Abstract
이 방법은 민감하고 특이 신뢰성 및 재현성을 역상 고성능 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC) 분석을 개발하여 다양한 배양 조건 하에서 정제 만성 림프 구성 백혈병에 의해 생성 된 세포 외 퓨린 뉴클레오티드 및 뉴 클레오 시드 (CLL) 세포의 정량화 검증 설명 . 크로마토 그래피 아데노신 5'- 모노 포스페이트의 분리 (AMP), 아데노신 (ADO) 이노신 (INO)의 극성 화합물의 보존에 사용되는 실리카 계, 역상 컬럼상에서 RT에서 수행된다. 방법 / 분 1.00 mL의 유속으로 7mm의 암모늄 아세테이트 및 아세토 니트릴로 구성된 이진 이동상을 포함한다. 용출액은 260 nm에서 설정된 광 다이오드 어레이 UV 검출기를 이용하여 모니터링된다. 표준 검량선 각 퓨린 화합물의 분석 정량 식을 계산하기 위해 생성된다. 시스템 제어, 데이터 획득 및 분석이 수행된다. 이 프로토콜을 적용, AMP, 및 ADO INO은 각각 7, 11, 11.9 분에서 용출하고, 각 샘플의 총 실행 시간은 20 분이다. 이 프로토콜은 매트릭스로서 배양 배지를 이용하여 세포 유형 및 세포주 (현탁액 및 부착 모두) 다른 적용될 수있다. 이점은 간단하고 빠른 샘플 준비 및 분석을 위해 상등액을 소량의 요구이다. 또한, 무 혈청 배지를 사용하는 아세토 니트릴과 단백질 침전 단계를 건너 허용하는 영향 퓨린 화합물의 최종 농도. 방법의 한계 중 하나는 각각의 단일 샘플을 실행하기 전에 실행 평형 열의 요건 이상 실험의 총 동작 시간을 결정하고 높은 처리량 스크리닝 응용을 방지한다.
Introduction
아데노신 (ADO)가 글리코 시드 결합을 통해 리보스 당 분자 잔기에 부착 된 아데닌 분자와 퓨린 뉴 클레오 사이드이다. 되면 세포 외 환경에 존재하는, 상기 면역계의 작용에 의해 과도한 손상으로부터 세포를 보호한다. 이 역할은 예 1 대장염, 당뇨병이 천식 3 패혈증 4, 허혈 5와 같은 다른 질병 모델을 사용하여 강조되어왔다. ADO 주요 기능 중 하나는 종양 면역 회피 6에 기여 종양 미세 환경의 면역 반응을 억제한다. 이러한 이유로, ADO 형성과 관련된 시그널링 메커니즘은 상당한 치료 학적 이익 (7)이다.
조직의 미세 ADO 수준은 정상적인 생리 조건 하에서 확실하게 면역 세포의 감도 임계 값보다 상대적으로 낮다. 그러나 동안 저산소증, 허혈, 염증, 감염, 대사스트레스와 종양의 변화는 빠르게 팔을 높일 수 있습니다. 분비하고 분비 방법으로 조직 손상을보고하고 세포 보호 일반적으로 볼 수있는 조직 반응을 생성하기 위해 : 조직 교란 신호에 응답하여 상승 된 세포 수준 ADO는 이중 기능을 갖는다.
세포 외 ADO 때문에 아데노신 데 아미나가 운영하는 장애인 저하의 뉴 클레오 시드 수송 9 축적에 의해 매개 세포 내 구획에서 방출을 포함 메커니즘의 다양한 통해 형성 될 수있다. 증가 된 세포 외 ADO 수준에 이르는 주요 경로는 죽었거나 죽어가는 세포에서 방출 뉴클레오티드의 phosphohydrolysis으로 ADO를 생성하는 막 관련 ectoenzymes 있습니다 ectonucleotidases의 캐스케이드의 활동을 포함한다. 이 경로는 CD39의 순차적 작용을 통해 진행한다 (ectonucleoside 포스페이트 diphosphohydrolase-1)의 세포 외 아데노신 5'- 삼인산 변환 (ATP) 또는 AMP 10 ADO로 변환 아데노신 5'- 모노 포스페이트 (AMP) 및 CD73 (5'- 뉴 클레오)의 아데노신 5'- 인산 (ADP).
세포 외 ADO 네 횡단 ADO 수용체, 즉 A1, A2A, A2B 및 A3에 결합하여 생리적 반응을 이끌어. 각 수용체는 ADO 특정 조직 분포에 대해 서로 다른 친화력을 보유하고 있습니다. 모든 수용체는 일곱 경막 도메인을 가지며 G 단백질 세포 GTP 결합 단백질 (G 단백질)에 결합 된, 즉 유도 (G 단백질), 또는 후속 적으로, 세포의 cAMP의 생산을 억제 (GI 단백질) 아데 닐 레이트 시클 라제 활성과 수있다. 따라서, 생리적 반응 (11) 중 세포 내 단백질 키나제 활성에 세포질 캠프 수준에 미치는 영향의 변화. 생리 학적 조건에서 세포 외 ADO 무차별 A1, A2A 및 A3 수용체를 활성화 할 수 있습니다 1 μM, 이하이다. 그러나, A2B 서브 타입의 활성은 상당히 높은 필요이러한 병태 생리 학적 조건에서 생성되는 것과 같이 뉴 클레오 사이드의 농도. 또한, 세포 외 ADO는 아데노신 데 아미나 제 (ADA)와 CD26, 세포 표면에 ADA 현지화 ADA 착화 단백질에 의해 이노신 (INO)로 저하 될 수 있습니다. 또 다른 가능성은 ADO는 ADO 키나아제 단백질 (12, 13)에 의해 AMP에 equilibrative 뉴 클레오 시드 수송 (ENT) 및 인산화를 통해 세포에 의해 내면화된다는 것이다.
이 프로토콜의 목적은 인간 림프구에 의해 생성 된 바와 같이, 하나의 실행에서, 기판 AMP 및 제품 ADO 및 INO 정량을 역상 고성능 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC)의 분석 방법을 설명한다. 우리의 경험은 초기 구조적 14,15 CD39를 발현하는 CD19 + / CD5 + B 림프구의 성숙 인구의 팽창에 의해 특징 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자로부터의 세포를 사용하여 수득 하였다. 우리는 30 % 정도 나타났다CLL의 환자들은 CD73의 ectoenzyme을 표현하고 있음이 표현형은 불량한 예후 (16)와 상관 관계. CD39 및 CD73 공동 발현 백혈병 세포의이 하위 집단은 적극적으로 ADP 및 / 또는 AMP에서 세포 외 ADO를 생성 할 수 있습니다. α와 CD73 + CLL 세포의 예비 배양은 β 메틸렌 ADP (APCP) CD73 효소 활성의 공지 된 억제제 완전히 차단 외 ADO 합성 CD73가 캐스케이드 (16)의 보틀 넥 효소를 나타내는 것을 확인.
CLL 세포는 INO로 ADO의 변환에 대한 책임이 있습니다 ADA와 ADA 복합체 단백질 CD26를 표현한다. 예컨대 에리트로 -9- 특정 ADA 저해제를 사용하여 (2- 히드 록시 -3- 노닐)는 I wiadenine (EHNA) 염산염 deoxycoformycin (DCF)은 INO에 외 ADO 저하를 차단하는 것이 가능하다. 또한, 디피 리다 몰과 조합의 ADA 억제제와 전처리, 블록 뉴 클레오 시드 운송 것으로, 셀 ADO 축적을 강화상층 액.
우리는 그 다음 CD73에 의존 ADO 생산을 확인하는 T 림프구와 골수 세포를 포함한 다른 계통에서 파생 된 세포에이 프로토콜을 확장했다. 이러한 결과는 본 HPLC 프로토콜 매우 다재다능하고 (도 1) 상이한 세포 계통으로 상이한 배양 조건에 적용 할 수 있다는 것을 시사한다.
세포 외 ADO 생산을 담당하는 효소 기계 그림 1. 도식 표현. 아데노신 5'- 삼인산 (ATP) 및 / 또는 아데노신 5'- 인산 (ADP)은 아데노신 5'- 모노 포스페이트 (AMP)에 CD39에 의해 분해 될 수있는 다시 뉴 클레오 시드 아데노신 (ADO)로 CD73에 의해 변환된다. ADO는 세포 외 공간에서 생산되면,이 뉴 클레오 컨베이어 (ENT)를 통해 셀을 다시 입력 할 수 있고, 이노신으로 변환 (INO) 또는P1 ADO 수용체의 서로 다른 유형의 결합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
CLL 혈액 샘플은 기관 지침 및 헬싱키 선언에 따라 얻을 수있다.
CLL 환자의 혈액 샘플에서 백혈병 림프구 1. 분리
- 나트륨 헤파린 (녹색 위) 튜브 (17)의 혈액 샘플을 수집합니다.
- RT 1X 인산 완충 식염수 (PBS)으로 전체 혈액의 3 희석 : 1을 확인합니다.
- 밀도 구배 원심 분리에 의해 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 정제 하였다.
- 신중 언더 5 15 mL의 원심 분리 튜브의 밀도 원심 분리 매체 (예를 들면, 피콜) ml의 희석 혈액 10 ㎖를 옮긴다. 즉시 실온에서 20 분 동안 1,500 XG에 원심 분리기.
- 진공 펌프에 연결된 유리 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 흡인 부와 5 ml의 피펫 밀도 원심 매체 희석 플라즈마 사이의 계면에서 PBMC 링을 모은다. (50m를 50 ml의 원심 분리 관에 전송하고 PBS로 세척리터 최종 부피). 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기.
- 대기음 유리 파스퇴르 피펫으로 상층 액은 PBS 50 ㎖에 펠렛을 재현 탁하고, 혈구 세포를 사용하여 계산.
- 얼룩 방지 CD19와 PBMC를 및 흐름에 대한 -CD5 항체는 세포 계측법 면역 염색을위한 표준 프로토콜을 다음과 PBMC의 모집단 구성 (18)를 확인합니다.
참고 : CLL 림프구는 CD19 + / CD5 +입니다. - 18 사이토 흐름을 사용하여 CD19 + / CD5 + 세포의 %를 확인합니다. CD19 + / CD5 + B 세포 (19)의 음의 분리를위한 2 단계에 설명 된 지침에 따라 백혈병 세포의 ≥95 % 환자에서 B 림프구를 정화.
음의 분리에 의한 백혈병 B 세포의 2. 정제
- PBS, 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 2 mM의 EDTA, pH 7.4의 (차단 완충액)에서 재현 탁 PBMC를 107 / ㎖.
- 10 추가1, 마우스 단일 클론 항 CD3, -CD14 10 7 세포에 대한 -CD16 차 항체의 g, 4 ℃에서 30 분 동안 품어.
- 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에서 분리 버퍼와 원심 분리기로 세포를 씻으십시오.
- PBMC를 107 / ㎖로 분리 완충액에 세포를 재현 탁.
- 세포와 함께 배양하기 전에, 양 항 - 마우스 IgG를 바이알에 자성 비드를 재현 탁. 튜브 10 (7) 셀 당 구슬의 100 μl를 전송합니다.
- 절연 버퍼 1 mL를 넣고 1 분간 자석 홀더에 튜브를 배치합니다. 5 ml를 피펫으로 상층 액을 버린다.
- 자석에서 튜브를 제거하고 분리 버퍼 100 ㎕의 세척 비드를 재현 탁.
- 완만 한 경사와 회전 4 ° C에서 30 분 동안 자기 구슬 100 ㎕ 10 7 세포를 품어.
- 2 분 동안 자석 홀더에 튜브를 놓고 CD19 + / CD5 + 언 바운드 세포 상층 액을 전송5 ml를 피펫와 신선한 튜브.
- 분리 프로토콜의 마지막에, 세포 계측법 항 CD19과 세포 100 ㎕와 흐름 -CD5 항체 염색, 4 ° C에서 30 분 동안 배양한다. , PBS 1 % BSA의 3 ㎖로 세포를 씻으 뜨는의 과잉을 취소하고 19 유동 세포 계측법에 의해 다시 B 세포의 순도를 확인합니다.
주 : B 세포의 순도는 95 %보다 낮 으면 추가적인 제외 분리 공정을 수행한다.
표준 및 억제제 주식 솔루션 (3) 준비
- AMP를 제조 AMP의 0.00345 g을 달아 및 AMP의 2mm의 표준액을 가지고 무 혈청 배지 5 ㎖에 용해.
- ADO를 준비하려면 ADO 중 0.00265 g의 무게와 ADO의 2 mM의 표준 용액을 가지고 무 혈청 배지 5 ㎖에 용해.
- INO를 준비하려면, INO 중 0.00268 g의 무게 및 INO의 2 mM의 표준 용액을 가지고 무 혈청 배지 5 ㎖에 용해.
- AMP, ADO의 400 μm의 솔루션을 준비하고INO 혈청 배지 (5 ㎖의 최종 부피) 4 ㎖에 2 mM의 스톡 용액 1ml를 혼합함으로써.
- 각 400 μM 표준 용액의 4 희석 무 혈청 배지 (2 ㎖의 최종 부피)의 1,500 μL에 400 μM 용액 500 μl를 피펫 팅하여 100 μM 농도를 얻기 위해 : 1합니다.
- 다음 농도를 얻기 위해, 무 혈청 배지에서 각 화합물의 희석액을 제조 100 μM - 50 μM - 25 μM - 10 μM - 5 μM - 250 μM - 1 μM - 0.5 μM - 0.25 μM.
참고 : 예를 들어, 무 혈청 배지 1 ㎖에서 100 μM 용액을 피펫 1 ㎖ (1 : 2 희석) 50 μM의 농도를 수득하고, 나머지 희석 진행.
- PBS에 용해 APCP의 10 mM 스톡 용액을 준비한다; 30 ° C -에서 나누어지는 및 주식.
- 디메틸 설폭 시드에 용해 EHNA 염산염, DCF 및 디피 리다 몰의 10 mM의 스톡 솔루션 (DMSO)를 준비; 나누어지는과 주식에서 -30기음.
4.를 프로그램 HPLC 방법
- 이중 탈 이온수 2 L (완충액 A)에 아세트산 암모늄 0.770 g을 용해시켜 7 mM의 아세트산 암모늄 완충액을 준비한다. 염산으로 pH 3.0으로 조정합니다.
- HPLC (완충액 B) 용 초순수 아세토 니트릴 중 적어도 2 L를 함유하는 유리 병을 준비하고 보호 컬럼 및 HPLC 컬럼에 연결한다.
참고 : 사용하는 동안 열 및 버퍼는 RT에 있습니다. - HPLC를 소프트웨어에 로그인하고 "찾아보기 프로젝트"버튼을 선택합니다. "파일"메뉴로 이동하여 "새로운 방법"및 "악기 방법"을 선택합니다.
- 프로그램 표 1에 따라, 평형 열 방법. 1.00 ㎖ / 분의 유량을 설정하고 260 nm에서 읽어 UV 검출기를 프로그램. 악기 방법을 저장 한 다음 "방법 설정"을 "파일"메뉴에서 다시 "새로운 방법"을 선택합니다. 이전에 저장 한 악기 방법을 선택동일한 이름으로 설정된 현재의 방법을 저장합니다.
| 시각 | 유속 (㎖ / 분) | %에이 | %비 |
| 1.00 | (100) | 0 | |
| 1.24 | 1.00 | (100) | 0 |
| 6.22 | 1.00 | 이 | 98 |
| 18.65 | 1.00 | 이 | 98 |
표 1 : 평형 열 방식의 열 평형에 대한 용매 변화의 도식 표현.. 완충액 A : 7mm의 암모늄 아세테이트, pH가 3.0. 버퍼 B : 아세토 니트릴.
- 1.00 m의 설정 유량을 표 2에 나타낸 시료 실행 방법을 프로그래밍하는 단계를 반복 4.3L / 분, 프로그램 UV 검출기는 260 nm에서 읽을 수 있습니다. 기기 저장 방법 및 상기 방법들을 저장하는 단계 4.4에 기재된 것과 동일한 절차를 반복 ..
| 시각 | 유속 (㎖ / 분) | %에이 | %비 |
| 1.00 | 0 | (100) | |
| 3.74 | 1.00 | 0 | (100) |
| 13.71 | 1.00 | (15) | (85) |
| 17.00 | 1.00 | (100) | 0 |
| 20.00 | 1.00 | (100) | 0 |
표 2 : 샘플 실행 방법. 퓨린 화합물의 HPLC 측정을위한 용매 변화의 도식 표현. 버프ER A : 7mm의 암모늄 아세테이트, pH가 3.0. 버퍼 B : 아세토 니트릴.
- "파일"메뉴에서 "새로운 샘플 세트 방법을"선택 "을 실행 샘플"버튼을 선택합니다.
- 은 "빈"옵션을 선택합니다 (자동 시료 주입기에) 유리 병의 수, 샘플 이름, 주입량 (50 μL)를 입력합니다. "방법 세트"컬럼에 대해 이전에 저장 한 방법 세트를 선택하고 전체 실행 시간 (분)을 입력합니다.
참고 : 각 샘플 실행하기 전에 "방법 설정 '항목에서 평형 열 방법 (표 1)를 입력하고 전체 실행 시간 (분)을 입력합니다.
각 화합물에 대한 표준 검량선 5 세대
- 빈 (아데노신 데 아미나 제를 포함하지 않는 특정 혈청 배지)의 표 1 및 표 2에 기재된 방법에 따라 각 표준 시료 50 ㎕를 주입한다.
- 평형 열을 사용하여방법 (표 1) 이전에 각각의 샘플 실행하고 적절한 피크 간격을 얻기 위해, 표 2에 기재된 구배 조건을 설정한다. 이러한 HPLC 조건에서 AMP, ADO 및 INO의보고 체류 시간은 표 3을 참조하십시오.
| 유지 시간 | λ 최대 | |
| AMP | 8.00 분 | (260) |
| INO | 11.00 분 | (260) |
| 야단법석 | 11.90 분 | (260) |
표 3 : 퓨린 화합물의 체류 시간 AMP, ADO 및 INO 관찰 일반적인 유지 시간.. 자외선 검출기는 260 nm에서 판독하도록 프로그램된다.
- 아홉 점 보정 곡선을 얻기 위해 각 표준의 공칭 농도에 대해 피크 면적 플롯 (100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 μM).
- AMP, 및 ADO INO에 대한 직선의 식을 계산한다 : Y = MX + B,
x는 μM 농도 Y이고 피크 면적에 대응한다.
내부 표준 곡선의 그림 2 세대. 대표 교정 표준 ADO에 대한 곡선 얻어진 상대 식. 그녀를 클릭하세요전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
기판과 억제제와 배양 6. 전처리 (AMP)
- CD73, ADA의 억제 및 뉴 클레오 시드 수송, 재현 탁하지 않고 AMP 소비, ADO 및 INO 생성을 테스트하는 2 × 10 6 CD19 + / CD5 + CLL 세포 (분리하고 1 단계에서 정제, 2) 무 혈청 배지 250 μL와 48 웰 플레이트에 플레이트 세포 (또는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서).
- CD73의 효소 활성을 차단하기 위해, 희석 한 1,000 APCP (10 mM)을의 원액을 배양 배지에 10 μM의 최종 농도를 얻었다. APCP을 함유하는 배지 250 ㎕를 2 × 106 CLL 세포를 재현 탁하고, 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 60 분간 전처리.
- INO에 ADO의 전환을 차단하려면 희석 1 : 1,000 혈청 배지에서 EHNA 염산염 및 / 또는 DCF의 스톡 용액 (10 mM의 양)이 10 μM의 최종 농도가.EHNA 및 / 또는 DCF를 함유하는 배지 250 ㎕를 2 × 106 CLL 세포를 재현 탁. 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션.
- 10 μM의 최종 농도를 갖는 무 혈청 배지에서 1,000 디피 리다 몰의 원액 (10 mM)을 다음 클레오 수송차를 통해 ADO의 흡수를 차단하는 1 희석. 배양 배지를 함유하는 250 ㎕의 디피 리다 몰에서 2 × 106 CLL 세포를 재현 탁하고, 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
- APCP, EHNA, DCF의 단일 솔루션을 준비하고 디피 리다 몰은 1 희석 : 천 400 μM의 AMP.
- 200 μM AMP의 최종 농도를 얻기 위해 400 μM AMP 또는 AMP 플러스 억제제 250 μL를 추가한다. 기판의 부재 상태가 빈 샘플로서 사용 포함한다.
- 30에서 37 ° C에서 60 분에 품어.
주 : AMP 및 배양 시간의 최적 농도는 실험적으로 결정 하였다. - t에서그는, 배양 시간의 끝 (얼음) 추위의 microcentrifuge 튜브의 상층 액 500 μl를 수집하고 즉시 5 분 동안 4 ° C에서 17,000 XG에 원심 분리기.
- 새로운 1.5 ML의의 microcentrifuge 튜브의 상층 액을 전송하고 즉시 -80 ° C에서 보관 또는 HPLC 실행을위한 준비를 샘플로 진행합니다.
7. 샘플 HPLC 준비
- 0.2 μm의 주사기 필터를 새 1.5 ML의의 microcentrifuge 튜브의 상층 액을 필터링합니다. 필터링에 1 ml의 주사기를 사용합니다.
- HPLC 시스템 오토 샘플러로 제공되면, HPLC 용 유리 바이알을 제조하고 작은 샘플 볼륨에 0.1 ml의 마이크로 인서트를 사용한다.
- 전송 마이크로 피펫 또는 유리 파스퇴르 피펫으로 유리 바이알 샘플의 적어도 100 μL. 거품없이 전송하고 나사 마개로 병을 닫습니다주의하십시오.
- 샘플은 현재 RP-HPLC로 분석을위한 준비가되어 있습니다.
8. HPLC Measu퓨린의 rements
- "실행 샘플"버튼을 선택합니다; "파일"메뉴에서 "새로운 샘플 세트 방법"을 선택합니다.
- 은 "빈"옵션을 선택하고 나타냅니다합니다 (자동 시료 주입기에) 유리 병의 수, 샘플 이름, 주입량 (50 μl를).
- 평형 열 방법 및 표 1 및 표 2에 기재된 실행 샘플 방법을 선택, 각각에 따라 모든 공백 및 예제 실행합니다.
참고 : 각 샘플 실행하기 전에 평형 열 방법 (표 1)를 설정합니다. - 블랭크 (무 혈청 배지)의 각 시료 50 ㎕를 주입한다.
- 각 샘플 퓨린의 농도를 결정하기 표 3에 기술 된 체류 시간에서의 피크 면적을 구하여 AMP, 및 ADO INO 정량화.
- "프로세스"버튼과 "통합"옵션 옆에있는을 선택합니다. ㄱ 시작 또는 수동으로 선택각 단일 피크 ND 종단점 지역 측정치를 얻었다. 이것은 피크의 시작점과 끝점 사이에 선을 추적함으로써 수행된다.
- 표준 곡선에서 얻은 식인가 μM 농도를 측정 : Y = X는 μM 농도를 나타내고, Y는 미지의 시료에서 측정 된 피크의 면적 인 MX + B.
참고 : ADO 교정 표준 곡선의 예는 그림 2에보고됩니다 : X = (Y 지역 - 981.02) / 40,026을
- AMP의 μmoles 계산 2 × 106 세포 배지 0.500 ㎖에 재현 탁 점을 감안하면, ADO 및 INO 소비 및 / 또는 다음의 비율로 도포 106 CLL 세포에 의해 생성 :
μmoles : 1,000 ㎖ = X의 μmoles : 0.250 ml의
참고 : 1,000 ml의의 μmoles (수는 1 L에 μmoles)이 μM 농도에 해당하고, x는 뉴의 μmoles이다의cleotide 또는 뉴 클레오 시드 10 6 세포에 의해 생성.- 마지막으로, 106 CLL 세포에 의해 소비 및 / 또는 생성 된 나노 몰에 μmoles 변환 :
나노 몰 = μmoles X 1000
- 마지막으로, 106 CLL 세포에 의해 소비 및 / 또는 생성 된 나노 몰에 μmoles 변환 :
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Representative Results
대표 CLL 환자에서 갓 정제 된 PBMC에서 백혈병 세포의 비율 (%)을 평가하기 위해 세포는 안티 CD19 및 안티 CD5 항체로 표시되어 있습니다. 그림 3의 왼쪽 패널은 살아있는 세포에 선택적 게이트와 cytofluorimetric 도트 플롯을 나타냅니다. (3) 전 (중간 패널)는 CLL 환자에서 PBMC의 예를 보여줍니다과 후 (오른쪽 패널) B 세포 정화.
CD73 + CLL 세포의 퓨린 화합물의 HPLC 정량의 예를도 4a에 나타낸다. 260 nm에서 AMP, INO 및 ADO의 상이한 체류 시간은 화합물의 동시 정량을 허용한다. 분석이 제대로 실행되면, 모든 뉴클레오티드와 뉴 클레오 시드가 적절한 피크 분리가 있습니다. 기판 200 μM AMP의 농도에서 시작, ADO 및 INO 얻은 피크가 명확하다가시 농도는 표준 검량선의 범위이다. 그러나, 기판과 같은 낮은 농도 (예를 들어, 100 μM)를 사용하면 좋은 결과를 얻을 것이다. 피크 적분 후, 각 피크의 면적은 μM 농도로 그리고 마지막으로 표준 곡선을 사용하여 106 CLL 림프구에 의해 생성 된 화합물의 나노 몰에 변환된다.
10 μM APCP와 전처리 60 분 후 CD73 + 세포에 의해 생성 ADO의 HPLC 크로마토 그램은 세포 외 ADO 합성 (도 4A)의 완전한 봉쇄를 나타냅니다. 때문에 ADA / CD26 복합체에 의해 조작 INO에 ADO의 급속한 효소 변환, 10 μM의 EHNA 염산염 또는 10 μM DCF와 CLL 세포의 전처리는 ADA 저하를 억제 할 필요가있다. 이러한 조건 하에서 세포 ADO 농도가 크게 증가된다. 인터넷의 대표적인 크로마토 그램완전히 INO로 ADO 변환을 억제 - EHNA 하이드로 클로라이드 및 / 또는 DCF (C 그림 4B)와 전처리 방법 gure 4 하이라이트.
대표 CLL 환자의 갓 정제 된 PBMC에서 CD19 + / CD5 + 백혈병 세포의 % 그림 3. Cytofluorimetric 분석. 살아있는 세포 (왼쪽 패널)에 게이팅 후, CD19 + / CD5 + CLL 세포의 %가 평가됩니다. B 세포 (중간 패널)의 음의 분리 전에, 백혈병 세포의 %가 75 %에 상당한다. 정제 (오른쪽 패널) CLL B 림프구의 %가 95 %에 도달 한 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
AMP 다른 억제제에 노출 된 후 백혈병 세포에 의해 소비와 생산 세포 외 퓨린 뉴클레오티드와 뉴 클레오 시드의 그림 4. 정량화. (A) 또는 α, β 메틸렌와 전처리없이 CD73 + 백혈병 림프구에 의해 생성 된 대표 ADO의 크로마토 그램 및 INO ADP (APCP, 10 μM, 60 분), CD73 효소 활성의 특이 억제제. (B) CD73 + CLL 세포의 상층 액으로부터 얻은 대표적인 HPLC 크로마토 그램은 전처리 여부 아데노신 데 아미나 제와 (ADA) 억제제 인 에리스로 -9- (2- 히드 록시 -3- 노닐) 아데닌 (EHNA) 하이드로 클로라이드 (10 μM, 30 분) 기판으로 AMP (200 μM, 30 분)와 부화하기 전에. (C) CD73의 상층 액으로부터 얻은 대표적인 크로마토 그램
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 정제 된 인간의 백혈병 세포에서의 세포 배양 배지에서 CD39 / CD73 adenosinergic 기계의 활성을 평가할 수있게한다. 이 HPLC 방법을 통해 우리는 다음과 정량적으로 ADO (CD73-에 따라 다름) 및 INO에 그 이후의 저하 (CD26 / ADA에 따라 다름)의 효소 생성을 측정 할 수 있습니다. 효소 저해제를 사용하는 프로토콜을 제어하고 내부 제어를 할 수있다. 이 프로토콜의 장점과 참신 II)는 배양액의 소량이 필요하고 ⅲ) 샘플 준비가 매우 용이하다, 배양 성장 세포에 적용될 수있다) 나는 것을이다.
우리의 시스템은 자동 시료와 함께 급 저압 혼합 펌프 인라인 진공 탈기 장치를 구비 한 분리 모듈로 구성된다. AMP, 및 ADO INO의 크로마토 그래피 분리는 극성 화합물의 보존에 사용되는 실리카 계, 역상 컬럼상에서 달성된다. 일즉 이진 이동상 시스템은 완충액 A 구성 (더블 증류수 7 mM의 아세트산 암모늄, pH를 3.0로 조정 염산) 및 완충액 B (아세토 니트릴).
이러한 HPLC 방법은 민감하고 신뢰성 있고 재현성 및 다른 세포 배양 모델 모두 부착 및 세포 현탁액에 적용 할 수있다. 또한 normoxia 이러한 상이한 배양 조건과 저산소증 (1-3 %의 O 2) (O (2)의 21 %)과 비교하거나 다른 세포 활성화 상태를 비교하기 위해 적용될 수있다. 여기에서 우리는 세포 배양 접시에 퓨린 화합물과 세포 치료를 수행하지만, 짧은 시간의 치료에도 사용의 microcentrifuge 튜브가 될 수 있습니다.
여기에 기술 된 방법은 (TLC)는 열 분석하여 박층 크로마토 그래피에 사용되는 것과 같은 방사성 동위 원소 표지 된 화합물의 사용을 회피 반응에서 소비 생산 세포 외 퓨린 뉴 클레오 시드 및 뉴클레오티드의 정량을 허용한다. 또한, HPLTLC 방법에 비해 C 시스템은 또한 더욱 민감하고 선택적이다. 그러나, 탠덤 질량 분광 (MS / MS) 감지와 RP-HPLC 시스템은 지금 뉴클레오티드와 뉴 클레오 시드의 정량적 측정을위한 최선의 선택으로 간주됩니다. 이 HPLC 방법의 한계는 더 이상 실험의 총 동작 시간을 상당히 높은 처리량 스크리닝을위한 가능성을 제한하는 각각의 단일 샘플을 실행하기 전에 실행 평형에 컬럼의 요구 사항이다. 빨리 다른 방법은 말라카이트 그린 인산 분석, ADO로 AMP 변환의 간접적 인 측정이 가능하고, 루시 페라 제 기반 방법 (20) bythe 비색 방법으로 표시됩니다. 그러나이 두 방법은 아데노신의 직접 측정을 제공하지 않습니다.
프로토콜은 무 혈청 배지의 사용에 기초하기 때문에,이 분석을위한 시료 처리는 최소한의 아세토 니트릴로 침전 된 단백질은 필요하지 않다. 대안무 혈청 배지에 기판과 함께 배양하기 전에 PBS 5 mM의 포도당에서 세포를 재현 탁 할 수 있었다.
프로토콜 내의 주요 중요한 단계 B 세포의 순수 집단을 수득하는 것이다. 실제로, AMP, 및 ADO INO의 측정은 이에 캐스케이드 (예 : T 림프구)에 관련된 ectoenzymes를 나타내는 다른 세포 집단의 존재를 거짓으로 할 수있다. 두 번째 중요한 점은 무결성 및 컬럼의 수명에 영향을 줄 수있는 세포의 오염없이 HPLC 시스템으로 필터링 된 배양 배지를 주입한다.
결론적으로, 이러한 분석은 다른 세포 집단의 염기 소비 클레오 세대의 실시간 모니터링을 허용 비교적 빠르고, 신뢰성이 높은 것이다.
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Acknowledgments
이 작품은 Associazione Italiana의 Ricerca Cancro (IG # 12754)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 mm x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 mm x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
- Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
- Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
- Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
- Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
- Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
- Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
- Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M.
- Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
- Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
- Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
- Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what's new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
- Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M.
- Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
- Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
- Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
- Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).
