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Chemistry

定点自旋标记和五聚体配体门控离子通道的EPR光谱研究

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127

Introduction

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在过去的十年,五聚配体门控离子通道的结构理解(pLGIC)增长的跨越式发展,由于家庭的几名成员的高分辨率结构的众人。导致在该领域的当前进展的关键因素包括,原核pLGIC渠道发现,真核生物膜蛋白表达1-3主要进展,4-6和巨大的突破,结构的测定方法。7这些结构上提供了一个明确的共识pLGIC的三维结构的整体保护。然而,这似乎落后背后两大领域是这些渠道制剂的功能特性和通道功能的机械描述。

选通的构象变化是复杂的,发生在沿着通道的长度的60埃的距离和这些转换由广泛调制膜脂。特别是,负脂质,胆固醇和磷脂已经显示调节pLGIC 8-11的功能。尽管通道功能,这些脂质成分的确切作用尚不清楚,门完整的分子机制,需要在他们自然环境研究这些通道。定点自旋标记(SDSL)和电子顺磁共振(EPR)谱是首选在复原系统研究蛋白质动力学的技术。 EPR谱不被分子大小的限制(这是NMR)或样品的光学特性(如为荧光光谱法),由此允许在天然脂质条件重构全长构建体的测量。该技术是非常敏感的,并具有相对低的样品的要求(在微微摩尔的范围)。这两个方面使该技术非常适合于大型研究膜蛋白难以超过毫克来表达数量。

利用与定点自旋标记组合EPR谱是由韦恩哈贝尔和同事开发,并已被改编为研究的范围内的蛋白质的类型。12-24 EPR数据的已被用于研究的二级结构,在该蛋白质改变构象,膜 - 插入深度,以及蛋白质 - 蛋白质/蛋白质 - 配体相互作用。

该方法涉及在由定点诱变感兴趣位置半胱氨酸取代。为确保位点特异性标记,就必须以替代天然半胱氨酸与另一个氨基酸( 例如 ,丝氨酸)来创建一个半胱氨酸少模板。到目前为止,最流行的自旋标记是一个特定硫醇MTSL:(1-氧基-2,2,5,5-四甲基Δ3吡咯啉-3-甲基)methanethiosulfonate通过二硫键桥连接到蛋白质上。由于其高特异性,相对小的尺寸(小于色氨酸稍大),和灵活接头区域的相容性,这自旋标记已被证明具有优异的反应性,即使埋入半胱氨酸。此外,为了最大限度地提高反应性,该蛋白质的标记反应是在洗涤剂溶解的形式进行。通过尺寸排阻色谱的过量的游离自旋标记的分离后,将蛋白质重组到脂质体或限定的脂质组合物的双层模仿系统。在一般情况下,半胱氨酸诱变耐受良好的蛋白质的大部分地区,和自旋探头的相对小的尺寸会导致极小扰动的二级和三级结构。以确保该变形保留野生型功能,标记和重构通道可以通过膜片钳测量来研究。

然后将标记的官能蛋白进行光谱测量,其基本上提供三种主要类型的信息:由linesh 12,14,15,20,22,23,25-27自旋探针动力学猿分析;探头顺松弛剂无障碍;和距离的分布。27 EPR距离通过两种不同的方法进行测定。第一种是基于所述连续波(CW)技术,其中,从自旋标签之间偶极相互作用产生的频谱展宽(在8 - 20埃的距离范围内)。用于确定距离28,29的第二个是一个脉冲的EPR方法,其中,距离测量可以延长至70埃。30-34在双电子电子共振(鹿),在自旋回波振幅振荡被分析以确定的距离和距离的分布。这里自旋回波是在偶极相互作用的频率调制。总之,这些参数被用来确定蛋白质的拓扑结构,二级结构元件,和蛋白质的构象变化。

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Protocol

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1.定点突变和Cys突变

  1. 克隆和诱变
    注:GLIC野生型(wt)35有一个单一的天然半胱氨酸(C27),其被突变为丝氨酸以创建一个半胱氨酸较少的背景。半胱氨酸突变引入上通过使用在所需的位置36携带一个半胱氨酸密码子的引物位点定向诱变的半胱氨酸的较少的背景。
    1. 混合5微升10×反应缓冲液,1微升100纳克/微升半胱氨酸少GLIC模板DNA 35中 ,每一个40微米的正向和反向引物36,1微升的dNTPs(100毫米)的0.5微升,41微升的去离子水。几次吸取样品充分混合后,纺(6000转),最后加入1微升DNA聚合酶。
    2. 设置热循环仪,以如下协议:
      1. 变性在95ºC4分钟。
      2. 变性95ºC30秒。
      3. 退火ING在55ºC1分钟。
      4. 伸长率在68ºC10分钟(每KB质粒长度约1分钟)。
      5. 重复步骤1.1.2.2 - 1.1.2.4 18个周期。
      6. 在68ºC最后延伸10分钟。
      7. 在4ºC保持温度
        注:退火温度是基于引物的Tm计算。
    3. 加入1μl的DpnI的反应混合物中,吹打调匀,和自旋向下(6000转),持续1分钟。在37℃下孵育2小时。
  2. 转型
    1. E.解冻大肠杆菌感受态细胞冰上。等份的30μl细胞成一个14毫升无菌转化管中,加入1微升消化的DNA的细胞中。通过敲击管道的侧面混合。孵育在冰上20分钟。
    2. 放置管在42ºC水浴45秒,然后将其放回冰上2分钟。加入400微升无菌SOC媒体和动摇的细胞在INCU巴托37ºC1小时。
    3. 板100微升在含有卡那霉素(50μM)和1%葡萄糖的LB平板的细胞。孵育板O / N在37ºC。
    4. 从板收获单菌落并在5毫升的LB /卡那霉素培养基O / N培养物接种。在37ºC文化O / N(〜16小时),在培养摇床。
    5. 通过小量制备37摘自O / N培养的DNA。量化的DNA使用分光光度计通过测量在260nm波长的吸光度的产率。浓度应为〜100 - 200毫微克/微升。确认突变的通过标准重组DNA测序策略38,39的存在。

2. GLIC表达和纯化

  1. 转型
    1. 以下在1.2节中描述的步骤,变换30微升C43能干细胞与1μl的 - 包含GL编码基因的质粒(〜100 200毫微克/微升)与人鼻病毒(HRV)-3C蛋白酶切割位点沿集成电路(对于质粒和基因序列,指的是补充文本)35(从步骤1.2.5)。
    2. 板在含有1%葡萄糖和50μg/ ml卡那霉素的LB琼脂平板100微升细胞,并在培养箱中在37ºC孵育他们O / N(〜16小时)。
    3. 目视检查的殖民地,并确保他们不会过度生长或显示的卫星殖民地的存在。及时封板封口膜,并将它们存储在4ºC。
  2. 设置O / N-文化和生长培养基的制备
    1. 使用循环接种丝挑单个孤立菌落并转移到含有20ml Luria液体培养基的100毫升无菌瓶中(LB)培养基补充有无菌1%葡萄糖和50μg/ ml卡那霉素。在250rpm的摇床在37ºC培养他们的O / N(〜16小时)。
    2. 蒸压900毫升好棒肉汤(TB)的媒体(见媒体和缓冲区组成)2.8大号费恩巴赫玻璃烧瓶在121°C在蒸汽循环中的细菌培养物20分钟。
  3. 建立大文化发展
    1. 百毫升无菌磷酸钾缓冲液(见媒体和缓冲液组成)添加到蒸压TB介质。添加无菌葡萄糖(0.2%终浓度),卡那霉素(50微克/毫升),和10毫升的O / N培养物。在以250rpm的摇床上孵育37ºC。
    2. 检查在600nm波长(OD 600),使用密度计或分光光度计每隔一小时的光密度,直到达到0.5(〜2小时)。此时降低速度至150转,温度降低到18ºC。监视OD 600每隔30分钟,直到达到0.8(〜1小时)。
    3. 添加甘油为50毫升,并继续振荡培养,直到OD 600达到1.0 - 1.2(〜15 - 30分钟)。
      注意:在这些条件下,大约需要一小时,使文化从37ºC达到18ºC。这是小鬼ortant甘油被加入到培养中,冷却到18ºC之后。
    4. 诱导用200μM的IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)的细胞和重置摇床回至250rpm,在18ºC进一步孵育〜16小时。
  4. 蛋白质纯化
    1. 确保在16小时结束时的外径600〜16 - 18收获的细胞在1.0升离心瓶中通过8500 xg离心,4.0ºC15分钟旋转。倒出上清液并称重瓶与细胞沉淀。通过从总重量减去重量空瓶的计算粒料的重量。
      注:预期细胞沉淀重为〜30 - 35克/升。虽然,这是应当注意,有可能在整个突变体的最终OD 600和细胞沉淀重变性。
    2. 重悬在每1.0升培养150毫升冰冷的缓冲液A(100mM NaCl的20毫摩尔Tris,pH7.4)中的细菌沉淀。添加DNA酶I(100微克/毫升)和龙眼È抑制剂(苯甲基磺酰氟(1毫米),亮抑蛋白酶肽(2.0微克/毫升),抑肽酶(2.0微克/毫升),和胃酶抑素A(1微克/毫升))。
    3. 通过使它们通过一个细胞破碎在4.0ºC冷室均质化细胞。重复该过程三次,使得大部分细菌被裂解。离心细胞以14,000 xg离心15分钟,吸取上清并转移到一个干净的离心管中。弃沉淀,其中包含未裂解细胞包涵体。
    4. 离心上清168000 XG 1小时。小心倒出上清液,而不会干扰膜沉淀。
    5. 从1升培养物汇集膜沉淀和在缓冲液A(补充有10%甘油)中重悬它至50ml的终体积。在4.0ºC0.5克-N-十二烷基 - β-D-吡喃麦芽糖苷(DDM)添加到膜悬浮液和章动2小时。
    6. 膜溶解后,从由centrifug裂解物去除细胞碎片在通货膨胀XG 168000 1小时。在此期间,制备直链淀粉树脂。转印用吸管到一个空的聚丙烯色谱柱3毫升树脂。通过使10柱床体积的水洗涤3次,然后用缓冲液A 10床体积的含0.5mM DDM洗涤树脂。
    7. 离心后,轻轻取上清出使用移液管并转移到一个干净50ml锥形管中。对于分批结合,预平衡的直链淀粉树脂添加到锥形管中。通过在4.0ºC章动2小时,混合物结合所提取的蛋白质以直链淀粉树脂。
    8. 通过色谱柱传递整个浆料,收集流过。然后传递整个收集流过在树脂的第二时间最大化结合。
    9. 通过缓冲液A 10床体积的用0.5mM DDM,0.5毫三(2-羧乙基)膦(TCEP)和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)以除去未结合的蛋白质。
    10. 洗脱GLIC蛋白用10ml BUF的FER包含除了0.5毫米DDM和0.05毫米TCEP 40毫米麦芽糖。 TCEP防止半胱氨酸侧链的氧化。收集整个洗脱。
    11. 集中使用离心浓缩器(分子量截止= 50千道尔顿)洗脱的蛋白,以4 - 6毫克/毫升,并加HRV-3C蛋白酶(每10毫克200微克蛋白质),并在4.0ºC孵育O / N。
      注:通过运行在SDS PAGE凝胶样品推求蛋白酶消化的完成(参见步骤2.5.5和图1)。
  5. 定点自旋标记
    1. 使约100微升的DMSO(1-氧基-2,2,5,5-四甲基Δ3吡咯啉-3-甲基)MTSL 40的200mM的库存,并在-20 C存储库存在25微升等分试样。
    2. 使用自旋标记与MTSL蛋白酶消化的样本。添加10倍摩尔过量MTSL自旋标记物(GLIC单体:MTSL 1:10摩尔比)。在冰上孵育1小时。加入自旋标记的第二杆在5倍摩尔过量比并孵育1小时。
      注:对于埋位置(具有低自旋标记效率, 下面说明 ),一个30倍摩尔过量的自旋标记的,并将该蛋白温育6小时。
    3. 通过大小排阻快速蛋白质液相色谱(FPLC)列,它是用缓冲液A和0.5mM DDM预平衡到在切割MBP和来自GLIC五聚体的过量的游离自旋标签分开传递样品。收集1-毫升级分,共30毫升洗脱。汇集含有GLIC五聚体( 图1)的级分。按照制造商的指令来运行FPLC。
    4. 确定使用分光光度计通过测量在280nm波长的吸光度的样品的浓度。摩尔消光系数和GLIC单体的估计的分子量是49850 M -1 -1和36380道尔顿,分别。集中用离心浓缩的蛋白质溶液(分子重量截止= 50千道尔顿)至〜8-10毫克/毫升,并放置在冰上的最终浓度。样品现在准备用于重建。
    5. 作为一个额外的质量检查,以确保制剂是生化均匀,运行一个降低(1.0%β-ME)的SDS-PAGE凝胶。
      注:考马斯亮染色的凝胶应在约对应到GLIC单体( 图1)33 kDa的显示单一条带。
    6. 在抗磁性标签41的存在为疑似表现出偶极增宽,自旋标记的突变体下标记样品。孵育洗脱蛋白与0.1倍MTSL并在冰上孵育1.0小时。之后,加入20倍摩尔过量的反磁标签(1-乙酸基2,2,5,5-四甲基Δ3吡咯啉-3-甲基)甲烷硫代磺酸的。
      注意:这里使用的抗磁性试剂是异空间与相同的化学标记顺磁性标签。
    7. 在冰上孵育样品2小时。通过SIZ通过样本Ë排阻色谱列,它是用缓冲液A和0.5毫米DDM预平衡的步骤2.5.3。
  6. 自旋标记效率
    1. 自旋标记效率被定义为自旋标记浓度的半胱氨酸侧链(GLIC单体)的浓度之比。确定样品的自旋标记的效率,样品的积分强度将与已知浓度的标准使用校准曲线图进行比较。通过在水中溶解 - (250μM10)的范围内的浓度:(TEMPO如2,2,6,6-四甲基-1- piperidinyloxyl)作出的EPR标准的解决方案。
    2. 测量每个这些解决方案的EPR信号和确定的曲线下对于每个浓度的区域(EPR信号的双重积分)(如在步骤6.1中所述)。产生通过绘制所测量的面积作为TEMPO浓度的函数,并用直线拟合的校准曲线。
      注意:是一个衍生EPR信号下的光谱强度比峰值到峰值幅度的一个更好的描述。积分第一衍生物的EPR信号将给吸收光谱,第二积分然后将得到的吸收光谱下的面积(正比于自旋浓度)。确保一个恒定的基准都在频谱的低场和高场区域。
    3. 测量使用分光光度计洗涤剂自旋标记蛋白质的浓度(如在步骤2.5.4)。现在测量样品的EPR信号,然后确定以下6.1节步骤EPR信号的双重积分的面积。通过使用校正曲线,确定其对应于所测量的EPR信号标签的浓度。计算自旋标记效率为自旋标记和蛋白质浓度的摩尔比。

3. GLIC重建中Asolectin膜

  1. 冲洗用5ml氯仿的清洁25毫升圆底烧瓶中并在N 2气中的通风橱的流干燥烧瓶中。转移10毫克asolectin的(大豆极性提取物25mg / ml的库存在氯仿)到烧瓶中并干燥下N 2气的连续流的脂质。
    注:脂质的用于重建的选择是根据在第4,从实验研究结果。
  2. 当氯仿蒸发,将烧瓶在真空1小时以保证完全干燥。加入1 ml重组缓冲液A到干燥的脂质和涡大力瓶拿到脂质沉淀成混悬液。
  3. 为了准备小单层囊泡,超声处理在寒冷的槽式声波脂质停牌,直至囊泡的解决方案变得或多或少透亮,无团块观察(约10 - 15分钟)。向该混合物中,添加DDM至4 1mM的终浓度,并在室温孵育30分钟。
<LI>重建
  1. 从步骤2.5.4至脂质混合物中添加纯化的蛋白质。
    注:蛋白质与脂质比例取决于实验的类型。为宏观电流测量中,1:使用万比。对于EPR研究,重构以较高的蛋白质与脂质比(1:2,500)进行最大化信号。它以前曾表明,在这些浓度,没有横向聚合观察42。
    注:GLIC为EPR典型工作用量为1〜毫克,虽然基于探测的位置,较低的数额也行。
  2. 孵育4ºC样品1小时,轻轻转动然后稀释样品至15ml用缓冲液A
    注:此步骤带来的临界胶束浓度(CMC)以下洗涤剂浓度。
  3. 通过加入聚苯乙烯珠(具有疏水孔陷阱洗涤剂)除去在悬浮液中的残留洗涤剂。加入80毫克的清洁珠和孵化lipos在4ºCOME悬挂Ø在章动器/ N。
    1. 准备使用的珠子,体重约100毫克,并将它们转移到50毫升锥形管。加入10ml甲醇,剧烈振荡,在8000 XG降速珠2分钟,倾倒出甲醇。重复甲醇此过程洗涤三次。重复同样的过程,用30ml去离子水,洗涤3次。
  4. 第二天,使用柱过滤以除去珠和样品进一​​步稀释至25ml的脂质体转移到25毫升超速离心管。离心样品在168000 XG 2小时。倒出上清液并重新悬浮使用100微升缓冲液B的小球

4.确定最佳的脂组成由FRET重建

  1. 使用荧光共振能量转移(FRET)系检测,以确定维持所述蛋白质的单分散的膜组合物。
  2. 净化重量
  3. 以下在用于重建部3.2的步骤,制备三种不同的样品进行测试各脂质组合物; 首先 ,荧光素标记的GLIC以1:1的摩尔比。1500(五聚体:类脂) ,罗丹明标记的摩尔比GLIC 1:1500(五聚体:脂肪)。第三,混合洗涤剂溶解荧光素和罗丹明标记的GLIC(1:1摩尔比)。重建该混合物在1:750(五聚体:脂质)的比例。
    注意:我们使用了三种脂质系统:asolectin,POPC:POPG(3:1摩尔比)和E.大肠杆菌极性提取物。在FRET实验的蛋白脂质重构比率是比用于EPR测量更高(1:750相比为1:1500用于EPR研究)。
  4. 稀脂质体悬浮液(以减少光散射信号;〜5微升在995微升缓冲液A),然后吸取样品放入石英比色皿,并将其放置在一个荧光。
  5. 设定在490激发波长(其对应于供体的最大吸收:荧光素)。使用制造商的说明,该发射光谱记录从500nm至660nm处。
    注:对于荧光标记的样品GLIC,你会看到在518纳米的峰值(对应于荧光发射),无峰572纳米(相当于罗丹明发射)。对于罗丹明标记的样品GLIC,你不会看到一个峰值在518纳米,而是在572纳米距离罗丹明的直接激发而产生的490纳米。对于含有荧光素和罗丹明标记的样品,在荧光峰值强度的降低和罗丹明峰的相应增加是有可能在膜蛋白质的横向聚集的指示一个FRET信号。
  6. 监控在572纳米罗丹明发射的幅度在各种时间间隔(从0 - 24小时)在每一个小时记录的前6小时,然后经过O / N培养( 图2)。对于每一个间隔,测量荧光强度在572纳米(罗丹明:IA)和518纳米(荧光素:ID)。减去的iA(IAC)直接激活罗丹明(样品2步骤4.3)的贡献。确定FRET比率IAC /(IAC +磅)。在不同的时间间隔和在不同的脂质组合物进行比较的FRET。
    注意:作为对照,进行步骤4.5和4.6用于洗涤剂溶解样品和发射光谱比较那些从重组的脂质体。使用标记的蛋白质的等摩尔混合物在洗涤剂(在步骤4.3中所述)和稀的缓冲液A补充有0.5mM的DDM。据预计,洗涤剂的样品将显示出最小的FRET信号。

5.功能通过测量膜片钳录音

  1. PR准备oteoliposomes用于膜片钳测量以完全相同的方式与EPR研究(3.1节)。
    注:然而,调节蛋白:根据测量的类型正在取得(单通道VS的肉眼记录)的脂质比率。闪冻在液氮中,并存储所述脂蛋白体在-80ºC直至使用。通常情况下,重构GLIC在1:10,000蛋白质:脂质(摩尔比)为宏观电流和1:单声道录音50000摩尔比。
  2. 在冰上解冻脂质体。冲洗用水和乙醇干净的载玻片上并完全干燥。放置脂蛋白体上的幻灯片和干燥的O中心10微升滴/ N在真空下4 摄氏度的干燥器。
  3. 重新水合物加入20微升缓冲液B(150mM的氯化钠,10mM的HEPES,pH值7.0)的干燥脂蛋白体,并放置在上有湿滤纸的顶部petriplate的幻灯片。覆盖板并允许补液进行约2小时。
    注:此过程一愕LDS巨型多层脂质体有利于从修补。
  4. 使用厂家推荐的移液器拉马设置 - 从薄壁高硼硅玻璃毛细管(2微米尖端直径约1)拉补丁移液器。在充满缓冲B.2MΩ - 使用热抛光火锻造到1.5的阻力
  5. 填充缓冲液B用吸管录音室和附加的Ag / AgCl接地电极。使用2微升枪头,轻轻移去从边缘和转移1μl的在记录室中的悬浮液的脂质体。等待几分钟的脂质体沉淀到底​​层。
  6. 用非金属注射器针头填充补丁吸管缓冲液B,并将其安装在放大器头阶段。确定一个单一的隔离泡修补。应用微正压,以防止堵塞补丁吸管,然后将尖端插入录音室。
  7. 应用测试脉冲来测量移液管resistaNCE和补偿吸管电压偏移。接近囊泡,并接触时作出,申请轻微负压轻轻一拉针对补丁吸管囊泡形成千兆欧姆密封。
  8. 监视吸管在整个过程中的阻力。一旦千兆欧姆密封形成,撤回吸管从脂质体精心客场以形成一个由内而外的补丁。关闭测试脉冲。
  9. 保持电位设置为-100毫伏,并应用的pH脉冲。用10mM柠檬酸钠缓冲液C(150​​mM的氯化钠,10mM柠檬酸,pH值3.0)中获得的低pH值。 ( 图3)
    注:录音将在10kHz为宏观和40千赫的单信道测量的采样频率进行。

6. EPR测量

  1. 连续波EPR光谱
    1. 来自步骤3.2转移脂质体悬浮液成200μl的管中,用离心机沉淀样品。丢弃supernataNT和样本准备EPR测量。
      注:对于EPR测量,重要的是从脂质体样品尽可能除去尽可能多缓冲。由于水样吸收导致加热和灵敏度的损失微波的电气部分。
    2. 为了进行缓冲交换,传输用移液管到离心管脂质体颗粒的20微升。添加180微升缓冲液D(100mM NaCl的10 mM柠檬酸盐,pH值3.0)中,并在42ºC水浴孵育5分钟。离心样品,用移液管除去上清液,并重复该过程三次以确保完全缓冲液交换。
      注:可替代地,缓冲液交换可通过对样品进行多次冷冻/解冻循环进行。
    3. 气体可渗透塑料毛细管是同时适合谱线-形状和溶剂可接近的测量。点击毛细管到沉淀的脂蛋白体里面抽取样本和密封用骨蜡结束。
      不E:典型样品量〜5微升和期望的自旋浓度为150微米。如果目标是单独测量线形状,可以使用0.4毫米外径石英毛细管。如果需要的话,吸移管可以用于填充所述毛细管内的试样。
    4. 操作光谱仪
      1. 配备有介电谐振器按照制造商的说明书X波段分光计 - 在RT(297ķ292)执行的CW-EPR测量。
      2. 打开冷水机组,电源,微波桥控制台。允许系统用于记录前约30分钟,热平衡。打开采集软件。
      3. 插入该样品管/毛细管到谐振器中,确保所述管填充有样品的部分是在谐振器腔的中心。调整谐振器按在光谱仪手动指令。
      4. 记录由场扫描第一衍生物的吸收光谱在1.0毫瓦,100kHz的调制频率及100 G的扫描宽度的入射微波功率确定最佳功率进行实验通过进行累进度数饱和实验,其中峰到峰高一阶导数的CW EPR信号作为入射微波功率平方根的函数被测量。
        注:在较低的微波功率,在正比于功率的平方根的信号强度增大,只要自旋态的平衡人口不受影响。但是,如果功率进一步增加时,自旋 - 晶格弛豫不再能保持两个自旋态的群体平衡差和信号幅度开始高原或“饱和”。除了这一点,信号的幅度可能实际上随着观察功率由于自旋联署的粒子数反转降低。另外,对于具有广泛的翅膀加宽光谱,其中一个良好定义的平面的基线不是六sible,扫描宽度扩展到150 - 200 G以防止面积损失。
      5. 开始使用的1.0的调制振幅G.
        注:此值是样品依赖性和调整,以减少在所述信号中的低频噪音。如果使用过大的值,它可能会扭曲或拓宽信号。
      6. 设置时间常数和转换时间为20.48毫秒,扫描时间为20.97秒,分辨率为1024点。
        注:时间常数也基于样品和被调节以滤除高频噪声。
      7. 第一扫描后,在EPR信号的中心设置中心场,并选择扫描宽度,使得所述跟踪包括在任一侧的信号和足够的基线。
        注意:另外,为了提高信号/噪声比,增加基于所述EPR信号强度的扫描次数。包括扫描宽度和点数
      8. 测量自旋标记的无障碍碰撞放松代理O 2 27步骤6.1.4.4所述。
        注意:如前面所述26准备NiEDDA。
      9. 首先用N 2 5分钟灌注样品中的空腔(冲洗掉O 2)。测量5之间的每个微波功率谱 - 以3 dB步进值为35dB 30 G的扫描宽度
      10. 然后灌注样品与空腔 空气10分钟,并测量在不同的微波功率的谱(5 - 在3 dB步35分贝)如在步骤6.1.4.9。
      11. 孵育20微升脂质体沉淀的用50mM NiEDDA 180微升(在缓冲液B或缓冲液D)在一个42ºC水浴5分钟。离心样品和使用移液管去除上清。加载样品进入毛细管,并将其放置在谐振器腔。重复步骤6.1.4.9。
        注:在实验的原理是与顺磁松弛素的相互作用摹代理通过海森堡自旋交换会阻止信号和粒子数反转的饱和。水溶性NiEDDA和脂溶性分子O 2作为记者的水(散装和intraprotein门廊)和膜分别暴露在蛋白质上的位置。
  2. 数据分析:
    注:EPR数据分析包括下列步骤:14,22,23,25-27
    1. 计算自旋探头的流动性(ΔHÒ-1),如在第一衍生物的吸收光谱的中央线宽度的倒数。 ØΔH-1反光运动自由度或探头的动态。
    2. 计算的辅助参数(П),其是探针的可及其他顺磁性碰撞放松剂的估计,使用下面描述的步骤。
      注:从顺松弛剂旋转探头的互动增强了海森堡自旋交换氨基氧的自旋-晶格松弛速率(T 1)。27
      1. 从其中第一衍生物的EPR光谱的中心线的垂直峰-峰振幅在不同的微波功率测量功率饱和实验(6.1.4.8)25图解可访问参数(П)估计。的信号的振幅作为微波功率平方根的函数,并且适合与以下等式27。
        式(1)
        注意:其中A是信号的振幅,是谐振线路(通常是在0.5和1.5之间)的饱和的均匀性的量度, 是比例因子,P是入射功率,并且表示值在该一阶导数的幅度是其不饱和值的一半。
  3. 计算ΔP 2或NiEDDA),并缺席1/2值(灌注N 2)顺放松剂。计算使用公式无障碍参数(П):
    公式(2)
    注意:其中,P 1/2 参考ΔHO 参考是半最大功率饱和度值和中央线宽度分别为参考标准(如DPPH(2,2-二苯基-1-苦基 ​​肼))27。

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Representative Results

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自旋标记GLIC突变体的生化特征

按照上述描述的方案通常产生GLIC-MBP融合蛋白在10〜 - 12毫克/升培养物。虽然这个值可以在不同的突变体而变化,特别是对于埋在蛋白质内的位置时,产率可能会显著损害。在这些情况下,培养体积可能需要扩大。融合的裂解构建由HRV3C蛋白酶进行O / N方便。通过运行在SDS PAGE凝胶上的样品中,我们发现,这种切割是30内完成 - 60分钟。 ( 图1A)。大小排阻凝胶过滤柱纯化,GLIC主要洗脱与11.3毫升保留体积五聚体。 MBP的级分洗脱以15ml和聚集在柱(〜7.0mL)中的空隙体积中洗脱。自旋标记正值洗脱结束时(〜24ml)中( 图1B)

基于FRET检测在各种膜脂监测GLIC复溶的聚集

FRET的测定用于在重构囊泡评估GLIC五聚体的聚合(距离<50埃的膜中来在一起)。 图2示出了来自GLIC重量数据(与C27,标记或荧光素或四甲基罗丹明),并于E重构.coli极性脂质,POPC:POPG(3:1),POPE:POPG(3:1)或asolectin。荧光测量表明,在GLIC重组asolectin没有表现出FRET,甚至冻结/解冻样品(称为促进凝集的条件)所产生的FRET 43水平变化很小。出于这个原因,asolectin是选择用于这些STU使用的功能和光谱测量脂质混合物死亡。

在脂蛋白GLIC的宏观行为

在重组蛋白脂质体纯化GLIC的功能特性的特点是膜片钳测量。从重量GLIC从响应于的pH跳的内侧出补丁代表宏观当前记录示于图3在-100毫伏保持电位,切换至pH3.0缓冲产生迅速激活向内的电流。(10 - 100毫秒),该衰变到秒43内的峰值幅度的约10%(1 - 3秒, 图3)。电流从这个宏观腐烂或脱敏切换回中性pH恢复。而在里面出补丁通道是在浴pH值的变化敏感,有在吸管溶液无pH变化的影响(数据未显示),表明GLIC被在一个严重主要取向ction使得在补丁中的胞外结构域所面临的浴/溶液热交换器。

结构重排在通道激活

在RT,自旋探头可以采用多个旋转异构构象,和谱线形状不仅是自旋标签侧链相对于肽骨架的运动,也给骨干波动和全球蛋白运动敏感。因此,在EPR lineshapes变化可以被证明是监测蛋白的构象变化的优良的诊断工具。 图4示出了光谱在位置L241(17)中的R1孔隙衬M2区域的胞外疏水区域(位置突出如黑圆图4, 插图 )在pH 7.0和pH 3.0。两种条件下的光谱显示的差异,无论是在信号幅度和的程度动感扩大。与功能测量42,由EPR信号报告的构象变化也完全可逆的。频谱展宽由探头的动生约束和由偶极耦合的影响两者。以确定两个,L241(17)的贡献是共同标记有抗磁自旋的标签。下标记的和充分标记的光谱在pH 7.0和pH 3.0( 图4B)进行了比较。偶极增宽在该位置的范围内降低时,通道被下标,它表示不同的亚基之间自旋标签之间的相互作用。

图5示出用于在M4螺旋的两个位置,其位于所述通道的周边光谱。 ΔHø-1为中心的线宽度(在插图示出)的逆测量。作为氮氧化物的旋转运动被减少,因为形成期间目睹的叔或季接触,线路宽度增加(并因此ΔHö-1减少)对于任何特定动生的几何形状。与此相反,从而增加在移动的探头的自由结构运动反映为○-1增加ΔH。 F312R1是更多的移动而R296R1是不动的,与他们的接触和高度受限的环境相一致,分别为。

基于所述辅助参数,在蛋白上的特定位置处的自旋标记物可以被分类为以下之一:埋蛋白质核无法进入水或脂质内,暴露于水性溶液的表面上,或者在表面暴露于脂质( 图5和6)。对于一系列连续的部位的所获得的可访问参数然后可以被用来确定一个区域的二级结构,探针蛋白质的区域接触,测量蛋白质的倾斜膜内,估计界面环的浸入深度,以及跨膜螺旋内识别水前庭和脂质结合口袋26作为一个例子,在图6中显示,F312R1具有电饱和曲线对于O 2的相对高磷1/2,相比于R296R1,暗示侧链在位置F312是脂露出。此外,F312R1也是比较R296R1其在脂质 - 水界面的位置一致,以NiEDDA更容易获得。另一方面,L180R1在细胞外结构域的环C区是移动的,并向NiEDDA,符合其在暴露于水的循环位置。

探针动力学和辅助数据在给定的位置提供关于整个蛋白质倍之内的特定位置局部结构信息。对于人确定这些参数沿着该蛋白质的残基的inear序列可以使用基于傅立叶分析方法变换方法作进一步分析。这些分析是评估在EPR环境参数的周期性变化,并在预测和定向的二级结构,引导有益的。对于特定蛋白质片段,离散傅立叶变换被计算为在该段相邻位置(ω)之间的角度的函数的功率谱P(ω)。然后该曲线被用来确定频谱的主要角频率分量相比,对于α螺旋的预期(ω)的值(80 - 120º)或β链(150 - 180º)。
公式3
其中,P('ω')的傅里叶变换的功率谱作为角频率ω的函数,n是在该段中的残基的数目,是在该位置的环境参数,P(“ω”)获取的价值评估ω= 公式6最大化P('ω')。

另外,周期性指数参数(给出了预测的二级结构的显着性)被计算作为区域的为表示该光谱的总面积的一个给定的结构元件的角功率谱下的比率。然后,滑动窗口方法是用来识别的开始和一个给定的二级结构元件的端部。相对方向相对于该蛋白的其余部分这一部分可以从P('ω')的时刻的方向进行估算。

对于α螺旋:

公式4

公式5

这些方法已经成功应用于多个系统来确定三维拓扑结构,并预测蛋白质功能14,23,24,41,44-53潜在的构象变化。

从EPR确定分布的距离

跨亚氮氧化物的距离可以从电子 - 电子偶极相互作用来确定。在CW-EPR, 如图4,通过空间偶极相互作用导致的频谱变宽和是标签之间的接近的功能。距离可达约15 - 20 A,拓宽(比较充分标光谱和下标记谱之间)的程度可以用于半定量地估计使用距离傅立叶去卷积方法。28,29

间亚基距离(<50埃)可以使用双电子-电子共振(鹿)方法测量。30-34鹿数据被收集洗涤剂样品中或在因为在脂质体54这些测量相关的限制的纳米圆盘重构。用于洗涤剂中的缓冲液A自旋标记的样品(〜100μM)用0.5mM DDM,30%(重量/体积)甘油被用于冷冻保护。偶极时间演化数据使用标准鹿四脉冲协议(π/ 2)83ķ得到MW1-τ1-(π)MW1-τ1-(π)MW2-τ2-(π)MW1-τ2回波55在脉冲EPR谱仪在Q波段频率(33.9 GHz)的工作。为(π/ 2)MW1和(π)MW1的脉冲长度是10和20毫微秒,分别与40纳秒为(π)MW2。鹿信号然后背景校正假设一个三维均匀backgroUND并分析了吉洪诺夫正规化31,56来确定距离平均距离和分布。

用于通过鹿实验在pH 7.0确定在M4(F314R1)的代表性位置的分子内距离被示出在图7中由于有在GLIC五聚体在五个旋标签,至少两个距离预计。对应一到相邻亚基和不相邻的亚基另一方面,虽然额外的峰值可能从备用旋转异构自旋方向出现。鹿信号衰减和相应的概率分布列。第一短距离峰(〜42A)表示相邻亚基之间的距离,和第二峰(〜53A)对应于非相邻的距离。为对角线距离的峰是在短距离,这是可能的,因为超出60埃可靠的测量结果被低估不是实验条件下可行由于与背景校正技术困难。

图1
图1. 生化特征自旋标记GLIC突变体 。自旋标记-GLIC的MBP标签的蛋白水解切割后(A)的代表性的凝胶过滤色谱图。该峰对应于GLIC五聚体和游离的MBP。 (B)表示从凝胶过滤汇集的完整无缺的单体GLIC-MBP融合蛋白(凝胶过滤前)和MBP和GLIC分数SDS-PAGE。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2. FR ET基于测定监测GLIC复溶的聚集状态中的各种膜脂。FRET示为样品测量后O / N复溶(左)和冷冻/解冻的样品(右侧)之后。 (从原来的图修改)。43 ,请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. 在GLIC的脂蛋白宏观行为。在从重组asolectin泡切除一个由内而外的补丁,GLIC受pH值激活使用快速的解决方案交换跳跃。的信道被看作激活〜10毫秒和1的时间常数脱敏 - 3秒。 (从原来的图修改)。43ig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4 结构重排期间信道激活。(A)的代表在孔的位置处衬M2螺旋,响应于pH变化显示在幅度和线的形状的变化的CW-EPR谱。在每一种情况下,光谱被标准化为自旋的总数。自旋标记位置被示为黑色圆圈。仅两个亚单位示为清楚。 (B)EPRspectra显示了由自旋相互作用偶极增宽。在虚线的谱从下标记通道(在抗磁性标签的存在),并在实线的来自完全标记的信道。插图显示振幅归一化的光谱的重叠。充分标记的条件下扩大高箭头亮起。扫描宽度为150 G.(从原来的图修改)。36 ,请点击此处查看该图的放大版本。

如图5
图5. 残留的具体环境参数由功率饱和进行测量。在跨膜结构域的M4螺旋两种截然不同的立场谱宽(ΔH0)和溶剂可(P 1/2)的测量。 请点击此处查看大图这一数字。

图6
图6 的环境一个代表性的循环C残基在GLIC的胞外区。自旋标准化CW-光谱和相应的辅助功能的三围L180R1。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7
脉冲-EPR途径(鹿)。GLIC结构表示Phe314的位置和相应的相邻和非相邻亚基Cβ-Cβ距离图7 的距离测量 。 CW-光谱这个位置显示在右侧。背景减去DEER-回波强度暗算演化时间,并使用无模型吉洪诺夫正则洗涤剂样品适合。相应的自旋间距离分布( )。PLOAD / 54127 / 54127fig7large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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EPR谱已被证明是在一个近乎完美的环境量化膜蛋白的构象变化无与伦比的结构方法。这种方法可以让我们一窥了在高分辨率结构遮蔽X射线晶体学和低温电子显微镜蛋白质动力学的分子机制。但是,要考虑这种做法可能会影响一般适用于其他系统,并要牢记沿途的潜在实验路障的技术限制,是非常重要的。我们讨论一些这些方面的下面一起排除故障推荐的策略。

其中较常见的问题,一个遇到具有广泛涉及突变扰动的低产量和蛋白质低聚稳定性差的技术。与复杂的多聚膜蛋白如离子通道时,这方面是进一步恶化。这是个erefore至关重要着手广泛突变之前,这两个生物化学方面进行优化。我们发现,有毒GLIC突变体的表达在BL21细胞的C41和C43菌株耐受性更好3,36另外,降低感应后温度到15日- 18ºC,降低IPTG浓度至100μM,并且包括5%甘油诱导期间似乎帮助减缓蛋白表达率和减少错误折叠的程度大概降低蛋白质聚集。在某些位置(特别是在渗透途径)半胱氨酸突变已显示出增加的信道的组成性活性和这些突变体很可能在表达造成更大的障碍。二价孔隙阻滞剂使用(10 - 25毫巴2+)诱导时减轻毒性,提高的细胞生长57这些策略已在许多情况下,在增强产量,降低蛋白质聚集和增强寡聚证明是有效的。MERIC稳定。36,58

在SDSL另一个关键步骤是标号处理的效率。而表面露出半胱氨酸应构成在MTSL反应性(> 90%标记率)没有问题,其中该半胱氨酸侧链都埋和不可访问的位置,可能需要更高的自旋标记的浓度和更长的温育时间。自旋标签浓度提高至30倍摩尔过量和孵育O / N在4ºC有助于提高标记效率。此外,它也是重要的测量标记的Cys-少模板的光谱,以确定背景的贡献。对于被标记的不良部位(<10%),背景信号淹没的整体光谱。在确定自旋标记效率,请注意,精度由若干包括样品体积,样品毛细管直径,谐振器内的毛细管的定位,模腔温度,和谐振器Q值的影响值(它是在能量存储在其中的能量的比例消散出来)。必须小心以维持样品和标准之间相同这些条件。此外,应该指出的是,对于不动的场所,其中所述光谱是本质宽,标记测量精度进一步下降。另外,飞行 - 电喷雾质谱法(LCT-ESI-MS)的液相色谱时间可以用来直接确定分子质量,因此贴标效率。然而,该MS灵敏度在洗涤剂和用于紧紧折叠膜蛋白破坏样品。

一旦突变体作为同源性的群体进行纯化,它以确定制剂的功能是重要的。在通道的关键区域自旋标记的突变体的膜片钳测量将揭示扰动对配体的亲和力和通道门控的效果。另外,信道特性可以在黑色L进行研究IPID膜(BLM)59或如果它发现该半胱氨酸取代,并在一定的位置上的自旋标签改变的配体灵敏度或门控动力学注射蛋白脂质体进入卵母细胞和测量由双电极电压钳59-61电流。渠道,实验条件(配体浓度,调制器,脂类成分),可以适当改变正在调查,以稳定构象状态。此外,它是要注意,EPR测量稳态条件下进行,因此,改变了信道的快速动力学的可能性较小影响的结构的解释。

显然,这种技术的主要优点是研究中所定义组合物的膜信道动态,并直接探测的动力学脂质介导的效应如何改变通道功能的能力。然而,一个限制是,一些脂质组合物可能会引起通道o的横向聚集n中的膜,因此需要脂质的适宜性来确定。45对于做引起聚合的条件下,降低蛋白质与脂质比,在较低的温度下进行重建,并缩短的重建时间的持续时间中保持通道可以帮助单分散62可替换地,通道可以在纳米圆盘,它是由两亲膜的支架蛋白(载脂蛋白A1)63的环形包围通过优化通道蛋白,脂类成分和膜支架蛋白的摩尔比的纳米脂质组件重构,它能够实现纳入个别纳米圆盘单信道单元的均匀和单分散的人口。该系统已在一些额外的优势纳米圆盘是光学透明的,并提供容易进入细胞内和细胞膜的外两侧。

最后,在水平在EPR测量,人们可能会认为是不能直接解释面临CW-EPR谱,尤其对多组分显示光谱位置。这样的构象异构性可以由在给定的蛋白质构象缓慢交换蛋白和/或自旋标记的多个方向的构象发生。确定两个场景的相对贡献是不平凡的,并且可能需要使用替代自旋标记的衍生物,或改变实验温度,64压力,65场强/微波频率,66或渗透质扰动。67

另外,在脂质体鹿测量可以通过许多因素,包括灵敏度较低,从增强分子间的相互作用导致更高的背景的贡献,并在可测量的距离范围(<50埃)的减小受到限制。在一般情况下,对于较长的距离(<50埃),有很大的在距离分布的宽度,由于偶极进化时间不够呃不确定性。然而,使用Q带(34千兆赫)的微波频率和标签与双功能自旋标记(具有降低的固有动态)已经显示出减轻这些局限性。54重构的纳米圆盘也已显示通过向极大改善鹿灵敏度减少从分子偶极相互作用产生的背景贡献。15

尽管有这些限制,SDSL / EPR研究,特别是在与少数天然半胱氨酸系统,已被证明是非常丰富。未来的技术进步正在向适应这个强大的方法来研究更复杂的人类渠道,其中原生变异半胱氨酸是不可行的面向。在这方面,基于68的非天然氨基酸位点特异性掺入,或SYNT备用标记策略,如那些发展标签hesis被瞄准往其他氨基酸,69似乎具有很大的希望。

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Acknowledgments

我们非常感谢Chakrapani实验室对稿件批判性阅读和评论的现任和前任成员。 这项工作是由卫生部授予全国学院(1R01GM108921)和美国心脏协会(NCRP科学家发展赠款12SDG12070069)和SC的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

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定点自旋标记和五聚体配体门控离子通道的EPR光谱研究
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Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

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