Abstract
Este método descreve uma cromatografia sensível, específico, fiável e reprodutível de fase inversa de alto desempenho líquida (RP-HPLC) desenvolvido e validado para a quantificação de nucleótidos extracelulares de purina e nucleósidos produzidos por purificada da leucemia linfocítica crónica (CLL) células, sob diferentes condições de cultura . A separação cromatográfica de adenosina 5'-monofosfato (AMP), a adenosina (ADO) e inosina (NOi) é realizada a temperatura ambiente numa coluna à base de sílica, de fase inversa que é usada para a retenção de composto polar. O método inclui uma fase móvel binária, que consiste em acetato de amónio 7 mM e acetonitrilo com um caudal de 1,00 ml / min. Os eluatos são monitorizadas utilizando um detector de UV de fotodíodos ajustado a 260 nm. Uma curva de calibração padrão é gerada para calcular a equação para a quantificação analítica de cada composto de purina. controle do sistema, aquisição e análise de dados são então realizadas. Aplicando este protocolo, AMP, INO e ADO eluir aos 7, 11 e 11,9 min, respectivamente, eo tempo total de execução para cada amostra é de 20 min. Este protocolo pode ser aplicado a diferentes tipos de células e linhas celulares (ambos de suspensão e aderentes), utilizando meios de cultura como matriz. As vantagens são a preparação da amostra fácil e rápido e a exigência de uma pequena quantidade de sobrenadante para análise. Além disso, a utilização de um meio isento de soro permite saltando a etapa de precipitação de proteínas com acetoni trilo que os impactos a concentração final dos compostos de purina. Uma das limitações do método é a exigência de a coluna de equilíbrio executado antes de cada corrida única amostra, fazendo com que o tempo total de funcionamento do experimento mais tempo e evitando aplicações rastreio de alto rendimento.
Introduction
A adenosina (ADO) é um nucleósido de purina com uma molécula de adenina ligado a uma molécula porção de açúcar ribose através de uma ligação glicosídica. Quando presente no meio extracelular, que protege as células de danos excessivos pela acção do sistema imune. Este papel tem sido destacada usando diferentes modelos de doenças, tais como a colite 1, 2 diabetes, asma 3, sepse 4 e lesão isquêmica 5. Uma das principais funções ADO é a inibição de respostas imunitárias no microambiente tumoral, contribuindo para a evasão do tumor imune 6. Por esta razão, os mecanismos envolvidos na formação de ADO e de sinalização são de considerável interesse terapêutico 7.
ADO níveis no microambiente do tecido são relativamente baixas, em condições fisiológicas normais e, certamente, inferior ao limiar de sensibilidade das células imunes. No entanto, durante a hipoxia, isquemia, inflamação, infecção, metabólicastress e transformação do tumor eles aumentam rapidamente 8. Os elevados níveis ADO extracelular em resposta a sinais de perturbação do tecido tem uma dupla função: relatar lesão do tecido de uma maneira autócrina e parácrina e gerar respostas de tecido que pode ser geralmente visto como citoprotetor.
ADO extracelular pode ser formada através de uma variedade de mecanismos, que incluem a libertação a partir de compartimentos intracelulares mediadas por transportadores de nucleosídeos 9 ou acumulação por causa da degradação auditivos operado pela adenosina-desaminase. A principal via que conduz ao aumento dos níveis extracelulares ADO envolve a acção de uma cascata de ectonucleotidases, que são ectoenzimas associadas à membrana, gerando ADO phosphohydrolysis de nucleótidos libertados a partir de células mortas ou a morrer. Esta via prossegue através da ação sequencial de CD39 (trifosfato de ectonucleoside difosfohidrolase-1) que converte extracelular de adenosina 5'-trifosfato (ATP) ou adenosina 5'-difosfato (ADP) em adenosina-5'-monofosfato (AMP) e de CD73 (5'-nucleotidase), que converte a AMP ADO 10.
Extracelular ADO provoca suas respostas fisiológicas pela ligação a quatro transmembrana ADO receptores, ou seja, A1, A2A, A2B e A3. Cada receptor tem diferentes afinidades para ADO e distribuição do tecido específico. Todos os receptores possuem sete domínios transmembranares e são a proteína G acoplado a proteínas de ligação de GTP intracelular (proteínas G), que pode induzir a (proteína Gs) ou inibir a actividade da adenilato ciclase (proteína Gi) e, subsequentemente, a produção de AMPc intracelular. Portanto, mudanças no citoplasmática impacto níveis acampamento na atividade da proteína quinase intracelular durante as respostas fisiológicas 11. Sob condições fisiológicas ADO extracelular é abaixo de 1 uM, que podem activar indiscriminadamente A1, A2A e A3 receptores. No entanto, a activação de subtipo A2B requer consideravelmente maiorAs concentrações de nucleósido, tais como os gerados sob condições fisiopatológicas. Alternativamente, o ADO extracelular pode ser degradada de inosina (NOi) por adenosina-desaminase (ADA) e de CD26, uma proteína complexante da ADA localizar ADA na superfície da célula. Outra possibilidade é que o ADO é internalizado pela célula através dos transportadores de nucleosídeos equilibrative (ENT) e fosforilado em AMP por ADO proteína quinase 12,13.
O objectivo deste protocolo é descrever um método analítico de cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa (RP-HPLC) para quantificar num único ensaio AMP substrato e dos produtos de ADO e Ino, como gerado por linfócitos humanos. A experiência foi inicialmente obtida usando células de pacientes com leucemia linfocítica crónica (LLC), que são caracterizados pela expansão de uma população madura de linfócitos CD19 + / B CD5 + constitutivamente expressam CD39 14,15. Mostrámos cerca de 30%de CLL pacientes expressam a ectoenzima CD73 e que este fenótipo correlaciona-se com um mau prognóstico 16. Esta subpopulação de células leucêmicas co-expressam CD39 e CD73 pode produzir ativamente ADO extracelular a partir de ADP e / ou AMP. A pré-incubação de células CD73 + de CLL com α, síntese ADO extracelular β-metileno-ADP (APCP), um conhecido inibidor da actividade enzimica de CD73, que bloqueia completamente confirmando CD73 representa o enzima gargalo de que cascata 16.
células CLL expressam também a ADA e a ADA complexação proteína CD26, que são responsáveis pela conversão de ADO dentro INO. Ao utilizar inibidores específicos de ADA, como eritro-9- (2-hidroxi-3-nonil) eu wiadenine (EHNA) e cloridrato de desoxicoformicina (DCF), é possível bloquear a degradação ADO extracelular em INO. Além disso, o pré-tratamento com um inibidor da ADA em combinação com dipiridamol, que bloqueia os transportadores de nucleosídeos, aumenta a acumulação ADO na célulasobrenadantes.
Temos, em seguida, estendeu este protocolo para células derivadas de outros linhagens, incluindo linfócitos T e células mielóides, confirmando produção ADO dependente de CD73. Estes resultados sugerem que este protocolo de HPLC é altamente versátil e que pode ser aplicado a diferentes linhagens celulares e para diferentes condições de cultura (Figura 1).
Figura 1. Representação esquemática da maquinaria enzimática responsável pela produção de ADO extracelular. A adenosina 5'-trifosfato (ATP) e / ou da adenosina-5'-difosfato (ADP) pode ser degradado pela CD39 de adenosina 5'-monofosfato (AMP), a qual por sua vez, é convertido por CD73 para o nucleosídeo adenosina (ADO). Uma vez ADO é produzida no espaço extracelular, pode reinserir a célula através dos transportadores de nucleosídeos (ENT), ser convertidos em inosina (NOi) ouligam-se a diferentes tipos de receptores P1 ADO. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
amostras de sangue CLL são obtidos de acordo com as diretrizes institucionais e Declaração de Helsinki.
1. Isolamento de Linfócitos Leucêmica de amostras de sangue de doentes de CLL
- Recolher amostra de sangue em heparina sódica (verde-top) Tubo de 17.
- Adicione diluição de 1: 3 de sangue total com RT 1x tampão fosfato salino (PBS).
- Purifica-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir de amostras de sangue por centrifugação com gradiente de densidade.
- Underlay 5 ml de meio de centrifugação de densidade (por exemplo, Ficoll) num tubo de centrífuga de 15 ml e transferir cuidadosamente 10 ml de sangue diluído. Imediatamente centrifugar a 1.500 xg durante 20 min à TA.
- Aspirar parte do sobrenadante com uma pipeta de Pasteur de vidro, ligado a uma bomba de vácuo e recolher o anel de PBMC na interfase entre a densidade de meios de centrifugação e diluiu-se o plasma com uma pipeta de 5 mL. Transferir para um tubo de centrífuga de 50 ml e lava-se com PBS (50 ml de volume final). Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de Pasteur de vidro, ressuspender o sedimento em 50 ml de PBS e contar as células utilizando um hemocitómetro.
- PBMC mancha com anti-CD19 e -CD5 anticorpos para citometria de fluxo seguindo um protocolo padrão para imunocoloração e verificar se há PBMC composição subpopulação 18.
Nota: linfócitos LLC são CD19 + / CD5 +. - Verifique a% de CD19 + / CD5 + células usando um citômetro de fluxo 18. Purifica-se linfócitos B de pacientes com uma ≥95% de CD19 + / células leucémicas seguintes as instruções descritas no passo 2 para o isolamento de células B negativa 19 CD5 +.
2. A purificação de células leucémicas B por isolamento negativo
- Ressuspender 10 7 PBMC / ml em PBS 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) a 2 mM de EDTA, pH 7,4 (tampão de isolamento).
- Adicionar 101; g de monoclonal de rato anti-CD3, e -CD14 -CD16 anticorpos primários para 10 7 células e incubar durante 30 min a 4 ° C.
- Lavam-se as células com o tampão de isolamento e centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em tampão de isolamento em 10 7 PBMC / ml.
- Antes da incubação com as células, ressuspender IgG anti-ratinho de ovelha esferas magnéticas no frasco. Transferir 100 ul de pérolas por 10 7 células para um tubo.
- Adicionar 1 mL de tampão de isolamento e colocar o tubo num suporte magnético durante 1 minuto. Descartar o sobrenadante com uma pipeta de 5 mL.
- Remover o tubo do íman e ressuspender as esferas lavadas em 100 ul de tampão de isolamento.
- Incubar 10 7 células com 100 uL de pérolas magnéticas durante 30 min a 4 ° C com inclinação suave e a rotação.
- Colocar o tubo no suporte de íman durante 2 minutos e transfere-se o sobrenadante com as células não ligadas CD19 + / + CD5para um novo tubo com uma pipeta de 5 mL.
- No final do protocolo de isolamento, mancha de 100 ul de células com anti-CD19 e anticorpos -CD5 para citometria de fluxo e incubar 30 min a 4 ° C. Lavam-se as células com 3 ml de PBS, BSA a 1%, deite fora o excesso de sobrenadante e verificar a pureza de células B novamente por citometria de fluxo 19.
Nota: Executar uma etapa de isolamento negativo adicional se a pureza das células B é inferior a 95%.
3. Preparação de Padrões e inibidores de Soluções de Stock
- Para preparar AMP, pesam-se 0,00345 g de AMP e dissolvê-la em 5 ml de meio isento de soro para uma solução padrão 2 mM de AMP.
- Para preparar ADO, pesar 0,00265 g de ADO e dissolvê-lo em 5 ml de meio livre de soro para ter uma solução padrão de 2 mM de ADO.
- Para preparar INO, pesar 0,00268 g de INO e dissolvê-lo em 5 ml de meio livre de soro para ter uma solução padrão de 2 mM de INO.
- Preparar uma solução 400 mM de AMP, ADO eINO por mistura de 1 mL da solução-mãe 2 mM em 4 ml de (5 ml de volume final) meio isento de soro.
- Fazer uma diluição de cada solução de referência 400 | iM 4 para se obter uma concentração de 100 ^ M por pipetagem de 500 ul da solução de 400 uM em 1.500 mL de meio isento de soro (2 ml de volume final).
- Preparar diluições em série de cada composto em meio isento de soro para se obter as seguintes concentrações: 100 pM - 50 pM - 25 pM - 10 pM - 5 | iM - 2,5 ^ M - 1 | iM - 0,5 ^ M - 0,25 uM.
Nota: Por exemplo, pipeta de 1 ml da solução de 100 uM em 1 ml de meio isento de soro (diluição 1: 2) para se obter 50 uM de concentração e prosseguir com as restantes diluições.
- Prepara-se uma solução de estoque 10 mM de APCP dissolvido em PBS; alíquota e ações a - 30 ° C.
- Preparar soluções de estoque 10 mM de cloridrato de EHNA, o DCF e dipiridamole dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO); alíquota e estoque a -30° C.
4. Programa do Método HPLC
- Preparar um tampão de acetato de amónio 7 mM por dissolução de 0,770 g de acetato de amónio em 2 L de água desionizada dupla (Tampão A). Ajustar a pH 3,0 com ácido clorídrico.
- Prepara-se uma garrafa de vidro contendo pelo menos 2 L de acetonitrilo para HPLC ultrapura (Tampão B) e conectar-se a pré-coluna e a coluna de HPLC.
Nota: As colunas e os buffers são à TA durante a utilização. - Faça o login no software HPLC e selecione o botão "projecto de procura". Vá para o menu "Arquivo" e selecione "novo método" e depois "método do instrumento".
- Programa do método da coluna de equilíbrio de acordo com a Tabela 1. Definir um caudal de 1,00 ml / min e programar o detector de UV a leitura a 260 nm. Salve o método do instrumento e selecione novamente "novo método" do menu "Arquivo" e depois "set método". Escolha o método de instrumento previamente salvose salvar o atual método definido com o mesmo nome.
| Tempo | Taxa de fluxo (ml / min) | %UMA | % B |
| 1.00 | 100 | 0 | |
| 1,24 | 1.00 | 100 | 0 |
| 6.22 | 1.00 | 2 | 98 |
| 18.65 | 1.00 | 2 | 98 |
Tabela 1: método da coluna de Equilíbrio Representação esquemática das alterações solvente para o equilíbrio da coluna.. Tampão A: acetato de amio 7 mM, pH 3,0. Tampão B: acetonitrilo.
- Repita o passo 4.3 para programar o método de amostra prazo indicado na Tabela 2. Defina uma taxa de fluxo de 1,00 mL / min e um programa de detector de UV para ler a 260 nm. Guardar o método do instrumento e repetir o mesmo procedimento como descrito no passo 4.4 para guardar o conjunto método ..
| Tempo | Taxa de fluxo (ml / min) | %UMA | % B |
| 1.00 | 0 | 100 | |
| 3,74 | 1.00 | 0 | 100 |
| 13,71 | 1.00 | 15 | 85 |
| 17.00 | 1.00 | 100 | 0 |
| 20,00 | 1.00 | 100 | 0 |
Tabela 2: Executar método de amostra. Representação esquemática das alterações de solventes para a medição de HPLC de compostos de purina. tapaer A: acetato de amio 7 mM, pH 3,0. Tampão B: acetonitrilo.
- Selecione o botão "amostras executados", escolha "novo método conjunto de amostras" do menu "Arquivo".
- Selecione a opção "vazio" e digite o número do frasco (no amostrador automático), o nome da amostra, o volume de injecção (50 ul). Selecione o conjunto de método salvo antes para a coluna "método set" e digite o tempo de execução total (min).
Nota: Digite o método da coluna de equilíbrio (Tabela 1) na coluna "método set" antes de cada amostra Executar e digite o tempo de execução total (min).
5. Geração de uma curva de calibração padrão para cada composto
- Injecte 50 ul de branco (meio isento de soro específico, que não contém adenosina-desaminase) e de cada amostra padrão seguindo os métodos descritos na Tabela 1 e Tabela 2.
- Utilize a coluna de equilíbriométodo (Tabela 1) antes de cada amostra de execução e definir as condições de gradiente descritos na Tabela 2 para obter a separação pico adequado. Consulte a Tabela 3 para tempos de retenção relatados de AMP, ADO e INO nestas condições de HPLC.
| Tempo de retenção | λ max | |
| AMP | 8,00 min | 260 |
| EU NÃO | 11.00 min | 260 |
| ADO | 11.90 min | 260 |
Tabela 3: Os tempos de retenção dos compostos de purina tempos de retenção típicos observados para AMP, ADO e INO.. O detector de UV está programado para ler a 260 nm.
- Traçar as áreas de pico em função da concentração nominal de cada padrão para se obter a curva de calibração de nove pontos (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 mM).
- Calcule a equação de uma linha reta para a AMP, ADO e INO: y = mx + b,
em que x é a concentração uM e Y correspondem à área de pico.
Figura 2. Geração de uma curva padrão interno. Curva padrão de calibração Representante para ADO e a equação relativa obtida. Por favor, clique delae para ver uma versão maior desta figura.
6. O pré-tratamento com os inibidores e incubação com o substrato (AMP)
- Para testar AMP consumo, ADO e geração INO sem inibição de CD73, ADA e transportadores de nucleosídeos, ressuspender + / células CD5 + CLL 2 x 10 6 CD19 (isolado e purificado nos passos 1 e 2) em 250 ul de meio isento de soro e células da placa numa placa de 48 (ou em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml).
- Para bloquear a actividade enzimática de CD73, dilua 1: 1000 da solução de stock de APCP (10 mM) no meio de cultura para obter uma concentração final de 10 uM. Ressuspender 2 X 10 6 células CLL em 250 ul de meio de cultura contendo APCP e pré-tratamento de 60 min a 37 ° C numa incubadora de cultura de células.
- Para bloquear a conversão de ADO dentro INO, dilua 1: 1000 da solução-mãe de cloridrato de EHNA e / ou DCF (ambos 10 mM) em meio isento de soro para uma concentração final de 10 uM.Ressuspender 2 X 10 6 células CLL em 250 ul de meio de cultura contendo EHNA e / ou dCF. Incubar durante 30 min a 37 ° C na incubadora de cultura de células.
- Para bloquear a captação de ADO através dos transportadores de nucleosídeos, dilua 1: 1000 da solução de stock de dipiridamole (10 mM) em meio isento de soro para uma concentração final de 10 uM. Ressuspender 2 X 10 6 células CLL em 250 ul de meio de cultura contendo dipiridamol e incubar durante 30 min a 37 ° C na incubadora de cultura de células.
- Preparar soluções únicas de APCP, EHNA, o DCF e Dipiridamol diluído 1: 1.000 em 400 mM AMP.
- Adicionar 250 uL de 400 uM de AMP ou mais inibidores da AMP para obter uma concentração final de 200 ^ M de AMP. Incluir uma condição na ausência do substrato a ser usado como amostra de controlo.
- Incubar de 30 a 60 min a 37 ° C.
Nota: A concentração óptima de AMP e o tempo de incubação foram determinados experimentalmente. - em tele final do tempo de incubação, recolher 500 uL dos sobrenadantes em tubos de microcentrífuga frios (em gelo) e centrifuga-se imediatamente a 17000 xg, a 4 ° C durante 5 min.
- Transfira os sobrenadantes em novos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar imediatamente a -80 ° C ou proceder à preparação da amostra para o HPLC é executado.
7. Preparação de Amostras para HPLC
- Filtrar os sobrenadantes em novos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml com os 0,2? M filtros de seringa. Use seringas de 1 ml para filtragem.
- Se o sistema de HPLC é fornecido com um amostrador automático, preparar os frascos de vidro para usar HPLC e os 0,1 ml de micro-implantes para pequenos volumes de amostra.
- Transferência de pelo menos 100 ul de amostra no frasco de vidro com uma micropipeta ou de uma pipeta de Pasteur de vidro. Tenha cuidado para transferir sem bolhas e fechar o frasco com a tampa de rosca.
- As amostras estão agora prontas para a análise por RP-HPLC.
8. HPLC measuexigên- de purinas
- Selecione o botão "amostras Executar"; escolha "novo método conjunto de amostras" do menu "Arquivo".
- Seleccionar a opção de "vazio" e indicar: o número do frasco (no amostrador automático), o nome da amostra, o volume de injecção (50 pi).
- Seleccionar o método da coluna de equilíbrio e o método de execução de exemplo descrita na Tabela 1 e Tabela 2, respectivamente, para todas as execuções branco e da amostra que se seguem.
Nota: Defina o método de coluna de equilíbrio (Tabela 1) antes de cada amostra de execução. - Injecte 50 ul de branco (meio isento de soro) e de cada amostra.
- Determinar a concentração de purinas em cada amostra, quantificar a AMP, INO ADO e obtendo as áreas dos picos para os tempos de retenção descritas na Tabela 3.
- Selecione o botão "processo" e em seguida a opção "integrar". Alternativamente escolher manualmente a iniciar umOs pontos finais de cada ND único pico para obter a medição da área. Isso é feito traçando uma linha entre os pontos de início e fim do pico.
- Determinar a concentração uM aplicação da equação obtida para a curva padrão: y = mx + b, onde x representa a concentração de jiM e y é a área do pico medido a partir da amostra desconhecida.
Nota: Um exemplo do padrão de calibração curva ADO é apresentado na Figura 2, onde: x = (y área - 981,02) / 40026
- Considerando-se que 2 x 10 6 culas foram novamente suspensas em 0.500 ml de meio, calcular os umoles de AMP, ADO e Ino consumidos e / ou produzidos por 10 6 células CLL aplicando a seguinte proporção:
umoles: 1.000 ml = x umoles: 0,250 ml
Nota: Os umoles em 1.000 ml (número umoles em 1 L) são equivalentes à concentração uM e X são os umoles de Nucleotide nucleósido ou produzido por 10 6 células.- Por último, converter os umoles em nmoles consumidos e / ou produzidos por 10 6 células CLL:
nmoles = ^ moles x 1.000
- Por último, converter os umoles em nmoles consumidos e / ou produzidos por 10 6 células CLL:
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Representative Results
Para avaliar a percentagem (%) de células leucémicas em PBMC recentemente purificado a partir de um doente CLL representativa, as células são marcadas com anticorpos anti-CD5 e anti-CD19. O painel esquerdo da Figura 3 representa um gráfico de pontos de citometria de fluxo com um portão selectiva em células vivas. A Figura 3 mostra um exemplo de PBMC de um paciente CLL antes (painel do meio) e depois a purificação de células B (para a direita do painel).
Um exemplo de quantificação por HPLC dos compostos de purina em células CD73 + CLL é representado na Figura 4A. Os tempos de retenção diferentes de AMP, INO ADO e a 260 nm permitem a quantificação simultânea dos compostos. Quando o ensaio é executado corretamente, todos os nucleotídeos e nucleosídeos tem uma separação pico adequado. A partir de uma concentração de 200 ^ M de AMP como substrato, os picos obtidos por ADO e Ino são claramentevisível e as concentrações estão na gama da curva de calibração padrão. No entanto, também usando concentrações inferiores do substrato (por exemplo, 100 um) vão dar bons resultados. Após integração do pico, as áreas de cada pico são convertidos em concentração pM e, finalmente, em nmoles de composto produzido por 10 6 linfócitos LLC através da utilização de curvas padrão.
O cromatograma de HPLC de ADO produzido por células CD73 + após 60 min de pré-tratamento com 10 uM APCP indica um bloqueio completo da síntese de ADO extracelular (Figura 4A). Por causa da conversão enzimática rápida do ADO em INO operado pelo complexo ADA / CD26, o pré-tratamento de células CLL com 10? M de cloridrato de EHNA ou 10 uM DCF é necessária para inibir a degradação da ADA. Sob estas condições, as concentrações extracelulares de ADO são significativamente aumentadas. Cromatogramas representativos de FiGure 4 destaca como pré-tratamento com cloridrato de EHNA e / ou DCF (Figura 4B - C) inibe completamente a conversão ADO em INO.
Figura 3. Análise de citometria de fluxo da% de CD19 + / CD5 + células leucémicas em PBMC purificadas de fresco de um paciente CLL representativa. Após gating em células vivas (painel da esquerda), é avaliada a% de células CD19 + / CD5 + CLL. Antes do isolamento negativo de células B (painel do meio), a% de células leucémicas corresponde a 75%. Após purificação (painel da direita) a% dos linfócitos B CLL atinge 95%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Quantificação de nucleótidos de purina e nucleósidos extracelulares consumidos e produzidos por células leucémicas após a exposição ao AMP e diferentes inibidores. (A) cromatogramas representativos de ADO e Ino gerados por CD73 + linfócitos leucémicos, com ou sem pré-tratamento com α, β-metileno- ADP (APCP, 10 uM, 60 min), um inibidor específico da actividade enzimica de CD73. (B) cromatograma de HPLC representativos obtidos a partir de sobrenadantes de células CD73 + CLL pré-tratados ou não com a adenosina-desaminase (ADA), inibidor de adenina (EHNA) cloridrato de (2-hidroxi-3-nonil) 9- eritro-(10 uM, 30 min) antes da incubação com a AMP como substrato (200 uM, 30 min). (C) cromatograma representativos obtidos a partir de sobrenadantes de CD73
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Discussion
O protocolo aqui descrito permite avaliar a actividade do CD39 / CD73 máquinas adenosinérgico em meios de cultura de células a partir de células leucémicas humanas purificadas. Através deste método HPLC podemos seguir e medir quantitativamente a geração enzimática de ADO (dependente de CD73-) e sua posterior degradação INO (CD26 / ADA dependente). O uso de inibidores da enzima permite controlar o protocolo e ter controles internos. As vantagens e novidades deste protocolo são de que i) pode ser aplicada a células que estão a crescer em cultura, que ii) necessita uma pequena quantidade de meio de cultura e que iii) a preparação da amostra é extremamente fácil.
O nosso sistema é composto por um módulo de separação equipado com uma bomba de mistura em linha e de baixa pressão de desgaseificação a vácuo quaternário, juntamente com um amostrador automático. A separação cromatográfica de AMP, ADO e Ino é conseguida através de uma coluna à base de sílica, de fase inversa que é usada para a retenção de composto polar. ºsistema de fase móvel binária e consiste de um tampão A (acetato de amio 7 mM em água desionizada dupla, pH 3,0 ajustado com ácido clorídrico) e Tampão B (acetonitrilo).
Este método de HPLC é sensível, fiável e reprodutível e pode ser aplicado a diferentes modelos de cultura de células, tanto as células aderentes e em suspensão. Pode ser também aplicado para comparar diferentes condições de cultura, tais como a normoxia (21% de O2) e hipóxia (1-3% de O2) ou para comparar diferentes estados de activação das células. Aqui nós realizar o tratamento das células com compostos de purina em placas de cultura celular, mas pode ser também utilizados tubos de microcentrífuga para tratamentos de tempo curtos.
O método aqui descrito permite a quantificação de nucleótidos de purina e nucleósidos extracelulares consumidos e produzidos na reacção de evitar a utilização de compostos marcados radioactivamente, tais como aqueles empregues na cromatografia em camada fina (TLC) ensaios 10. Por outro lado, o HPLC sistema é também mais sensível e selectivo em comparação com o método de TLC. No entanto, um sistema de RP-HPLC com detecção por espectrometria de massa em tandem (MS / MS) é agora considerado a melhor escolha para medições quantitativas de nucleotídeos e nucleosídeos. Uma limitação deste método de HPLC é a exigência de uma coluna de equilíbrio executado antes de cada única corrida de exemplo, fazendo com que o tempo total de execução do experimento mais tempo e limitando significativamente as possibilidades de rastreios de elevada capacidade. Métodos mais rápidos alternativos são representados pelo ensaio de fosfato de verde de malaquite, um método colorimétrico que permite a medição indirecta de conversão de AMP em ADO e bythe método à base de luciferase de 20. No entanto, ambos estes métodos não oferecem uma medição directa da adenosina.
O processamento da amostra para este ensaio é mínima e precipitação de proteína com acetonitrilo não é necessário, porque o protocolo baseia-se na utilização de um meio isento de soro. Uma alternativapara o meio isento de soro poderia ser para ressuspender as células em PBS 5 mM de glucose antes da incubação com o substrato.
O principal passo crítico no âmbito do protocolo é a obtenção de uma população pura de células B. De facto, as medições de AMP, ADO e Ino pode ser falsa devido à presença de outras populações de células que expressam os ectoenzimas envolvidos nesta cascata (por exemplo, linfócitos T). Um segundo ponto crítico é para injectar o meio de cultura filtrado para dentro do sistema de HPLC, sem qualquer contaminação de células que podem afectar a integridade e a vida útil da coluna.
Em conclusão, este ensaio é relativamente rápido e altamente fiável, permitindo o acompanhamento em tempo real do consumo de nucleótido e nucleósido de geração em diferentes populações de células.
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Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 mm x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 mm x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
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