラムを接続します。
   注意：使用中の列およびバッファは室温です。
3. HPLCソフトウェアにログインし、「ブラウズ・プロジェクト」ボタンを選択します。 「ファイル」メニューに移動し、「新しい方法」を選択し、「楽器法」。
4. 番組表1に従って平衡化カラム法は1.00 ml /分の流量を設定し、260nmで読み取るためのUV検出器をプログラムします。装置メソッドを保存し、「ファイル」メニューから、再び「新しい方法」を選択し、「メソッドセット」。以前に保存した機器の方法を選択しますそして、同じ名前で設定された現在のメソッドを保存します。

時間	流速（ml /分）	％A	％のB
	1.00	100	0
1.24	1.00	100	0
6.22	1.00	2	98
18.65	1.00	2	98

表1： 平衡化カラム法カラムの平衡化のための溶媒の変化の略図。緩衝液A：7mMの酢酸アンモニウム、pHは3.0。緩衝液B：アセトニトリル。

5. セット1.00メートル流量を表2に示したランサンプル方法をプログラムするステップ4.3を繰り返しL /分およびプログラムUV検出器は260nmで読み取ります。装置メソッドを保存して、メソッドのセットを保存するために、ステップ4.4で説明したのと同じ手順を繰り返し..

時間	流速（ml /分）	％A	％のB
	1.00	0	100
3.74	1.00	0	100
13.71	1.00	15	85
17.00	1.00	100	0
20.00	1.00	100	0

表2： サンプルの実行方法 。プリン化合物のHPLC測定のための溶媒変化の模式図。バフえー：7mMの酢酸アンモニウム、pHは3.0。緩衝液B：アセトニトリル。

6. 「ファイル」メニューから「新しいサンプルセット方法」を選択し、「実行サンプル」ボタンを選択します。
7. 「空」のオプションを選択し、（オートサンプラー中）バイアルの数、サンプル名、注入量（50μl）を入力します。 「メソッドセット」列に前に保存されたメソッドのセットを選択し、合計実行時間（分）を入力します。
   注：各サンプルの実行前に、「メソッドセット」列で平衡化カラム法（ 表1）を入力し、合計実行時 ​​間（分）を入力します。

各化合物についての標準検量線5世代

1. 表1と表2に記載の方法以下の空欄（アデノシンデアミナーゼが含まれていない特定の無血清培地）の各標準試料の50μLを注入します。
   1. 平衡化カラムを使用して方法（ 表1）前各サンプルの実行に、十分なピーク分離を得るために、表2に記載した勾配条件を設定します。これらのHPLC条件の下でAMP、ADOとINOの報告保持時間については、 表3を参照してください。

	リテンションタイム	最大 λ
AMP	8.00分	260
INO	11.00分	260
ADO	11.90分	260

表3：プリン化合物の保持時間 AMP、ADOとINOについて観察された典型的な保持時間。 UV検出器は260nmで読み取るようにプログラムされています。

2. 9点較正曲線を得るために、各標準の名目上の濃度に対してピーク面積をプロットする（100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25μM）。
3. AMP、ADOとINOのために直線の方程式を計算します。y = MX + B、
   xは、μM濃度およびYであり、ピーク面積に相当します。

内部標準曲線の 図2 世代。ADOと得られた相対式のための代表的な標準曲線と。 彼女をクリックしてくださいeは、この図の拡大版を表示します。

基質と阻害剤とのインキュベーション6.前処理（AMP）

1. CD73、ADAおよびヌクレオシド輸送体の阻害せずにAMP消費、ADOとINO世代をテストするには、無血清培地250μlの中で（手順1と2で単離され、精製された）2×10 ⁶ CD19 ⁺ / CD5 ⁺ CLL細胞を再懸濁し、 48ウェルプレート中のプレート細胞（1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内）。
2. CD73の酵素活性をブロックするために、1希釈：1,000 APCP（10ミリモル）のストック溶液を培地中に10μMの最終濃度を得ました。 APCPを含む培地250μlの2×10 ^6個のCLL細胞を再懸濁し、細胞培養インキュベーター中で37℃で60分間前処理します。
3. INOにADOの変換を阻止するために、1希釈：1,000無血清培地中でEHNA塩酸及び/又はDCFのストック溶液（両方とも10 mm）は、10μMの最終濃度を有すること。EHNAおよび/ ​​またはDCFを含む培地250μlの中で2×10 ⁶ CLL細胞を再懸濁します。細胞培養インキュベーター中で37℃で30分間インキュベートします。
4. 10μMの最終濃度を持つように無血清培地でジピリダモールの千ストック溶液（10 mM）の：ヌクレオシドトランスポーターを介してADOの取り込みをブロックするには、1を希釈します。培養培地を含有するジピリダモールの250μlの2×10 ^6個のCLL細胞を再懸濁し、細胞培養インキュベーター中で37℃で30分間インキュベートします。
5. 400μMのAMP 1,000：1に希釈しAPCP、EHNA、DCFおよびジピリダモールの単一ソリューションを準備します。
6. 200μMのAMPの最終濃度を得るために、400μMのAMPまたはAMPプラス阻害剤の250μLを加えます。ブランクサンプルとして使用される基質の非存在下での条件が挙げられます。
7. 30から37℃で60分間インキュベートします。
   注：AMPの最適濃度およびインキュベーション時間は、実験的に決定しました。
8. トンで彼は、インキュベーション時間の終わり（氷上で）冷たいマイクロ遠心チューブに上清の500μLを収集し、直ちに5分間4℃で17000×gで遠心します。
9. 新しい1.5 mlマイクロチューブに上清を移し、直ちに-80℃で保存するか、またはHPLCを実行するための準備をサンプリングに進みます。

7.サンプルをHPLCのための準備

1. 0.2μmのシリンジフィルターを使用して新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブ内の上清をフィルタリングします。フィルタリングのために1ミリリットル注射器を使用してください。
2. HPLCシステムは、オートサンプラーを備えている場合には、HPLCガラスバイアルを準備し、試料の少量の0.1 mlのマイクロインサートを使用します。
3. 転送マイクロピペット又はガラスパスツールピペットでガラスバイアル内のサンプルの少なくとも100μL。泡なしで転送し、スクリューキャップでバイアルを閉じるように注意してください。
4. サンプルは現在、RP-HPLCによる分析のための準備が整いました。

8. HPLC Measuプリンのrements

1. 「ランサンプル」ボタンを選択します。 「ファイル」メニューから「新しいサンプルセット方法」を選択します。
2. 「空」のオプションを選択し、指示：（オートサンプラー中）バイアルの数、サンプル名、注入量（50μl）を。
3. 平衡カラム法と表1と表2に記載ランサンプル方式を選択し、それぞれ、続くすべてのブランクとサンプルの実行のために。
   注：各サンプルの実行前に、平衡化カラム法（ 表1）を設定します 。
4. ブランク（無血清培地）を50μlを注入し、各サンプルの。
5. 各試料中のプリンの濃度を決定し、 表3に記載の保持時間でピーク面積を求めることによりAMP、ADOとINOを定量化します。
   1. 「プロセス」ボタンと「統合」オプションNext]を選択します。開始代わりに、手動で選択しますエリア測定値を得るために、各単一ピークの終了点をND。これは、ピークの開始点と終了点の間の線をトレースすることによって行われます。
   2. 標準曲線に対して得られた式を適用することμMの濃度を決定します。y = xは、μM濃度を表し、yは未知の試料から測定したピークの面積であるMX + B、。
      注：ADO校正標準曲線の例を図2に報告されます。x =（yの面積- 981.02）/ 40026を
6. AMPのマイクロモルを計算し、2×10 ⁶個^の細胞を培地の0.500ミリリットルに再懸濁させたことを考えると、ADOとINOは、消費および/ ​​または以下の割合を適用する10 ⁶ CLL細胞によって産生されます。
   マイクロモル：千ミリリットル= xとのμモル​​：0.250ミリリットル
   注：千ミリリットル中のマイクロモル（数は1 Lでμモル）のは、μM濃度と同等であり、xは NUのマイクロモルであります10 ⁶個^の細胞によって産生されるヌクレオチドまたはヌクレオシド。
   1. 最後に、消費および/ ​​または10 ⁶ CLL細胞によって産生されるナノモルにマイクロモルを変換します。
      ナノモル=マイクロモルのx千

Representative Results

代表的なCLL患者から新たに精製したPBMC中の白血病細胞の割合（％）を評価するために、細胞を抗CD19および抗CD5抗体でマークされています。 図3の左側のパネルには、生きた細胞に選択ゲートと細胞蛍光ドットプロットを表している。 図3は、（中央パネル）の前にCLL患者からのPBMCの一例を示し、（右パネル）B細胞の精製後。

CD73 ⁺ CLL細胞中のプリン化合物のHPLC定量化の例を図4（a）に示されています。 260 nmでのAMP、INOとADOの異なる保持時間は、化合物の同時定量を可能にします。アッセイが正しく実行された場合、すべてのヌクレオチドおよびヌクレオシドは、十分なピーク分離を持っています。基質として200μMのAMPの濃度から出発し、ADOとINOのために得られたピークは明らかにされています可視および濃度を標準検量線の範囲内にあります。しかし、また、基板のより低い濃度（ 例えば、100μM）を使用すると良い結果が得られます。ピーク積分した後、各ピークの領域は、μM濃度にし、最終的に標準曲線を使用することによって10 ⁶ CLLリンパ球によって生成された化合物のナノモルに変換されます。

10μMAPCPによる前処理の60分後にCD73 ⁺細胞によって産生されるADOのHPLCクロマトグラムは、細胞外ADO合成（ 図4A）の完全な遮断を示しています。そのためADA / CD26複合体によって運営INOへのADOの急速な酵素的変換の、10μMのEHNA塩酸塩または10μMDCFにCLL細胞の前処理は、ADAの分解を阻害するために必要とされます。これらの条件下で、細胞外ADO濃度が大幅に増加しています。 Fiのの代表的なクロマトグラム完全INOにADO変換を阻害する- EHNA塩酸塩および/ ​​またはDCF（C 図4B）による前処理はどのようにグレ4のハイライト。

代表的なCLL患者の新たに精製したPBMC中の CD19 ⁺ / CD5 ⁺ 白血病細胞 の％の 図3. 細胞蛍光分析 。生細胞（左パネル）にゲーティングした後、CD19 ⁺ / CD5 ⁺ CLL細胞の％が評価されます。 B細胞（中央パネル）の負の単離の前に、白血病細胞の％を75％に相当します。精製（右パネル）の後CLL Bリンパ球の％は95％に達した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

AMPと異なる阻害剤への曝露後に白血病細胞によって消費と生産細胞外プリンヌクレオチドおよびヌクレオシドの 図4. 定量化。（A）またはα、β-メチレンで前処理することなく、CD73 ⁺白血病性リンパ球によって生成された代表的ADOのクロマトグラムとINO ADP（APCP、10μM、60分）、CD73酵素活性の特異的阻害剤。 （B）CD73 ⁺ CLL細胞の上清から得られた代表的なHPLCクロマトグラムは、前処理されたかどうか、アデノシンデアミナーゼで（ADA）阻害剤エリスロ-9-（2-ヒドロキシ-3-ノニル）アデニン（EHNA）塩酸塩（10μM、30分間）基質としてAMP（200μM、30分間）とのインキュベーションの前に。 （C）CD73の上清から得られた代表的なクロマトグラムこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

ここで説明するプロトコルは、精製されたヒト白血病細胞からの細胞培養培地中のCD39 / CD73アデノシン機械の活性を評価することを可能にします。このHPLC法を通して、私たちは以下の通りと定量的にADO（CD73依存）とINOへのその後の分解（CD26 / ADA依存）の酵素的生成を測定することができます。酵素阻害剤の使用は、プロトコルを制御するために、内部コントロールを有することを可能にします。このプロトコルの利点および新規性は、I）は、II）は、培養培地の少量を必要とするIII）試料調製が非常に容易であることは、培養物中で増殖している細胞に適用することができることです。

私たちのシステムは、オートサンプラーと一緒に四低圧混合ポンプとインライン真空脱気を装備した分離モジュールから構成されています。 AMP、ADOとINOのクロマトグラフィー分離は、極性化合物の保持のために使用されるシリカベースの逆相カラム上で達成されます。目電子バイナリ移動相システムは、緩衝液A（二重脱イオン水で7 mMの酢酸アンモニウム、塩酸で調整してpH3.0）及びバッファーB（アセトニトリル）で構成されています。

このHPLC法は、敏感な信頼性の高い再現可能であり、異なる細胞培養モデル、両方の接着および懸濁細胞に適用することができます。また、通常酸素（O ₂ 21％）および低酸素（1-3％のO _2）のように、異なる培養条件を比較するために適用することができる、または細胞の異なる活性化状態を比較します。ここでは、細胞培養プレート中のプリン化合物による細胞の処理を行うが、短い時間の治療のためにマイクロチューブをも使用することができます。

ここで説明する方法は、薄層クロマトグラフィー^（TLC）10アッセイで用いられるもののような放射性標識化合物の使用を回避する反応で消費され、生成、細胞外プリンヌクレオチド及びヌクレオシドの定量化を可能にします。また、HPLCシステムは、TLC法に比べて、より高感度かつ選択的です。しかし、タンデム質量分析（MS / MS）検出を備えたRP-HPLCシステムは現在、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの定量的測定のための最良の選択であると考えられます。このHPLC法の制限は、長い実験の合計実行時間を作り、大幅高スループットスクリーニングのための可能性を制限し、各単一のサンプルの実行前に実行平衡列の要件です。より高速な代替方法は、マラカイトグリーン、リン酸アッセイ、ADOにAMP変換の間接的な測定を可能にし、ルシフェラーゼベースの方法²⁰メートが比色法で表されます。しかし、両方のこれらの方法は、アデノシンの直接測定を提供していません。

プロトコルは、無血清培地を使用することに基づいているため、このアッセイのための試料処理が最小限であり、アセトニトリルでタンパク質沈殿が必要とされません。代替案無血清培地に基質とのインキュベーションの前にPBS 5 mMグルコース中で細胞を再懸濁することができました。

プロトコル内の主重要な工程は、B細胞の純粋な集団を得ることです。実際、AMP、ADOとINOの測定が原因で、このカスケードに関与するectoenzymes（ 例えば、Tリンパ球）を発現する他の細胞集団の存在をfalseにすることができます。第二の重要な点は、完全性とカラムの寿命に影響を与えることができる任意の細胞を汚染することなく、HPLCシステムに濾過培地を注入することです。

結論として、このアッセイは、異なる細胞集団におけるヌクレオチド消費およびヌクレオシド世代のリアルタイムモニタリングを可能にする、比較的高速で信頼性が高いです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human blood
Milli-Q water	Millipore		double deionised water
Ficoll-Paque Plus	GE-Healthcare	17-1440-03
purified anti-CD3, -CD14, -CD16	made in-house		mouse monoclonal
PE-labeled anti-CD19	Miltenyi Biotec	120-014-229
FITC-labeled anti-CD5	Miltenyi Biotec	130-096-574
Dynabeads sheep anti-mouse IgG	Invitrogen	11031
Phosphate-buffered saline (PBS)	Amresco	E404-200TABS	tablets
bovine serum albumin (BSA)	ID bio	1000-70	standard grade
isolation buffer			PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4
AIM V serum free medium	GIBCO	12055-091	liquid (research grade)
adenosine 5’-diphosphate (ADP)	Sigma-Aldrich	A2754
adenosine 5’-monosphate (AMP)	Sigma-Aldrich	A1752
adenosine (ADO)	Sigma-Aldrich	A9251
inosine (INO)	Sigma-Aldrich	I4125
α,β-methylene-ADP (APCP)	Sigma-Aldrich	M8386	CD73 inhibitor
EHNA hydrochloride	Sigma-Aldrich	E114	adenosine deaminase inhibitor
Deoxycoformycin (dCF)	Tocris	2033	adenosine deaminase inhibitor
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dipyridamole	Sigma-Aldrich	D9766	nucleoside transporter inhibitor
acetonitrile (CHROMASOLV Plus)	Sigma-Aldrich	34998	HPLC-grade
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	9688	7 mM, pH 3.0
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	30721-1L	min. 37%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Bürker cell counter	VWR	631-0920	hemocytometer
DynaMag-15 Magnet	Invitrogen	12301D	Dynal magnetic bead separator
microcentrifuge safe-lock tubes	Eppendorf	030-120-0086	1.5 ml
PET centrifuge tubes	Corning	430053/430304	15 – 50 ml
Minisart RC4 syringe filters	Sartorius Stedim Biotech	17821	membrane 0.2 µm
short thread vials	VWR	548-0029	1.5 ml/glass
micro-inserts	VWR	548-0006	0.1 ml/glass
screw caps	VWR	548-0085	9 mm/PP blue
Atlantis dC18 Column	Waters	186001344	5 µm, 4.6 mm x 150 mm
Atlantis dC18 Guard Column	Waters	186001323	5 µm, 4.6 mm x 20 mm
Waters Alliance 2965 Separations Module	Waters		HPLC separation module
Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector	Waters		UV detector
Waters Empower2 software	Waters