This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.
Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.
I det seneste årti har den strukturelle forståelse af pentamere ligand-gatede ionkanaler (pLGIC) vokset med stormskridt på grund massevis af højopløselige strukturer af flere medlemmer af familien. Vigtige faktorer, der førte til de nuværende fremskridt inden omfatter, opdagelsen af prokaryote pLGIC kanaler, 1-3 store fremskridt inden eukaryote membranprotein udtryk, 4-6 og enorme gennembrud i struktur beslutsomhed tilgange. 7. Disse strukturer giver en klar enighed om den overordnede beskyttelse af den tredimensionale arkitektur af pLGIC. Men to store områder, der synes at trail bag er den funktionelle karakterisering af disse kanal præparater og mekanistisk beskrivelse af kanal funktion.
Gating konformationelle ændringer er komplekse og forekommer over en 60 Å afstand langs længden af kanalen og disse overgange er udførligt moduleres vedmembranlipider. Især har negative lipider, cholesterol og phospholipider vist sig at modulere funktionen af pLGIC 8-11. Mens den præcise rolle af disse lipid bestanddele i kanal funktion forbliver ukendt, ville en komplet molekylær forståelse af gating kræver at studere disse kanaler i deres oprindelige miljø. Site-directed Spin Mærkning (SDSL) og elektronspinresonans (EPR) spektroskopi er de teknikker til valg for at studere protein dynamik i rekonstituerede systemer. EPR-spektroskopi er ikke begrænset af den molekylære størrelse (som er NMR) eller den optiske egenskab af prøven (som er fluorescensspektroskopi), og tillader derved målinger af fuld længde konstruktioner rekonstitueret i native lipid forhold. Teknikken er yderst følsom og har krav relativt lave prøve (i pico-mol interval). Begge disse aspekter gør teknikken velegnet til at studere store membranproteiner, der er vanskelige at udtrykke i løbet milligrammængder.
Anvendelsen af EPR-spektroskopi i kombination med steddirigeret centrifugering mærkning blev udviklet af Wayne Hubbell og kolleger, og er blevet tilpasset til at studere en række protein-typer. 12-24 EPR data er blevet anvendt til at undersøge sekundære strukturer, ændringer i proteinet konformation, membran-indsættelse dybder, og protein-protein / protein-ligand-interaktioner.
Fremgangsmåden involverer cystein substitution ved positionerne af interesse ved site-directed mutagenese. At sikre stedspecifik mærkning, er det nødvendigt at erstatte native cysteiner med en anden aminosyre (f.eks., Serin) at skabe en cystein-mindre skabelon. Langt den mest populære spin-mærket er et thiol-specifik MTSL: (1-oxy 2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl) methanethiosulfonate der tillægger proteinet gennem en disulfidbinding bro. På grund af sin høje specificitet, relativt lille størrelse (lidt større end tryptophan), og flexiheden for linker-regionen, har denne spinmærkning vist sig at have fremragende reaktivitet selv med en nedgravet cystein. Endvidere at maksimere reaktiviteten reaktionen af proteinet mærkning udføres i detergent-solubiliserede formular. Efter separation af overskydende frie spin-mærke ved gelpermeationskromatografi proteinet rekonstitueres til liposomer eller dobbeltlag-efterlignende systemer med defineret lipidsammensætning. Generelt er cystein mutagenese veltolereret i de fleste dele af proteinet, og den relativt lille størrelse af spin-sonde forårsager minimal forstyrrelse til de sekundære og tertiære strukturer. At sikre, at modifikationen bevaret vildtype-funktioner, kan de mærkede og rekonstituerede kanaler studeres ved patch-clamp målinger.
Det mærkede-funktionelle protein udsættes derefter for spektroskopiske målinger, som i det væsentlige giver tre hovedtyper af oplysninger: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-probe dynamik ved lineshabe-analyse; tilgængelighed af proben til paramagnetiske afslapning midler; og afstand distribution. 27 EPR afstande måles ved to forskellige fremgangsmåder. Den første er baseret på den Continuous Wave (CW) -teknik, hvor spektral udbredning følge af dipolære vekselvirkninger mellem spin-etiketter (i 8 – 20 A afstandsområde). Anvendes til at bestemme afstanden 28,29 Den anden er en pulseret-EPR metode, hvor afstandsmålinger kan forlænges op til 70 Å. 30-34 i Double Electron Electron Resonance (DEER), er svingninger i spin-ekko amplitude analyseret for at bestemme afstande og afstande distributioner. Her spin ekko moduleres ved frekvensen af den dipolære interaktion. Tilsammen er disse parametre anvendes til at bestemme protein topologi, sekundære strukturelementer, og protein-konformationelle ændringer.
EPR-spektroskopi har vist sig at være en enestående strukturel tilgang kvantificering konformationelle ændringer i membranproteiner i en nær-native miljø. Denne tilgang giver os et kig ind i de molekylære detaljer af protein dynamik, der er skjult i høj opløsning strukturer fra røntgenkrystallografi og Cryo-elektronmikroskopi. Men det er vigtigt at overveje de tekniske begrænsninger ved denne fremgangsmåde, der kan påvirke den generelle anvendelighed til andre systemer, og også at huske på de potentielle e…
The authors have nothing to disclose.
Vi er meget taknemmelige for de nuværende og tidligere medlemmer af Chakrapani laboratorium for kritisk læsning og kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud (1R01GM108921) og American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 12SDG12070069) og SC.
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations | |||
10x PfuUltra HF reaction buffer | Agilent Technologies | 600380-52 | |
dNTPS | New England BioLabs Inc | N0447L | 10mM each dNTP |
pfu Ultra DNA polymerase | Agilent Technologies | 600380-51 | 2.5 U/ul |
DPNI | New England BioLabs Inc | R0176S | 20,000 U/ml |
XL10 GOLD | Agilent Technologies | 200314 | |
SOC media | New England BioLabs Inc | B9020S | |
Kanamycin | Fisher Scientfic | BP905 | |
LB media | Invitrogen | 127957084 | |
Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
C43 competent cells | Lucigen | 60446 | |
Expression and Purification | |||
Glucose | Fisher Scientfic | D16 | |
Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421-500 | |
Yeast extract | Amresco | J850 | |
Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229 | |
K2HPO4 | Amresco | 0705 | |
KH2PO4 | Amresco | 0781 | |
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) | Gold Biotechnology | I2481C25 | |
Trizma Base | Sigma Life Science | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
DNase I | Sigma Life Science | DN25 | |
PMSF | Amresco | M145 | |
Leupeptine | Amresco | J580 | |
Pepstatin | Amresco | J583 | |
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
Amylose resin | New England BioLabs Inc | E8021L | |
TCEP | Amresco | K831 | |
EDTA | Fisher Scientfic | BP118 | |
Maltose | Acros Organics | 329915000 | |
Superdex 200GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
Empty polypropylene Chromatography column | BioRad | 731-1550 | |
Site-Directed Spin Labeling | |||
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | O873900 | |
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | A167900 | |
DMSO | J.T. Baker | 9224-01 | |
Reconstitution | |||
Asolectin lipid | Avanti polar lipids Inc | 541602C | |
Biobeads (Polystyrine beads) | Bio Rad | 152-3920 | |
Methanol | Fisher chemicals | A413 | |
FRET | |||
Fluorescein-maleimide | ThermoFisher Scientific | F-150 | |
Tetramethylrhodamine-maleimide | ThermoFisher Scientific | T-6027 | |
POPC | Avanti polar lipids Inc | 850457C | |
POPG | Avanti polar lipids Inc | 840457C | |
E.Coli polar lipid extract | Avanti polar lipids Inc | 100600C | |
HEPES | Sigma Life Science | H3375 | |
EPR measurement | |||
TPX plastic capillaries | Bruker | ER221 | |
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) | Aldrich | 158186 | |
Ni(OH)2 | Aldrich | 283622 |