Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Webstedet Instrueret Spin Mærkning og EPR spektroskopiske Undersøgelser af pentamere ligand ionkanaler

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I det seneste årti har den strukturelle forståelse af pentamere ligand-gatede ionkanaler (pLGIC) vokset med stormskridt på grund massevis af højopløselige strukturer af flere medlemmer af familien. Vigtige faktorer, der førte til de nuværende fremskridt inden omfatter, opdagelsen af prokaryote pLGIC kanaler, 1-3 store fremskridt inden eukaryote membranprotein udtryk, 4-6 og enorme gennembrud i struktur beslutsomhed tilgange. 7. Disse strukturer giver en klar enighed om den overordnede beskyttelse af den tredimensionale arkitektur af pLGIC. Men to store områder, der synes at trail bag er den funktionelle karakterisering af disse kanal præparater og mekanistisk beskrivelse af kanal funktion.

Gating konformationelle ændringer er komplekse og forekommer over en 60 Å afstand langs længden af ​​kanalen og disse overgange er udførligt moduleres vedmembranlipider. Især har negative lipider, cholesterol og phospholipider vist sig at modulere funktionen af pLGIC 8-11. Mens den præcise rolle af disse lipid bestanddele i kanal funktion forbliver ukendt, ville en komplet molekylær forståelse af gating kræver at studere disse kanaler i deres oprindelige miljø. Site-directed Spin Mærkning (SDSL) og elektronspinresonans (EPR) spektroskopi er de teknikker til valg for at studere protein dynamik i rekonstituerede systemer. EPR-spektroskopi er ikke begrænset af den molekylære størrelse (som er NMR) eller den optiske egenskab af prøven (som er fluorescensspektroskopi), og tillader derved målinger af fuld længde konstruktioner rekonstitueret i native lipid forhold. Teknikken er yderst følsom og har krav relativt lave prøve (i pico-mol interval). Begge disse aspekter gør teknikken velegnet til at studere store membranproteiner, der er vanskelige at udtrykke i løbet milligrammængder.

Anvendelsen af EPR-spektroskopi i kombination med steddirigeret centrifugering mærkning blev udviklet af Wayne Hubbell og kolleger, og er blevet tilpasset til at studere en række protein-typer. 12-24 EPR data er blevet anvendt til at undersøge sekundære strukturer, ændringer i proteinet konformation, membran-indsættelse dybder, og protein-protein / protein-ligand-interaktioner.

Fremgangsmåden involverer cystein substitution ved positionerne af interesse ved site-directed mutagenese. At sikre stedspecifik mærkning, er det nødvendigt at erstatte native cysteiner med en anden aminosyre (f.eks., Serin) at skabe en cystein-mindre skabelon. Langt den mest populære spin-mærket er et thiol-specifik MTSL: (1-oxy 2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl) methanethiosulfonate der tillægger proteinet gennem en disulfidbinding bro. På grund af sin høje specificitet, relativt lille størrelse (lidt større end tryptophan), og flexiheden for linker-regionen, har denne spinmærkning vist sig at have fremragende reaktivitet selv med en nedgravet cystein. Endvidere at maksimere reaktiviteten reaktionen af ​​proteinet mærkning udføres i detergent-solubiliserede formular. Efter separation af overskydende frie spin-mærke ved gelpermeationskromatografi proteinet rekonstitueres til liposomer eller dobbeltlag-efterlignende systemer med defineret lipidsammensætning. Generelt er cystein mutagenese veltolereret i de fleste dele af proteinet, og den relativt lille størrelse af spin-sonde forårsager minimal forstyrrelse til de sekundære og tertiære strukturer. At sikre, at modifikationen bevaret vildtype-funktioner, kan de mærkede og rekonstituerede kanaler studeres ved patch-clamp målinger.

Det mærkede-funktionelle protein udsættes derefter for spektroskopiske målinger, som i det væsentlige giver tre hovedtyper af oplysninger: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-probe dynamik ved lineshabe-analyse; tilgængelighed af proben til paramagnetiske afslapning midler; og afstand distribution. 27 EPR afstande måles ved to forskellige fremgangsmåder. Den første er baseret på den Continuous Wave (CW) -teknik, hvor spektral udbredning følge af dipolære vekselvirkninger mellem spin-etiketter (i 8 - 20 A afstandsområde). Anvendes til at bestemme afstanden 28,29 Den anden er en pulseret-EPR metode, hvor afstandsmålinger kan forlænges op til 70 Å. 30-34 i Double Electron Electron Resonance (DEER), er svingninger i spin-ekko amplitude analyseret for at bestemme afstande og afstande distributioner. Her spin ekko moduleres ved frekvensen af ​​den dipolære interaktion. Tilsammen er disse parametre anvendes til at bestemme protein topologi, sekundære strukturelementer, og protein-konformationelle ændringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. steddirigeret mutagenese og Cys Mutationer

  1. Kloning og mutagenese
    BEMÆRK: GLIC vildtype (wt) 35 har en enkelt-native cystein (C27), der er muteret til serin at skabe en cystein-mindre baggrund. Cystein indføres mutationer på cystein-mindre baggrund ved site-directed mutagenese ved anvendelse af primere, der bærer en cysteinkodon ved den ønskede position 36.
    1. Bland 5 eliter 10X reaktionsbuffer, 1 pi 100 ng / pl cystein-mindre GLIC template DNA 35, 0,5 pi af hver af 40 uM fremadrettet og revers primer 36, 1 pi dNTP'er (100 mM), og 41 pi deioniseret vand . Pipette prøven en par gange for at blande det grundigt, centrifugering (6000 rpm) og endelig tilsættes 1 pi af DNA-polymerase.
    2. Indstil termo-cycler med følgende protokol:
      1. Denaturering ved 95 ºC i 4 min.
      2. Denaturering ved 95 ºC i 30 sek.
      3. annealing ved 55 ºC i 1 min.
      4. Forlængelse ved 68 ºC i 10 minutter (ca. 1 min pr kb plasmid længde).
      5. Gentag trin 1.1.2.2 - 1.1.2.4 i 18 cyklusser.
      6. En endelig forlængelse ved 68 ºC i 10 minutter.
      7. Holding temperatur ved 4 ºC
        BEMÆRK: Annealing temperatur beregnes på grundlag af primeren Tm.
    3. Tilsæt 1 pi Dpnl til reaktionsblandingen, blandes omhyggeligt ved pipettering, og spin ned (6.000 rpm) i 1 min. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
  2. Transformation
    1. Thaw E. coli kompetente celler på is. Aliquot 30 pi celler i en 14 ml steril transformation rør og tilsæt 1 pi fordøjede DNA til cellerne. Bland ved at trykke på siden af ​​røret. Der inkuberes i 20 minutter på is.
    2. Glasset anbringes i et 42 ºC vandbad i 45 sek og derefter placere den tilbage på is i 2 min. Tilsæt 400 ul sterilt SOC medier og ryst cellerne i en INCUbator ved 37 ºC i 1 time.
    3. Plade 100 pi celler på LB-plader indeholdende kanamycin (50 uM) og 1% glucose. Inkubér pladerne O / N på 37 ºC.
    4. Harvest en enkelt koloni fra pladen og inokulering i 5 ml O / N kulturer indeholdende LB / kanamycin media. Inkuber kulturen O / N (~ 16 timer) ved 37 ºC i en inkubator-ryster.
    5. Uddrag DNA fra O / N kultur ved minipreparation 37. Kvantificere udbyttet af DNA under anvendelse af et spektrofotometer ved at måle absorbansen ved 260 nm bølgelængde. Koncentrationen skal være ~ 100-200 ng / pl. Bekræfte tilstedeværelsen af mutation ved standard rekombinant DNA-sekventering strategier 38,39.

2. GLIC Ekspression og oprensning

  1. Transformation
    1. Efter de trin, der er beskrevet i afsnit 1.2, transformere 30 pi C43 kompetente celler med 1 pi (~ 100-200 ng / ul) af plasmid indeholdende genet, der koder for GLIC sammen med en human rhinovirus (HRV) 3C proteasespaltningssted (For plasmidet og gensekvens, henvises til supplerende tekst) 35 (fra trin 1.2.5).
    2. Plade 100 pi celler på LB-agarplader indeholdende 1% glucose og 50 ug / ml kanamycin og inkuberes dem O / N (~ 16 timer) ved 37 ºC i en inkubator.
    3. Check visuelt for kolonier, og sikre, at de ikke over-dyrket eller vise tilstedeværelsen af ​​satellit kolonier. Straks forsegle pladerne med parafilm og gemme dem ved 4 ºC.
  2. Opsætning O / N-kulturer og Udarbejdelse af vækstmedier
    1. Pick et enkelt isoleret koloni ved anvendelse loop inokulering wire og overføres til en 100 ml steril kolbe indeholdende 20 ml af Luria Broth (LB) medium suppleret med steril 1% glucose og 50 ug / ml kanamycin. Inkuber dem O / N (~ 16 timer) ved 37 ºC i et rysteapparat ved 250 rpm.
    2. Autoklave 900 ml Terrific Broth (TB) medier (Se Medier og Buffer Afdeling) i 2,8L Fernbach glaskolber til bakteriekulturen i damp cyklus ved 121 * C i 20 min.
  3. Opsætning af store vækst kulturer
    1. Tilsæt 100 ml sterilt kaliumphosphatpuffer (Se Medier og Buffer Sammensætning) til autoklaveret TB medier. Tilføj sterilt glucose (0,2% slutkoncentration), kanamycin (50 ug / ml), og 10 ml af O / N-kulturen. Der inkuberes ved 37 * C i et rysteapparat ved 250 rpm.
    2. Tjek den optiske densitet ved 600 nm bølgelængde (OD 600) under anvendelse af densitometer eller et spektrofotometer hver time indtil den når 0,5 (~ 2 timer). På dette tidspunkt reducere hastigheden til 150 rpm og sænke temperaturen til 18 ºC. Overvåg OD 600 hver 30 min, indtil den når 0,8 (~ 1 time).
    3. Tilsæt 50 ml glycerol og fortsætte ryste kulturen, indtil OD600 når 1,0-1,2 (~ 15-30 min).
      BEMÆRK: Under disse betingelser, det tager ca. en time for kulturen at nå 18 ºC fra 37 ºC. Det er important at glycerol sættes til kulturen, når den er afkølet til 18 ° C.
    4. Inducere cellerne med 200 uM IPTG (isopropyl-thio-β-galactosid) og nulstille shaker tilbage til 250 rpm og inkuberes yderligere for ~ 16 timer ved 18 * C.
  4. protein Purification
    1. Sikre, at OD600 ved udgangen af 16 timer er ~ 16 - 18. Cellerne høstes i 1,0 L centrifugeflasker ved centrifugering ved 8.500 x g, 4,0 ºC i 15 minutter. Dekanteres og vejer flasken med cellepelleten. Beregn vægten af ​​pelleten ved at subtrahere vægten af ​​den tomme flaske fra den samlede vægt.
      BEMÆRK: Den forventede cellepellet vægt er ~ 30 - 35 g / L. Selv om det skal bemærkes, at der kan være variation i den endelige OD 600 og cellepellet vægt tværs mutanter.
    2. Resuspender den bakterielle pellet i 150 ml iskold puffer A (100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4) pr 1,0 I kultur. Tilføj DNase I (100 ug / ml) og protease inhibitorer (phenylmethylsulfonylfluorid (1 mM), leupeptin (2,0 ug / ml), aprotinin (2,0 ug / ml), og pepstatin A (1 ug / ml)).
    3. Homogenisere cellerne ved at passere dem gennem en celle disrupter i en 4,0 ºC kølerum. Gentag processen tre gange, således at de fleste af de bakterier lyseres. Centrifuger cellerne ved 14.000 xg i 15 min og pipette supernatanten ud og overføres til en ren centrifuge rør. Kassér pillen, som indeholder un-lyserede celler og inklusionslegemer.
    4. Centrifugeres supernatanten ved 168.000 x g i 1 time. dekanteres forsigtigt supernatanten uden at forstyrre membranen pellet.
    5. Pool membranpelleten fra 1 I kultur og re-suspendere det i Buffer A (suppleret med 10% glycerol) til et endeligt volumen på 50 ml. Tilsæt 0,5 g n-Docecyl-β-D-maltopyranosid (DDM) til membranen suspension og nutate i 2 timer ved 4,0 ºC.
    6. Efter membran solubilisering, fjernelse af cellerester fra lysatet ved centrifugation på 168.000 xg i 1 time. I mellemtiden forberede amylose harpiks. Overfør 3 ml harpiks ved hjælp af en pipette ind i en tom polypropylen kromatografikolonne. Vask harpiksen ved at lede 10 lejevolumener vand 3 gange og derefter med 10 søjlevolumener buffer A indeholdende 0,5 mM DDM.
    7. Efter centrifugering, forsigtigt tage supernatanten ved anvendelse af en pipette og overføres til en ren 50 ml konisk rør. For batchvis binding, tilføje præækvilibreret amylose harpiks til den konisk rør. Binde det ekstraherede protein til amylose harpiks ved nuterende af blandingen i 2 timer ved 4,0 ºC.
    8. Passere hele opslæmning gennem en kromatografisøjle og indsamle gennemløbet. Derefter passerer hele opsamlet gennemløbet over harpiksen en gang for at maksimere binding.
    9. Bestå 10 søjlevolumener buffer A med 0,5 mM DDM, 0,5 mM tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) og 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) for at fjerne ubundne proteiner.
    10. Eluering af GLIC protein med 10 ml Buffer A indeholdende 40 mM maltose foruden 0,5 mM DDM og 0,05 mM TCEP. TCEP forhindrer oxidation af cystein sidekæder. Saml hele eluat.
    11. Koncentrer det eluerede protein ved anvendelse centrifugal-koncentrator (molekylvægtsafskæring-off = 50 kDa) til 4 - 6 mg / ml, og der tilsættes HRV-3C protease (200 ug pr 10 mg protein) og inkuber O / N på 4,0 ºC.
      BEMÆRK: Derefter bestemmes afslutningen af proteasespaltning ved at køre prøver på SDS PAGE gel (Se trin 2.5.5 og figur 1).
  5. Site-directed Spin-mærkning
    1. Gør omkring 100 ul 200 mM bestand af (1-oxy 2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl) MTSL 40 i DMSO og opbevar lager ved -20 ºC i 25 pi prøver.
    2. Brug protease-fordøjet prøve for spin-mærkning med MTSL. Tilsæt 10-fold molært overskud af MTSL spin-label (GLIC monomer: MTSL i 01:10 molforhold). Der inkuberes på is i 1 time. Tilføj et andet skud af spinmærkning på et 5-fold molært overskudforholdet og inkuberes i en time.
      BEMÆRK: For nedgravede positioner (med lav effektivitet spin-mærkning, der er beskrevet nedenfor), der tilsættes en 30 gange molære overskud af spin-label og proteinet inkuberes i 6 timer.
    3. Prøven gennem en størrelse-eksklusion Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) kolonne, der er præ-ækvilibreret med puffer A og 0,5 mM DDM at adskille det spaltede MBP og den overskydende frie spin-etiket fra GLIC pentamerer. Opsaml fraktioner på 1 ml i alt 30 ml eluering. Pool fraktionerne indeholdende GLIC pentamerer (figur 1). Følg producentens anvisninger for at køre FPLC.
    4. Bestemme koncentrationen af ​​prøven under anvendelse af et spektrofotometer ved at måle absorbansen ved 280 nm bølgelængde. Molære ekstinktionskoefficient og den estimerede molekylvægt på GLIC monomer er 49.850 M-1 cm-1 og 36.380 Da. Koncentrer proteinopløsningen ved anvendelse af en centrifugal-koncentrator (MolecularVægt Cut-off = 50 kDa) til en slutkoncentration på ~ 8-10 mg / ml og placere den på is. Prøven er nu klar til rekonstitution.
    5. Som en ekstra kvalitetskontrol for at sikre, at præparatet er biokemisk homogen, køre en reducerende (1,0% β-ME) SDS-PAGE-gel.
      BEMÆRK: commassiefarvet gel skal vise et enkelt bånd på ~ 33 kDa svarende til GLIC monomer (figur 1).
    6. For spin-mærkede mutanter, der mistænkes for at udstille dipolær udvidelse, under-mærke prøverne i overværelse af diamagnetisk etiket 41. Inkubér den eluerede-protein med 0,1-fold MTSL og inkuber på is i 1,0 time. Bagefter tilsættes 20-fold molært overskud af diamagnetisk etiket (1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl) methan thiosulfonat.
      BEMÆRK: diamagnetiske reagens her er iso-sterisk til paramagnetiske etiket med en identisk mærkning kemi.
    7. Prøven inkuberes på is i 2 timer. Før prøven gennem en size udelukkelse chromatografisøjle, der er præ-ækvilibreret med puffer A og 0,5 mM DDM som i Trin 2.5.3.
  6. Effektivitet af spin-mærkning
    1. effektivitet spin-mærkning er defineret som forholdet mellem koncentrationen spin-label til koncentrationen af ​​cystein sidekæde (GLIC-monomer). For at bestemme effektiviteten af ​​spin-mærkning af prøven, vil den integrerede intensitet af prøven sammenlignes med en standard med kendt koncentration under anvendelse af en kalibreringskurve. Lav opløsninger af en EPR standard (såsom 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxyl: TEMPO) i en række koncentrationer (10-250 uM) ved opløsning i vand.
    2. Mål EPR signal for hver af disse opløsninger og bestemme arealet under kurven (dobbelt integration af EPR-signalet) for hver koncentration (som beskrevet i trin 6.1). Generer en Kalibreringskurven afbildes det målte område som en funktion af TEMPO koncentration og snit, med en lige linje.
      BEMÆRK: eren under et derivat EPR signal er en bedre beskrivelse af den spektrale intensitet end spids til spids amplitude. Integration af den første afledede EPR signal vil give absorptionsspektret, vil en anden integration derefter give arealet under absorptionsspektrum (som er proportional med spin koncentration). Sikre en konstant basislinie både i lav-felt og høje felt område af spektret.
    3. Måle koncentrationen af ​​spin-mærket protein i detergentet anvendelse af et spektrofotometer (som i trin 2.5.4). Nu måler EPR-signalet af prøven og derefter afgøre det område af den dobbelte integral af EPR-signalet efter trin i afsnit 6.1. Ved at bruge kalibreringskurve, bestemme koncentrationen af ​​etiketten, som svarer til den målte EPR signal. Virkningsgraden beregnes spin-mærkning som molforholdet mellem spinmærkning og proteinkoncentration.

3. GLIC Rekonstitution i Asolectin Membraner

  1. Skyl en ren 25 ml rundbundet kolbe med 5 ml chloroform, og kolben tørre i en strøm af N2-gas i stinkskab. Overfør 10 mg asolectin (sojabønne polær ekstrakt 25 mg / ml stamopløsning i chloroform) til kolben og tørre lipiderne under en kontinuerlig strøm af N2-gas.
    BEMÆRK: Valget af lipider til rekonstitution er baseret på resultater fra eksperimenter i afsnit 4.
  2. Når chloroform er fordampet, anbringes kolben i et vakuum i 1 time for at sikre fuldstændig tørring. Tilsæt 1 ml opløsning Buffer A til tørrede lipid og vortex kolben kraftigt for at få lipid pillen i suspension.
  3. Til fremstilling små unilamellare vesikler, sonikeres lipidsuspensionen i et koldt badlydbehandlingsapparat indtil vesikel opløsningen bliver mere eller mindre gennemskinnelige og observeres ingen klumper (ca. 10 - 15 min). Til denne blanding tilsættes DDM til en slutkoncentration på 4 mM og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter.
<li> Rekonstituering
  1. Tilføj det oprensede protein fra trin 2.5.4 til lipidblandingen.
    BEMÆRK: Proteinet-til-lipid-forhold afhænger af typen af ​​eksperimentet. For makroskopiske aktuelle målinger, en 1: er 10.000 anvendte forhold. For EPR studier, er rekonstituering udført ved en højere protein og lipid (1: 2.500) for at maksimere signalet. Det er tidligere vist, at ved disse koncentrationer er der ikke lateral aggregering observeret 42.
    BEMÆRK: Typisk arbejder mængde GLIC for EPR er ~ 1 mg, selvom den er baseret på positionen undersøgt, ville lavere mængder arbejde så godt.
  2. Prøven inkuberes ved 4 * C i 1 time under forsigtig rotation derefter fortynde prøven til 15 ml med puffer A.
    BEMÆRK: Dette trin bringer koncentrationen vaskemiddel under den kritiske micellekoncentration (CMC).
  3. Fjern den resterende detergent i suspensionen ved tilsætning polystyrenkugler (med hydrofobe porer, der fælde detergent). Tilføj 80 mg ren perlerne og inkuber liposogle suspension O / N på et nutator ved 4 ºC.
    1. Til fremstilling perlerne til anvendelse afvejes ~ 100 mg og overføre dem til en 50 ml konisk rør. Der tilsættes 10 ml methanol, rystes kraftigt, spin ned perlerne ved 8.000 xg i 2 min, og dekanteres methanol. Gentag denne proces med methanol vaske tre gange. Gentag den samme proces med 30 ml deioniseret vand, vask tre gange.
  4. Den næste dag, overføre liposomet til en 25 ml ultracentrifugerør anvendelse af en søjle filter for at fjerne perlerne og yderligere fortynde prøven til 25 ml. Centrifuger prøverne ved 168.000 xg i 2 timer. Dekanteres og re-suspendere pellet hjælp 100 ul puffer B.

4. Bestem Optimal Lipid Sammensætning til rekonstitution af FRET

  1. Brug en fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) -baseret assay til bestemmelse af membranens sammensætning og som opretholder proteinets monodisperse.
  2. rense vægt
  3. Efter trin i afsnit 3.2 til rekonstitution, forberede tre forskellige prøver for hver lipidsammensætningen der skal undersøges først, fluorescein-mærket GLIC i et molforhold på 1:. 1500 (pentamer: lipid) For det andet rhodamin-mærket GLIC i et molforhold på 1: 1.500 (pentamer: lipid). Tredje, bland detergent solubiliseret fluorescein og rhodamin mærket GLIC (1: 1 molforhold). Rekonstituer denne blanding i 1: 750 (pentamer: lipid) -forhold.
    BEMÆRK: Vi anvendte tre lipidsystemer: asolectin, POPC: POPG (3: 1 molforhold), og E. coli polar ekstrakt. Proteinet til lipid rekonstituering forholdet i FRET eksperimentet er højere end ved EPR målinger (1: 750 i forhold til 1: 1.500 anvendes til EPR studier).
  4. Udvandeliposomsuspensionen (for at reducere lysspredning signal, ~ 5 pi i 995 pi Buffer A) og derefter pipette prøven i en kvarts kuvette og læg den i et fluorimeter.
  5. Indstil excitationsbølgelængden på 490 (som svarer til absorptionsmaksima for donoren: fluorescein). Brug producentens anvisninger, optage emission spektre fra 500 nm til 660 nm.
    BEMÆRK: For fluorescein-mærket GLIC prøve, vil du se en top på 518 nm (svarende til fluorescein emission) med nogen top ved 572 nm (svarende til rhodamin emission). For rhodamin-mærkede GLIC prøve, vil du ikke se en top ved 518 nm, men i stedet ved 572 nm skyldes direkte excitation af rhodamin ved 490 nm. For prøven indeholdende både fluorescein- og rhodamin- etiketter, et fald i fluorescein peak intensitet og en tilsvarende stigning i rhodamin top er en FRET signal, som sandsynligvis en indikator for lateral aggregering af proteinet på membranen.
  6. Overvågamplituden af rhodamin emission ved 572 nm med forskellige tidsintervaller (0-24 timer) optagelse på hver time for de første 6 timer og derefter efter O / N inkubation (figur 2). For hvert interval, måle fluorescensintensiteten ved 572 nm (for rhodamin: la) og ved 518 nm (for fluorescein: Id). Fratræk bidrag direkte rhodamin aktivering (prøve 2 i trin 4.3) fra la (IAC). Bestem FRET forhold som IAC / (IAC + Ib). Sammenlign FRET med forskellige tidsintervaller og på tværs af forskellige lipidsammensætninger.
    BEMÆRK: Som kontrol udføre trin 4.5 og 4.6 for detergent solubiliseret prøver og sammenligne emissionsspektrene til dem fra rekonstitueret liposomer. Brug en ækvimolær blanding af mærket protein i detergent (beskrevet i trin 4.3) og fortyndes i buffer A suppleret med 0,5 mM DDM. Det forventes, at detergent prøver vil vise minimal FRET signal.

5. Funktionelle Målinger ved Patch-clamp Optagelser

  1. Forbered proteoliposomes for patch-clamp målinger i nøjagtig samme måde som for EPR undersøgelser (afsnit 3.1).
    BEMÆRK: Men justere protein: lipid-forhold baseret på den type af måling foretages (Single-kanal vs Makroskopiske optagelser). Flash-fryse proteoliposomer i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ºC indtil brug. Typisk rekonstruere GLIC i 1: 10.000 protein: lipid (molforholdet) for makroskopiske strømme og 1: 50.000 molforholdet for enkelt-kanal optagelser.
  2. Tø liposomer på is. Skyl en ren glasplade med vand og ethanol og tørre helt. Placer en 10 pi dråbe af proteoliposom på midten af objektglasset og tørre O / N i en ekssikkator ved 4 ° C under vakuum.
  3. Re-hydrat de tørrede proteoliposomer ved tilsætning af 20 pi puffer B (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,0) og anbring objektglasset i en petriplate oven på et fugtigt filtrerpapir. Dæk pladen og tillade rehydrering at forløbe i ca. 2 timer.
    BEMÆRK: Denne proces Yieninger gigantiske multilamellare liposomer, der er befordrende for lappe fra.
  4. Træk patch pipetter fra tyndvæggede borosilikatglas kapillærer (~ 1 - 2 ud um spids diameter) ved hjælp af producentens anbefalede indstilling på pipetten aftrækker. Heat-polish anvendelse af en brand-smede til en modstand på 1,5 - 2MΩ når den er fyldt med puffer B.
  5. Fyld optagelsen kammer med puffer B med en pipette og fastgør Ag / AgCl jordelektrode. Ved hjælp af en 2 pi pipettespids, forsigtigt løsne liposomer fra kanten og forflyttelse 1 pi af suspensionen på optagelsen kammeret. Vent et par minutter for liposomerne at bosætte til bunden.
  6. Fyld patch-pipette med puffer B ved hjælp af en ikke-metallisk sprøjte nål og montere den på forstærkeren hoved-scenen. Identificere et enkelt-isoleret vesikel at lappe. Påfør et let positivt tryk for at forhindre, at patch-pipette fra tilstopning, og sæt spidsen ind i optagelsen kammer.
  7. Påfør test impulser til at måle pipette ResistaIOU og kompensere for pipette spænding offset. Nærmer vesikel, og når kontakten er lavet, anvende en let undertryk til forsigtigt at trække den vesikel mod plasteret pipette til at danne en gigaohm forsegling.
  8. Overvåg modstanden af ​​pipetten under hele processen. Når gigaohm forseglingen er dannet, trække pipetten forsigtigt væk fra liposomet til dannelse af en inside-out patch. Sluk testen puls.
  9. Indstil holdepotentiale til -100 mV, og anvender en pH-puls. Lav pH blev opnået under anvendelse af 10 mM natriumcitratbuffer C (150 mM NaCl, 10 mM citrat, pH 3,0). (Figur 3)
    BEMÆRK: Optagelser foretages på en samplingfrekvens på 10 kHz for makroskopisk og 40 kHz for kanal målinger single.

6. EPR Målinger

  1. Kontinuerlig-Wave EPR spektroskopi
    1. Overfør liposomsuspensionen fra trin 3.2 til en 200 pi rør og pelletere prøver ved anvendelse af en centrifuge. Kassér supernatant og prøven er klar til EPR målinger.
      BEMÆRK: EPR målinger, er det vigtigt at fjerne så meget puffer fra liposomet prøve som muligt. Da vandige prøver absorberer den elektriske del af mikrobølge resulterer i opvarmning og tab af følsomhed.
    2. For at udføre buffer udveksling, overføre 20 pi liposompellet Med pipette til et mikrocentrifugerør. Tilføj 180 pi buffer D (100 mM NaCl, 10 mM citrat, pH 3,0) og inkuberes ved 42 ºC vandbad i 5 min. Centrifugeres prøven, supernatanten fjernes med en pipette og gentage processen tre gange for at sikre fuldstændig bufferudskiftning.
      BEMÆRK: Alternativt kan bufferudskiftning fremstilles ved at underkaste prøverne til flere fryse / tø-cykler.
    3. Gasgennemtrængelige plast kapillærer er velegnede til målinger af både spektrallinie-former og opløsningsmiddel tilgængelighed. Tryk på kapillar på pelleteret proteoliposomet at trække prøven inde og forsegle enden med knogle voks.
      IKKEE: Typical prøvevolumener er ~ 5 pi og en ønskelig centrifugering koncentration er 150 uM. Hvis formålet er at måle linjefigurer alene, kan man anvende 0,4 mm OD kvarts kapillarrør. Om nødvendigt kunne en pipette anvendes til fyldning af prøven inde i kapillarrøret.
    4. Betjen spektrometer
      1. Udfør CW-EPR-målinger ved RT (292-297 K) på en X-band spektrometer forsynet med en dielektrisk resonator som pr fabrikanternes brugsanvisning.
      2. Tænd for vandet køler, strømforsyning og mikrobølgeovn bro konsol. Lad systemet termisk ligevægt i ca. 30 min før optagelsen. Åbn erhvervelse software.
      3. Sæt prøveglasset / kapillar ind i resonator, sørge for, at den del af rør fyldt med prøven er i centrum for den resonator hulrum. Tune resonator som pr instruktionerne på spektrometer manual.
      4. Optag den første afledede absorptionsspektrum ved felt sweep påen hændelse mikrobølgeeffekt på 1,0 mW, en modulationsfrekvens på 100 kHz og en sweep bredde på 100 G. Bestem optimal kraft til eksperimentet ved udførelse af en tiltagende styrke mætning forsøg, hvor den top-til-top højde af den første afledede CW EPR signal måles som en funktion af kvadratroden af ​​den indfaldende mikrobølgeeffekt.
        BEMÆRK: Ved lavere mikroovn beføjelser, intensiteten af ​​signalet øges proportionalt med kvadratroden af ​​magten, så længe den ligevægt befolkningen i spin-tilstande er upåvirket. Men hvis strømmen øges yderligere, spin-gitter afslapning kan ikke længere opretholde ligevægten befolkning forskellen mellem de to spin-tilstande og signalet amplitude begynder at plateau eller "mætte". Ud over dette punkt, kan signalet amplitude faktisk falde med stigende observere magt på grund af befolkningens inversion spin forvaltnings. Derudover forbindelse med et udvidet spektre med omfattende vinger, hvor et veldefineret flad baseline er ikke VIligt, udvide sweep bredde til 150-200 G for at forhindre tab område.
      5. Start med anvendelse af en modulation amplitude på 1,0 G.
        BEMÆRK: Denne værdi er prøve-afhængig og justeret for at formindske lavfrekvent støj i signalet. Hvis der anvendes en for stor værdi, kan den fordreje eller udvide signalet.
      6. Indstil tiden konstant og konvertering tid til 20,48 ms, feje tid til 20,97 sek, og beslutning til 1024 point.
        BEMÆRK: Tidskonstanten er også baseret på prøven og justeres til bortfiltrere højfrekvente støj.
      7. Efter den første scanning, indstille midterste felt i midten af ​​EPR-signalet og vælger sweep bredde, således at spor omfatter signalet og tilstrækkelig baseline på hver side.
        BEMÆRK: Også for at forbedre signal / støj-forhold, øge antallet af scanninger baseret på styrken af ​​EPR signalet. Medtag feje bredde og antal point
      8. Mål tilgængeligheden af spin etiketten kollisionsdæmper afslappende agenter O 2 27 beskrevet i trin 6.1.4.4.
        BEMÆRK: Forbered Niedda som tidligere 26 beskrevet.
      9. Først perfundere prøven i hulheden med N2 i 5 minutter (for at skylle ud O 2). Mål spektre for hver mikrobølgeeffekt mellem 5-35 dB i trin på 3 dB med en sweep bredde på 30 G.
      10. Derefter perfundere prøven i hulheden med luft i 10 min og måle spektre ved forskellige mikroovn beføjelser (5 - 35 dB i trin på 3 dB) som i trin 6.1.4.9.
      11. Inkuber 20 ul liposompellet med 180 ul 50 mM Niedda (i puffer B eller Buffer D) i en 42 ºC vandbad i 5 min. Centrifugeres prøven og fjern supernatanten med en pipette. Læg prøven i kapillarrøret, og placere den i resonator hulrum. Gentag trin 6.1.4.9.
        BEMÆRK: Princippet bag forsøget er, at samspillet med paramagnetiske relaxing agenter gennem Heisenberg spin-udveksling ville forhindre mætning af signalet og befolkning inversion. Vandopløselig Niedda og lipid opløselige molekylære O 2 anvendes som reportere for vand (både bulk og intraprotein vestibuler) og membran udsatte positioner på protein.
  2. Dataanalyse:
    BEMÆRK: Analysen af EPR-data omfatter følgende trin: 14,22,23,25-27
    1. Beregn mobilitet af spin probe (AH o -1), som det modsatte af den centrale linje bredden af den første afledede absorptionsspektrum. AH o -1 er reflekterende af motional frihed eller dynamikken i sonden.
    2. Beregn tilgængelighed parameter (П), som er et estimat af tilgængeligheden af ​​proben til andre paramagnetiske kollisionsdæmper afslappende midler, ved hjælp af trin beskrevet nedenfor.
      BEMÆRK: Interaktion af spin-sonde med paramagnetiske afslappende agenterøger relaksationshastigheden spin-gitter (T 1) af nitroxid af Heisenberg spin-udveksling. 27
      1. Estimere tilgængelighed parameter (П) fra power mætningsforsøg (6.1.4.8), hvori den lodrette peak-to-peak amplitude af den centrale linie af den første afledede EPR spektrum måles ved forskellige mikrobølgeeffekt. 25 Plot amplituden af signalet som en funktion af kvadratroden af mikrobølgeeffekt og pasform med den følgende ligning 27.
        ligning 1
        BEMÆRK: Hvor A er amplituden af signalet, er et mål for homogeniteten af mætning af resonans linjen (som normalt mellem 0,5 og 1,5), jeg er en skaleringsfaktor, P er indfaldende effekt, og den repræsenterer værdi, ved hvilken den første afledede amplitude er halvdelen af ​​sin umættet værdi.
  3. Beregn delta P 1/2 værdier i nærvær (O 2 eller Niedda) og fravær (perfunderet med N2) af paramagnetiske afslappende midler. Beregn tilgængelighed parameter (П) ved anvendelse af ligningen:
    ligning 2
    BEMÆRK: Hvor P 1/2 reference og AH o henvisning er den halve maksimale effekt mætning værdi og den centrale linje bredde, henholdsvis for reference standard (såsom DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)) 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biokemisk karakterisering af Spin-mærket GLIC mutanter

Efter den ovenfor beskrevne protokol ville typisk give GLIC-MBP-fusionsproteinet i området på 10 - 12 mg / l kultur. Selv om denne værdi kan variere på tværs af forskellige mutanter, især for positioner begravet i proteinet, kan udbyttet blive væsentligt kompromitteret. I disse tilfælde kan de mængder kultur kræver opskalering. Spaltningen af ​​fusionskonstruktion ved HRV3C protease udføres O / N for bekvemmelighed. Ved at køre prøverne på SDS PAGE-gel, fandt vi, at denne spaltning er komplet inden for 30 - 60 min. (Figur 1A). Oprenset GLIC på størrelsesudelukkelseskromatografi gelfiltreringssøjle eluerer overvejende som en pentamer med en retentionstid volumen på 11,3 ml. MBP fraktion eluerer ved 15 ml og aggregater eluerer ved det tomme volumen af ​​søjlen (~ 7,0 ml). Spin-label kommer påslutningen af elueringen (~ 24 ml) (figur 1B)

FRET baseret assay til overvågning Aggregering af GLIC Rekonstitueret i forskellige membranlipider

FRET-assay anvendes til at evaluere aggregering af GLIC pentamerer i rekonstituerede vesikler (kom sammen inden for en afstand <50 Å på membranen). Figur 2 viser data fra GLIC wt (med C27, mærket med enten fluorescein eller tetramethylrhodamin) og rekonstitueres i E. .coli polære lipider, POPC: POPG (3: 1), POPE: POPG (3: 1) eller asolectin. Fluorescens målinger viser, at GLIC rekonstitueret i asolectin viste ingen FRET og endda fryse / optøning af prøven (betingelser er kendt for at fremme aggregering) produceret minimal ændring i FRET niveauer 43. Derfor asolectin er lipidblandingen valg for funktionelle og spektroskopiske målinger, der anvendes i disse STUdør.

Makroskopisk Behavior af GLIC i proteoliposomer

Funktionelle egenskaber af renset GLIC er kendetegnet ved patch-clamp målinger i rekonstituerede proteoliposomer. Repræsentative makroskopisk aktuelle optagelse fra wt GLIC fra en inside-out patch som reaktion på en pH-spring er vist i figur 3 ved -100 mV holdepotentiale, skifte til pH 3,0 puffer producerer hurtigt aktiverende indadgående strømme. (10 - 100mSek), som henfald til ca. 10% af spidsamplituden inden for sekunder 43 (1 - 3 sec, figur 3). Strømme tilbagesøge denne makroskopisk forfald eller desensibilisering ved at skifte tilbage til neutral pH. Mens kanaler i inside-out patch var følsomme over for ændringer i badet pH, var der ingen virkning af pH-ændring i pipetten opløsning (data ikke vist), hvilket antyder, at GLIC overvejende var orienteret i en direktion således at det ekstracellulære domæne i plasteret står for bad / opløsning veksler.

Strukturelle Omlejringer Under Channel Aktivering

Ved stuetemperatur, kan spin-probe vedtage flere rotamere konformationer, og den spektrale linie form er følsom, ikke blot til bevægelsen af ​​spin-label-sidekæder i forhold til peptidskelettet, men også til backbone udsving og globale protein bevægelser. Derfor kan ændringer i EPR lineshapes vise sig at være en fremragende diagnostisk værktøj til at overvåge protein konformationsændringer. Figur 4 viser spektre i position L241 (17) R1 i det ekstracellulære hydrofobe område af pore-foring M2 region (position fremhævet som sorte cirkler i Figur 4, indsat) ved pH 7,0 og pH 3,0. De spektre viser forskelle under de to betingelser, både i signalet amplitude og omfanget afmotional udvidelse. Som med funktionelle målinger 42, de konformationelle ændringer indberettet af de EPJ signaler er også fuldt reversible. Spektral udvidelse påvirkes både af bevægelsens begrænsninger sonden og ved dipolært kobling. For at bestemme bidraget fra de to, L241 (17) er co-mærket med en diamagnetisk spin-label. De under-mærkede og fuldt mærkede spektre sammenlignes ved pH 7,0 og pH 3,0 (figur 4B). Omfanget af dipolær udvidelse i denne position falder, når kanalerne er under mærket, hvilket indikerer en interaktion mellem spin-labels mellem forskellige underenheder.

Figur 5 viser spektre for to positioner på M4 helix, som er placeret ved periferien af kanalen. AH o -1 måles som den inverse af den centrale linje bredde (vist i indsat). Som nitroxid roterende bevægelse reduceres, hvilket bevidnes under dannelsenaf tertiære eller kvaternære kontakter, linjebredden øges (og dermed AH o -1 reduceres) for en bestemt motional geometri. Tværtimod er strukturelle bevægelser, der fører til en stigning i sonden bevægelsesfrihed afspejles som en stigning i AH o -1. F312R1 er mere mobile, mens R296R1 er immobile, i overensstemmelse med deres udsatte og stærkt begrænsede miljøer, hhv.

Baseret på tilgængelighed parametre, kan et spin-label ved en bestemt position på proteinet klassificeres som en af ​​følgende: begravet i proteinet kerne utilgængelige for enten vand eller lipider, på overfladen udsættes for en vandig opløsning, eller på overfladeeksponerede til lipider (figur 5 og 6). De parametre for tilgængeligheden opnået for en række efter hinanden følgende lokaliteter kan derefter anvendes til at bestemme den sekundære struktur af en region, probe områder af protein-proteinkontakt, måler hældning af et protein i membranen, estimere fordybelse dybde grænsefladeteknik loops, og identificere vand vestibuler og lipid-bundne lommer inden for de transmembrane spiraler. 26 Som et eksempel, power-mætning kurver i figur 6 viser, at F312R1 har en relativt højere P 1/2 for O 2, i sammenligning med R296R1, hvilket tyder sidekæderne i position F312 er lipid-eksponerede. Desuden F312R1 er også mere tilgængelige for Niedda sammenlignet med R296R1 overensstemmelse med sin placering i lipid-vand-grænsefladen. På den anden side, L180R1 i sløjfen C-region af det ekstracellulære domæne er mobil og tilgængeligt for Niedda, i overensstemmelse med sin placering i en vand-eksponerede løkke.

Probe dynamik og data tilgængelighed på en given position giver lokal strukturel information om den specifikke position i den samlede protein-fold. Disse parametre bestemmes for alinear sekvens af rester langs protein kan analyseres yderligere ved anvendelse af analytiske metoder baseret på Fourier-transformation metoder. Disse analyser er nyttige til at evaluere periodiske variationer i EPR miljøparametre og vejlede forudsige og orientere sekundære strukturer. For et særligt protein segment, en diskret Fourier transformation effektspektrum P (ω) beregnes som en funktion af vinklen mellem hosliggende positioner (w) i dette segment. Dette plot anvendes derefter til at bestemme den vigtigste vinkelfrekvens komponent af spektret og sammenlignet med de forventede (w) værdier for en α-helix (80 - 120 º) eller p-strenge (150 - 180 º).
ligning 3
hvor P (ω) er Fouriertransformation power spektrum som en funktion af kantet frekvens ω, n er antallet af rester i segmentet, er miljøparameter på positionen. P ('ω') bliver evalueret for værdien ω = ligning 6 der maksimerer P (ω).

Endvidere kan en periodicitet indeks parameter (giver betydningen af ​​den forudsagte sekundære struktur) beregnes som et forhold mellem arealet under effektspektret for vinklen, som repræsenterer en bestemt strukturelt element til den for det samlede areal af spektret. En glidende vindue metode anvendes derefter til at identificere begyndelsen og afslutningen af ​​et givet sekundært strukturelt element. Den relative orientering dette segment i forhold til resten af proteinet kan estimeres ud fra retningen af P (ω) øjeblik.

For α-helix:

ligning 4

ligning 5

Disse metoder er blevet anvendt med succes til flere systemer til at bestemme tredimensionelle topologier og forudsige konformationelle ændringer underliggende proteinfunktion 14,23,24,41,44-53.

Bestemmelse Afstand Distribution fra EPJ

Inter-subunit-nitroxid afstande kan bestemmes ud fra elektron-elektron dipolære vekselvirkninger. I CW-EPR, som vist i figur 4, gennemgående rum dipolære vekselvirkninger fører til spektral udbredning og er en funktion af nærhed mellem etiketterne. Ved afstande op til -15 - 20 A, omfanget af udvidelse (sammenlignet mellem fuldt mærket spektre og under-mærkede spektre) kan anvendes til semikvantitativt estimere afstande ved hjælpFourier dekonvolution metoder. 28,29

Inter-subunit afstande (<50 Å) kan måles ved hjælp Dobbelt Electron-Electron Resonance (DEER) metoder. 30-34 DEER data indsamles prøver vaskemiddel eller rekonstitueret i nanodiscs grund af de begrænsninger, der er forbundet med disse målinger i liposomer 54. For afledte mærkede prøver i rengøringsmiddel (~ 100 um) i Buffer A med 0,5 mM DDM, er 30% (vægt / volumen) glycerol anvendt til kryobeskyttelse. De dipolære tidsudvikling data opnås ved 83 K ved hjælp af en standard DEER fire-puls-protokol (π / 2) MW1-τ1- (π) MW1-τ1- (π) MW2-τ2- (π) MW1-τ2-ekko 55 på en pulseret EPR spektrometer, der arbejder ved Q-band frekvens (33,9 GHz). De puls længder til (π / 2) MW1 og (π) MW1 er 10 og 20 ns henholdsvis og 40 ns for (π) MW2. DEER signaler bliver derefter baggrund korrigeres under forudsætning af en 3D homogen background og analyseres af Tikhonov legalisering 31,56 at bestemme gennemsnitlige afstande og fordelinger i afstand.

Intramolekylære afstande for en repræsentativ position i M4 (F314R1) bestemt af hjorte eksperimenter ved pH 7,0 er vist i figur 7 Da der er fem spin-etiketter inden for GLIC pentamer, mindst to afstande forventes.; der svarer til de tilstødende underenheder og den anden fra ikke-tilstødende underenheder, selv om der kan opstå yderligere toppe fra alternative rotamere spin-orienteringer. Hjorte signal henfalder og de tilsvarende sandsynlighedsfordelinger vises. Den første korte afstande peak (~ 42A) repræsenterer afstande mellem hosliggende underenheder, og den anden top (~ 53A) svarer til den ikke-tilstødende afstand. Toppen for den diagonale afstand ser ud til at være på kortere afstand, og det er sandsynligt, at være undervurderet, fordi pålidelige målinger ud over 60 Åikke er muligt under de eksperimentelle betingelser på grund af tekniske vanskeligheder med baggrund korrektion.

figur 1
Figur 1. Biokemisk karakterisering Spin-mærket GLIC mutanter. (A) repræsentant gelfiltrering kromatogram af spin-mærket-GLIC efter proteolytisk spaltning af MBP-tag. Toppene svarer til GLIC pentamer og fri MBP. (B) SDS-PAGE viser uncut monomer GLIC-MBP fusionsproteinet (før gelfiltrering) og MBP og GLIC fraktioner puljet fra gel filtrering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. FR ET baseret assay for Overvågning af Aggregation staten GLIC Rekonstitueret i forskellige membranlipider. FRET målinger er vist for prøver efter O / N rekonstitution (til venstre) og efter frysning / optøning af prøver (til højre). (Modificeret fra den oprindelige figur). 43 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Makroskopisk Behavior af GLIC i proteoliposomer. I en inside-out patch fjernet fra rekonstitueret asolectin vesikler, er GLIC aktiveres ved pH hopper hjælp af en hurtig løsning veksler. Kanalerne ses at aktivere i ~ 10 msek og desensitize med en tidskonstant af 1 - 3 sek. (Modificeret fra den oprindelige figur). 43ig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Strukturelle Omlejringer Under Channel aktivering. (A) repræsentant CW-EPR-spektre for en position i pore foring M2 helix, viser ændringer i amplitude og linjefigurer som reaktion på pH-ændringer. I hvert tilfælde spektrene normaliseret til det totale antal af spins. Spin-mærket position er vist som en sort cirkel. Kun to underenheder er vist for klarhed. (B) EPRspectra viser dipolær udvidelse af spin-spin-interaktioner. Spektrene i stiplede var fra under-mærkede kanaler (i nærvær af diamagnetiske etiketter) og i fast-line var fra fuldt mærkede kanaler. Det indsatte viser en overlejring af amplitude-normaliseret spektre. Bredere under fuldt mærkede betingelser er højoplyst af pile. Scan bredde er 150 G. (modificeret fra den oprindelige figur). 36 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. restkoncentrationer Specifik Miljømæssige parametre målt ved Power mætning. Målinger af spektral bredde (AH 0) og solvens tilgængelighed (P 1/2) for to modsatrettede positioner i M4 helix af transmembrane domæne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Miljø en repræsentant Loop C Rester i det ekstracellulære domæne af GLIC. Spin-normaliseret CW-spektre og de ​​tilsvarende tilgængelighed målinger for L180R1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. afstandsmålinger ved Pulserende-EPR Approaches (rådyr). GLIC struktur der viser placeringen af Phe314 og tilsvarende Cp-Cp afstande for de tilstødende og ikke-tilstødende underenheder. CW-spektre for denne position er vist til højre. Baggrund trækkes DEER- ekkointensitet er plottet mod evolution tid og passer bruger model-fri Tikhonov legalisering for prøver i vaskemiddel. Den tilsvarende inter-spin-afstand distribution (højre).pload / 54127 / 54127fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

EPR-spektroskopi har vist sig at være en enestående strukturel tilgang kvantificering konformationelle ændringer i membranproteiner i en nær-native miljø. Denne tilgang giver os et kig ind i de molekylære detaljer af protein dynamik, der er skjult i høj opløsning strukturer fra røntgenkrystallografi og Cryo-elektronmikroskopi. Men det er vigtigt at overveje de tekniske begrænsninger ved denne fremgangsmåde, der kan påvirke den generelle anvendelighed til andre systemer, og også at huske på de potentielle eksperimentelle vejspærringerne undervejs. Vi diskutere nogle af disse aspekter nedenfor sammen med de anbefalede strategier for fejlfinding.

Blandt de mere almindelige problemer, man støder på med en teknik, der involverer omfattende mutationsmønstre perturbationer er det lave udbytte og dårlig oligomere proteinets stabilitet. Dette aspekt er yderligere forværret, når der arbejdes med komplekse multimere membranproteiner såsom ionkanaler. Det er therefore afgørende at optimere disse to biokemiske aspekter, før der iværksættes en udbredt mutagenese. Vi fandt, at ekspressionen af giftige GLIC mutanter er bedre tolereres i C41 og C43 stammer af BL21 celler 3,36 Endvidere sænke post-induktion temperaturen til 15 -. 18. ºC, faldende IPTG koncentrationen til 100 uM, og med 5% glycerol under induktion synes at hjælpe med at sænke protein aggregering formentlig ved at nedsætte hastigheden af ​​protein-ekspression og reducere omfanget af misfoldning. Cystein mutationer ved visse positioner (især i permeation pathway) er blevet vist at forøge den konstitutive aktivitet på kanalen og disse mutanter kunne indebære større forhindringer i ekspression. Anvendelse af divalente pore blokkere (10-25 mM Ba 2+) under induktion lindrer toksicitet og forbedrer cellevækst 57 Disse strategier har vist sig effektive i mange tilfælde på at øge udbyttet, sænke protein aggregering og øge oligo.Meric stabilitet. 36,58

En anden afgørende skridt i SDSL er effektiviteten af ​​mærkning processen. Mens overfladeeksponerede cysteiner bør ikke være noget problem i MTSL reaktivitet (> 90% mærkning udbytter), kan positioner, hvor cystein sidekæder er begravet og utilgængelige kræve højere spin-label koncentrationer og længere inkubationstider. Stigende koncentration spin-label til 30 gange molært overskud og inkubere O / N ved 4 ºC hjælper med at forbedre effektiviteten mærkning. Derudover er det også vigtigt at måle spektrene af det mærkede Cys-mindre skabelon til at bestemme bidraget baggrund. For websteder, der er dårligt mærket (<10%), baggrunden signal overvælder den overordnede spektre. Mens bestemme effektiviteten spin-mærkning, opmærksom på, at nøjagtigheden påvirkes af en række faktorer, der omfatter prøvevolumen, prøve-kapillær diameter, positionering af kapillær i resonator, hulrum temperatur, og resonator Qværdi (der er forholdet mellem energien lagret i det over energi, der spredes ud). Der skal udvises forsigtighed for at opretholde disse betingelser identiske mellem prøverne og standard. Endvidere bør det bemærkes, at for immobile steder, hvor spektrene er uløseligt bred, nøjagtigheden af ​​målingen mærkning falder yderligere. Alternativt kan væskekromatografi Time of Flight-elektrospray massespektrometri (LCT-ESI-MS) anvendes til direkte at bestemme molekylmasse og dermed mærkning effektivitet. Imidlertid er MS følsomhed kompromitteret for prøver i vaskemidler og for stramt foldede membranproteiner.

Når mutanterne oprenses som en homogen population, er det vigtigt at fastslå funktionaliteten af ​​præparatet. Patch-clamp målinger af afledte mærkede mutanter i centrale områder af kanalen vil afsløre effekten af ​​forstyrrelse på ligand affinitet og kanal gating. Alternativt kan kanal egenskaber studeres i sort Lipid Membraner (BLM) 59 eller ved at injicere proteoliposomer i oocytter og måle strømme med to elektrode spænding clamp. 59-61 Hvis det konstateres, at cystein substitution og spin-label i bestemte positioner ændrer ligand-følsomhed eller gating kinetik kanaler, eksperimentelle betingelser (ligand koncentration, modulatorer, lipider sammensætning) kan varieres passende at stabilisere konformationel tilstand under efterforskning. Endvidere skal det bemærkes, at EPR målinger foretages under steady-state betingelser og ændrer derfor i hurtige kinetik af kanalen er mindre tilbøjelige til at påvirke den strukturelle fortolkning.

Det er klart, en stor fordel ved denne teknik er muligheden for at studere kanal dynamik i membraner med defineret sammensætning og til direkte sonde hvordan lipid-medierede virkninger på dynamikken ændrer kanal funktion. , En begrænsning er imidlertid, at nogle lipidsammensætninger kan forårsage lateral aggregering af kanaler on membranen og dermed egnetheden af lipider skal undersøges. 45 For betingelser, der forårsager aggregering, sænke protein-til-lipid-forhold, udføre rekonstitution ved lavere temperatur, og forkorte varigheden af rekonstitution tid kan hjælpe med at opretholde kanalerne monodisperse 62 Alternativt kan kanalerne rekonstitueres i nanodiscs, som er nanoskala lipid samlinger omgivet af en ring af amfipatisk membranscaffoldprotein (apolipoprotein A1). 63 ved at optimere det molære forhold af kanalen protein, lipidbestanddele, og membranen stilladser protein, er det muligt at opnå en homogen og mono-disperse population af enkeltstrengede kanalenheder inkorporeret i individuelle nanodiscs. Dette system har adskillige yderligere fordele, idet de nanodiscs er optisk klare og giver nem adgang til både intracellulære og ekstracellulære sider af membranen.

Endelig på det niveauaf de EPJ-målinger, kunne man blive konfronteret med CW-EPR spektre, der ikke er ligetil at fortolke, især for positioner viser flerkomponent spektre. Sådan konformationel heterogenitet kan opstå fra langsomt udveksle konformationer af proteinet eller / og flere orienteringer af spin-label i et givet protein konformation. Bestemmelse af relative bidrag af de to scenarier er ikke trivielt, og kan kræve brug af alternative spin-label derivater eller skiftende eksperimentelle temperatur, 64 tryk, 65 feltstyrke / mikrobølge frekvens, 66 eller ved osmolyt perturbation. 67

Desuden kan DEER målinger i liposomer være begrænset af en række faktorer, herunder lavere følsomhed, højere bidrag baggrund ved forbedrede intermolekylære interaktioner, og en reduktion i den målbare distance interval (<50 Å). Generelt for længere afstande (<50 Å), er der storis usikkerhed i bredderne af fordelingen afstand på grund af utilstrækkelige dipolære evolution gange. Men brugen af Q-båndet (34 GHz) mikrobølgefrekvens og mærkning med et bifunktionelt spinmærkning (med reducerede iboende dynamik) har vist, at afhjælpe nogle af disse begrænsninger. 54 rekonstituering i nanodiscs har også vist sig at uhyre forbedre DEER følsomhed ved faldende baggrund bidrag, der opstår fra intermolekylære dipolære interaktioner. 15

På trods af disse begrænsninger, SDSL / EPR studier, især i systemer med få indfødte cysteiner, har vist sig at være bemærkelsesværdigt informativ. Fremtidige teknologiske fremskridt er rettet mod at tilpasse denne kraftfulde tilgang til at studere mere komplekse menneskelige kanaler, hvor muterer indfødte cysteiner eventuelt ikke er muligt. I denne henseende, udvikling af alternative strategier mærkning såsom dem baseret på stedspecifik inkorporering af unaturlige aminosyrer, 68 eller synthesis af etiketter, der er rettet mod andre aminosyrer, 69 synes at holde meget lovende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi er meget taknemmelige for de nuværende og tidligere medlemmer af Chakrapani laboratorium for kritisk læsning og kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud (1R01GM108921) og American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 12SDG12070069) og SC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4 (2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452, (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457, (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474, (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512, (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512, (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25, (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284, (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259, (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23, (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27, (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7, (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102, (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16, (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52, (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4, (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248, (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89, (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40, (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124, (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86, (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457, (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287, (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94, (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38, (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38, (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16, (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88, (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47, (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158, (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5, (10), e271 (2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30, (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289, (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11, (11), e1001714 (2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288, (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23, (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46, (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584, (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281, (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51, (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (39), 9108-9111 (2011).
Webstedet Instrueret Spin Mærkning og EPR spektroskopiske Undersøgelser af pentamere ligand ionkanaler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter