Abstract
Questo metodo descrive una fase di inversione di cromatografia sensibili, specifiche, affidabile e riproducibile liquida ad alta prestazione (RP-HPLC) test sviluppato e validato per la quantificazione dei nucleotidi extracellulari purine e nucleosidi prodotti da purificata leucemia linfatica cronica (LLC), le cellule in diverse condizioni di coltura . La separazione cromatografica di adenosina 5'-monofosfato (AMP), adenosina (ADO) e inosina (INO) viene eseguita a temperatura ambiente su una colonna a fase inversa a base di silice che viene utilizzato per ritenzione dei composti polari. Il metodo comprende una fase mobile binario, che consiste di ammonio acetato 7 mM e acetonitrile con una portata di 1,00 ml / min. Gli eluati sono monitorati utilizzando un rivelatore UV fotodiodi fissato a 260 nm. Una curva di calibrazione standard è generata per calcolare l'equazione per la quantificazione analitica di ciascun composto purine. Sistema di controllo, acquisizione e analisi dei dati vengono eseguite. L'applicazione di questo protocollo, AMP, INO e ADO eluiscano a 7, 11 e 11,9 min, rispettivamente, e il tempo di esecuzione totale per ogni campione è 20 min. Questo protocollo può essere applicato a diversi tipi di cellule e linee cellulari (sia di sospensione e di aderenti), utilizzando terreni di coltura come matrice. I vantaggi sono facile e veloce preparazione del campione e l'esigenza di una piccola quantità di surnatante per l'analisi. Inoltre, l'uso di un mezzo privo di siero permette saltando il passo proteine precipitazione con acetonitrile che impatta la concentrazione finale dei composti purinici. Uno dei limiti del metodo è il requisito della colonna equilibrio eseguire prima di ogni singola esecuzione del campione, rendendo il tempo di esecuzione totale dell'esperimento più a lungo e prevenire le applicazioni di screening ad alto rendimento.
Introduction
L'adenosina (ADO) è un nucleoside purinico con una molecola di adenina attaccato ad una molecola di residuo di zucchero ribosio attraverso un legame glicosidico. Quando presenti nell'ambiente extracellulare, protegge le cellule da danni eccessivi dall'azione del sistema immunitario. Questo ruolo è stato evidenziato utilizzando diversi modelli di malattie, come la colite 1, il diabete 2, asma 3, sepsi 4 e 5 danno ischemico. Una delle principali funzioni ADO è l'inibizione delle risposte immunitarie nel microambiente tumorale, contribuendo al tumore evasione immune 6. Per questo motivo, i meccanismi coinvolti nella formazione ADO e segnalazione sono di notevole interesse terapeutico 7.
i livelli di ADO nel microambiente tissutale sono relativamente bassi in condizioni fisiologiche normali e certamente al di sotto della soglia di sensibilità delle cellule immunitarie. Tuttavia, durante l'ipossia, ischemia, infiammazioni, infezioni, metabolichelo stress e la trasformazione tumorale che aumentano rapidamente 8. Gli elevati livelli di ADO extracellulari in risposta a segnali di tessuto-perturbante hanno una doppia funzione: da segnalare lesioni dei tessuti in modo autocrino e paracrino e per generare le risposte del tessuto che possono essere visti in generale come cytoprotective.
Extracellulare ADO può essere formato attraverso una varietà di meccanismi, che comprendono il rilascio da compartimenti intracellulari mediati da trasportatori nucleosidici 9 o accumulo a causa del degrado compromessa gestito da adenosina deaminasi. La via principale che porta a un aumento dei livelli extracellulari ADO comporta l'azione di una cascata di ectonucleotidases, che sono associati a membrana ectoenzimi generano ADO phosphohydrolysis di nucleotidi rilasciati dalle cellule morte o morenti. Questo percorso procede attraverso l'azione sequenziale di CD39 (trifosfato ectonucleoside difosfoidrolasi-1) che converte extracellulare adenosina 5'-trifosfato (ATP) o adenosina 5'-difosfato (ADP) di adenosina 5'-monofosfato (AMP) e CD73 (5'-nucleotidasi), che converte AMP ad ADO 10.
Extracellulare ADO suscita le sue risposte fisiologiche legandosi a quattro transmembrana ADO recettori, cioè A1, A2A, A2B e A3. Ogni recettore ha affinità diverse per ADO e distribuzione tissutale specifica. Tutti i recettori hanno sette domini transmembrana e sono accoppiati a proteine G per intracellulari proteine GTP-binding (proteine G), che può indurre (proteina Gs) o inibire (Gi proteine) attività di ciclasi e, di conseguenza, la produzione di cAMP intracellulare. Pertanto, i cambiamenti nel citoplasmatica livelli di cAMP intracellulare impatto sulle attività della proteina chinasi durante risposte fisiologiche 11. In condizioni fisiologiche ADO extracellulare è inferiore a 1 micron, che possono attivare indiscriminatamente A1, A2A e recettori A3. Tuttavia, l'attivazione di A2B sottotipo richiede notevolmente superioreconcentrazioni del nucleoside, quali quelli generati in condizioni fisiopatologiche. In alternativa, ADO extracellulare può essere degradata a inosina (INO) di adenosina deaminasi (ADA) e CD26, una proteina ADA complessante localizzazione ADA sulla superficie cellulare. Un'altra possibilità è che ADO è interiorizzato dalla cella attraverso i trasportatori equilibrativo nucleosidici (ENT) e fosforilata di AMP di ADO proteina chinasi 12,13.
Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo analitico di fase inversa cromatografia liquida ad alta prestazione (RP-HPLC) quantificare in un'unica seduta AMP substrato e prodotti ADO e INO, come generato da linfociti umani. La nostra esperienza è stato inizialmente ottenuto con cellule di pazienti leucemia linfocitica cronica (CLL), che si caratterizzano per l'espansione di una popolazione matura di linfociti CD19 + / CD5 + B che esprimono costitutivamente CD39 14,15. Abbiamo mostrato circa il 30%della LLC pazienti esprimono la ectoenzima CD73 e che questo fenotipo correla con una prognosi infausta 16. Questa sottopopolazione di cellule leucemiche co-esprimono CD39 e CD73 può produrre attivamente ADO extracellulare da ADP e / o AMP. La preincubazione di cellule CD73 + CLL con α, β sintesi extracellulare ADO-metilene-ADP (APCP), un inibitore noto di CD73 attività enzimatica, blocca completamente confermando che CD73 rappresenta l'enzima strozzatura di tale cascade 16.
cellule CLL esprimono anche ADA e l'ADA proteine complessanti CD26, che sono responsabili per la conversione di ADO in INO. Utilizzando inibitori ADA specifici, come eritro-9- (2-idrossi-3-nonil) I wiadenine (EHNA) cloridrato e desossicoformicina (dCF), è possibile bloccare la degradazione ADO extracellulare in INO. Inoltre, pre-trattamento con un inibitore ADA in combinazione con dipiridamolo, che blocca trasportatori nucleosidici, aumenta l'accumulo di ADO nella cellasurnatanti.
Abbiamo poi esteso questo protocollo per le cellule derivate da altre stirpi, tra cui i linfociti T e cellule mieloidi, confermando la produzione ADO CD73-dipendente. Questi risultati suggeriscono che questo protocollo HPLC è estremamente versatile e che può essere applicata a diverse linee cellulari e per diverse condizioni di coltura (Figura 1).
Figura 1. Rappresentazione schematica del meccanismo enzimatico responsabile della produzione ADO extracellulare. Adenosina 5'-trifosfato (ATP) e / o adenosina 5'-difosfato (ADP) può essere degradata per CD39 di adenosina 5'-monofosfato (AMP), che a sua volta viene convertito dal CD73 nella adenosina nucleoside (ADO). Una volta ADO viene prodotto nello spazio extracellulare, può rientrare cella attraverso i trasportatori nucleosidici (ORL), è convertito in inosina (INO) olegarsi a diversi tipi di recettori P1 ADO. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Protocol
campioni di sangue CLL sono ottenuti in accordo con le linee guida istituzionali e Dichiarazione di Helsinki.
1. Isolamento di leucemica Linfociti da campioni di sangue di pazienti affetti da LLC
- Raccogliere il campione di sangue in eparina sodica (verde-top) del tubo 17.
- Fare 1: 3 diluizione del sangue intero con RT 1x tampone fosfato salino (PBS).
- Purificare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da campioni di sangue da gradiente di densità centrifugazione.
- Underlay 5 ml di mezzi di centrifugazione densità (ad esempio, Ficoll) in una provetta da centrifuga da 15 ml e con attenzione trasferire 10 ml di sangue diluito. centrifugare Immediatamente a 1.500 xg per 20 minuti a RT.
- Aspirare parte del surnatante con una pipetta Pasteur di vetro collegato ad una pompa a vuoto e raccogliere l'anello PBMC all'interfase tra media centrifugazione densità e plasma diluito con una pipetta da 5 ml. Trasferire in una provetta da centrifuga da 50 ml e lavare con PBS (50 ml volume finale). Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Aspirare il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro, risospendere il pellet in 50 ml di PBS e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- PBMC macchia con anti-CD19 e -CD5 anticorpi per citometria a flusso a seguito di un protocollo standard per immunostaining e verificare la presenza di PBMC composizione sottopopolazione 18.
Nota: i linfociti CD19 + sono CLL / CD5 +. - Controllare la% di CD19 + / CD5 + cellule utilizzando un citofluorimetro 18. Purificare linfociti B di pazienti con ≥95% delle cellule leucemiche seguendo le istruzioni riportate al punto 2 per l'isolamento negativo delle cellule B CD19 + 19 / + CD5.
2. Purificazione di cellule leucemiche B dall'isolamento Negative
- Risospendere 10 7 PBMC / ml in PBS 0,1% di albumina di siero bovino (BSA) 2 mM EDTA, pH 7,4 (tampone di isolamento).
- Aggiungere 101; g di topo monoclonale anti-CD3, -CD14 e -CD16 anticorpi primari per 10 7 cellule e incubare per 30 min a 4 ° C.
- Lavare le cellule con il buffer di isolamento e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Risospendere le cellule in tampone di isolamento a 10 7 PBMC / ml.
- Prima di incubazione con le cellule, risospendere pecora anti-topo IgG perline magnetiche nel flacone. Trasferire 100 ml di perle per 10 7 cellule in una provetta.
- Aggiungere 1 ml di tampone isolamento e porre il tubo in un supporto magnetico per 1 minuto. Eliminare il surnatante con una pipetta da 5 ml.
- Rimuovere il tubo dal magnete e risospendere le sfere lavati in 100 ml di buffer di isolamento.
- Incubare 10 7 cellule con 100 ml di perline magnetiche per 30 minuti a 4 ° C con ribaltamento dolce e rotazione.
- Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 2 minuti e trasferire il surnatante con le cellule non legato CD19 + / CD5 +in una nuova provetta con una pipetta da 5 ml.
- Alla fine del protocollo di isolamento, macchiare 100 microlitri di cellule con anti-CD19 e -CD5 anticorpi per citometria a flusso e incubare per 30 min a 4 ° C. Lavare le cellule con 3 ml di PBS 1% BSA, eliminare l'eccesso di surnatante e verificare di nuovo B purezza delle cellule mediante citometria di flusso 19.
Nota: eseguire un passaggio aggiuntivo di isolamento negativo se la purezza delle cellule B è inferiore al 95%.
3. Preparazione di standard e inibitori archivio Solutions
- Per preparare AMP, pesare 0,00,345 mila g di AMP e sciogliere in 5 ml di mezzo privo di siero per avere una soluzione standard di 2 mM di AMP.
- Per preparare ADO, pesare 0,00,265 mila g di ADO e sciogliere in 5 ml di mezzo privo di siero per avere una soluzione standard di 2 mM di ADO.
- Per preparare INO, pesare 0,00,268 mila g di INO e sciogliere in 5 ml di mezzo privo di siero per avere una soluzione standard di 2 mM di INO.
- Preparare una soluzione di 400 micron di AMP, ADO eINO mescolando 1 ml di 2 mM soluzione madre in 4 ml di (5 ml di volume finale) senza siero medie.
- Fare diluizione 1: 4 di ciascuna soluzione standard di 400 mM per ottenere una concentrazione di 100 pM pipettando 500 microlitri della soluzione 400 mM in 1.500 ml di mezzo privo di siero (2 ml di volume finale).
- Preparare diluizioni seriali di ciascun composto in mezzo privo di siero per ottenere le seguenti concentrazioni: 100 pM - 50 micron - 25 micron - 10 micron - 5 uM - 2.5 pM - 1 pM - 0,5 uM - 0,25 pM.
Nota: Per esempio, pipettare 1 ml della soluzione 100 mM in 1 ml di mezzo privo di siero (diluizione 1: 2) per ottenere 50 concentrazione uM e procedere con i rimanenti diluizioni.
- Preparare una soluzione madre di 10 mm APCP sciolto in PBS; aliquota e il brodo a - 30 ° C.
- Preparare 10 soluzioni madre mm di EHNA cloridrato, DCF e dipiridamolo sciolto in dimetilsolfossido (DMSO); Un'aliquota e azioni a -30° C.
4. Programmare il metodo HPLC
- Preparare un tampone di acetato di ammonio 7 mm sciogliendo 0,770 g di acetato di ammonio in 2 litri di acqua deionizzata doppia (tampone A). Regolare a pH 3.0 con acido cloridrico.
- Preparare una bottiglia di vetro contenente almeno 2 L superpuro acetonitrile per HPLC (tampone B) e collegare la colonna di protezione e la colonna per HPLC.
Nota: Le colonne e tamponi sono a RT mentre in uso. - Accedere al software HPLC e selezionare il pulsante "progetto di esplorazione". Vai al menu "File" e selezionare "nuovo metodo" e quindi "metodo dello strumento".
- Programmare il metodo della colonna equilibrazione come da Tabella 1. Impostare una portata di 1,00 ml / min e programmare il rivelatore UV per leggere a 260 nm. Salvare il metodo dello strumento e selezionare di nuovo "nuovo metodo" dal menu "File" e poi "metodo set". Scegliere il metodo dello strumento precedentemente salvatoe salvare il metodo corrente impostata con lo stesso nome.
| Tempo | Portata (ml / min) | %UN | % B |
| 1.00 | 100 | 0 | |
| 1.24 | 1.00 | 100 | 0 |
| 6.22 | 1.00 | 2 | 98 |
| 18.65 | 1.00 | 2 | 98 |
Tabella 1: metodo della colonna equilibrazione Rappresentazione schematica delle variazioni di solventi per l'equilibrio della colonna.. Tampone A: 7 mm acetato di ammonio, pH 3,0. Tampone B: acetonitrile.
- Ripetere la fase 4.3 programmare il metodo di esempio run indicato nella Tabella 2. Impostare una portata di 1,00 mL / min e il programma rivelatore UV da leggere a 260 nm. Salvare il metodo dello strumento e ripetere la stessa procedura descritta al punto 4.4 per salvare il metodo set ..
| Tempo | Portata (ml / min) | %UN | % B |
| 1.00 | 0 | 100 | |
| 3.74 | 1.00 | 0 | 100 |
| 13.71 | 1.00 | 15 | 85 |
| 17.00 | 1.00 | 100 | 0 |
| 20.00 | 1.00 | 100 | 0 |
Tabella 2: Eseguire il metodo di campionamento. Rappresentazione schematica dei cambiamenti di solventi per la misurazione HPLC di composti purine. pelle di bufaloEr A: 7 mm di ammonio acetato, pH 3,0. Tampone B: acetonitrile.
- Selezionare il pulsante "campioni RUN", scegliere "nuovo metodo set campione" dal menu "File".
- Selezionare l'opzione "vuoto" e inserire il numero del flacone (nel campionatore automatico), il nome del campione, il volume di iniezione (50 ml). Selezionare il set metodo salvato prima per la colonna "metodo set" ed inserire il tempo totale (min).
Nota: Inserire il metodo della colonna di equilibratura (Tabella 1) nella colonna "metodo set" prima di ogni corsa del campione e immettere il tempo di funzionamento totale (min).
5. Generazione di una curva di calibrazione standard per ciascun composto
- Iniettare 50 ml di vuoto (specifico mezzo privo di siero, che non contiene adenosina deaminasi) e di ogni campione di riferimento secondo le modalità illustrate nella Tabella 1 e nella Tabella 2.
- Utilizzare la colonna di equilibraturaMetodo (Tabella 1) prima di ogni serie di campioni e impostare le condizioni di gradiente descritte in Tabella 2 per ottenere un'adeguata separazione dei picchi. Fare riferimento alla Tabella 3 per i tempi di ritenzione riportati di AMP, ADO e INO in queste condizioni HPLC.
| Tempo di ritenzione | λ max | |
| AMP | 8.00 min | 260 |
| IO NO | 11.00 min | 260 |
| ADO | 11.90 min | 260 |
Tabella 3: I tempi di ritenzione dei composti purine tempi di ritenzione tipici osservati per AMP, ADO e INO.. Il rilevatore UV è programmato per leggere a 260 nm.
- Tracciare le aree dei picchi contro la concentrazione nominale di ogni standard per ottenere la curva di calibrazione nove punti (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 micron).
- Calcolare l'equazione di una retta per AMP, ADO e INO: y = mx + b,
dove x è la concentrazione uM e y corrisponde alla zona di picco.
Figura 2. Generazione di una curva standard interno. Curva rappresentativa standard di calibrazione per ADO e la relativa equazione ottenuta. Cliccate suoe per vedere una versione più grande di questa figura.
6. Il pretrattamento con gli inibitori e incubazione con il substrato (AMP)
- Per eseguire il test AMP consumi, ADO e la generazione INO senza inibizioni di CD73, ADA e trasportatori nucleosidici, risospendere 2 x 10 6 CD19 + / cellule CD5 + CLL (isolato e purificato ai punti 1 e 2) in 250 ml di mezzo privo di siero e cellule piastra in una piastra da 48 (o in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga).
- Per bloccare attività enzimatica CD73, diluito 1: 1000 soluzione madre di APCP (10 mM) nel terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale 10 pM. Risospendere 2 x 10 6 cellule CLL in 250 ml di terreno di coltura contenente APCP e pretrattare 60 min a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare.
- Per bloccare la conversione di ADO in INO, diluire 1: 1.000 soluzione madre di EHNA cloridrato e / o dCF (entrambi 10 mM) in mezzo privo di siero per avere una concentrazione finale 10 pM.Risospendere 2 x 10 6 cellule CLL in 250 ml di terreno di coltura contenente EHNA e / o DCF. Incubare per 30 minuti a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare.
- Per bloccare l'assorbimento di ADO attraverso i trasportatori nucleosidici, diluire 1: 1.000 soluzione madre di dipiridamolo (10 mM) in mezzo privo di siero per avere una concentrazione finale 10 pM. Risospendere 2 x 10 6 cellule CLL in 250 pl di mezzo di coltura contenente dipiridamolo e incubare per 30 min a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare.
- Preparare le soluzioni singole di APCP, EHNA, DCF e dipiridamolo diluito 1: 1.000 in 400 micron AMP.
- Aggiungere 250 ml di 400 micron AMP o AMP più inibitori per ottenere una concentrazione finale di 200 micron AMP. Include una condizione in assenza del substrato da utilizzare come campione in bianco.
- Incubare da 30 a 60 min a 37 ° C.
Nota: la concentrazione ottimale di AMP e il tempo di incubazione sono stati determinati sperimentalmente. - A tha termine del tempo di incubazione, raccogliere 500 ml di surnatanti in provette da microcentrifuga freddo (su ghiaccio) e subito si centrifuga a 17.000 xga 4 ° C per 5 min.
- Trasferire il surnatante in nuovi tubi da 1,5 ml microcentrifuga e subito conservare a -80 ° C o procedere alla preparazione del campione per HPLC viene eseguito.
7. I campioni di preparazione per HPLC
- Filtrare i supernatanti in nuovi tubi da 1,5 ml microcentrifuga con i 0,2 micron filtri per siringa. Usare 1 ml siringhe per il filtraggio.
- Se il sistema HPLC è dotato di un campionatore automatico, preparare le fiale di vetro per HPLC e utilizzare i 0,1 ml microdispositivi per piccoli volumi di campione.
- Trasferimento almeno 100 microlitri di campione nella fiala con una micropipetta o una pipetta Pasteur di vetro. Fare attenzione a trasferire senza bolle e chiudere il flacone con tappo a vite.
- I campioni sono ora pronti per l'analisi mediante RP-HPLC.
8. HPLC measurements delle purine
- Selezionare il pulsante "campioni Run"; scegliere "nuovo metodo set campione" dal menu "File".
- Selezionare l'opzione "vuoto" e di indicare: il numero del flacone (nel autocampionatore), il nome del campione, il volume di iniezione (50 ml).
- Selezionare il metodo della colonna equilibrazione e il metodo di esempio run descritto nella Tabella 1 e nella Tabella 2, rispettivamente, per tutte le piste vuote e di esempio che seguono.
Nota: Impostare il metodo della colonna di equilibratura (Tabella 1) prima di ogni corsa del campione. - Iniettare 50 ml di vuoto (mezzo privo di siero) e di ogni campione.
- Determinare la concentrazione di purine in ciascun campione, quantificare l'AMP, ADO e INO ottenendo le aree dei picchi a tempi di conservazione indicati nella Tabella 3.
- Selezionare il pulsante "processo" e il prossimo l'opzione "integrare". In alternativa scegliere manualmente il iniziare unapunti finali nd di ogni singolo picco per ottenere la misura dell'area. Questo viene fatto tracciando una linea tra i punti di inizio e di fine del picco.
- Determinare la concentrazione uM applicando l'equazione ottenuta per la curva standard: y = mx + b, dove x rappresenta la concentrazione uM e y è l'area del picco misurata dal campione sconosciuto.
Nota: Un esempio di curva standard di taratura ADO è riportato in Figura 2, dove: x = (y zona - 981,02) / 40026
- Considerando che 2 x 10 6 cellule sono state risospese in 0.500 ml di terreno, calcolare le umoli di AMP, ADO e INO consumati e / o prodotti da 10 6 cellule CLL applicando la seguente proporzione:
umoli: 1.000 ml = x umoli: 0,250 ml
Nota: Le umoli a 1.000 ml (numero umoli in 1 L) sono equivalenti alla concentrazione mM ed x sono le umoli di nucleotide o nucleoside prodotti da 10 6 cellule.- Infine, convertire i umoli in nmoli consumate e / o prodotti di 10 6 cellule CLL:
nmoli = umoli x 1.000
- Infine, convertire i umoli in nmoli consumate e / o prodotti di 10 6 cellule CLL:
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Representative Results
Per valutare la percentuale (%) di cellule leucemiche in PBMC appena purificati da un paziente rappresentante CLL, le cellule vengono marcate con anti-CD19 e anti-CD5. Il pannello di sinistra di figura 3 rappresenta un diagramma a punti citofluorimetrica con un cancello selettiva su cellule vive. La Figura 3 mostra un esempio di PBMC da un paziente CLL prima (pannello centrale) e dopo la purificazione delle cellule B (pannello destro).
Un esempio di HPLC quantificazione dei composti purine nelle cellule CD73 + CLL è rappresentato nella figura 4A. I diversi tempi di ritenzione di AMP, INO e ADO a 260 nm consentono la quantificazione simultanea dei composti. Quando il test viene eseguito correttamente, tutti i nucleotidi e nucleosidi hanno un'adeguata separazione dei picchi. Partendo da una concentrazione di 200 pM AMP come substrato, i picchi ottenuti per ADO e INO sono chiaramentevisibile e le concentrazioni sono nella gamma della curva di taratura standard. Tuttavia, usando concentrazioni anche inferiori del substrato (ad esempio, 100 mM) darà buoni risultati. Dopo integrazione dei picchi, le aree di ogni picco vengono convertiti in concentrazione uM ed infine in mmoli di composto prodotto da 10 6 linfociti CLL attraverso l'uso di curve standard.
Il cromatogramma HPLC di ADO prodotta da CD73 + cellule dopo 60 min di pretrattamento con 10 pM APCP indica un blocco completo della sintesi ADO extracellulare (Figura 4A). A causa della conversione enzimatica rapida ADO in INO azionato dal complesso ADA / CD26, pretrattamento delle cellule CLL con 10 pM EHNA cloridrato o 10 pM dCF è necessaria per inibire la degradazione ADA. In queste condizioni le concentrazioni extracellulari ADO sono significativamente aumentati. Cromatogrammi rappresentativi di Figurare 4 evidenzia come pretrattamento con EHNA cloridrato e / o DCF (Figura 4B - C) inibisce completamente la conversione ADO in INO.
Figura 3. analisi citofluorimetrica della% di CD19 + / CD5 + cellule leucemiche in PBMC appena purificati di un paziente rappresentante LLC. Dopo gating sulle cellule vive (pannello di sinistra), la% di cellule CD19 + / CD5 + CLL viene valutata. Prima l'isolamento negativo delle cellule B (pannello centrale), la% di cellule leucemiche corrisponde al 75%. Dopo la purificazione (pannello di destra) la% di linfociti B CLL raggiunge il 95%. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Quantificazione dei nucleotidi purinici extracellulari e nucleosidi consumate e prodotte dalle cellule leucemiche dopo l'esposizione alla AMP e diversi inibitori. (A) cromatogrammi rappresentativi di ADO e INO generati da CD73 + linfociti leucemici con o senza pre-trattamento con α, β-methylene- ADP (APCP, 10 pM, 60 min), un inibitore specifico di CD73 attività enzimatica. (B) rappresentativa cromatogramma HPLC ottenuti da supernatanti di cellule CD73 + CLL pretrattato o meno con l'adenosina deaminasi (ADA) inibitore eritro-9- (2-idrossi-3-nonil) adenina (EHNA) cloridrato (10 pM, 30 min) prima dell'incubazione con AMP come substrato (200 mM, 30 min). (C) cromatogramma rappresentativa risultante da surnatanti di CD73
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Discussion
Il protocollo qui descritto permette di valutare l'attività del CD39 / CD73 macchine adenosinergic in mezzi di coltura cellulare da cellule leucemiche umane purificate. Attraverso questo metodo HPLC possiamo seguire e quantitativamente misurare la generazione enzimatica di ADO (CD73-dipendente) e la sua successiva degradazione di INO (CD26 / ADA dipendente). L'uso di inibitori enzimatici permette di controllare il protocollo e di avere controlli interni. I vantaggi e le novità di questo protocollo è che i) può essere applicata alle cellule che crescono in coltura, che ii) richiede una piccola quantità di terreni di coltura e che iii) la preparazione del campione è estremamente semplice.
Il nostro sistema è costituito da un modulo di separazione dotato di pompa di miscelazione e linea a bassa pressione degasaggio sottovuoto quaternario insieme con un autocampionatore. La separazione cromatografica di AMP, ADO e INO è realizzato su una colonna a fase inversa a base di silice che viene utilizzato per ritenzione dei composti polari. thsistema binario fase mobile e consiste di un tampone A (acetato di ammonio 7 mM in acqua deionizzata doppia, pH 3,0 regolato con acido cloridrico) e Tampone B (acetonitrile).
Questo metodo HPLC è sensibile, affidabile e riproducibile e può essere applicato a diversi modelli di coltura cellulare, sia cellule aderenti e sospensione. Esso può essere applicato anche per confrontare le diverse condizioni di coltura, come normossia (21% di O 2) e ipossia (1-3% O 2) o per confrontare diversi stati di attivazione di cellule. Qui eseguiamo trattamento delle cellule con composti purine in piastre di coltura cellulare, ma può essere microprovette utilizzato anche per i trattamenti di tempo brevi.
Il metodo qui descritto consente la quantificazione dei nucleotidi purinici extracellulari e nucleosidi consumati e prodotti nella reazione evitando l'uso di composti radiomarcati come quelli impiegati in cromatografia su strato sottile (TLC) Saggi 10. Inoltre, l'HPLSistema C è anche più sensibile e selettivo rispetto al metodo TLC. Tuttavia, un sistema di RP-HPLC con spettrometria di massa tandem di rilevamento (MS / MS) è ormai considerata la scelta migliore per le misure quantitative di nucleotidi e nucleosidi. Una limitazione di questo metodo HPLC è il requisito di una colonna equilibrazione eseguire prima di ogni singola esecuzione del campione, rendendo il tempo di funzionamento totale della sperimentazione più lunga e limitare in modo significativo le possibilità di proiezioni ad alto rendimento. Metodi alternativi veloce sono rappresentati dal saggio fosfato verde malachite, un metodo colorimetrico che permette la misura indiretta della conversione AMP in ADO e bythe metodo luciferasi basato 20. Tuttavia, entrambi questi metodi non offrono una misura diretta di adenosina.
Il campione di trasformazione per questo dosaggio è minimo e non è necessaria la precipitazione delle proteine con acetonitrile, perché il protocollo si basa sull'impiego di un mezzo privo di siero. Un'alternativaal mezzo privo di siero potrebbe essere per risospendere le cellule in PBS 5 mM di glucosio prima della incubazione con il substrato.
Il passo critico principale all'interno del protocollo è quello di ottenere una popolazione pura di cellule B. Infatti, le misurazioni di AMP, ADO e INO possono essere falso dovuto alla presenza di altre popolazioni cellulari che esprimono le ectoenzimi coinvolte in questa cascata (ad esempio, linfociti T). Un secondo punto critico è quello di iniettare mezzi di coltura filtrato nel sistema HPLC senza alcuna contaminazione cellula che può compromettere l'integrità e la vita della colonna.
In conclusione, questo saggio è relativamente veloce e altamente affidabile, consentendo il monitoraggio in tempo reale del consumo nucleotide e generazione nucleoside in differenti popolazioni cellulari.
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Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 mm x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 mm x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
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