Abstract
Denne fremgangsmåten beskriver en følsom, spesifikk og pålitelig og reproduserbar revers fase høy-ytelse væskekromatografi (RP-HPLC) analyse utviklet og validert for kvantifisering av ekstracellulære purinnukleotider og nukleosider produsert av renset kronisk lymfatisk leukemi (CLL) celler under forskjellige dyrkningsbetingelser . Kromatografisk separasjon av adenosin 5'-monofosfat (AMP), adenosin (ADO) og inosin (INO) utføres ved romtemperatur på en silika-basert reversert-fase-kolonne som brukes for polare forbindelse oppbevaring. Fremgangsmåten inkluderer en binær mobil fase, som består av 7 mM ammoniumacetat og acetonitril med en strømningshastighet på 1,00 ml / min. Eluatene blir overvåket ved bruk av en fotodiode-array UV-detektor innstilt på 260 nm. En standard kalibreringskurve generert for å beregne ligningen for den analytiske kvantifisering av hver purinforbindelse. Systemet kontroll, datainnsamling og analyse blir så utført. Bruk av denne protokollen, AMP, INO og ADO eluere på 7, 11 og 11,9 min, henholdsvis, og den samlede gangtid for hver prøve er 20 min. Denne protokollen kan påføres på forskjellige celletyper og cellelinjer (både fjæring og adherente), ved bruk av dyrkningsmedier som matrise. Fordelene er enkle og raske prøvepreparering og kravet om en liten mengde av supernatant for analyse. Videre er bruken av et serumfritt medium gjør det mulig å hoppe over proteinet utfellingstrinnet med acetonitril som påvirker den endelige konsentrasjonen av purin-forbindelser. En av begrensningene ved fremgangsmåten er kravet til likevektskolonnen kjøres før hver enkelt prøve løp, noe som gjør den totale driftstid på eksperimentet lengre og forhindrer høy gjennomstrømning screeningsprogrammer.
Introduction
Adenosin (ADO) er en purinnukleosidanalog med en adenin molekyl festet til et ribose sukkermolekyl gruppen via en glykosidbinding. Når den er tilstede i det ekstracellulære miljøet, beskytter cellene mot overdreven skade ved virkningen av immunsystemet. Denne rollen har blitt fremhevet ved hjelp av ulike sykdomsmodeller, for eksempel kolitt 1, diabetes 2, astma 3, sepsis 4, og iskemisk skade fem. En av hovedfunksjonene ADO er inhibering av immunresponsen hos svulsten mikromiljøet, noe som bidrar til reduksjon av tumorImmunflukt 6. Av denne grunn er de mekanismene som er involvert i dannelse og ADO signalering er av betydelig terapeutisk interesse 7.
ADO nivåer i vev mikro er forholdsvis lav under normale fysiologiske betingelser og i hvert fall under sensitivitetsgrensen på immunceller. Men under hypoksi, ischemi, inflammasjon, infeksjon, metabolskstress og svulst forvandling de raskt øke åtte. De forhøyede ekstracellulære ADO nivåer i respons til vev-perturbing signaler har en dobbel funksjon: å rapportere vev skade i en autokrint og parakrint måte og å generere vev responser som kan generelt sett på som cytoprotective.
Ekstracellulær ADO kan dannes gjennom en rekke mekanismer, som inkluderer frigivelse av intracellulære kamre mediert av nukleosid-transportører 9 eller akkumulering på grunn av nedsatt nedbrytning drives av adenosindeaminase. Den viktigste vei som fører til økte ekstracellulære nivåer ADO omfatter virkningen av en kaskade av ectonucleotidases, som er membran-assosiert ectoenzymes genererer ADO ved phosphohydrolysis av nukleotider som frigjøres fra døde eller døende celler. Denne veien går gjennom den sekvensielle handling av CD39 (ectonucleoside trifosfat diphosphohydrolase-1) som konverterer ekstracellulære adenosin 5'-trifosfat (ATP) eller adenosin-5'-difosfat (ADP) til adenosin-5'-monofosfat (AMP) og CD73 (5'-nukleotidase), som konverterer AMP til ADO 10.
Ekstracellulær ADO utløser sine fysiologiske responser ved å binde seg til fire transmembrane ADO-reseptorer, nemlig A1, A2A, A2B og A3. Hver reseptor har forskjellige affinitet for ADO og spesifikk fordeling vev. Alle reseptorene har syv transmembrandomener og er i G-proteinkoblet til intracellulære GTP-bindende proteiner (G-proteiner), som kan indusere (Gs-proteinet) eller inhiberer (Gi protein) adenylatsyklase-aktivitet og, senere, produksjonen av intracellulær cAMP. Derfor endringer i cytoplasma cAMP-nivåer innvirkning på intracellulært protein-kinase-aktivitet under fysiologiske responser 11. Under fysiologiske betingelser ekstracellulære ADO er under 1 pm, som kan aktivere ukritisk A1, A2A og A3-reseptorer. Imidlertid aktivering av A2B subtype krever betydelig høyerekonsentrasjoner av nukleosidet, for eksempel de som er oppnådd under patofysiologiske betingelser. Alternativt kan ekstracellulære ADO bli degradert til inosin (INO) av adenosindeaminase (ADA) og CD26, en ADA kompleksprotein lokalisere ADA på celleoverflaten. En annen mulighet er at ADO er internalisert av cellen gjennom nukleosidlikevektstransportør transportører (ØNH) og fosforylert til AMP av ADO kinase protein 12,13.
Formålet med denne protokollen er å beskrive en analytisk metode for revers fase høy-ytelse væskekromatografi (RP-HPLC) for å kvantifisere i en enkelt kjøring substratet AMP og produktene ADO og INO, som genereres av humane lymfocytter. Vår erfaring var i utgangspunktet oppnådd ved bruk av celler fra kronisk lymfatisk leukemi (KLL) pasienter, som er preget av utvidelsen av en moden befolkning på CD19 + / CD5 + B-lymfocytter konstitutivt uttrykker CD39 14,15. Vi viste ca 30%av KLL pasienter uttrykker CD73 ectoenzyme og at dette fenotype korrelerer med dårlig prognose 16. Denne undergruppe av leukemiceller co-uttrykker CD39 og CD73 kan aktivt produsere ekstracellulære ADO fra ADP og / eller AMP. Preinkubasjon av CD73 + CLL celler med α, β-metylen-ADP (APCP), en kjent inhibitor av CD73 enzymatisk aktivitet, fullstendig blokkerer ekstracellulære ADO syntese bekreftet at CD73 representerer en flaskehals og enzym fra det kaskade 16.
KLL celler også uttrykker ADA og ADA komplekse protein CD26, som er ansvarlig for konvertering av ADO i INO. Ved å bruke spesifikke ADA-inhibitorer, slik som erytro-9- (2-hydroksy-3-nonyl) I wiadenine (EHNA) -hydroklorid og deoksykoformycin (DCF), er det mulig å blokkere ekstracellulære ADO degraderingen INO. Videre forbehandling med en ADA-inhibitor i kombinasjon med dipyridamol, som blokkerer nukleosid transportører, forbedrer ADO akkumulering i cellensupernatanter.
Vi har deretter utvidet denne protokollen til celler som stammer fra andre linjer, inkludert T-lymfocytter og myeloide celler, bekrefter CD73-avhengig ADO produksjon. Disse funnene tyder på at denne HPLC-protokollen er meget allsidig, og at den kan brukes til forskjellige celle linjer og til forskjellige dyrkningsbetingelser (figur 1).
Figur 1. Skjematisk fremstilling av den enzymatiske maskineri ansvarlig for ekstracellulær ADO produksjon. Adenosin-5'-trifosfat (ATP) og / eller adenosin-5'-difosfat (ADP) kan brytes ned av CD39 til adenosin 5'-monofosfat (AMP), hvilken i sin tur omdannes av CD73 til nukleosidet adenosin (ADO). Når ADO er produsert i det ekstracellulære rom, kan det inn igjen i cellen gjennom nukleosid transportører (ENT), omdannes til inosin (INO) ellerbinde seg til forskjellige typer P1 ADO reseptorer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
KLL blodprøver er innhentet i henhold til institusjonelle retningslinjer og Helsinkideklarasjonen.
1. Isolering av leukemisk lymfocytter fra blodprøver av KLL
- Samle blodprøve i natrium heparin (grønn-top) tube 17.
- Lag 1: 3 fortynning av helt blod med RT 1 x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Rens perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra blodprøver ved tetthetsgradient sentrifugering.
- Underlag 5 ml av densitetssentrifugering media (for eksempel Ficoll) i et 15 ml sentrifugerør og omhyggelig overføre 10 ml fortynnet blod. Umiddelbart sentrifuger ved 1500 xg i 20 min ved RT.
- Aspirer del av supernatanten med en glass Pasteur pipette er koblet til en vakuumpumpe og samle PBMC ring ved grenseflaten mellom tetthetssentrifugeringsmedier og fortynnet plasma med en 5 ml pipette. Overfør til et 50 ml sentrifugerør og vask med PBS (50 ml sluttvolum). Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten med et glass Pasteur pipette, resuspender pelleten i 50 ml PBS og tell cellene ved bruk av et hemocytometer.
- Flekke PBMC med anti-CD19 og -CD5 antistoffer for flowcytometri etter en standard protokoll for farging og se etter PBMC undergruppe sammensetning 18.
Merk: KLL lymfocytter er CD19 + / CD5 +. - Sjekk% av CD19 + / CD5 + celler ved hjelp av en strømningscytometer 18. Rens B-lymfocytter fra pasienter med ≥95% av CD19 + / CD5 + leukemiceller ved å følge instruksjonene beskrevet i trinn 2 for den negative isolering av B-celler 19.
2. Rensing av leukemisk B-celler ved negativ Isolation
- Resuspender 10 7 PBMC / ml i PBS 0,1% bovint serumalbumin (BSA), 2 mM EDTA, pH 7,4 (buffer isolasjon).
- Legg 101; g monoklonalt anti-CD3, -CD14 og -CD16 primære antistoffer i 10 7-celler og inkuber i 30 min ved 4 ° C.
- Vask cellene med isolasjonsbuffer og sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender cellene i isolasjon buffer ved 10 7 PBMC / ml.
- Før inkubasjon med cellene, resuspender sau anti-mus IgG magnetiske perler i glasset. Overfør 100 ul av perler per 10 7 celler til et rør.
- Tilsett 1 ml isolasjonsbuffer og plassere røret i en magnet holder i 1 min. Kast supernatanten med en 5 ml pipette.
- Fjerne røret fra magneten og resuspender vaskede perlene i 100 pl buffer isolasjon.
- Inkuber 10 7 celler med 100 ul av magnetiske kuler i 30 minutter ved 4 ° C med forsiktig vipping og dreining.
- Plasser røret på magneten holder i 2 min og overfør supernatanten med CD19 + / CD5 + bundne cellenetil et friskt rør med en 5 ml pipette.
- Ved slutten av isoleringen protokollen, beis 100 ul celler med anti-CD19 og -CD5 antistoffer for strømningscytometri og inkuber i 30 min ved 4 ° C. Vask cellene med 3 ml PBS 1% BSA, kast overskudd av supernatanten og kontrollere B-celle renhet på nytt ved strømningscytometri 19.
Merk: Utfør en ytterligere negativ isolasjonstrinnet hvis B-celle renhet er lavere enn 95%.
3. Utarbeidelse av standard og hemmere Stock Solutions
- For å fremstille AMP, veie ut 0,00345 g av AMP og oppløse den i 5 ml serumfritt medium for å få en 2 mM standardløsning av AMP.
- For å forberede ADO, veie ut 0,00265 g ADO og oppløse den i 5 ml serumfritt medium til å ha en 2 mm standardløsning av ADO.
- For å fremstille INO, veie ut 0,00268 g INO og oppløse den i 5 ml serumfritt medium for å få en 2 mM standardløsning av INO.
- Forbered en 400 mM løsning av AMP, ADO ogINO ved å blande 1 ml av en 2 mM forrådsoppløsning i 4 ml serumfritt medium (5 ml sluttvolum).
- Lag 1: 4 fortynning av hver 400 uM standard oppløsning for å oppnå en 100 uM konsentrasjon ved pipettering av 500 ul av 400 uM oppløsning i 1500 ul serumfritt medium (2 ml endelig volum).
- Fremstille serielle fortynninger av hver forbindelse i serumfritt medium for å oppnå de følgende konsentrasjoner: 100 pM - 50 pM - 25 pM - 10 pM - 5 um - 2,5 pM - 1 pM - 0,5 pM - 0,25 uM.
Merk: For eksempel, pipette 1 ml av 100 mM løsning i 1 ml serumfritt medium: å (1 2 fortynning) får 50 mikrometer konsentrasjon og fortsette med de resterende fortynninger.
- Forbered en 10 mM stamløsning av APCP oppløst i PBS; delmengde og lager på - 30 ° C.
- Fremstille 10 mM stamløsninger av EHNA hydroklorid, dCF og dipyridamol ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO); delmengde og lager ved -30° C.
4. Programmer HPLC-metode
- Fremstille en 7 mM ammoniumacetatbuffer ved å oppløse 0,770 g ammonium-acetat i 2 liter dobbelt deionisert vann (buffer A). Juster til pH 3,0 med saltsyre.
- Fremstille en glassflaske inneholdende minst 2 liter ultra acetonitril for HPLC (buffer B) og koble beskyttelseskolonne og kolonnen til HPLC.
Merk: Kolonnene og buffere er ved RT under bruk. - Logg inn i HPLC-programvaren og velg "Bla gjennom prosjektet" -knappen. Gå til "Fil" -menyen og velg "ny metode" og deretter "instrument metoden".
- Programmet den likevektskolonnen Fremgangsmåte som angitt i Tabell 1. Sett en strømningshastighet på 1,00 ml / min og programmere UV-detektor for å avlest ved 260 nm. Lagre instrumentet metode og velg igjen "ny metode" fra "Fil" -menyen og deretter "metoden set". Velg instrument metoden tidligere lagredeog lagre den gjeldende metoden satt med samme navn.
| Tid | Strømningshastighet (ml / min) | %EN | % B |
| 1.00 | 100 | 0 | |
| 1,24 | 1.00 | 100 | 0 |
| 6,22 | 1.00 | 2 | 98 |
| 18.65 | 1.00 | 2 | 98 |
Tabell 1: Ekvilibrering kolonne metode Skjematisk fremstilling av løsemiddel endringer for ekvilibrering av kolonnen.. Buffer A: 7 mM ammoniumacetat, pH 3,0. Buffer B: acetonitril.
- Gjenta trinn 4.3 til å programmere løp prøvemetoden er angitt i tabell 2. Sett en strømningshastighet på 1,00 mL / min og program UV-detektoren for å avlest ved 260 nm. Lagre instrumentet fremgangsmåte og gjenta den samme prosedyre som beskrevet i trinn 4.4 til å lagre den fremgangsmåte som er ..
| Tid | Strømningshastighet (ml / min) | %EN | % B |
| 1.00 | 0 | 100 | |
| 3,74 | 1.00 | 0 | 100 |
| 13.71 | 1.00 | 15 | 85 |
| 17.00 | 1.00 | 100 | 0 |
| 20.00 | 1.00 | 100 | 0 |
Tabell 2: Kjør prøve metoden. Skjematisk fremstilling av løsemiddel endringer for HPLC-måling av purin-forbindelser. buffer A: 7 mM ammoniumacetat, pH 3,0. Buffer B: acetonitril.
- Velg "kjøre prøvene" -knappen, velg "ny prøvesett metoden" fra "Fil" -menyen.
- Velg "tom" og angi antall hetteglasset (i autosampler), prøvenavnet, injeksjonsvolumet (50 ul). Velg metoden sett lagret før for "metoden set" -kolonnen og angi total kjøretid (min).
Merk: Skriv inn likevekt kolonne metode (tabell 1) i "metoden set" -kolonnen før hver prøve kjøre og gå inn i total kjøretid (min).
5. generasjon av en standard kalibreringskurve for hver forbindelse
- Injiser 50 ul emnet (spesifikt serum-fritt medium, som ikke inneholder adenosindeaminase), og for hver standardprøve å følge fremgangsmåtene beskrevet i tabell 1 og tabell 2.
- Bruk likevekt kolonneFremgangsmåte (tabell 1) før hver prøve kjøring og sett gradient betingelser som er beskrevet i tabell 2 for å oppnå tilfredsstillende topp separasjon. Se Tabell 3 for rapportert retensjonstider på AMP, ADO og INO under disse HPLC-betingelser.
| oppholdstid | λ max | |
| AMP | 8,00 min | 260 |
| INO | 11.00 min | 260 |
| ADO | 11.90 min | 260 |
Tabell 3: Oppholdstider av purine forbindelser Typiske tilbakeholdelsestider observert for AMP, ADO og INO.. UV-detektoren er programmert til å lese ved 260 nm.
- Plotte topparealer mot den nominelle konsentrasjonen av hver standard for å oppnå den ni-punkts kalibreringskurve (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 uM).
- Beregn ligningen for en rett linje for AMP, ADO og INO: y = mx + b,
hvor x er uM konsentrasjon og y svarer til toppområdet.
Figur 2. Dannelse av en intern standardkurve. Representative kalibreringsstandardkurve for ADO og den relative ligningen erholdt. Klikk hennese for å se en større versjon av dette tallet.
6. Forbehandling med hemmere og Inkubasjon med substratet (AMP)
- For å teste AMP forbruk, ADO og INO generasjon uten hemming av CD73, ADA og nukleosid transportører, resuspender 2 x 10 6 CD19 + / CD5 + KLL celler (isolert og renset i trinn 1 og 2) i 250 mL serumfritt medium og plate celler i en 48-brønners plate (eller i et 1,5 ml mikrosentrifugerør).
- For å blokkere CD73 enzymatisk aktivitet, fortynnet 1: 1000 i stamløsning av APCP (10 mM) i kulturmediet for å oppnå en 10 uM endelig konsentrasjon. Resuspender 2 x 10 6 CLL celler i 250 ul kulturmedium innehold APCP og forbehandle 60 minutter ved 37 ° C i en cellekulturinkubator.
- Til å blokkere omdannelsen av ADO inn i INO, fortynnet 1: 1000 i stamløsning av EHNA-hydroklorid og / eller dCF (begge 10 mM) i serumfritt medium for å ha en 10 uM endelig konsentrasjon.Suspender 2 x 10 6 KLL celler i 250 mL av kultur medium som inneholder EHNA og / eller dCF. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C i cellekulturinkubator.
- Å blokkere opptak av ADO gjennom nukleosid transportører, fortynnet 1: 1000 i stamløsning av dipyridamol (10 mM) i serumfritt medium for å ha en 10 uM endelig konsentrasjon. Resuspender 2 x 10 6 CLL celler i 250 ul kulturmedium inneholdende dipyridamol og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C i cellekulturinkubator.
- Forbered enkle løsninger av APCP, EHNA, dCF og dipyridamol fortynnet 1: 1000 i 400 mikrometer AMP.
- Tilsett 250 ul av 400 uM AMP AMP eller i tillegg inhibitorer for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 200 uM AMP. Inkludere en tilstand i fravær av substratet til å bli brukt som blindprøve.
- Inkuber 30-60 min ved 37 ° C.
Merk: Den optimale konsentrasjonen av AMP og inkubasjonstiden ble bestemt eksperimentelt. - ved than ende av inkubasjonstiden, samler 500 ul av supernatantene i kalde mikrosentrifugerør (på is), og umiddelbart sentrifuger ved 17.000 xg ved 4 ° C i 5 minutter.
- Overfør supernatants i nye 1,5 ml mikrosentrifugerør og umiddelbart lagre ved -80 ° C eller fortsette å prøve forberedelse til HPLC går.
7. Prøver Forberedelse for HPLC
- Filter supernatantene i nye 1,5 ml mikrosentrifugerør med 0,2 mikrometer sprøytefilter. Bruk 1 ml sprøyter for filtrering.
- Ved HPLC-systemet er forsynt med en autosampler, fremstille glassampuller for HPLC og bruke 0,1 ml mikroinnsatser for små volumer av prøven.
- Overføre minst 100 ul prøve i hetteglass med en mikropipette eller et glass Pasteur pipette. Vær forsiktig med å overføre uten bobler og lukk flasken med skrukork.
- Prøvene er nå klare for analyse ved RP-HPLC.
8. HPLC målerements av puriner
- Velg "run prøver" -knappen; velg "ny prøvesett metoden" fra "Fil" -menyen.
- Velg "tom" og viser: antall hetteglasset (i autosampler), prøvenavnet, injeksjonsvolumet (50 ul).
- Velg ekvilibrering kolonnen metoden og løpe prøvemetode som er beskrevet i tabell 1 og tabell 2, respektivt, for alle blindprøven og løper som følger.
Merk: Sett likevekt kolonne metode (tabell 1) før hver prøve løp. - Injiser 50 ul emnet (serumfritt medium), og for hver prøve.
- Bestem konsentrasjonen av puriner i hver prøve, kvantifisere AMP, ADO og INO ved å skaffe topparealene ved retensjonstider som er beskrevet i tabell 3.
- Velg "prosess" -knappen, og neste på "integrere" alternativet. Alternativt velger manuelt starte ennd endepunktene av hver enkel topp å få området måling. Dette gjøres ved å trekke en linje mellom start- og sluttpunktene til topp.
- Bestem uM konsentrasjon anvende ligningen oppnådd for standardkurven: y = mx + b, hvor x representerer uM konsentrasjon og y er i området av toppen målt fra den ukjente prøve.
Merk: Et eksempel på ADO kalibreringsstandardkurven er rapportert i figur 2, hvor x = (y område - 981,02) / 40 026
- Tatt i betraktning at 2 x 10 6 celler ble resuspendert i 0,500 ml medium, beregne umol AMP, ADO og INO konsumert og / eller produsert av 10 6 KLL celler som gjelder følgende forhold:
umol: 1000 ml = x umol: 0,250 ml
Merk: pmol av 1000 ml (nummer umol i 1 L) av er ekvivalent med uM konsentrasjon og x er de umol nucleotide eller nukleosid produsert av 10 6 celler.- Til slutt, konvertere umol inn nmol forbrukes og / eller produsert av 10 6 KLL celler:
nmol = umol x 1000
- Til slutt, konvertere umol inn nmol forbrukes og / eller produsert av 10 6 KLL celler:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å vurdere den prosentvise (%) av leukemiske celler i ferskt renset PBMC fra et representativt CLL pasient, blir cellene merket med anti-CD19 og anti-CD5-antistoffer. Det venstre panel i figur 3 representerer et cytofluorimetric dot tomt med en selektiv port på levende celler. Figur 3 viser et eksempel på PBMC fra en pasient før CLL (midtre panel) og etter (høyre panel) B-celle rensing.
Et eksempel på en HPLC-kvantifisering av purin forbindelser i CD73 + CLL cellene er vist i figur 4A. De forskjellige Retensjonstidene til AMP, INO og ADO ved 260 nm tillate den samtidige kvantifisering av forbindelsene. Når analysen kjøres på riktig måte, er alle nukleotidene og nukleosider har en tilstrekkelig topp separasjon. Fra en konsentrasjon på 200 uM AMP som substrat, toppene som oppnås for ADO og INO er klartsynlige og de konsentrasjoner som er i området av standardkalibreringskurven. Men ved å bruke også lavere konsentrasjoner av substratet (f.eks, 100 pm) vil gi gode resultater. Etter at toppintegrering er de områder av hver topp omdannes til uM konsentrasjon og til slutt i nmol av forbindelsen produsert av 10 6 CLL lymfocytter ved bruk av standardkurver.
HPLC-kromatogram av ADO produsert av CD73 + celler etter 60 minutters forbehandling med 10 pM APCP indikerer en fullstendig blokkering av ekstracellulær ADO syntese (figur 4A). På grunn av den raske enzymatisk omdannelse av ADO inn i INO drives av ADA / CD26 komplekset er forbehandling av CLL celler med 10 uM EHNA hydroklorid eller 10 uM dCF nødvendig for å inhibere degradering ADA. Under disse betingelser ekstracellulære ADO konsentrasjonene er betydelig økt. Representative kromatogrammene av FiGure 4 høydepunkter hvordan forbehandling med EHNA hydroklorid og / eller dCF (figur 4B - C) helt hemmer ADO konvertering til INO.
Figur 3. Cytofluorimetric analyse av% av CD19 + / CD5 + leukemiceller i ferske renset PBMC av en representant KLL pasient. Etter gating på levende celler (venstre panel), er det% av CD19 + / CD5 + KLL celler evaluert. Før den negative isolering av B-celler (midtre panel), den% av leukemiske celler som tilsvarer 75%. Etter rensing (høyre panel) i% av KLL B-lymfocytter når 95%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kvantifisering av ekstracellulære purinnukleotider og nukleosider forbrukes og som er produsert av leukemiske celler etter eksponering til AMP og forskjellige inhibitorer. (A) Representative kromatogrammer av ADO og INO generert av CD73 + leukemiske lymfocytter med eller uten forbehandling med α, β-metylen ADP (APCP, 10 uM, 60 min), en spesifikk inhibitor av CD73 enzymatisk aktivitet. (B) Representative HPLC-kromatogram oppnådd fra supernatanter av CD73 + CLL celler forbehandlet eller ikke med adenosin deaminase (ADA) inhibitor erytro-9- (2-hydroksy-3-nonyl) adenin (EHNA) hydroklorid (10 uM, 30 min) før inkubering med AMP som substrat (200 uM, 30 min). (C) Representative kromatogram oppnådd fra supernatanter av CD73
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her gjør det mulig å evaluere aktiviteten av CD39 / CD73 adenosinergic maskineri i cellekulturmedier fra rensede humane leukemiceller. Gjennom denne HPLC metoden kan vi følge og kvantitativt måle enzymatisk generasjon av ADO (CD73-avhengig) og påfølgende degradering til INO (CD26 / ADA avhengig). Bruken av enzyminhibitorer gjør det mulig å kontrollere protokoll og for å ha intern kontroll. Fordelene og nyheter i denne protokollen er at i) den kan anvendes på celler som vokser i kultur, at ii) det kreves en liten mengde av kulturmedier, og at iii) den prøvepreparering er ekstremt lett.
Systemet består av en separasjonsmodul utstyrt med en kvaternær lavtrykksblandepumpe og inline vakuum avgassing sammen med en automatisk prøvetaker. Den kromatografiske separasjon av AMP, ADO og INO oppnås på en silika-basert reversert-fase-kolonne som brukes for polare forbindelse oppbevaring. the binært mobil fase system består av en buffer A (7 mM ammoniumacetat i dobbelt avionisert vann, pH 3,0 justert med saltsyre) og buffer B (acetonitril).
Denne HPLC-metode er følsom, pålitelig og reproduserbar og kan brukes på forskjellige cellekulturmodeller, både adherente og suspensjonsceller. Det kan også brukes til å sammenligne ulike dyrkningsforhold, for eksempel normoxia (21% av O 2) og hypoksi (1-3% O 2), eller for å sammenligne ulike aktiverings tilstander av celler. Her utfører vi behandling av celler med purin- forbindelser i cellekulturplater, men kan også brukes mikrosentrifugerør for kortere tids behandlinger.
Fremgangsmåten som her er beskrevet tillater kvantifisering av ekstracellulære purinnukleotider og nukleosider forbrukes og som er produsert i reaksjons unngå bruk av radioaktivt merkede forbindelser, slik som de som anvendes i tynnsjiktskromatografi (TLC)-analysene 10. Videre er HPLC-systemet er også mer følsom og selektiv i forhold til TLC-metoden. Imidlertid er en RP-HPLC system med tandem massespektrometrisk (MS / MS) deteksjon nå regnet som det beste valget for kvantitative målinger av nukleotider og nukleosider. En begrensning av denne HPLC-metode er behovet for en likevektskolonnen kjøres før hver enkelt prøve løp, noe som gjør den totale driftstid på eksperimentet lenger og i betydelig grad begrenser mulighetene for høy gjennomstrømning screeninger. Raskere alternative metoder er representert ved malakittgrønt Fosfat assay, en kolorimetrisk metode som gjør det mulig for indirekte måling av AMP konvertering til ADO, og stipulert luciferase-baserte metode 20. Imidlertid ikke begge disse metodene ikke gir en direkte måling av adenosin.
Den type behandling for denne analysen er minimal og proteinutfelling med acetonitril er ikke nødvendig, fordi protokollen er basert på anvendelse av et serumfritt medium. Et alternativtil det serumfrie medium kan være å resuspendere cellene i PBS 5 mM glukose før inkubasjonen med substratet.
Den viktigste kritiske trinn i protokollen, er å oppnå en ren populasjon av B-celler. Faktisk kan målingene av AMP, ADO og INO være falsk på grunn av tilstedeværelsen av andre cellepopulasjon som uttrykker de ectoenzymes som er involvert i denne kaskade (for eksempel T-lymfocytter). Et annet viktig punkt er å injisere filtrerte kulturmedium inn i HPLC-systemet uten noen celle forurensning som kan påvirke integriteten og levetiden av kolonnen.
I konklusjonen, er denne analysen relativt rask og svært pålitelig, noe som åpner for sanntids overvåking av nucleotide forbruk og nukleosid generasjon i forskjellige cellepopulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 mm x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 mm x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
- Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
- Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
- Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
- Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
- Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
- Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
- Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M. Nucleoside transporter proteins. Curr Vasc Pharmacol. 7 (4), 426-434 (2009).
- Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
- Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
- Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
- Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what's new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
- Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 352 (8), 804-815 (2005).
- Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
- Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
- Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
- Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).
